Manual de Bacteriologia

COLECCIN
Textos Universitarios
Libros de LUZ
El Vicerrectorado Acadmico de la Universidad del Zulia, consciente de la importancia que el
libro tiene como herramienta para fortalecer tareas esenciales como la docencia y la investigacin,
presenta su nueva coleccin de libros que, desde su Consejo de Publicaciones, salen a poner de
manifiesto la diversidad intelectual que caracteriza nuestra institucin. Ms que un proyecto editorial hecho realidad, esta nueva coleccin le da forma tangible al conocimiento que tanto docentes
como investigadores producen en sus mltiples actividades de pre y post grado, haciendo realidad
la relacin acadmica entre profesores y estudiantes, como el pilar fundamental del quehacer universitario.
La coleccin Textos Universitarios ampla sus dimensiones con el brillo de estos nuevos ttulos, que a partir de este momento se sumarn a la inquebrantable tarea de iluminar los caminos del
estudio, la indagacin y la reflexin, convertidos desde sus pginas en rutas de hallazgo, conocimiento y placer, que son en definitiva las potencialidades de cualquier texto. Sabor y saber, como
nos dijeran desde siempre los ms fervorosos amantes de los libros. Y es que estos nuevos ttulos
vienen a impulsar lo que ya inicialmente se hiciera: enriquecer el patrimonio bibliogrfico de la
academia universitaria, hacer tangible el conocimiento producido en nuestra alma mter, prestigiar
a nuestro personal que incansablemente hace posible la expresin diversa del saber, transferir los
grandes logros para consecucin del bien colectivo y, con la intensidad de una comunidad que
existe hecha un referente de esplendor, irradiar nuestro quehacer a la regin y el pas que todos
somos.
Los libros que desde hoy continan naciendo desde el Consejo de Publicaciones del Vicerrectorado de LUZ, expresan un esfuerzo de trabajo conjunto con diversas instituciones pblicas y
privadas que creyeron en nuestro proyecto editorial, y trascendieron las meras formalidades de
alianzas - aportes, para identificarse con la trascendental labor de multiplicar el acervo bibliogrfico universitario. Con el crecimiento de la coleccin Textos Universitarios las posibilidades
de crecer como creadores se hace imponderable y permite reencontrarnos perennemente en el
trayecto infinito de la bsqueda del saber. Y es que como deca Oscar Wilde Leer un libro es
leernos a nosotros mismos. Y es esta una noble y extraordinaria tarea.
Profa. Judith Aular de Durn

Vicerrectora Acadmica de la Universidad del Zulia
MANUAL PRCTICO DE
BACTERIOLOGA GENERAL
Segunda Edicin
Universidad del Zulia

Autoridades Universitarias
Jorge Palencia Pia
Rector
Judith Aular de Durn
Vicerrectora Acadmica
Mara Guadalupe Nez
Vicerrectora Administrativa
Marlene Primera
Secretaria
Consejo de Publicaciones del
Vicerrectorado Acadmico
Judith Aular de Durn
Directora
ngel Madriz
Coordinador
MANUAL PRCTICO DE
BACTERIOLOGA GENERAL
Segunda Edicin
Maribel J. Castellano G.
Messaria M. Ginestre P.
Yeiny C. vila R.
Sonia C. Romero A.
Armindo J. Perozo M.

Coleccin Textos Universitarios
Ediciones del Vicerrectorado Acadmico
Manual Prctico De Bacteriologa General; Segunda Edicin

Maribel J. Castellano G.
Messaria M. Ginestre P.
Yeiny C. vila R.
Sonia C. Romero A.
Armindo J. Perozo M.
Coleccin Textos Universitarios

Segunda Edicin, 2011.
Diseo y cuidado de edicin:
Consejo de Publicaciones de la Universidad del Zulia - Jannieliz Leal
Impresin:
Hecho el Depsito de Ley:

XXXXXXXXXXXXXXXXXXX
Reservados todos los derechos
Este libro ha sido arbitrado por las instancias correspondientes.
de esta edicin
Impreso en Venezuela
ndice General
Pgina
Introduccin
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Actividad Prctica 1.1: Introduccin al Trabajo Prctico de Bacteriologa

Objetivos especficos
Normas de bioseguridad en el Laboratorio de Bacteriologa
Material y equipo de uso frecuente en el Laboratorio de Bacteriologa
Actividad a realizar
Ejercicios de auto-evaluacin
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Actividad Prctica 1.2: Observacin de Bacterias y otros Microorganismos in vivo

Objetivo especfico
Observacin de bacterias y otros microorganismos vivos provenientes de diferentes ambientes naturales:
agua, suelo, alimentos, otros
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Actividad Prctica 1.3: Examen al Fresco y tcnica de la Gota Pendiente

Examen microscpico
Examen al fresco
Tcnica de la Gota Pendiente
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UNIDAD II: MORFOLOGA Y ULTRA-ESTRUCTURA DE LA CLULA BACTERIANA

Objetivos terminales
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Actividad Prctica 2.1: Tcnicas de Coloracin. Examen microscpico de Preparaciones Coloreadas

Colorantes
Coloraciones
Etapas del proceso de coloracin
Tcnicas de coloracin
Coloracin de Gram
Coloracin de Ziehl-Neelsen
Coloracin de grnulos metacromticos
Coloracin de cpsula
Coloracin de flagelos
Coloracin de esporas
Laminero Prctica 2.1: Coloraciones
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UNIDAD I. INTRODUCCIN AL TRABAJO PRCTICO DE BACTERIOLOGA

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Maribel J. Castellano G, Messaria M. Ginestre P, Yeiny C. vila R, Sonia C. Romero A, Armindo J. Perozo M
Unidad III: Nutricin y Crecimiento Bacteriano

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Actividad Prctica 3.1: Tcnicas de Siembra y Morfologa Colonial

Tcnicas de siembra o Inoculacin
Tcnicas de inoculacin de medios lquidos
Tcnicas de inoculacin de medios slidos y semi-slidos en tubo
Tcnicas de inoculacin de medios slidos en placa
Tcnicas de aislamiento de colonias en medios slidos
Morfologa colonial
Laminero3.1:Morfologia colonial bacteriana en medios enriquecidos, selectivos y diferenciales
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Actividad Prctica 3.2: Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano

Objetivo especfico
Factores Fsicos
Temperatura
Concentracin de hidrogeniones (pH)
Tensin de oxgeno y potencial de xido-reduccin
Presin osmtica
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70
70
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Actividad Prctica 3.3.: Medicin del Crecimiento Bacteriano

Cuantificacin del crecimiento bacteriano
Contaje en placas
Turbidimetra
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72
72
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UNIDAD IV: METABOLISMO BACTERIANO

Objetivo terminal
79
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Actividad Prctica 4.1: Pruebas Bioqumicas utilizadas en la Identificacin de Bacterias en el Laboratorio

Generalidades
Identificacin utilizando mtodos convencionales
Laminero 4.1: Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias en el laboratorio
81
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112
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UNIDAD V: GENTICA BACTERIANA

Objetivo terminal
123
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Manual prctico de bacteriologa general
Actividad Prctica 5.1: Transferencia de Material Gentico por Conjugacin

Bacteriana
Objetivo especfico
Generalidades
125
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UNIDAD VI: CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

Objetivo terminal
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Actividad Prctica 6.1: Evaluacin de Mtodos Fsicos para el Control del Crecimiento Bacteriano
Objetivo especfico
Efecto del Calor sobre el Crecimiento Bacteriano
Efecto de las Radiaciones sobre el Crecimiento Bacteriano
Ejericicios de auto-evaluacin
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Actividad Prctica 6.2: Evaluacin de Desinfectantes y Antispticos

Generalidades
Actividades de auto-evaluacin
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Actividad Prctica 6.3: Pruebas de Susceptibilidad y Resistencia Bacteriana a los Antibiticos

Generalidades
Mtodos para determinar la susceptibilidad bacteriana a los antibiticos
Mtodo de Dilucin en Caldo
Mtodo de Dilucin en agar
Mtodo de Difusin del Disco en Agar
Mtodos de Gradiente de Antibiticos
Otras pruebas
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UNIDAD VII: INTERACCIN BACTERIA-HOSPEDERO

Objetivo terminal
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Actividad Prctica 7.1: Flora Normal

Objetivo especfico
Generalidades
Flora normal del cuerpo humano
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UNIDAD VIII: CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO

Objetivo Terminal
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Actividad Prctica 8.1: Preparacin y Control de Calidad de Medios de Cultivo

Objetivos Especficos
Generalidades
Medios de cultivo
Tcnica de preparacin de medios de cultivo
Control de calidad de medios de cultivo
Anexos
Referencias Bibliogrficas
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INTRODUCCIN
El Manual Prctico de Bacteriologa General, en su segunda edicin, est dirigido fundamentalmente

a los estudiantes que se inician en el fascinante mundo de los microorganismos y contiene una serie de actividades
destinadas a integrar y fortalecer los conocimientos tericos impartidos en el Programa de Bacteriologa General,
asignatura obligatoria para los estudiantes de Bioanlisis de la Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia.
Sin embargo, est concebido como libro de referencia para estudiantes de carreras afines y de post-grado que
necesiten profundizar nociones bsicas de bacteriologa; as como para cualquier persona que desee informacin
sobre la bacteriologa prctica.
Este manual proporciona una serie de normas y tcnicas necesarias para un adecuado desempeo en
el laboratorio de Bacteriologa mediante ejercicios prcticos, cuya finalidad es el desarrollo de habilidades y
destrezas en el laboratorio. Con este propsito, los contenidos han sido organizados en ocho unidades, divididas
en un mximo de tres sesiones prcticas por unidad. Cada una de estas sesiones contiene los fundamentos tericos
bsicos, esquemas explicativos, figuras e ilustraciones que facilitan la comprensin de las actividades prcticas
contempladas.
La Unidad I est enfocada en los principios bsicos y las normas de bioseguridad que rigen el trabajo de
laboratorio; presenta los materiales y equipos de uso rutinario en el rea de Bacteriologa e inicia al estudiante en
la observacin directa de microorganismos vivos en diferentes tipos de muestras.
La Unidad II comprende la exploracin de las tcnicas empleadas para la observacin de los
microorganismos in vivo, las tcnicas de coloracin de las bacterias y la comprensin de los diferentes morfotipos
bacterianos apreciables en una muestra biolgica.
En la Unidad III, se abordan las tcnicas de siembra y los mtodos de aislamiento y cuantificacin
bacteriana. Tambin se enfoca la visualizacin de las colonias bacterianas en diversos medios de cultivo y el
reconocimiento de la influencia de los factores fsico-qumicos en el crecimiento bacteriano.
Los contenidos de la Unidad IV presentan las bases para la comprensin de diversidad de pruebas
bioqumicas que reflejan los procesos metablicos que se llevan a cabo en la clula procariota; brindando las
herramientas bsicas para la correcta ejecucin, lectura e interpretacin de las pruebas bioqumicas utilizadas de
rutina para la identificacin bacteriana.
Por su parte, la Unidad V, estudia la gentica bacteriana, especficamente brinda algunos lineamientos
relacionados con los posibles mecanismos de transferencia de material gentico entre bacterias, en especial,
mediante la conjugacin bacteriana y su implicacin en la diseminacin de la resistencia bacteriana.
Los contenidos de la Unidad VI abarcan los mtodos fsicos para el control del crecimiento bacteriano;
la evaluacin de desinfectantes y antispticos y las pruebas de susceptibilidad y resistencia de las bacterias a los
antibiticos.
13
En la Unidad VII, los contenidos han sido organizados en una sesin prctica, relacionada con la
observacin de las bacterias y otros microorganismos que forman parte de la flora normal de diferentes sitios del
cuerpo humano.
Finalmente, la Unidad VIII proporciona los principios generales sobre la preparacin y control de
calidad de los medios de cultivo utilizados para el aislamiento e identificacin bacteriana.
Esperando que esta obra constituya un valioso aporte a la enseanza de la Bacteriologa General y que
sea de provecho para los estudiantes, a quienes va dirigido este trabajo.
Los Autores
14
UNIDAD I
INTRODUCCIN AL TRABAJO PRCTICO DE
BACTERIOLOGA
Objetivos Terminales:
Al finalizar la Unidad, el participante estar en capacidad de:
Aplicar las normas de bioseguridad que rigen el trabajo en el Laboratorio de Bacteriologa.
Diferenciar los materiales y equipos de uso frecuente en el Laboratorio de Bacteriologa.
Verificar la presencia de bacterias y otros microorganismos vivos en diferentes tipos de muestras.
Reconocer la movilidad bacteriana en preparaciones al fresco.
ACTIVIDAD PRCTICA 1.1

INTRODUCCIN AL TRABAJO PRCTICO DE BACTERIOLOGA
Objetivos Especficos:
1. Aplicar las normas de bioseguridad en el Laboratorio de Bacteriologa.
2. Identificar los materiales y equipos de mayor utilidad en el Laboratorio de Bacteriologa.
Normas de Bioseguridad en el Laboratorio de Bacteriologa
Los laboratorios de Bacteriologa son ambientes especiales con respecto a la seguridad de las personas
que trabajan en los mismos. Las muestras recibidas para su estudio representan un riesgo potencial para el
personal, debido a los agentes infecciosos que pueden contener. La educacin del personal que manipula a diario
los agentes potencialmente infecciosos, as como de aqullos que slo tienen una exposicin limitada al ambiente
del laboratorio, tales como: personal de mantenimiento, personal que entrega las muestras y visitantes, debe estar
dirigida al conocimiento de las medidas para prevenir las infecciones adquiridas en el laboratorio. Los riesgos de
un laboratorio de esta rea pueden extenderse a los laboratorios adyacentes y a las familias del personal.
Adems del riesgo por infeccin, los laboratorios de Bacteriologa tambin estn expuestos a todos
los riesgos asociados con cualquier ambiente de laboratorio o institucional, como: incendios, riesgos elctricos,
qumicos, situaciones ambientales, materiales radiactivos, mal funcionamiento de los equipos y peligros
dependientes de desastres naturales.
Los riesgos biolgicos existentes en la seccin de bacteriologa del laboratorio clnico son los de inters
en este caso. Las normas de bioseguridad son un conjunto de medidas preventivas, destinadas a proteger la salud
de los trabajadores y la comunidad frente a riesgos por agentes biolgicos en el laboratorio.
A continuacin se indican las normas generales que deben cumplirse en el Laboratorio de
Bacteriologa:
1. El Laboratorio de Bacteriologa representa un gran peligro para las personas no entrenadas, por lo tanto, el
acceso debe estar limitado al personal que labora en l. Deben evitarse las visitas, especialmente de nios.
Ciertas reas de alto riesgo, como las secciones de Micobacteriologa, deben estar cerradas al pblico.
2. El estudiante, al igual que el resto del personal que all labora, debe usar una bata de laboratorio. La misma
deber ser larga (que cubra la ropa de calle), manga larga y estar completamente cerrada. Debe quitrsela antes
de abandonar el laboratorio.
3. Es indispensable usar guantes de goma o ltex cuando se manipulan materiales potencialmente patgenos.
Como el riesgo de contaminacin por aerosoles es grande, es necesario utilizar mascarilla.
4. Dentro de las reas de trabajo est absolutamente prohibido comer, beber, fumar y aplicarse cosmticos. Bajo
ninguna circunstancia, utilice la cristalera o los envases del laboratorio para ingerir lquidos o sustancias
alimenticias.
5. Se recomienda no llevarse los objetos o las manos, a la cara o la boca, durante su permanencia en el laboratorio;
sino despus de minucioso lavado con agua, jabn y cepillo.
6. Todas las operaciones hechas con pipetas deben ser practicadas con el empleo de propipetas o gomas de
succin. Nunca pipetee con la boca.
7. Est terminantemente prohibido utilizar telfonos celulares dentro del laboratorio para evitar distracciones que
puedan ocasionar accidentes y disminuir el riesgo de contaminacin.
8. Mantenga su mesn de trabajo despejado. Disponga nicamente, los materiales estrictamente necesarios para
realizar su trabajo. Todo artculo que no sea indispensable para la ejecucin de las actividades deber ser
guardado fuera del rea para evitar su contaminacin.
9. En caso de cualquier accidente, por pequeo que ste sea, notifquelo de inmediato a su superior para tomar
las acciones pertinentes.
17
10. Muchos de los microorganismos estudiados en el laboratorio son patgenos para el hombre; por lo tanto, todas
las muestras y cultivos que se procesan deben ser considerados potencialmente patgenos y ser tratados
como tales.
11. Rotule convenientemente todas las muestras procesadas. Nunca incube cultivos no identificados.
12. No realice experimentos o trabajos sin autorizacin de su superior.
13. Una vez terminado el trabajo, devuelva a su lugar todos los reactivos y equipos utilizados. Su rea de trabajo
debe quedar totalmente despejada. Descarte todos los cultivos, las muestras y la cristalera utilizados en el
recipiente destinado a tal fin. Una vez depositado un objeto en el recipiente, nunca debe ser retirado del
mismo.
14. Deposite las pipetas utilizadas en los recipientes correspondientes. Nunca coloque pipetas contaminadas sobre
su mesa de trabajo.
15. No desplazarse dentro del laboratorio con material contaminado, por ejemplo: pipetas que hayan sido utilizadas.
Asegurarse de tener disponible el recipiente de descarte antes de usar materiales como pipetas, hisopos u
otros.
16. Los microorganismos desecados o fijados sobre lminas portaobjetos no necesariamente estn muertos;
maniplelos con cuidado y al descartarlos, hgalo en el recipiente correspondiente.
17. Nunca saque material contaminado (por ejemplo: cultivos bacteriolgicos) del laboratorio sin haber obtenido
las instrucciones pertinentes.
18. No interrumpa a quienes estn trabajando; pues se pueden ocasionar graves errores o accidentes.
19. Trabaje siempre cerca del mechero para evitar la contaminacin de los cultivos. De igual manera, no hable
mientras est inoculando las muestras en sus correspondientes medios de cultivo.
20. Las personas que tienen el cabello largo, deben recogrselo para prevenir accidentes.
21. Las sandalias o zapatos descubiertos no ofrecen proteccin adecuada a los pies; por lo tanto, se recomienda el
uso de calzados cerrados.
22. Lave cuidadosamente sus manos con agua y jabn al terminar cada sesin de trabajo y antes de salir del
laboratorio.
23. El laboratorio debe mantenerse limpio y ordenado, retirando del mismo cualquier material que no tenga
relacin con el trabajo.
24. Las superficies de trabajo se descontaminarn al terminar cada actividad especfica.
25. Todos los procedimientos tcnicos se practicarn de manera que se evite, en lo posible, la formacin de
aerosoles.
26. Durante el trabajo se mantendrn cerradas las puertas del laboratorio.
Cumpliendo a cabalidad las normas anteriormente descritas, el Laboratorio de Bacteriologa puede
constituir un rea segura para trabajar y aprender.
Material y Equipo de uso frecuente en el Laboratorio de Bacteriologa
Con fines didcticos, el material de uso en el Laboratorio de Bacteriologa puede dividirse en dos clases:
A.- Material de vidrio
B.- Instrumentos, equipos y otros materiales microbiolgicos.
A) Material de vidrio:
Debe cumplir con ciertos requisitos especiales; como:
1. Ser resistente al calor seco y hmedo
2. Resistir lavados frecuentes
3. El vidrio debe ser neutro (que no altere el pH de los medios que contengan)
4. Resistentes a los cidos y lcalis.
18
El material de vidrio utilizado en los Laboratorios de Bacteriologa est representado por:

Cilindros graduados: Tambin denominados Probetas graduadas, son recipientes de vidrio grueso, forma
cilndrica y dimetro uniforme, provistos de una base o pie para darles estabilidad. No son aptos para calentar ni
para efectuar reacciones qumicas. Poseen una escala graduada en mililitros (ml) y calibrada a 20C. Generalmente,
tienen una capacidad entre 25 y 2.000 ml. Se usan para medir lquidos. En bacteriologa, se emplean durante la
preparacin de medios de cultivo, colorantes y reactivos, entre otros.
Embudos: Son conos de vidrio o de material plstico con punta de longitud variable terminada en bisel. Se utilizan
para filtrar reactivos, colorantes y medios de cultivo, para lo cual deben ser preparados, previamente, con papel
de filtro. Otro de sus usos, es facilitar el trasvasado de lquidos y slidos hacia recipientes de cuello estrecho. Para
obtener una buena filtracin, es mejor utilizar un embudo de buena calidad con un ngulo de 58 exactamente.
Esptulas en forma de L: Son varillas de vidrio que miden 22 x 25 mm. de largo, dobladas en uno de sus
extremos en ngulo de 90. Se utilizan para la diseminacin de material sobre la superficie de los medios de
cultivo.
Fiolas o Erlenmeyers: Son recipientes de vidrio de forma cnica, cuello corto y fondo plano. Su capacidad est
entre 25 y 5.000 ml. Se utilizan para la preparacin de medios de cultivos y soluciones.
Frascos goteros: Son frascos de vidrio que poseen una ranura que al ser colocada de manera que coincida con otra
presente en la tapa, permiten la salida del lquido en forma lenta (gota a gota). Adicionalmente, existen frascos de
plstico o vidrio con un orificio o un dispositivo, que permite dispensar lquidos gota a gota. Por lo general, tienen
una capacidad de 25 a 50 ml.
Frascos para hemocultivo: Son frascos redondeados o rectangulares, de vidrio transparente con tapa de baquelita,
generalmente con una capacidad de 120 ml. Se utilizan para el cultivo de microorganismos a partir de muestras
de sangre.
Lminas cubreobjeto (laminillas): Son laminillas delgadas de vidrio con forma cuadrada, rectangular o redonda
que cubren las preparaciones microscpicas colocadas sobre los portaobjetos. Miden entre 15 y 22 mm de largo
por 0,13; 0,17 a 0,20 mm de espesor.
Lminas excavadas: Son rectngulos de vidrio con tamaos variables, algunas veces iguales a los portaobjetos;
otras veces, de mayor tamao (110 x 55; 15 x 40 mm) que presentan en su superficie una, dos, tres o ms
excavaciones. Se utilizan para observar la movilidad de los microorganismos por el mtodo de la gota pendiente.
Lminas portaobjeto: Son rectngulos de vidrio utilizados para realizar extendidos a ser observados al microscopio.
Las de uso frecuente miden 75 mm de largo por 25 mm de ancho con 1 mm de espesor. Pueden poseer o no, bordes
esmerilados.
Matraces o balones: Son recipientes de forma esfrica con un cuello cilndrico, largo y de fondo plano. Su
capacidad est entre 50 y 5.000 ml. Algunos son aforados; es decir, poseen una marca circular que indica que a ese
nivel contiene un volumen exacto. Se utilizan para la preparacin de soluciones.
Mechero de alcohol: Consta de un envase de vidrio o metal, provisto de una mecha, la cual se encuentra en
contacto con el alcohol contenido en el recipiente. Posee una tapa para evitar la evaporacin del alcohol cuando no
se encuentra en uso. Se utiliza en algunos procedimientos de coloracin que requieren calentamiento y para crear
un ambiente estril durante la toma de muestra de sangre para hemocultivos.
Pipetas: Son tubos de vidrio con longitud y capacidad variable que terminan en una extremidad afilada. Presentan
una graduacin exterior que indica su capacidad a 20C; algunas veces, la graduacin llega hasta la punta (pipetas
terminales) y en otras, termina por arriba de ella (pipetas no terminales). Las ms usadas tienen una capacidad
de 0,1; 0,2; 1; 2; 5 y 10 ml. Las hay tambin de plstico (desechables). Se emplean para transferir un volumen
determinado de lquido o solucin. Existen tambin las Pipetas volumtricas, calibradas para dispensar volmenes
fijos de un lquido. Existen de diferentes capacidades que varan en un rango de 1 a 100 ml.
Pipetas Pasteur: Se obtienen comercialmente, o pueden prepararse en el laboratorio. Poseen un extremo afilado
que puede ser largo o corto. Presentan tambin, un estrechamiento en la parte superior para facilitar el taponamiento.
Se utilizan para la inoculacin de medios de cultivo, separar sobrenadantes, aadir reactivos, entre otros usos.
Placas de Petri: Estn compuestas por dos platillos que difieren en su dimetro de manera que uno encaje
perfectamente sobre el otro. Existen de varios tipos y tamaos. El dimetro de las ms utilizadas es de 100 x 15
19
mm y de 150 x 25 mm. Algunas estn divididas en secciones o cuadrantes que permiten estudiar varios cultivos
simultneamente o efectuar contaje de colonias. Pueden ser de vidrio o de material plstico (desechables). Se
utilizan para contener los medios de cultivo donde se inocularn los microorganismos a estudiar.
Tubos de centrfuga: Son tubos de ensayo, cuyo extremo cerrado termina en forma de cono. Se utilizan en los
procesos de centrifugacin de muestras. Algunos poseen una escala graduada que permite medir, la cantidad de
sedimento obtenido. Pueden ser de material plstico o vidrio y tener o no, tapa de baquelita. Los ms usados tienen
15 y 30 ml de capacidad.
Tubos de ensayo: Son tubos de vidrio, cerrados por un extremo, con reborde o sin l, de dimetro variable. Los
ms utilizados son de: 160 x 15 mm; 150 x 15 mm; 125 x 15 mm y 100 x 13 mm. Algunos llevan tapa de baquelita.
Se usan principalmente para contener medios de cultivo y reactivos, as como tambin para efectuar pruebas
bioqumicas.
Tubos de fermentacin (Durham): Se usan para el estudio de los procesos de fermentacin de los carbohidratos
por parte de las bacterias. Permiten detectar la produccin de gas a travs del desplazamiento del lquido en el
interior del tubo. Generalmente miden 6 mm de dimetro x 50 mm de alto y suelen colocarse invertidos dentro de
otro tubo de mayor dimetro.
Varillas de vidrio: Son cilindros de vidrio con extremos redondeados, de longitud y tamao variables (20-25 cm
de longitud x 3-5 mm de ancho, respectivamente). Se utilizan para la siembra y aislamiento de colonias en placas.
Tambin para trasvasar lquidos y mezclar sustancias.
Vasos de precipitado (beakers): Son recipientes de forma cilndrica, poseen una depresin en el borde que facilita
el vaciamiento de los lquidos. La capacidad, por lo general, es entre 25 y 2.000 ml. Se utilizan para transferencia
de lquidos.
B) Instrumentos, Equipos y otros Materiales usados en Bacteriologa
Agitador tipo vrtex: Es un aparato formado por una base de aluminio fundido que brinda durabilidad y estabilidad
para su uso. Posee una copa de caucho suave para el mezclado de un tubo de ensayo nico. Presenta dos modos de
operacin: operacin continua y encendido constante; y encendido al tacto, el cual se activa al tocar el accesorio
de copa con un tubo de ensayo.
Asas bacteriolgicas: Estn formadas por un mango de Kolle unido a un alambre de platino puro u otro metal
que le permite flexibilidad y calentamiento o enfriamiento rpido. Por su flexibilidad, se le pueden dar las formas
de aguja (asa en punta) o en aro (asa en argolla o aro). El elevado punto de fusin del metal con que se elabora
el asa, le permite que sea esterilizado al calor directo de la llama sin que se funda, y su rpido enfriamiento evita
la muerte del microorganismo cuando es tocado por el asa para ser inoculado a otro medio. Este alambre est
sujeto a un mango o cuerpo que generalmente, es de material liviano (aluminio) y es un buen conductor del calor.
Est protegido en su extremidad posterior por una cubierta de ebonita (aislante). Se emplean para la inoculacin
de microorganismos en los medios de cultivo. En ocasiones, las asas suelen estar calibradas para dispensar un
volumen determinado de inculo, por ejemplo 0,001 ml.
Autoclave: Aparato diseado para la esterilizacin de materiales por vapor de agua a presin. Est provisto de
una llave y un manmetro para regular la presin, y por consiguiente, la temperatura a la que se desea someter
los microorganismos. Formado por una cmara de vapor de doble pared equipada con dispositivos, que permiten
que la cmara se llene a saturacin de vapor y se mantenga a la temperatura y presin deseada. El autoclave es
una pieza indispensable en todo laboratorio de Bacteriologa. Se utiliza para la esterilizacin de la mayora de los
medios de cultivo durante su preparacin; as como, para esterilizar material contaminado antes del lavado. Opera
a una presin de 15 libras a 121C de temperatura por un tiempo de 15 minutos.
Balanza: Equipo que permite pesar cualquier compuesto necesario para el trabajo diario de un laboratorio. Existen
en el mercado muchos modelos, algunos son de brazo, mecnicas, electrnicas o digitales.
Bandejas para esterilizar: Son recipientes, con o sin tapa, para descartar el material utilizado en el laboratorio
para luego esterilizarlo en el autoclave. Pueden ser de acero inoxidable o de propileno y su capacidad es variable.
Baos de Mara: Son aparatos provistos de una doble pared de acero inoxidable, y una capa central de asbesto,
poseen un termostato, un control del nivel de agua y un termmetro para regular la temperatura. El calor es
suministrado por una resistencia elctrica. Se utilizan para verificar reacciones de los microorganismos a temperaturas
controladas. Tambin se emplean en la estabilizacin de los medios de cultivo durante su preparacin.
20
Campana o jarra de microaerofilia: Son recipientes formados por un cuerpo y una tapa que cierra hermticamente.
El cuerpo est constituido por material de vidrio o plstico de boca ancha; en cuyo interior se colocan las placas
de Petri y tubos de ensayo contentivos de los microorganismos en cultivo para su incubacin en atmsferas
especiales (5-10% de CO2). Esta atmsfera especial se logra insertando una vela encendida en el interior del
recipiente o un sobre generador de la mezcla de gases deseada. Tambin puede crearse una atmsfera de este tipo
por procedimientos mecnicos; es decir, extrayendo el aire del interior con una bomba de vaco y cargndolo con
una mezcla que contenga una concentracin de 5-10% de CO2.
Campana o jarra de anaerobiosis: Sistema usado para crear una atmsfera anaerbica. La que se emplea con
mayor frecuencia es la Campana de Gaspak, la cual consiste en una campana de plstico transparente con una
tapa hermtica, la cual es ajustada por una abrazadera. La introduccin de una mezcla de gases que contiene
H2 es seguida por la reaccin cataltica del oxgeno con el hidrgeno para formar agua, establecindose as, la
anaerobiosis. Se emplea preferiblemente un catalizador fro compuesto por partculas de almina recubiertas con
paladio, ya que no tiene riesgo de explosin. Algunas estn provistas de una conexin para aplicar el mtodo de
evacuacin/reposicin de gases en la creacin de un ambiente de anaerobiosis.
Campana de extraccin: Sistema de seguridad, compuesto por un extractor centrfugo con motor y protegido de
los vapores por una ventana tipo guillotina con vidrio de seguridad, posee cuatro llaves de servicios localizadas a
cada lado para suministrar gas, agua, aire y vaco, adems de toma-corrientes. Permite la manipulacin de cultivos
bacteriolgicos y muestras clnicas evitando la propagacin de aerosoles.
Centrfugas: Son instrumentos metlicos de distintas capacidades, con envoltura de aluminio. Poseen un motor
que opera generalmente con 110-115 voltios y un restato que regula las revoluciones por minuto. En su interior
se encuentra un cabezal donde van colocados unos cilindros metlicos que sirven de receptores a los tubos de
centrfuga. Existen tambin centrfugas refrigeradas con un compresor que controla la temperatura. Poseen un
rango de temperatura de -20C a +40C. Son aparatos utilizados para la centrifugacin; es decir, la aplicacin de la
fuerza centrfuga para separar partculas en suspensin. Se emplean generalmente, para concentrar o precipitar los
elementos celulares contenidos en un lquido normal o patolgico.
Cestas: Son recipientes de tejido metlico o plstico resistente al calor, de diferentes formas y tamaos. Se usan
para el almacenamiento de los tubos de ensayo y para su esterilizacin.
Contador de colonias: Aparato que consta de una fuente de luz, una lupa y un vidrio cuadriculado que facilita el
contaje de las colonias presentes en un cultivo. Los contadores digitales estn provistos de un sensor que se activa
cada vez que se enumera una colonia durante el contaje.
Destilador de agua: Es un equipo que permite obtener agua de alta calidad, libre de pirgenos e iones metlicos a
partir de agua potable proveniente directamente de la tubera de suministro municipal. Est formado por resistencias,
condensadores y una caldera, entre otras partes. Algunos presentan diferentes dispositivos que interrumpen la
energa elctrica cuando el nivel de agua disminuye.
Dispensador: Es un dispositivo que se utiliza para repartir volmenes pequeos de lquido a partir de frascos
grandes. stos deben ser exactos y reproducibles en la dosificacin. Adems, no deben causar desperdicios de
reactivos. Estn conformados por una vlvula de seguridad, tubo telescpico para adaptarse a frascos de diferente
altura y controlador para ajustar el volumen de forma precisa y sencilla.
Encendedor para mecheros: Pieza metlica accionada por un resorte que lleva en un extremo un carbn
reemplazable, el cual es friccionado sobre una superficie irregular, producindose chispas que hacen encender los
mecheros.
Esptulas: Instrumentos planos, obtusos, semejantes a un cuchillo que se emplean para agregar sustancias. Son
de material inoxidable con mango de madera u otro material de hoja flexible, resistente al calor y a los agentes
qumicos.
Estufas o incubadoras: Son instrumentos metlicos que poseen una doble pared de aluminio revestida por una
sustancia refractaria al calor proporcionado por una resistencia elctrica y la temperatura es graduada por medio
de un termmetro que se maneja desde la parte externa. En la parte superior, posee un orificio donde se inserta el
termmetro e indica la temperatura existente en el interior. La temperatura usada en estos aparatos est entre 5 y
50C. Se utilizan para proveer de manera constante, temperaturas apropiadas para favorecer el crecimiento de los
microorganismos.
21
Frascos lavadores o picetas: Son recipientes plsticos utilizados para dispersar agua u otras sustancias contenidas
en ellos, permitiendo lavar o arrastrar cualquier material. Se usan para transvasar material slido y para lavar los
recipientes, sin tocar las paredes. Tambin se emplean en el lavado de preparaciones coloreadas.
Gomas de succin: Son bulbos de goma que se utilizan, al igual que las propipetas, para pipetear lquidos y
reactivos.
Guantes de ltex para laboratorio: Son prendas de tamao variable y ambidextros. Hechos de ltex y disponibles
en forma estril y no estril, con polvo (almidn de maz) y sin polvo. Se emplean para proteger las manos cuando
se trabaja con agentes infecciosos o qumicos peligrosos. En la actualidad existen tambin de nitrilo,libres de
polvo, especiales para personas alrgicas al ltex y/o al polvo que contienen los guantes de ltex.
Guantes de seguridad: Son prendas utilizadas para manipular objetos calientes provenientes del autoclave u
horno. Se fabrican de tejido de algodn puro o de asbesto. Son lavables y resistentes al calor hasta 232C.
Gradillas: Soportes especiales de madera, metal o plstico, empleados para colocar los tubos de ensayo.
Horno de aire caliente: Es una cmara rectangular de doble pared, de tamao variable, con amianto para evitar la
prdida de calor por radiacin, con un espacio areo entre ambas paredes. El calor es proporcionado por electricidad.
No puede utilizarse para lquidos ya que se agotaran por ebullicin, ni para telas, ni gomas que se quemaran. Se
utilizan para esterilizar cristalera. Este material debe estar limpio, completamente seco y debidamente envuelto
antes de ser esterilizado al calor seco del horno. Opera generalmente a una temperatura de 170-180C durante 60120 minutos para destruir todos los microorganismos. El ms utilizado es el Horno Pasteur.
Hisopos: Son aplicadores de madera que llevan algodn en uno de sus extremos. Son utilizados en forma estril
para la toma de muestras bacteriolgicas y algunas veces, para efectuar siembras.
Lpiz con punta de diamante: Se usan para marcar vidrios y otras superficies. El diamante es montado en bronce
y colocado al final de un mango de aluminio.
Lpices grasos: Son lpices especiales que sirven para escribir en vidrios o superficies muy pulidas. Los hay de
diferentes tipos, colores y marcas. Poseen en su composicin, un porcentaje graso que permite la adhesin de ste
en la superficie lisa. Para usarlos, es necesario que la superficie donde se va a escribir est completamente limpia
y seca.
Lentes de seguridad: Son instrumentos pticos panormicos que tienen como funcin proteger los ojos del
usuario ante cualquier accidente que pueda ocurrir en el laboratorio. Son de policarbonato claro y existen variados
modelos en el mercado.
Mascarillas: Son caretas faciales compuestas por tres capas de propileno fundido poroso que contiene en su parte
intermedia, un filtro del mismo material. Estas mascarillas aseguran la filtracin de bacterias.
Mecheros de Bunsen: Son tubos de metal que sirven para la combustin del gas natural. Antes de producir la
llama para la oxidacin completa del gas, se requiere mezclar el gas con aire. Se componen de las siguientes partes:
a) Pie: sirve de soporte, b) Vlvula para la regulacin de la mezcla aire-gas natural y c) Cuello del mechero. Se
utilizan para la esterilizacin de las asas bacteriolgicas y para el flameado de la boca de los tubos que contienen
cultivos, durante su manipulacin.
Medidor de pH (pHmetro): Instrumento que tiene como finalidad medir el pH de soluciones qumicas en el
laboratorio. Est formado por un electrodo y su soporte, el cual es el sensor que produce la lectura. Este equipo
debe calibrarse con el empleo de una solucin buffer o tampn. Existen muchos modelos en el mercado, algunos
pueden presentar dispositivos para determinar otras caractersticas, tales como: temperatura, conductividad y
concentracin.
Microincinerador: Es un aparato elctrico que cumple las funciones de un mechero de Bunsen. Adems, lleva
adaptado lateralmente, una cmara tubular para incinerar los microorganismos, evitando de esta forma, el peligro
de contaminacin de la atmsfera y del operador. Se les conoce popularmente como mecheros elctricos.
Microscopio: El microscopio compuesto de luz, ampliamente utilizado en la actualidad, es un instrumento ptico
constituido por un conjunto de lentes y partes mecnicas, que permite la observacin de especmenes diminutos,
invisibles al ojo humano, revelando detalles de su estructura. Existen otros tipos de microscopio, tales como:
Campo Oscuro, Contraste de Fase, Inmunofluorescencia, Electrnico, entre otros.
22
Mortero con mazo: Es un recipiente que sirve para macerar cualquier compuesto qumico o material que se desea
utilizar para la preparacin de una solucin y que se encuentre en estado slido. Existen de diferente capacidad,
comnmente se fabrican de porcelana.
Papel de filtro: Material compuesto por microfibrilla de vidrio que se utiliza para la retencin de partculas finas
con una alta velocidad de flujo, durante los procesos de filtracin.
Pinzas: Tenacillas de metal o acero inoxidable que sirven para varios usos. Por ejemplo: se utilizan para colocar
los discos de antibiticos en las pruebas de susceptibilidad y resistencia a los antimicrobianos, para sujetar hisopos
a fin de no tomarlos con la mano y para retirar el papel de filtro durante las coloraciones, entre otros.
Pipeta automtica: Es un dispensador de lquidos automtico, exacto y preciso. Presenta un eyector de punta para
evitar el desprendimiento accidental de la puntilla. Existen en el mercado diversidad de modelos y capacidades.
Plancha de calentamiento: Es un instrumento que tiene como finalidad el calentamiento rpido de sustancias
qumicas, para facilitar la preparacin de soluciones. Presentan una placa de calentamiento metlica, adems de
controladores de temperatura. Algunos modelos traen incorporado un agitador con control ajustable.
Propipetas: Son dispositivos de goma que poseen tres vlvulas de presin que operan independientemente para
controlar la entrada y salida de lquidos. Poseen un orifico inferior donde se inserta la pipeta que va a ser utilizada.
Poseen tambin tres botones: uno superior (A) que se utiliza para extraer el aire contenido en el interior del bulbo;
uno inferior (S) para succionar el lquido al interior de la pipeta y otro, lateral (E) que extrae el lquido de la
pipeta. Se usan para pipetear lquidos peligrosos.
Puntillas para pipetas automticas: Son boquillas de propileno que se colocan en la parte inferior de las pipetas
automticas y su funcin es tomar la cantidad de lquido a dispensar. Existen de diferentes capacidades adaptables
a cada modelo de pipeta.
Rejilla metlica: De forma cuadrangular, es una red constituida por finos alambres entrecruzados que llevan en
su centro un rea circular de amianto o asbesto. Este material dispersa el calor con uniformidad. Generalmente,
se colocan sobre anillos o trpodes cuando van a calentarse instrumentos o material de vidrio que no deben recibir
calor directo.
Reloj de laboratorio: Es un instrumento que se utiliza para medir el tiempo de todos los procesos y reacciones
que se verifican en el laboratorio. Pueden ser mecnicos o digitales.
Soporte para coloracin: Dispositivo en forma de U hecho de metal u otro material resistente, sobre el cual
se colocan las lminas portaobjetos que contienen extendidos fijados que van a ser sometidos a procesos de
coloracin.
Termmetro: es un instrumento que permite el registro permanente de la temperatura. Existe una gran variedad
de modelos, desde manuales hasta digitales.
Trpodes: Son instrumentos metlicos, hechos generalmente de hierro, provistos de un aro y tres patas que le
sirven de soporte. Se usan para sostener recipientes que van a ser sometidos a ebullicin. Por lo comn, se coloca
sobre el aro una rejilla metlica.
Actividad a Realizar
Proceda a identificar el material que se ha colocado sobre el mesn y relacinelo con su utilidad prctica.
23
Ejercicios de Auto-evaluacin
1.
2.
3.
4.
Defina Normas de Bioseguridad.

Explique la importancia del cumplimiento de las normas de bioseguridad en el Laboratorio de Bacteriologa.
Enumere diez normas de bioseguidad a cumplir en el Laboratorio de Bacteriologa.
Aparee los siguientes materiales y equipos de laboratorio con su correspondiente utilidad prctica.
Material y Equipo
Asa bacteriolgica _______
Placa de Petri ________
Estufa ______
Horno _______
Autoclave _______
Mechero de Bunsen _______
Pipetas _______
Lminas excavadas _______
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Utilidad Prctica
a) Estudio de los procesos de fermentacin
b) Preparacin de soluciones
c) Contener medios de cultivo
d) Verificar reacciones qumicas
e) Inoculacin de medios de cultivo
f) Esterilizacin de asas bacteriolgicas
g) Esterilizacin de materiales por vapor de agua a presin
h) Esterilizacin de cristalera
i) Instrumento utilizado para el contaje de colonias
j) Proveer temperaturas apropiadas para el crecimiento bacteriano
k) Transferir lquidos
l) Pesar medios de cultivo y reactivos
m) Observacin de la movilidad bacteriana

OBSERVACIN DE BACTERIAS Y OTROS MICROORGANISMOS IN VIVO
Objetivo especfico:
1. Observar la presencia de bacterias y otros microorganismos en diferentes tipos de muestras biolgicas.
Observacin de bacterias y otros microorganismos vivos provenientes de diferentes ambientes naturales:
agua, suelo, alimentos y otras muestras biolgicas
La Microbiologa se ocupa del estudio de organismos tan pequeos que no pueden observarse a simple
vista. Debido a la naturaleza de esta disciplina, el microscopio tiene una importancia crucial, ya que la mayor parte
de los conocimientos sobre los microorganismos han sido descubiertos con el uso del microscopio.
La primera persona que observ y describi los microorganismos fue el microscopista aficionado Anthony
Van Leeuwenhoek, quien con sus lentes cre una forma de iluminacin (campo oscuro) que permiti observar
claramente diferentes formas de vida microbiana.
Las bacterias fueron los primeros organismos vivos del planeta, viven prcticamente en cualquier
lugar donde la vida sea posible, se encuentran en mayor cantidad que otra clase de organismos, y constituyen
probablemente el componente mayoritario de la biomasa terrestre.
En este trabajo prctico, el estudiante examinar al microscopio, preparaciones realizadas con diversos
tipos de muestras con la finalidad de observar la gran cantidad de organismos vivos existentes en la naturaleza.
Materiales

Lminas portaobjeto

Laminillas cubreobjeto

Pipetas Pasteur

Asa en aro

Aplicadores de madera

Solucin salina fisiolgica (SSF)

Agua estril
Muestras

Diversos alimentos como: quesos no pasteurizados, jugos de frutas naturales, yogurt, entre otros.

Suelo.

Agua estancada.

Muestras clnicas: heces, orina, hisopado de piel, entre otras.
1. A cada grupo de estudiantes, se les asignar una de las muestras seleccionadas para el ejercicio prctico.
2. Con la muestra a observar, preparar una suspensin en SSF estril.
3. Colocar una gota de la suspensin en una lmina portaobjeto y cubrir con una laminilla. Alternativamente, la
suspensin de la muestra puede prepararse directamente sobre la lmina portaobjeto con ayuda del asa o un
aplicador de madera.
4. Observar la preparacin al microscopio, con objetivo seco de mayor aumento (40X).
5. Realizar anotaciones sobre lo observado en cada muestra. Reporte segn los siguientes criterios: abundante,
moderado, escaso o ausente.
6. Realice un dibujo de lo observado en cada muestra.
1. Indique cul muestra tiene mayor cantidad de microorganismos. Explique brevemente por qu.
2. De dnde provienen los microorganismos observados?
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EXAMEN AL FRESCO Y TCNICA DE LA GOTA PENDIENTE
1. Distinguir las bacterias de otros elementos presentes en un examen al fresco.
2. Ejecutar correctamente la tcnica de la gota pendiente para la observacin de la movilidad bacteriana.
3. Diferenciar entre movilidad verdadera y movimiento browniano en las bacterias.
Examen Microscpico
El examen microscpico es usualmente el primer paso para la identificacin de una bacteria desconocida.
Las bacterias pueden, tentativamente, ser colocadas en uno u otro grupo, cuando se han observado sus caractersticas
morfolgicas y sus reacciones tintoriales. Las caractersticas morfolgicas de importancia son:
a) Tamao
b) Forma
c) Agrupacin
d) Estructuras especiales:
Flagelos
Endosporas
Cpsula
Grnulos metacromticos
Existen dos formas en las cuales los microorganismos pueden ser examinados bajo un microscopio: En
estado vivo (in vivo) o en estado de fijacin (in vitro).
Observacin in vivo:
Este tipo de observacin puede hacerse necesaria cuando el microorganismo no es fcil de colorear o
cultivar o cuando se desea estudiar su morfologa no distorsionada por la fijacin.
Existen dos variantes:
1. Examen al fresco (montaje hmedo con SSF)
2. Tcnica de la Gota Pendiente.
1. Examen al Fresco:
Procedimiento
1. Colocar sobre una lmina portaobjeto limpia y libre de grasa, una asada de un cultivo puro en caldo
(utilizando para ello un asa en aro previamente esterilizada a la llama del mechero).
2. Cubrir con una laminilla y observar al microscopio ptico con objetivo de 40X, bajando el condensador para
disminuir la cantidad de luz permitida.
3. Si el examen al fresco se realiza a partir de un cultivo en medio slido, colocar una gota de SSF estril en una
lmina portaobjeto y resuspender en ella una colonia del cultivo, y repetir el procedimiento anterior.
Esta preparacin tambin puede ser examinada mediante microscopa de campo oscuro o de contraste de
fase. Adems, puede hacerse un examen al fresco a partir de muestras clnicas, tales como: orina, secrecin
vaginal, lquidos estriles entre otras; con la finalidad de observar si existen bacterias y otras estructuras (cilindros,
leucocitos, glbulos rojos).
2. Tcnica de la Gota Pendiente
Este mtodo se utiliza para la observacin de la movilidad de las bacterias aerbicas estrictas, por ejemplo:
los Bacilos Gram negativos no fermentadores de la Glucosa (BGNNF). Tiene la ventaja de eliminar la distorsin
ocasionada por el peso del cubreobjeto y se puede obtener un campo de foco ms profundo dentro de la gota.
26
Procedimiento:
1. Colocar, con ayuda de un aplicador de madera, una pequea cantidad de vaselina alrededor de una depresin de
la lmina excavada. (Alternativamente, puede agregarse la vaselina a la lmina cubreobjeto).
2. Colocar una suspensin de una colonia en SSF o una gota de un cultivo en caldo (4 a 6 horas de incubacin) en
un cubreobjeto. No mover la preparacin.
Figura 1: Preparacin de la suspensin bacteriana

Fuente: Johnson T, Case J. 2001
3. Colocar la lmina excavada sobre la laminilla de manera que la gota del cultivo quede en el centro de la
cavidad. Presionar ligeramente; pero de manera firme para que se fije.
Figura 2: Inversin de la lmina excavada sobre la laminilla cubreobjetos

4. Invertir rpidamente la preparacin de manera que la gota penda del cubreobjeto en la cmara.
5. Observar al microscopio ptico con objetivo seco de mayor aumento o con objetivo de inmersin para
evidenciar la movilidad; asegurndose de no confundir el movimiento browniano con la verdadera movilidad
que es mostrada por las bacterias que se desplazan en direcciones opuestas y llegan a cruzarse. El movimiento
browniano, es la constante vibracin de las bacterias en un punto fijo, comportamiento que se presenta por
estar suspendidas en medio lquido y por su pequeo tamao. Es un movimiento aleatorio derivado del empuje
de las molculas de agua alrededor de la bacteria.
Objetivo 40x
Lmina Excavada
Figura 3: Gota pendiente (Observacin al microscopio)

A cada grupo le ser suministrado un cultivo puro en caldo y agar. Realice un examen al fresco entre lmina
y laminilla y una movilidad por el mtodo de la gota pendiente. Observe detenidamente y registre los resultados.
27
Ejercicios de Auto-Evaluacin
1. Qu valor prctico tienen estas tcnicas?
2. Cmo puede distinguirse la movilidad verdadera del movimiento browniano de las bacterias?
3. Qu mtodos pueden utilizarse para determinar la movilidad de las bacterias en el laboratorio?
4. Cul es la ventaja que tiene el mtodo de la gota pendiente sobre el montaje hmedo?
5. Para qu se usa la vaselina en el mtodo de la gota pendiente?
6. Por qu son difciles de observar los microorganismos en montajes hmedos?
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UNIDAD II
MORFOLOGA Y ULTRA-ESTRUCTURA DE LA CLULA
BACTERIANA
Objetivos Terminales:
Reconocer la morfologa microscpica de las bacterias en preparaciones coloreadas.
Explicar los fundamentos y procedimientos de diferentes coloraciones.

TCNICAS DE COLORACIN. EXAMEN MICROSCPICO DE PREPARACIONES COLOREADAS
1.
2.
3.
4.
Interpretar los fundamentos de las coloraciones de uso ms frecuente en Bacteriologa.

Practicar las tcnicas de coloracin de uso frecuente en Bacteriologa.
Examinar al microscopio diversas preparaciones bacterianas.
Interpretar los resultados del examen microscpico de las coloraciones realizadas.
Colorantes
Debido a su elevada refringencia, la mayora de los microorganismos son visibles al microscopio ptico cuando
se examinan en vivo y en suspensin acuosa, pero este examen al fresco, importante para observar la movilidad
de las bacterias, no permite apreciar los detalles de su estructura. En general, son necesarios procedimientos de
tincin o coloracin para visualizar los microorganismos y demostrar los detalles finos de sus estructuras internas.
A tal fin, es necesario el empleo de sustancias colorantes.
Los colorantes son sustancias que, por procedimientos apropiados, tienen la capacidad de transmitir su
color a otros cuerpos. Generalmente, son sales de anilina que al disociarse originan iones cargados positiva y
negativamente. Uno de estos iones es el que imparte la propiedad cromgena y se denomina, entonces, cromforo.
El otro, se denomina auxocromo y es el que permite que el colorante se una a las fibras o tejidos.
En trminos amplios, de acuerdo con su comportamiento qumico, los colorantes se consideran cidos o
bsicos; lo cual no necesariamente indica su reaccin en solucin (pH); sino ms bien, si una parte significativa de
la molcula es aninica o catinica. Si el cromforo es el in positivo, el colorante se denomina bsico (catinico),
y si es el negativo, cido (aninico).
Las bacterias, a un pH 7,0; tienen una carga ligeramente negativa por ser ricas en cidos nuclicos, los cuales
poseen cargas negativas en forma de grupos fosfato, por lo tanto, cualquier colorante que vaya a ser utilizado
para teir este tipo de microorganismos, debe ser un colorante bsico, los cuales incluyen: cristal violeta (tambin
denominado violeta de genciana), azul de metileno, safranina, fucsina bsica y verde de malaquita, entre otros.
Los colorantes cidos, como la eosina, tinta china y nigrosina, son poco utilizados, debido a que su cromforo
(in negativo) repele las cargas negativas de la superficie bacteriana. Se usan generalmente, cuando se desea teir
estructuras citoplasmticas o efectuar tinciones negativas.
Coloraciones
El estudio de la forma y disposicin celular de los microorganismos se efecta a travs de preparaciones
coloreadas.
La introduccin de tinciones a mediados del siglo XIX representa, en gran medida, el fundamento de los
principales avances que se han producido en la Microbiologa durante los ltimos siglos. Hoy en da, se emplean
tanto, que es difcil comprender cmo pudo haber progresado el estudio de los microorganismos, antes de su
aplicacin rutinaria en el laboratorio.
Las tinciones consisten en aplicar soluciones acuosas o alcohlicas de colorantes a los microorganismos,
tejidos vegetales y animales, as como tambin otras sustancias de importancia biolgica. Colorear significa,
simplemente, teir los microorganismos para enfatizar ciertas estructuras.
Etapas del Proceso de Coloracin
En el proceso de coloracin se cumplen siempre las siguientes etapas:
1.-Preparacin del frotis o extendido.
2.-Fijacin del frotis o extendido.
3.-Aplicacin de colorantes o coloracin propiamente dicha.
1. Preparacin del Frotis o Extendido
Consiste en colocar el material a examinar sobre el portaobjeto. El extendido debe ser delgado, uniforme
y no llegar hasta los bordes de la lmina. Debe dejarse secar al aire.
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Tcnica de Preparacin:
1. Colocar una gota de SSF (0,85%) estril en el centro de un portaobjetos limpio y libre de grasa.
2. Con un asa, previamente esterilizada a la llama del mechero, tocar la superficie del crecimiento bacteriano
(colonia).
3. Resuspender la pequea cantidad de material retirado del cultivo, en la solucin salina. Utilizar el asa para
esto. Con la ayuda del asa, extender la suspensin bacteriana sobre un rea pequea del portaobjeto (1 cm.
aproximadamente).
Figura 4: Preparacin de un frotis o extendido

4. Esterilizar nuevamente el asa a la llama del mechero.

5. Permitir que el material se seque espontneamente al aire.
Figura 5: Secado del frotis

Si el frotis o extendido se va a preparar a partir de un cultivo en caldo: con asa en aro, colocar una o
dos gotas del caldo que contiene el microorganismo en la lmina portaobjeto. Extender con la misma asa. Los otros
pasos de la elaboracin son exactamente iguales al anterior.
2. Fijacin del Frotis o Extendido
La fijacin o segunda etapa de la coloracin se efecta con la finalidad de adherir los microorganismos al
portaobjeto de tal manera que no se desprendan durante los pasos subsiguientes de la coloracin. La fijacin del
frotis hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfologa
bacteriana y las posibles agrupaciones de clulas que pudiera haber. La fijacin puede hacerse por medio de
agentes fsicos como el calor moderado, que es el ms frecuentemente usado; o por agentes qumicos, entre los
que se encuentra el alcohol.
Figura 6: Fijacin del frotis a la llama del mechero

Fuente: Johnson T, Case J. 2001; modificado por Castellano, 2011
Tcnica de Fijacin por Calor: Una vez que el extendido se ha secado al aire, debe fijarse pasndolo ligeramente
varias veces (3 4) sobre la zona azul de la llama del mechero, con la cara del frotis mirando hacia arriba evitando
el sobrecalentamiento. Compruebe la temperatura alcanzada, colocando la cara limpia del portaobjeto sobre la
eminencia tenar de la mano (base del pulgar).
La temperatura alcanzada no debe ser superior a los 45C, la cual es tolerada adecuadamente por la piel del
operador. En la prctica, el frotis se debe calentar hasta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero sin
quemar.
32
Alternativamente, puede calentarse la preparacin en un dispositivo adecuado (plancha de calentamiento) a

60C por diez minutos para inactivar cualquier patgeno que pudiera estar presente.
Tcnica de Fijacin por Mtodos Qumicos: Una vez que el frotis se ha secado al aire, se procede a aplicar
alcohol (metanol al 95%), cubriendo completamente la lmina portaobjeto. Se deja actuar el alcohol por dos
minutos. Luego se escurre el exceso de alcohol y se deja secar al aire antes de proseguir con la coloracin.
4. Coloracin Propiamente dicha
Es la aplicacin del o los colorantes sobre el frotis ya fijado.
Figura 7: Aplicacin de colorantes (Tincin propiamente dicha)

Al aplicar colorantes cidos o bsicos, los microbilogos, usualmente emplean tres tcnicas diferentes de
coloracin:
Coloraciones simples.
Coloraciones diferenciales.
Coloraciones especiales.
Una coloracin simple es la que emplea nicamente un (1) colorante que se aplica al frotis en una sola
operacin. Su uso revela la morfologa y disposicin celular de las bacterias; sin embargo, no muestra detalles
finos de su estructura interna. El tiempo necesario para la coloracin vara con la dilucin del colorante. Una vez
teidos, los extendidos son lavados brevemente con agua para eliminar el exceso de colorante, secados al aire
o con papel secante y despus de ello, quedan listos para ser observados al microscopio ptico con objetivo de
inmersin (100X).
Las coloraciones simples ms utilizadas en bacteriologa son: azul de metileno, safranina, fucsina y violeta
de genciana.
Una coloracin diferencial es aquella que emplea dos ms colorantes juntos o separados, segn la tcnica
que se trate. Permite distinguir entre dos clases diferentes de microorganismos o entre dos partes diferentes de un
mismo organismo.
En frotis previamente elaborados y fijados, tpicamente, se utilizan cuatro componentes de manera progresiva:
colorante primario, mordiente, solucin decolorante y colorante de contraste.
El colorante primario, usualmente, tie del mismo color, todos los componentes celulares y microorganismos
presentes en el especimen. Ocasionalmente, se aade un qumico a la solucin para intensificar la tincin. Tal aditivo
se conoce como mordiente y su funcin es incrementar la afinidad del colorante por la muestra biolgica. Otra
funcin sera la de recubrir estructuras, por ejemplo, los flagelos, para hacerlos ms gruesos y fciles de visualizar
despus de teidos. Son ejemplos de mordientes: calor, lugol y fenol. Los agentes decolorantes, tpicamente,
son alcoholes y cidos. La remocin del colorante primario por accin del decolorante permite la tincin, con el
colorante de contraste, de las clulas que fueron decoloradas; as como tambin del fondo.
Esta segunda tincin diferencia entre tipos de bacterias, como por ejemplo, organismos violeta intenso y
rojizos vistos con la coloracin de Gram; o entre los microorganismos y el fondo, tales como los Bacilos cido
Resistentes (BAR) que se tien de rojo sobre un fondo azul.
Las dos coloraciones diferenciales ms utilizadas en bacteriologa, son sin lugar a dudas, la coloracin de
Gram y la coloracin de Ziehl-Neelsen.
Una coloracin especial o estructural es una coloracin diferencial que, como su nombre lo indica,
permite colorear, de manera particular, estructuras especiales de la clula bacteriana, como por ejemplo: cpsula,
33
flagelos, endosporas, grnulos metacromticos y otros constituyentes intracelulares de las clulas bacterianas.
Tcnicas de Coloracin
Coloracin de Gram
La tincin de Gram, descrita en 1.884 por Hans Christian Gram, se usa con mucha frecuencia para el
examen microscpico directo de muestras y subcultivos.
Fundamento: Aunque se han propuesto varias explicaciones sobre el fundamento de la coloracin de Gram,
parece probable que las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares sea la causa de la distinta
reaccin de las bacterias Gram positivas y Gram negativas a la coloracin.
La pared de la clula grampositiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglucano
as como una pequea cantidad de cidos teicoicos. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula grampositiva
es peptidoglucano. La pared de la clula gramnegativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada,
nicamente de peptidoglucano y una membrana externa compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y
lipoprotenas. Slo 10%-20% de la pared de la clula gramnegativa es peptidoglucano.
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal violeta
(otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este
estado, todas las clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, quedarn teidas de violeta.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo es
aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en
agua con el cristal violeta. De nuevo, tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas, se encuentran en la
misma situacin y aparecen de color violeta.
Una vez eliminado el exceso de mordiente a travs del lavado con agua de chorro, se lleva a cabo la
decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta.
Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen.
La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin;
esta resistencia se debe probablemente al hecho que en el caso de las bacterias gramnegativas, la mezcla de alcohol/
acetona constituye un solvente lipdico y la solubilidad de los lpidos en el alcohol permite que el decolorante
extraiga el complejo cristal violetayodo del interior celular sin que la pared celular constituya una barrera
impermeable. La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el complejo cristal violeta-yodo, por tanto,
en ese momento, sale el cristal violeta del interior de la bacteria y la clula se decolora.
Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglucano
y menos lpidos), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros,
disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el complejo cristal violeta-yodo quede atrapado
dentro de la pared celular; por lo que despus de la decoloracin permanecen de color violeta.
Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente
es un colorante de color rojo, como la safranina; aunque tambin puede usarse la fucsina bsica, en algunas
modificaciones de la tincin original. Despus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son de color
rojo-rosado; mientras que las grampositivas permanecen violetas (Lmina 1).
No obstante, ninguna composicin qumica exclusiva de la pared bacteriana parece explicar la coloracin
con Gram; ya que las gruesas paredes de las clulas de levaduras, que tambin se tien como grampositivas, tienen
una composicin qumica y una estructura diferente de las bacterias grampositivas.
Colorantes de Gram (Modificacin de Hucker)
1. Colorante primario: Cristal violeta Solucin Madre
Cristal violeta (85%).....................................................................................20,00 g
Etanol (95%).............................................................................................100,00 ml
Solucin Madre de Oxalato
Oxalato de Amonio.........................................................................................1,00 g
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Agua Destilada.........................................................................................100,00 ml
Solucin de Trabajo: Diluir la solucin madre de cristal violeta 1:10 con agua destilada y mezclar con 4
volmenes de la solucin madre de oxalato. Conservar en una botella con tapn de vidrio.
2. Mordiente: Solucin de Iodo de Gram
Cristales de yodo............................................................................................1,00 g
Ioduro de Potasio............................................................................................2,00 g
Disolver completamente en 5 ml de agua destilada, luego agregar:
Agua destilada..........................................................................................240,00 ml
Bicarbonato de sodio, solucin acuosa al 5%............................................60,00 ml
Mezclar y conservar en una botella de vidrio color mbar.
3. Solucin Decolorante: AlcoholAcetona
Acetona.....................................................................................................250,00 ml
Etanol (95%).............................................................................................250,00 ml
Mezclar y conservar en una botella con tapn de vidrio.
4. Colorante de Contraste: Safranina
Safranina O.....................................................................................................2,50 g
Etanol (95%).............................................................................................100,00 ml
Solucin de Trabajo:
Diluir la solucin madre 1:5 1:10 con agua destilada. Conservar en una botella con tapn de vidrio.
Tcnica de la Coloracin de Gram
Previamente, se debe elaborar un frotis y fjar al calor. Colocar la lmina que contiene el extendido sobre
un soporte para coloracin a fin de mantenerlo en posicin horizontal. Proceder entonces a:
1. Cubrir la lmina con cristal violeta. Dejar actuar por un minuto. Lavar con agua corriente.
2. Cubrir la lmina con lugol. Dejar actuar por un minuto. Lavar con agua corriente.
3. Sobre la lmina, dejar correr el decolorante orgnico (alcohol-acetona) hasta que la solucin de lavado no salga
teida con el colorante violeta. Si lo prefiere, puede mantener la lmina sujeta entre el dedo pulgar e ndice y
colocarla de manera que se obtenga un ngulo de 45. Por lo general, el tiempo requerido para la decoloracin
oscila entre 10-20 segundos. Lavar de nuevo con agua corriente.
4. Cubrir el frotis con una solucin de safranina. Dejar actuar por 30 segundos. Lavar con agua corriente.
5. Colocar la lmina con el frotis en posicin vertical para escurrir el exceso de agua y permitir que seque
espontneamente al aire. En su defecto, se puede emplear papel secante, teniendo cuidado de no arrastrar la
preparacin.
6. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin y observar al microscopio con objetivo de 100X
y ocular de 10X, lo cual resulta en un aumento total de 1.000X.
Interpretacin
Esta coloracin diferencial permite observar la morfologa, disposicin y afinidad tintorial de las clulas
bacterianas. Basados en la coloracin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grandes grupos: bacterias
Gram positivas, que se tien con el cristal violeta y aparecen de color violeta intenso y, Gram negativas, las que
se tien con la safranina y aparecen de color rojo-rosado (Lminas 2 a la 9).
Algunas bacterias no pueden clasificarse mediante la tincin de Gram; ya sea por su difcil tincin o
porque carecen de pared celular. Los micoplasmas carecen de pared celular y por lo tanto, no son susceptibles a
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la tincin por el procedimiento de Gram (no reactivas a la coloracin). Por otra parte, las micobacterias son muy
difciles de teir porque sus envolturas celulares contienen grandes cantidades de ceras, por lo que requieren el
uso de otras coloraciones diferenciales como la de Ziehl-Neelsen, por ejemplo. Existen microorganismos que se
tien indiferentemente como Gram positivos o Gram negativos y son denominados Gram variables. Se cree que
son bacterias que han perdido la habilidad de reaccionar en forma diferencial a esta coloracin. Esto generalmente
sucede en cultivos viejos (con ms de 48 horas de incubacin). Se asume que este fenmeno ocurre debido a
modificaciones en la pared celular provocadas por la edad del cultivo. En consecuencia, se recomienda que los
frotis sean elaborados a partir de cultivos de no ms de 24 horas de incubacin.
Forma de reportar:
1. Morfologa:

Bacilos

Cocos

Cocobacilos
2. Afinidad Tintorial:
Gram positivos
Gram negativos
3. Disposicin: la agrupacin o disposicin de las clulas bacterianas depende de los planos en que ocurre
la divisin celular y la tendencia de las clulas hijas a permanecer unidas. En los cocos, constituye una
caracterstica de importancia en la orientacin de la identificacin en el laboratorio. Pueden observarse las
siguientes disposiciones:
Cocos aislados
Cocos en pares
Cocos en cadenas
Cocos en tetradas (grupos de cuatro)
Cocos en sarcinas (grupos de ocho)
Cocos en racimos
Los bacilos se dividen solamente a travs de su eje ms corto, de forma que hay menos agrupamientos de
bacilos que de cocos. Pueden aparecer en pares o en cadenas tras la divisin. Ciertas especies bacterianas, como
Corynebacterium diphtheriae presentan una disposicin caracterstica en forma de empalizadas y letras chinas.
Algunos bacilos tienen el aspecto de cilindros, otros poseen extremos afilados (fusiformes) y algunos son curvos
(en forma de comas); sin embargo, la mayora de los bacilos se presentan de forma aislada.
Limitaciones
La coloracin de Gram no permite identificar especficamente ciertas estructuras bacterianas, tales como: la
cpsula, los flagelos, las esporas y los grnulos metacromticos; as como tampoco proporciona buenos resultados
en la investigacin de micobacterias y hongos, salvo en el caso de algunas especies de levaduras.
Estas limitaciones no son absolutas y como ya se ha demostrado, en ocasiones pueden observarse la
cpsula o las esporas (aunque no sean teidas en forma especfica). Por otra parte, las micobacterias, pueden ser
vistas como bacilos Gram positivos; pero se hace necesario realizar la coloracin de Ziehl-Neelsen o de Kinyoun
para demostrar su carcter cido-resistente.
Finalmente, es conveniente destacar que existen numerosas modificaciones de las frmulas de las
soluciones utilizadas en la tcnica de coloracin e incluso, del tiempo empleado en cada uno de los pasos sealados.
Realmente, lo importante es el empleo de un procedimiento similar en cada laboratorio para evitar variaciones en
los resultados.
Elabore un frotis con cada uno de los microorganismos que le suministre su profesor. Fjelos y colorelos
segn la tcnica de Gram, obsrvelos al microscopio con objetivo de inmersin. Anote los resultados y elabore los
grficos correspondientes.
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Coloracin de Ziehl-Neelsen
Fundamento
Las paredes celulares de ciertos gneros bacterianos clnicamente importantes, como: Nocardia y
Mycobacterium que incluye el agente causal de la tuberculosis (M. tuberculosis) y la lepra (M. leprae) contienen
una elevada concentracin de ceras en forma de cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos
de carbono). Esta gruesa capa de lpidos los provee de una cubierta casi impenetrable, que hace que la clula
sea difcil de colorear. Sin embargo, una vez teidos con colorantes bsicos, poseen la propiedad de resistir la
decoloracin con cidos minerales o alcohol cido. Por este motivo, a estos microorganismos se les denomina
Bacilos cido Resistentes (BAR), un fenmeno descubierto por Ziehl y Neelsen en 1.882.
Es necesario un tratamiento especial para que el colorante primario, fucsina fenicada, atraviese el material
creo de los bacilos cido resistentes. En la tcnica convencional de Ziehl-Neelsen se usa calor (coloracin en
caliente). La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared
bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, se provoca una nueva solidificacin
de los cidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento
aumenta la energa cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. El
decolorante consiste en una mezcla de alcohol y cido, la cual es capaz de remover completamente el color rojo
de la fucsina de todos los organismos, excepto de los BAR. El empleo de una coloracin de contraste con azul
de metileno tie de azul todo lo que no sea resistente al cido; mientras que los BAR permanecen rojos (Lmina
10).
La modificacin de Kinyoun se denomina mtodo en fro porque utiliza un detergente activo de superficie,
como tergitol, en lugar de calor. Utiliza un decolorante ms dbil (0,5-1% de H2SO4) en lugar de alcohol-cido al
3%. Esto ayuda a diferenciar entre organismos que son dbiles o parcialmente cido-resistentes, particularmente,
Nocardia sp., cualquiera de los dos mtodos es satisfactorio.
La cubierta crea de estas bacterias presenta adems un problema adicional, y es que las clulas tienden a
adherirse unas a otras y formar agregados en los frotis, en vez de extenderse uniformemente.
Colorantes de Ziehl-Neelsen
1. Colorante primario: Fucsina fenicada de Ziehl
Solucin I:
Fucsina Bsica (Acetato de pararrosanilina)..................................................0,30 g
Etanol (95%)...............................................................................................10,00 ml
Disolver y agregar:
Solucin II:
Fenol, cristales.................................................................................5,00 ml 5,00g
Agua destilada............................................................................................95,00 ml
Solucin de Trabajo:
Mezclar las dos soluciones (I y II). Dejar en reposo por varios das antes de usar. Guardar en frasco mbar.
Filtrar antes de usar.
2. Solucin Decolorante: Alcohol-cido
Etanol (95%)...............................................................................................97,00 ml
HCl concentrado...........................................................................................3,00 ml
Mezclar y conservar en un frasco mbar.
3. Colorante de Contraste: Azul de Metileno
Azul de metileno.............................................................................................0,30 g
Disolver el colorante en el agua. Guardar en frasco mbar.
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Tcnica
1. Elaborar un frotis a partir de un cultivo puro de M. tuberculosis. (Usar portaobjetos nuevos y libres de grasa).
2. Fijar el frotis, utilizando para ello, una plancha de calentamiento (60C) durante 10 minutos como mnimo; y
dos horas, como mximo.
3. Aplicar un papel de filtro sobre el portaobjetos con el frotis y colocar la lmina sobre un soporte de metal para
la coloracin.
4. Cubrir la preparacin con la fucsina fenicada (colorante primario), calentando a la llama de un mechero por
debajo de la lmina (durante 5 a 10 minutos) hasta obtener la emisin de vapor (3 veces). El calor acta como
mordiente. Evite que la lmina se seque, agregando ms colorante si es necesario.
5. Retirar el papel de filtro (con ayuda de una pinza) y lavar el portaobjetos con agua hasta que el colorante deje
de salir. Sacudir el exceso de lquido.
6. Cubrir el portaobjetos con solucin decolorante (alcohol-cido) durante 1 minuto aproximadamente. Comprobar
que no se desprende ms color rojo al escurrir el portaobjetos. Decolorar hasta que apenas quede una traza de
color rosado.
7. Lavar con agua y eliminar el exceso.
8. Cubrir la lmina con el colorante de contraste (azul de metileno) y dejar en contacto por 1 2 minutos.
9. Lavar con agua corriente. Escurrir y dejar secar al aire. No secar con papel absorbente.
10. Observar al microscopio ptico con objetivo de inmersin (100X).
Interpretacin
Los microorganismos cido-resistentes aparecern de color rojo intenso; mientras que otros elementos
celulares y bacterias no cido resistentes, se tien de azul con el colorante de contraste. Las micobacterias,
frecuentemente, aparecen como bacilos ligeramente curvos que muestran la propiedad de cido-resistencia (BAR).
Pueden presentar grnulos ms oscuros y dar la impresin de estar fragmentados (Lmina 11).
Coloree los frotis de M. tuberculosis que le han sido entregados y dibuje lo observado. (Debido a la
elevada patogenicidad de este microorganismo, los frotis, les sern suministrados ya fijados).
Coloracin de Grnulos Metacromticos (Azul de Metileno de Leffler)
Los grnulos metacromticos (volutina), son acmulos intracitoplasmticos, formados principalmente
por polifosfatos, que desempean un importante papel en el metabolismo bacteriano. Al parecer, los polifosfatos
proporcionan el fsforo y la energa requerida para la sntesis de los cidos nuclicos.
La volutina tiene una notable afinidad por los colorantes bsicos (azul de toluidina o azul de metileno), y con
frecuencia se presenta con un color distinto o ms intenso que el del colorante aplicado. Por su capacidad de teirse
metacromticamente, se denominan grnulos metacromticos.
Colorantes
Azul de Metileno de Leffler
Azul de metileno...............................................................................................0,3 g
Etanol (95%)...............................................................................................30,00 ml
Una vez disuelto, agregar:
Agua destilada......................................................................................... 100,00 ml
Guardar bien tapado en frasco de vidrio.
Tcnica
1. Elaborar un frotis de un cultivo de Corynebacterium diphtheriae en medio de Leffler.
2. Dejar secar al aire. Fijar el frotis a la llama del mechero.
3. Cubrir la lmina con una solucin alcohlica de azul de metileno. Dejar actuar por cinco (5) minutos.
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4. Lavar la preparacin con agua corriente. Escurrir la lmina y dejar secar al aire.
5. Observar la preparacin con objetivo de inmersin (100X).
Interpretacin
Esta es una coloracin simple en la que los grnulos metacromticos aparecen de color azul intenso y el
resto de la bacteria de color azul claro (Lmina 12).
Coloracin de Albert
Otra coloracin que puede utilizarse para colorear grnulos metacromticos es la coloracin de Albert.
1. Solucin I:
Azul de Toluidina O.........................................................................................1,5 g
Verder de malaquita o Verde de metilo.............................................................2,0 g
Etanol (95%).................................................................................................20,0 ml
cido Actico Glacial...................................................................................10,0 ml
Agua Destilada.......................................................................................... 970,0 ml
Disolver los colorantes en el alcohol y luego agregar el agua destilada conteniendo el cido actico glacial.
Dejar madurar por 24 horas y luego filtrar. Guardar en frasco mbar.
2. Solucin II:
Yodo................................................................................................................6,66 g
Ioduro de Potasio............................................................................................10,0 g
Agua destilada........................................................................................ 1.000,0 ml
Disolver el yodo y el ioduro de potasio en el agua destilada.
Tcnica
1. Preparar y fijar el frotis o extendido.
2. Cubrir el portaobjeto con el azul de toluidina-verde de metilo. Dejar actuar por 10 minutos.
3. Lavar con agua corriente. Escurrir.
4. Aplicar la solucin II (Iodo). Dejar actuar por 5 minutos.
5. Lavar con agua corriente.
6. Secar con papel absorbente o dejar secar al aire.
7. Observar con objetivo de inmersin.
Interpretacin
Esta es una coloracin estructural que tie los grnulos metacromticos de color azul oscuro y el citoplasma
bacteriano, de verde claro (Lmina 13).
A cada grupo le sern entregados frotis de un cultivo de C. diphtheriae. Colorelos segn la tcnica de
Leffler y de Albert y observe los grnulos metacromticos. Registre sus resultados.
Coloracin de Cpsula
La virulencia de los microorganismos patgenos, a menudo se correlaciona con la produccin de cpsula.
Por ejemplo, las cepas virulentas de Streptococcus pneumoniae y Klebsiella sp. producen abundantes polmeros
capsulares que protegen a la bacteria de la fagocitosis. La prdida, por mutacin, de la capacidad de formar una
cpsula, se asocia con la prdida de la virulencia y el aumento de la facilidad de destruccin por los fagocitos; pero
no afecta la viabilidad. Es decir, que las cpsulas son prescindibles, al igual que otros apndices bacterianos.
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Las cpsulas son estructuras mucilaginosas extracelulares que rodean a algunas bacterias. Se cree que
todas las bacterias poseen ms o menos un material capsular, fcilmente demostrable cuando son teidas de forma
adecuada. La mayora de las cpsulas estn formadas por polisacridos.
Las cpsulas son difciles de colorear y adems, son fcilmente destruidas o disueltas. Se utilizan dos
mtodos para visualizarlas al microscopio de luz: Las coloraciones de Anthony o Hiss, que utilizan cristal violeta
o fucsina bsica, para teir la clula, y una sal de cobre que es depositada en la parte exterior de la cpsula. Otro
mtodo consiste en el empleo de una coloracin negativa, con la cual, las clulas quedan suspendidas en tinta
china o nigrosina, que va a teir el medio que las rodea, pero no las clulas, dejndolas incoloras.
Coloracin de Hiss
Colorantes de Hiss
1.-Cristal Violeta:
Cristal violeta..................................................................................................1,00 g
Disolver el cristal violeta en el agua destilada. Mezclar bien y conservar en frasco mbar.
Alternativamente, puede utilizarse una solucin acuosa de fucsina al 0,5%.
2.- Sulfato de Cobre (20 %):
CuSO4 5 H2O............................................................................................. 200,00 g
Disolver completamente el sulfato de cobre en el agua destilada. Conservar en frasco mbar.
Tcnica
1. Preparar una suspensin bacteriana en SSF, a partir de un cultivo puro de Klebsiella pneumoniae.
2. Preparar un extendido, mezclando una asada de la suspensin bacteriana con una gota de suero normal sobre
un portaobjetos limpio y libre de grasa. Dejar secar al aire y fijar por calor.
3. Cubrir el extendido con cristal violeta. Calentar hasta desprendimiento de vapores durante un minuto
aproximadamente.
4. Enjuagar con sulfato de cobre. Nunca con agua.
5. Escurrir la lmina y dejar secar al aire en posicin vertical.
6. Examinar la preparacin con objetivo de inmersin (100X).
Interpretacin
Las cpsulas aparecern como un rea de color violeta claro alrededor de la clula bacteriana que toma un
color violeta intenso (Lmina 14).
Coloracin de Hiss Modificada por Anthony
Esta coloracin utiliza los mismos colorantes que la coloracin de Hiss, slo que la tcnica ha sido
ligeramente modificada.
Colorantes de Anthony
1.-Cristal Violeta:
Cristal violeta..................................................................................................1,00 g
Disolver el cristal violeta en el agua destilada. Mezclar bien y conservar en frasco mbar.
2.- Sulfato de Cobre (20 %):
CuSO4 5 H2O .............................................................................................200,00 g
Disolver completamente el sulfato de cobre en el agua destilada. Conservar en frasco mbar.
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Tcnica
1. Elaborar un extendido delgado en una lmina portaobjeto, a partir de un cultivo puro de Klebsiella pneumoniae
en leche descremada. Dejar secar al aire. No fijar con calor.
2. Cubrir la preparacin con una solucin acuosa de cristal violeta (1%). Dejar actuar por 2 minutos.
3. Lavar la preparacin con una solucin de sulfato de cobre al 20%.
4. Escurrir la lmina y dejar secar al aire en posicin vertical.
5. Examinar la preparacin con objetivo de inmersin (100X).
Interpretacin
Las cpsulas aparecern como un rea de color violeta claro, alrededor de las bacterias que se tien
intensamente. Si se utiliza fucsina, las cpsulas aparecern como un halo rosado claro alrededor de las bacterias
que se tien de color rojo intenso (Lmina 15).
Coloracin Negativa o por Contraste
La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero
se colorea en cambio el medio que las rodea. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco
que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china
(que es una suspensin de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua).
La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero
su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.
Tcnica
1. Colocar una pequea gota de SSF sobre un portaobjetos limpio y agregar una cantidad muy pequea de un
cultivo joven.
2. Mezclar bien y luego agregar una pequea gota de tinta china y cubrir inmediatamente con un cubreobjetos
delgado dejando que la gota se extienda como una pelcula fina debajo del mismo.
3. Examinar inmediatamente con objetivo de inmersin y bajando el condensador para reducir la luz en forma
marcada.
Interpretacin
Las cpsulas se observan como halos claros contra un fondo oscuro (Lmina 16).
Elabore convenientemente, varios frotis de K. pneumoniae y aplique las tcnicas de coloracin para la
cpsula. Obsrvelos al microscopio y registre los resultados.
Coloracin de Flagelos
Muchas bacterias mviles poseen flagelos, cuya forma, nmero y disposicin son caractersticas importantes
para la diferenciacin de especies, en particular, cuando las reacciones bioqumicas son dbiles o equvocas.
La coloracin de flagelos no es fcil, es un arte que debe desarrollarse con la experiencia. Los flagelos
son muy frgiles y tienden a desprenderse de la superficie bacteriana durante la manipulacin. Muchas clulas en
cultivo pueden no producir flagelos y la tincin a veces, fracasa.
Coloracin de Leifson
En los laboratorios clnicos es ms comn que se emplee la tcnica de Tincin de Leifson (o una
modificacin) y no es difcil de llevar a cabo, siempre y cuando se sigan los detalles exactos en cada paso del
procedimiento.
Fundamento
Los flagelos bacterianos pueden teirse por medio de soluciones alcohlicas de colorantes de rosanilina
que forman un precipitado a medida que el alcohol se evapora en el procedimiento de tincin. La fucsina bsica
(acetato de pararrosanilina) sirve como tincin primaria, con el agregado de cido tnico a la solucin como
mordiente. Puede usarse una contra-tincin, como azul de metileno, para visualizar mejor las bacterias; en casos
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en que la tincin primaria resulta dbil.

Colorantes de Leifson
1. Solucin A: Fucsina Bsica al 1,2% en Alcohol al 95%.
Fucsina bsica (certificada para tincin)........................................................6,00 g
Alcohol etlico (95%).................................................................................50,00 ml
Agregar a la fucsina, el alcohol y agitar 1824 horas con un agitador magntico para disolver la fucsina.
2. Solucin B: cido Tnico al 3% en solucin acuosa
Cloruro de sodio.............................................................................................0,37 g
cido tnico....................................................................................................0,75 g
La suspensin debe tener color amarillo claro para ser satisfactoria. Se agrega fenol con una concentracin
1:200 para evitar la aparicin de mohos durante el almacenamiento.
Mezclar cuidadosamente las soluciones A y B. Ajustar el pH con NaOH 1,0 N. Envasar el colorante en un
frasco mbar, bien tapado y dejar durante tres das en el refrigerador (4C) antes de usar, para estabilizar.
El colorante de Leifson puede conservarse durante un mes en refrigeracin y un ao o ms en congelacin.
A temperatura ambiente se deteriora rpidamente.
Para el proceso de tincin usar slo el sobrenadante claro, no agitar el sedimento que se deposita en
el fondo de la botella. Antes de usar, retirar un pequeo volumen de la solucin colorante y dejar que alcance
temperatura ambiente. Descartar la fraccin de colorante que pueda sobrar luego de la tincin.
Tcnica
1. Usando un cultivo joven en un medio de agar libre de carbohidratos, preparar una suspensin bacteriana
equivalente al tubo 5 del nefelmetro de McFarland. (Utilizar agua destilada o desionizada estril).
2. Colocar dos gotas de la suspensin bacteriana en el extremo de un portaobjetos, previamente tratado con una
solucin cida. Se deja secar al aire. Con un lpiz graso, trazar una lnea perpendicular en la superficie de vidrio
hacia el extremo opuesto a la suspensin seca.
3. Colocar el portaobjeto sobre una rejilla inclinada y cubrir la preparacin con una delgada pelcula del colorante.
La marca hecha con el lpiz graso, impide que el colorante se corra del extremo de la lmina.
4. Teir durante 5 a 15 minutos, dejando que se forme un precipitado a medida que se evapora el alcohol. El
tiempo de coloracin disminuye si el colorante es fresco, si la temperatura ambiente es alta, si hay corrientes
de aire en el laboratorio y si la capa de colorante es delgada. Las condiciones opuestas incrementan el tiempo
de tincin.
5. Cuando se forma un precipitado, enjuagar suavemente con agua destilada, escurrir el exceso de agua y se deja
secar al aire.
6. Observar al microscopio con objetivo de inmersin.
Interpretacin
Deben observarse flagelos de color rojo a azul-negro (Lmina 17a).
Nota: Los portaobjetos utilizados para esta coloracin deben ser sumergidos en solucin de HCl concentrado
(3%) en alcohol etlico (95%) durante 4 das. Lavar con agua corriente (dejar correr el agua sobre las lminas,
previamente colocadas en una jarra de Coplin durante 10 minutos) y luego, enjuagar con varios cambios de agua
destilada. Colocar los portaobjetos en posicin vertical para que se sequen al aire. Inmediatamente antes de usarlos,
pselos por la llama del mechero.
Coloracin de Ryu
Para la observacin de los flagelos, tambin se aconseja el uso de la tincin de Ryu. que es fcil de llevar
a cabo y da buenos resultados.
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Colorantes de Ryu
Solucin I:
Fenol al 5%.................................................................................................10,00 ml
cido tnico en polvo.....................................................................................2,00 g
Sulfato de potasio y aluminio saturado con 12 H2O...................................10,00 ml
Solucin II:
Cristal violeta................................................................................................12,00 g
Alcohol etlico (95%)...............................................................................100,00 ml
Esta es una solucin saturada. Se mezclan 10 partes de la solucin I (mordiente) con una parte de la solucin II y se almacena en un frasco plstico a temperatura ambiente.
Procedimiento:
1. Colocar dos gotas de SSF hacia un extremo de un portaobjetos escrupulosamente limpio.
2. Preparar el frotis tomando parte de un cultivo joven en un medio libre de carbohidratos (agar nutritivo), tocando
suavemente el centro de cada una de las dos gotas de SSF previamente colocadas. Dejar secar las gotas a
temperatura ambiente.
3. Cubrir los frotis ya secos con la solucin colorante durante 1 a 5 minutos (pueden ser necesarias algunas pruebas
para determinar el tiempo que produce la mejor coloracin de los flagelos). Quitar el exceso de colorante con
agua.
4. Una vez que los frotis se han secado, examinar con el objetivo de inmersin del microscopio ptico, comenzando
desde la periferia hacia el centro.
Interpretacin
Las bacterias y sus flagelos se tien de color violeta (Lmina 17b).
A cada grupo le ser entregado un cultivo bacteriano en agar nutritivo. Proceda a efectuar la coloracin de
flagelos y registre sus resultados.
Coloracin de Esporas
Dos gneros bacterianos, Clostridium y Bacillus se caracterizan por producir esporas. Estas constituyen
formas de resistencia ms no son estructuras de reproduccin como en los hongos.
Pueden tener una localizacin variable en la clula bacteriana y estar colocadas en el centro, en la parte
terminal o sub-terminal de la bacteria. Su contenido hdrico es sumamente bajo; por lo tanto, resisten condiciones
de deshidratacin que destruyen a las clulas vegetativas. Contienen cido dipicolnico y calcio, los cuales son, al
parecer, los responsables de la termo-resistencia de la espora.
Las esporas son impermeables a los colorantes, y as, pueden ser vistas ocasionalmente, como reas
incoloras en preparaciones teidas con Gram. Debido a la poca permeabilidad de la espora es necesario utilizar
colorantes muy concentrados; as como la aplicacin de calor que facilite su penetracin; pero una vez teidas son
muy difciles de decolorar, propiedad que se utiliza para poder demostrar su presencia.
Coloracin de Wirtz-Conklin modificada por Shaeffler-Foulton
Colorantes
1. Verde de Malaquita
Verde de malaquita.......................................................................................10,00 g
Disolver el verde de malaquita en agua destilada.
43
2. Safranina
Safranina.........................................................................................................0,25 g
Disolver la safranina en el agua destilada.
Tcnica:
1. Colocar un frotis seco, sobre un soporte para coloracin, someter a calentamiento sobre un vaso de precipitado
conteniendo agua hirviente (Alternativamente, puede colocarse la lmina sobre un soporte para coloracin
y utilizar un mechero). Permitir que el agua de condensacin forme gotas en el reverso de la lmina. (Es
importante no fijar el frotis antes, ya que el vapor facilita la penetracin del colorante. La fijacin de la espora
previa a la tincin, no permite la accin del vapor).
2. Colocar un papel de filtro sobre la lmina y cubrir con verde de malaquita.
3. Calentar hasta desprendimiento de vapores durante 45 minutos. Agregar ms colorante para evitar que se seque
la preparacin.
4. Dejar enfriar y lavar con agua corriente.
5. Colorear con safranina durante un minuto.
6. Lavar, dejar secar al aire y examinar con objetivo de inmersin.
Interpretacin
Las esporas se observan de color verde (debido a su tincin con el verde de malaquita) y los bacilos, de
color rojo (debido a su tincin con safranina) (Lmina 18).
Coloracin de Dorner (Modificada)
Colorantes de Dorner
1. Fucsina fenicada
Fucsina Bsica..................................................................................................4,00 g
Etanol (95%).................................................................................................20,00 ml
Fenol, cristales fundidos.................................................................................5,00 ml
Agua destilada.............................................................................................100,00 ml
Disolver la fucsina bsica en el alcohol y agregar lentamente el agua mientras se agita. Agregar el fenol a
la solucin de fucsina.
2. Nigrosina
Nigrosina.......................................................................................................10,00 ml
Agua destilada.............................................................................................100,00 ml
Diluir la nigrosina para obtener una solucin al 10%, calentar hasta ebullicin y filtrar.
Tcnica
1. En un tubo de ensayo que contiene SSF, preparar una suspensin concentrada del microorganismo y agregar un
volumen igual de fucsina fenicada recientemente filtrada.
2. Colocar el tubo en un bao con agua en ebullicin durante 5-10 min.
3. Sobre un portaobjetos limpio, mezclar una gota de la suspensin anterior con una gota de solucin de
nigrosina.
4. Extender y secar rpidamente con calor suave.
5. Examinar con objetivo de inmersin.
44
Interpretacin
oscuro.
Las esporas se tien de color rojo y las clulas bacterianas aparecen casi incoloras contra un fondo gris
Elabore un frotis de un microorganismo esporulado y colorelo, segn las tcnicas descritas. Obsrvelos
al microscopio y registre sus observaciones.
1. Complete los siguientes enunciados:
a) Una suspensin bacteriana hecha sobre una lmina portaobjeto se denomina______________.
b) La coloracin de Gram es un ejemplo de una coloracin______________.
c) Las esporas usualmente aparecen_______________ en preparaciones coloreadas con Gram.
d) Las reacciones a la coloracin de Gram son confiables slo para cultivos de _________ horas o menos.
e) El paso ms crtico en la tincin de Gram es _______________________.
f)
La coloracin de Ziehl Neelsen se utiliza para identificar___________.
2.Por qu un organismo Gram positivo puede aparecer como Gram negativo?.

3.Puede agregarse el lugol antes que el colorante primario en la coloracin de Gram?Por qu?.
4.Por qu se utiliza sulfato de cobre para lavar durante la coloracin de cpsula y no agua?.
5.Qu tipo de medio de cultivo debe utilizarse para incrementar el tamao de la cpsula?.
6. Qu importancia tienen los grnulos metacromticos en la prctica clnica?
7. Seale las diferencias existentes entre las coloraciones para grnulos metacromticos.
8.Por qu los medios donde crecen bacterias para realizar coloracin de flagelos deben estar libres de
carbohidratos?.
9. Qu utilidad tiene el cido tnico en la coloracin de flagelos?.
10.En la siguiente tabla, liste los pasos de la coloracin de Gram, en orden, e indique el color de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas despus de cada paso.
Paso
Reactivo
Apariencia
Gram positiva
Gram negativa
1
2
3
4
5
6
7
8
45
11.En la siguiente tabla, liste en orden, los cambios en los BAR y no BAR durante cada paso de la coloracin de
Ziehl-Neelsen.
Paso
Reactivo
Apariencia
BAR
No BAR
1
2
3
4
5
6
7
12.Complete la siguiente tabla mostrando los cambios en bacterias esporuladas y no esporuladas en cada paso de
la coloracin de Wirtz-Conklin (modificada por Schaeffler y Foulton).
Paso
1
2
3
4
5
46
Qumico
Esporas
Apariencia
Clulas vegetativas
LAMINERO PRCTICA 2.1: COLORACIONES
LAMINERO PRCTICA 2.1: COLORACIONES

COLORACIN DE GRAM
Lmina 1: Etapas de la Coloracin de Gram

Digitalizacin
Lmina 3: Bacilos Gram positivos en empalizadas y letras

chinas (Corynebacterium sp)
Digitalizacin
Lmina 5: Cocos Gram positivos en racimos (S. aureus)

Digitalizacin
Lmina 2: Bacilos Gram positivos (Bacillus sp.)

Digitalizacin
Lmina 4: Bacilos Gram negativos (E. coli)

Digitalizacin
Lmina 6: Cocos Gram positivos en cadenas (S. pyogenes)

Digitalizacin
49
Lmina 7: Cocos Gram positivos en cadenas (Enterococcus)

Digitalizacin
Lmina 8: Cocos Gram positivos en pares y cadenas cortas

(S. pneumoniae)
Digitalizacin
Lmina 9: Cocos Gram negativos en pares (Neisseria sp.)

Digitalizacin
COLORACIN DE ZIEHL-NEELSEN
Lmina 10: Etapas de la Coloracin de Ziehl-Neelsen

Digitalizacin
50
Lmina 11: BAR en frotis directo de esputo

Digitalizacin
COLORACIONES ESTRUCTURALES
Lmina 12: Coloracin de Grnulos Metacromticos

(Azul de Metileno de Leffler)
Digitalizacin
Lmina 14: Coloracin de Cpsula (Hiss)

Digitalizacin
Lmina 16: Cpsula: Tincin Negativa con Tinta China

Digitalizacin
Lmina 17b: Coloracin de Flagelos (Ryu )

Fuente: Mellies J, 2008
Lmina 13: Coloracin de Grnulos Metacromticos

(Albert)
Digitalizacin
Lmina 15: Coloracin de Cpsula (Anthony)

Digitalizacin
Lmina 17a: Coloracin de Flagelos (Leifson)

Fuente: Mellies J, 2008
Lmina 18: Coloracin de Espora (Wirtz-Conklin modificada por

Schaeffler-Foulton))
Digitalizacin
51
UNIDAD III
NUTRICIN Y CRECIMIENTO BACTERIANO
Objetivos Terminales
Practicar las tcnicas aspticas de siembra o inoculacin de bacterias en el laboratorio.
Reconocer la morfologa colonial bacteriana en diferentes medios de cultivo.
Analizar la influencia de las condiciones fsico-qumicas sobre el crecimiento bacteriano.
Cuantificar el crecimiento bacteriano utilizando diferentes mtodos.

TCNICAS DE SIEMBRA Y MORFOLOGA COLONIAL
1. Realizar las tcnicas de inoculacin en diferentes medios de cultivo.
2. Ejecutar adecuadamente las diferentes tcnicas de aislamiento de colonias en medios de cultivo.
3. Reconocer las caractersticas macroscpicas de las colonias bacterianas en medios de cultivo enriquecidos.
4. Relacionar la morfologa colonial bacteriana en medios diferenciales y selectivos con la actividad metablica
del microorganismo.
Tcnicas de siembra o inoculacin
En Bacteriologa, se entiende por Siembra o Inoculacin, al acto de colocar la muestra que se va a investigar
en medios de cultivo apropiados, para favorecer el crecimiento de las bacterias existentes en la misma.
Es importante la prctica de tcnicas aspticas que permitan la transferencia e inoculacin de las muestras a
los medios de cultivo, sin que se produzca contaminacin de los cultivos por microorganismos no deseados.
El equipo necesario para la inoculacin primaria de muestras es relativamente simple: a) asa bacteriolgica
(en aro o en punta), b) hisopos o varillas de vidrio, c) pipetas Pasteur o serolgicas y d) medios de cultivo en tubos
o en placas.
Las tcnicas para efectuar una siembra varan segn se trate de medios slidos, lquidos o semislidos.
1) Inoculacin de medios lquidos
Para la transferencia e inoculacin asptica del material se procede de la siguiente forma:
a) Se esteriliza el asa de inoculacin a la llama directa del mechero hasta que el alambre quede al rojo vivo y se
deja enfriar en la zona estril alrededor del mechero.
Figura 8: Esterilizacin del asa previa a la siembra

b) Con una mano tome el tubo con crecimiento microbiano y destpelo, sostenga el tapn entre los dedos meique
y anular y la palma de su otra mano.
c) Flamee o pase ligeramente la boca del tubo por la llama del mechero.
Figura 9: Destapado del tubo y flameado de la boca del mismo

55
d) Introduzca el asa y tome el inculo.
Figura 10: Toma del inculo con el asa bacteriolgica

e) Flamee de nuevo la boca del tubo y tpelo.
Figura 11: Flameado de la boca del tubo antes de cerrarlo

f) Los medios lquidos en tubo se inoculan introduciendo el asa bacteriolgica en forma perpendicular en el tubo
y haciendo un ligero movimiento de vaivn en el lquido. Se debe flamear la boca del tubo antes y despus de
inocular el medio.
Figura 12: Inoculacin de un medio en caldo

g) Una vez inoculado el medio, el asa debe esterilizarse nuevamente.

Si la siembra es a partir de crecimiento en una placa de agar se toma el inculo tocando una colonia aislada y
se sigue el procedimiento segn se indica en los puntos f y g.
Si la siembra es de un medio lquido a otro, tambin puede hacerse boca a boca directamente de tubo a tubo;
o bien, utilizando pipetas Pasteur o pipetas serolgicas.
2) Inoculacin en medios slidos y semi-slidos en tubo: repita los procedimientos de la a hasta la e.
Medios en taco:
Los medios semislidos, como el agar movilidad, se siembran por puncin del taco con un asa en punta,
sin llegar al fondo. La inoculacin debe realizarse en el centro del medio de cultivo. Es importante que el alambre
de inoculacin sea retirado a lo largo de la misma trayectoria que se us para atravesar inicialmente el medio. Un
movimiento en abanico puede dar como resultado un patrn de crecimiento a lo largo de la lnea de inoculacin
56
que puede interpretarse errneamente como movilidad bacteriana.
Figura 13: Inoculacin de agar semi-slido en taco

Medios en taco y bisel:
Como por ejemplo, el triple azcar hierro (TSI), se inoculan por puncin del taco y rayado del bisel. La
inoculacin de un plano inclinado o bisel, se hace con un asa de inoculacin en punta. Primero, se atraviesa el agar
con el alambre hasta el fondo del tubo y luego, ste se retira con un movimiento en S zig-zag a travs del agar
en el bisel para diseminar el inculo. Alternativamente, puede rayarse primero el bisel y luego, punzar el taco.
En ocasiones, se inocula slo el bisel o plano inclinado, sin punzar el taco. Este es el caso del Agar
Nutritivo (AN) y ciertos medios para pruebas bioqumicas que se estudiarn posteriormente, como el agar rea,
agar fenilalanina y el agar citrato, entre otros.
Una vez inoculado el medio se debe esterilizar nuevamente el asa.
Figura 14: Inoculacin de medios en taco y bisel

Fuente: Koneman E, 1997
Figura 15: Inoculacin de medios en bisel

3) Inoculacin de medios en placa

El inculo primario puede colocarse con asa (en aro), hisopo o pipeta. Una vez colocado dicho inculo, con
el asa se disemina el material en la placa, haciendo estras con un movimiento en zig-zag sobre la superficie de la
placa. Evite hablar mientras efecta la siembra, pues puede contaminar los cultivos.
Nota: Si la muestra a inocular es lquida puede utilizarse una pipeta para colocar el inculo primario y luego se
disemina el material con el asa.
Figura 16: Inoculacin de medios slidos en placa

Tcnicas de Aislamiento de Colonias en Medios Slidos

En los medios de cultivo slidos (en placas), los microorganismos de una misma especie pueden ser separados
en pequeas agrupaciones macroscpicas, llamadas Colonias.
Para aislar colonias en los medios slidos pueden utilizarse varios mtodos:

Aislamiento por vaciado

Aislamiento por extensin

Aislamiento por agotamiento
57
1) Aislamiento por vaciado

Este mtodo consiste en inocular una muestra lquida o un homogeneizado sobre el agar cuando todava se
encuentra lquido (45C), y luego se vaca sobre la placa de Petri estril. En su defecto, puede colocarse el inculo
en una placa de Petri estril y verter el agar, todava lquido sobre el inculo. Mezclar para distribuir uniformemente.
De esta forma, se obtienen colonias a travs del medio y sobre la superficie.
2) Aislamiento por extensin
Este mtodo consiste en inocular una muestra lquida o un homogeneizado sobre la superficie del agar y luego
se distribuye uniformemente, con la ayuda de una varilla en forma de L, con la finalidad de obtener colonias
aisladas sobre la superficie del medio de cultivo. La tcnica ser descrita con ms detalles en la actividad prctica
de medicin del crecimiento bacteriano.
Esta tcnica se utiliza para el recuento de colonias a partir de muestras de agua y alimentos. Tambin se
aplica para la cuantificacin de bacterias en muestras de orina y ser utilizada en la prctica de gentica bacteriana
(Unidad V).
3) Aislamiento por agotamiento
Consiste en sembrar los microorganismos por rayado sobre un medio slido, partiendo de inculos
concentrados de bacterias con el objeto de obtener colonias aisladas.
Tcnica
1. Seleccione de una placa o tubo, la porcin del crecimiento bacteriano que desea agotar y tome con un asa en
aro, preferiblemente, el inculo.
2. La placa se inocula en cuatro cuadrantes. Raye el primer cuadrante haciendo tantas estras como sea posible.
3. Esterilice el asa y djela enfriar, gire la placa hacia el segundo cuadrante, estre tocando una pequea rea del
sector inoculado anteriormente.
4. Esterilice el asa y djela enfriar, gire la placa hacia el tercer cuadrante, estre tocando una pequea rea del
segundo sector.
5. Esterilice nuevamente el asa y deje enfriar, gire hacia el cuarto cuadrante, raye tocando una pequea porcin
del tercer sector inoculado, luego estre el rea remanente de la superficie del agar teniendo cuidado de no hacer
contacto con las partes ya inoculadas.
6. Despus de incubar las placas a una temperatura, atmsfera y tiempo adecuados, en el ltimo cuadrante inoculado aparecern colonias aisladas.
Figura 17a: Aislamiento de Colonias por Agotamiento

Fuente: Steve A, 2001
Figura 17b: Aislamiento de Colonias por Agotamiento

Fuente: Digitalizacin
A cada grupo se le entregar una variedad de medios de cultivo. Practique las diferentes tcnicas de
siembra explicadas anteriormente, utilizando para ello los cultivos que le sern suministrados. En caso de duda,
consulte a su asesor.
58
Morfologa Colonial
La observacin de las caractersticas macroscpicas de las colonias bacterianas, habitualmente se lleva a cabo
por medio de la inspeccin visual del crecimiento en la superficie de placas de agar. Para ello, se sostiene la placa
en una mano y se observa la superficie del agar en busca de crecimiento bacteriano.
Cada placa debe estudiarse con cuidado porque las bacterias inicialmente recuperadas de muestras, a menudo
crecen produciendo cultivos mixtos; por lo tanto, pueden observarse tipos variados de colonias. En ocasiones,
colonias puntiformes de bacterias que crecen lentamente pueden pasar inadvertidas entre colonias ms grandes, en
particular, si el crecimiento tiene tendencia a diseminarse sobre la superficie de la placa.
Durante la observacin, las placas deben inclinarse en diversas direcciones, con una iluminacin directa y
brillante, de modo que la luz se refleje desde varios ngulos. Es aconsejable el uso de una lupa para detectar las
colonias diminutas y observar mejor sus caractersticas.
En medios enriquecidos como Agar Sangre (AS) y Gelosa Chocolate (GC) se pueden visualizar caractersticas
de las colonias que son tiles para una identificacin bacteriana preliminar, tales como:
Fusiforme
Figura 18: Morfologa Colonial en Medios Enriquecidos

Fuente: Steve A, 2001 modificado por Castellano M, 2011
En medios selectivos y diferenciales como Mac Conkey (MC), Xilosa-Lisina-Desoxicolato (XLD),

Salmonella-Shigella agar (SSA) y Agar Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sucrosa (TCBS); ms que las caractersticas antes
mencionadas, se deben observar propiedades metablicas tiles para la identificacin bacteriana (fermentacin de
carbohidratos, decarboxilacin de aminocidos, entre otras).
Las caractersticas de las colonias bacterianas en medios de cultivo enriquecidos, selectivos y diferenciales se
observan en el laminero de la presente actividad prctica (Lminas 19-28)
59
A cada grupo de estudiantes se le suministrar una serie de medios de cultivo en placas que contienen
diferentes microorganismos. Examine las caractersticas de las colonias en los diferentes medios de cultivo y
registre los resultados.
1. Por qu es importante utilizar tcnicas aspticas para la inoculacin de medios de cultivo?
2. Cul es el propsito de esterilizar el asa antes y despus de su uso?
3. Seale la importancia de enfriar el asa antes de tocar un cultivo?
4. Qu es un cultivo puro?
5. Cmo puede determinarse si una colonia es un contaminante en una placa rayada?
6. Cmo puede determinarse en el laboratorio si un cultivo bacteriano es puro o mixto?.
7. Indique 5 caractersticas tiles para la descripcin de las colonias bacterianas en medios enriquecidos.
8. Qu utilidad tiene la observacin de la morfologa de las colonias bacterianas en medios slidos?
a) El trmino utilizado cuando un cultivo se coloca a una temperatura especfica por un tiempo determinado
es________________.
b) Una masa de clulas creciendo en la superficie de un agar se denomina________________.
c) Un __________ es un microorganismo no deseado en un cultivo puro.
d) Cuando se desea obtener colonias aisladas se inocula un medio________________________
60
Laminero Prctica 3.1: Morfologia Colonial Bacteriana

en Medios Enriquecidos, Selectivos y Diferenciales
LAMINERO : PRCTICA 3.1: MORFOLOGIA COLONIAL

BACTERIANA EN MEDIOS ENRIQUECIDOS, SELECTIVOS Y
DIFERENCIALES
Lmina 19: Colonias de S. aureus en AS

Colonias grandes (4-6 mm de dimetro), lisas, de bordes
regulares, convexas, pigmentadas, consistencia cremosas, hemolticas.
Digitalizacin
Lmina 21: Colonias de Bacillus spp. en AS

Colonias grandes, secas, planas, de bordes irregulares, con aspecto
de vidrio esmerilado, opacas, pueden o no ser hemolticas.
Digitalizacin
Lmina 23: Colonias de K. pneumoniae. en AS

Colonias grandes, grises, elevadas, de bordes regulares, brillantes,
lisas, mucosas.
Digitalizacin
Lmina 20: Colonias de S. agalactiae en AS

Colonias puntiformes (< 0,5 mm de dimetro), de bordes regulares,
convexas, no pigmentadas, grises o ligeramente blanquecinas,
brillantes, -hemolticas.
Digitalizacin
Lmina 22: Colonias de S. pneumoniae. en AS

Colonias pequeas, translcidas, de bordes regulares, lisas, hemolticas, umbilicadas.
Digitalizacin
Lmina 24: Colonias de Enterococcus spp. en AS

Colonias medianas, de color blanco grisceo, de bordes
regulares, lisas, no hemolticas, no pigmentadas, elevadas.
Digitalizacin
63
Lmina 25: Colonias Fermentadoras de lactosa (CFL) en MC

Digitalizacin
Lmina 26: Colonias No Fermentadoras de lactosa (CNFL)

en MC
Digitalizacin

H2S Positivas en SSA
Digitalizacin

H2S Negativas en SSA
Digitalizacin
Lmina 29 : Colonias Fermentadoras de lactosa (CFL) H2S

Positivas en SSA
Digitalizacin
Lmina 30: Colonias Fermentadoras de lactosa (CFL) H2S

negativas en SSA
Digitalizacin
Lmina 31: Colonias amarillas H2S Positivas en XLD

Digitalizacin
64
Lmina 32: Colonias amarillas H2S Negativas en XLD

Digitalizacin
Lmina 33: Colonias rojas H2S Positivas en XLD

Digitalizacin
Lmina 35: Colonias Fermentadoras de Sucrosa (CFS)

en TCBS
Digitalizacin
Lmina
S Negativas
Negativasenen
XLD
Lmina34:
34:Colonias
Colonias rojas H22S
XLD
Digitalizacin
Digitalizacin
Lmina 36: Colonias No Fermentadoras de Sucrosa (CNFS)

en TCBS Digitalizacin
65

FACTORES FSICOS QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO BACTERIANO
Objetivo Especfico:
1. Demostrar la influencia que ejercen diversos factores fsicos y qumicos sobre el crecimiento bacteriano.
Factores Fsicos
Los procariotas son microorganismos extremadamente adaptables, pueden sobrevivir en casi todos los
ambientes naturales y son capaces de crecer bajo amplios rangos de condiciones fsicas, tales como: tensin de
oxgeno, concentracin de hidrogeniones (pH) y temperatura.
Los factores ambientales que pueden influir sobre el crecimiento de las bacterias se dividen en fsicos y
qumicos. Los factores fsicos ejercen su influencia sobre la composicin qumica de la clula y el medio ambiente.
As, la temperatura, la presin y la radiacin se considerarn claramente como fsicos; mientras que los antispticos
y desinfectantes son agentes qumicos. No obstante, la presin osmtica puede ser considerada como factor fsico
o como fisico-qumico; pero, en cualquier caso, no puede ser relegado de los efectos qumicos debido a que
interviene en los niveles de concentracin inica.
As como las bacterias varan ampliamente en sus requerimientos nutricionales, tambin muestran respuestas
diversas a las condiciones fsico-qumicas del medio. Estas condiciones incluyen: temperatura, concentracin de
hidrogeniones (pH), potencial de oxido-reduccin, tensin de oxgeno y presin osmtica, entre otras.
1. Temperatura
Las bacterias se dividen en tres grupos, teniendo como base su temperatura ptima de crecimiento:
a) Psicrfilas o crifilas: crecen en un rango de temperatura que va de 5C a 30C, con una temperatura
ptima de crecimiento de 10 a 20C.
b) Mesfilas: crecen en un rango de 10 a 45C, con una temperatura ptima de 20 a 40C.
c) Termfilas: crecen en un rango de 25 a 80C, con una temperatura ptima de 50 a 60C.
Las bacterias patgenas para el hombre crecen, generalmente, entre 35-37C; es decir, a temperaturas similares
a la corporal (mesfilas).
Es conveniente resaltar que algunas especies bacterianas no muestran las mismas caractersticas fenotpicas,
cuando se desarrollan a diferentes temperaturas. Por ejemplo, algunas bacterias producen un pigmento caracterstico
a bajas temperaturas; pero no lo producen o lo hacen en muy poca cantidad a altas temperaturas. Tal es el caso de
Serratia marcescens que produce un pigmento rojo a 25C; ms no a 35C.
a) Para verificar el efecto de la temperatura sobre el crecimiento de las bacterias, a cada grupo de trabajo le ser
entregada una cepa bacteriana. Esta bacteria se inocular en tres caldos soya tripticasa (CST), los cuales sern
incubados a diferentes temperaturas: 25C, 35C y 42C. Incube los caldos por 24 horas en condiciones de
microaerofilia y observe el crecimiento. Registre e interprete los resultados obtenidos.
b) Para poner en evidencia el efecto de la temperatura sobre la expresin de ciertas caractersticas fenotpicas de
las bacterias, se entregarn a cada grupo dos placas de AN. Cada una de estas placas ser inoculada con una
misma cepa bacteriana para luego ser incubadas, una a temperatura ambiente (25C) y la otra a 35C (en estufa),
por 24 horas. Transcurrido este tiempo proceda a leer la prueba e interpretar los resultados.
2. Concentracin de hidrogeniones (pH)
La mayora de las bacterias crecen bien a pH entre 6,0 y 9,0, tolerando cambios de pH de hasta 3 unidades;
pero, todo cambio superior a una unidad, afecta el crecimiento; sin embargo, existe un pH ptimo de crecimiento
bacteriano.
67
Las bacterias pueden ser clasificadas como: acidfilas, alcalfilas o basfilas y neutrfilas. Las bacterias
acidfilas crecen en un rango de pH entre 0 y 5,4. Las neutrfilas crecen a un rango de pH entre 5,4 y 8,5. A este
grupo pertenecen la mayora de las bacterias que causan enfermedad en el hombre. Las bacterias alcalfilas, crecen
en un rango de pH entre 7,0 y 11,5.
Para determinar el efecto del pH sobre el crecimiento de los microorganismos, a cada grupo le sern
suministradas placas de Agar Nutritivo (AN), cuyos pH han sido ajustados a 3, 5, 7 y 9. Proceda a dividir el fondo
de la placa en cuatro (4) cuadrantes e inocule en cada sector, con una suspensin estandarizada preparada con
cada uno de los cuatro microorganismos a probar. Incube las placas a 35C por 24 horas, en aerobiosis. Observe el
crecimiento, registre e interprete los resultados.
Preparacin de la suspensin estandarizada
A partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba, con la ayuda de un asa o un hisopo estril,
resuspender una pequea porcin del crecimiento en 5 ml de SSF estril y preparar una suspensin cuya turbidez
sea comparable con el estndar 0,5 de McFarland que contiene aproximadamente 1,5 x 108 UFC (Unidades
Formadoras de Colonias)/ml (Ajustar la turbidez si es necesario, utilizando para ello, SSF estril).
3. Tensin de oxigeno y potencial de xido-reduccin
El oxgeno es un componente universal de las clulas y casi siempre es suministrado por el agua en gran
cantidad. El requerimiento de oxgeno de una bacteria en particular, refleja el mecanismo empleado para satisfacer
sus necesidades energticas. Basndose en los requerimientos de oxgeno, las bacterias pueden dividirse en cinco
grupos:
a) Aerobios estrictos (obligados): requieren del oxgeno para crecer. Su metabolismo es siempre aerbico
(respiracin aerbica). Ej: Pseudomonas aeruginosa.
b) Anaerobios estrictos (obligados): crecen solo bajo condiciones de alta intensidad reductora; el oxgeno es
txico para estas bacterias. Su metabolismo es de tipo anaerobio (fermentacin o respiracin anaerbica).
Ej: Clostridium tetani.
c) Anaerobios facultativos (aerobios facultativos): son capaces de crecer, en presencia o ausencia de oxgeno.
En anaerobiosis, utilizan la fermentacin o la respiracin anaerbica; pero en presencia de oxgeno, cambian
a respiracin aerbica. Ej: Escherichia coli.
d) Anaerobios aerotolerantes: son aquellos anaerobios que no mueren por exposicin al oxgeno, pero su
metabolismo es siempre fermentativo. Ej: bacterias cido lcticas.
e) Microaeroflicos: crecen en presencia de bajas concentraciones de oxgeno libre, y son inhibidas por altas
tensiones de este gas. Ej: Campylobacter sp.
Las bacterias anaerobias estrictas, slo se podrn desarrollar si se toman precauciones especiales para
expulsar todo el oxgeno atmosfrico del medio. Se puede obtener un ambiente de anaerobiosis por cualquiera de
los siguientes mtodos:
a) Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, por ejemplo, tioglicolato de sodio o cistena, para
disminuir el contenido de oxgeno.
b) Eliminando el oxgeno de los envases cerrados que contienen el medio de cultivo por procedimientos
mecnicos, el aire se expulsa por bombeo y se reemplaza con nitrgeno, helio o una mezcla de nitrgeno y
dixido de carbono.
c) Mediante reacciones qumicas dentro del recipiente que contiene el medio de cultivo inoculado, para combinar
el oxgeno libre con otro compuesto; esto puede conseguirse con el empleo de la Campana de Gaspak, en
cuyo interior se crea un ambiente de anaerobiosis a travs de un sobre de Gaspak (BBL) que contiene en
su interior dos pastillas: a) Borohidrato de sodio y b) Bicarbonato de Sodio y cido Ctrico. La campana est
provista en su tapa de Palladium, el cual acta como catalizador de la reaccin. A este sobre, se le aaden 10
ml de agua para que libere hidrgeno que se combina con el oxgeno presente en el medio dando origen a la
formacin de gotitas de agua en la campana de Gaspak.
2 H2 + O2
2 H2O
68
Se recomienda el empleo de indicadores, tales como el azul de metileno, que en presencia de oxgeno se
muestra de color azul y, en condiciones de anaerobiosis, es incoloro.
Existe otro sistema para crear una atmsfera de anaerobiosis, el Anaerocult A (Merck) que contiene
componentes que fijan qumicamente en forma completa el oxgeno dentro de breve tiempo y producen un medio
exento de O2 (anaerobio). Las almohadillas contienen tierra silcea, hierro en polvo, cido ctrico y carbonato
sdico. Para su empleo deben aadirse uniformemente 35 ml de agua, dentro de 15-20 segundos, sobre el papel
especial de Anaerocult; teniendo la precaucin de mantener la almohadilla en posicin horizontal. Inmediatamente
despus, introducir la almohadilla humedecida en la campana de anaerobiosis, de manera que la pgina impresa
est dirigida hacia las placas. Humedecer una tira de Anaerotest con una gota de agua y fijarla en la campana, la
zona reactiva de la tira indicadora debe quedar colgando libremente en el aire. Cerrar inmediatamente la campana.
La condicin de anaerobiosis es indicada por el viraje de color de la tira de anaerotest de azul a blanco tras
aproximadamente 4 horas.
d) Si se trata de medios lquidos puede crearse un ambiente anaerbico cubrindolos con vaselina, parafina o
aceite mineral estril.
Para el crecimiento de las bacterias microaeroflicas se requiere el empleo de ambientes con una
concentracin ente 5 y 10% CO2. Para esto, se colocan los medios inoculados en una jarra o campana en cuyo
interior se enciende una vela blanca. Se tapa la campana y se espera a que la vela se apague. Cuando esto sucede
se ha creado un ambiente microaeroflico en el interior de la campana (mtodo de la vela). Este ambiente tambin
puede generarse por mtodos mecnicos (evacuacin-reposicion) o por mtodos qumicos, a travs del uso de
sobres generadores de ambientes microaeroflicos disponibles comercialmente, como el GenBag (BioMrieux),
por ejemplo.
El potencial de xido reduccin (Eh) es un factor crtico para determinar si habr o no crecimiento de un
inculo bacteriano cuando ste sea transferido a un medio fresco. Es una medida cuantitativa de la capacidad del
sistema de aceptar o ceder electrones en forma reversible, con referencia al electrodo de hidrgeno estndar. Un
potencial ms positivo que otro, tiene mayor tendencia a aceptar electrones; es decir, es un agente oxidante ms
fuerte. Para la mayora de los medios en contacto con el aire a pH 7,0; el Eh es aproximadamente + 0,2 a + 0,4 v
(+ 200 a + 400 mv).
Segn el grupo de bacterias se tienen los siguientes Eh:
a) Aerobios estrictos: + 300 mv a - 50 mv.
b) Anaerobios facultativos: + 300 mv a - 420 mv.
c) Anaerobios aerotolerantes: + 180 mv a - 350 mv.
d) Anaerobios estrictos: - 150 mv a - 420 mv.
a) A fin de verificar el efecto de la tensin de oxgeno y el potencial redox sobre el crecimiento bacteriano proceda
a inocular dos placas: una de Agar Sangre Humana (ASH) y otra de Agar Sangre Anaerobiosis (ASA) con los
tres microorganismos a probar. (Divida cada placa en tres partes iguales). Incube la placa de ASH en aerobiosis
y la de ASA en condiciones de anaerobiosis, por 24 horas a 35C. Transcurrido el tiempo de incubacin,
proceda a observar el crecimiento de los microorganismos y clasifquelos de acuerdo a sus requerimientos de
oxgeno. Un microorganismo aerobio estricto crecer solamente en la placa de ASH incubada en presencia
de oxgeno; un microorganismo anaerobio estricto, crecer slo en la placa incubada anaerbicamente y uno
anaerobio facultativo, crecer en ambas placas por igual.
El efecto de la tensin de oxgeno tambin puede verificarse en medios lquidos. A este fin, proceda a inocular un
caldo tioglicolato con cada uno de los microorganismos utilizados en la parte A. Incube los tubos hermticamente
cerrados, en la estufa a 37C por 24 horas. Un microorganismo anaerobio estricto crecer slo en el fondo del
caldo; un aerobio estricto lo har solamente en la parte superior y un anaerobio facultativo, crecer por igual a todo
lo largo de la columna del caldo.
Observe el crecimiento de los microorganismos en los diferentes medios de cultivo, anote los resultados y
clasifique los microorganismos convenientemente.
69
b) Para verificar la influencia de la tensin de oxgeno sobre el crecimiento de los microorganismos microaeroflicos
proceda de la siguiente manera: inocule dos placas de GC con la cepa bacteriana a probar. Incube a 37C por
24 horas, una placa en condiciones de aerobiosis y la otra, en ambiente microaeroflico por el mtodo de la
vela (5-10% CO2). Observe el crecimiento obtenido e interprete los resultados.
4. Presin osmtica
smosis es la difusin de un solvente a travs de una membrana semipermeable que separa dos
soluciones de diferentes concentraciones. Al trmino de la difusin, la concentracin es igual en ambos lados de
la membrana. Por ejemplo, si una clula bacteriana est suspendida en una solucin que contenga 20% de NaCl
(medio hipertnico), el agua pasar a travs de la membrana celular (que es semipermeable) de la regin de menor
concentracin de sustancias disueltas (el interior de la clula) a la solucin que rodea la clula y, como resultado
la clula se deshidratar. A este fenmeno se le denomina Plasmlisis.
Si la situacin se invierte y las bacterias se colocan en una solucin con una concentracin menor del 1%
(medio hipotnico), la corriente se invertir, y el agua pasar de la solucin al interior de la clula, se produce una
gran presin osmtica por la cantidad de agua acumulada en el interior. Esto se conoce como Plasmoptisis.
Las bacterias poseen paredes muy rgidas y, generalmente, no presentan cambios aparentes de tamao o
forma cuando ocurre plasmlisis o plasmoptisis. Algunas bacterias se han adaptado muy bien a elevadas presiones
osmticas y son capaces de crecer en un medio de alta concentracin salina; incluso, algunos necesitan grandes
cantidades de sal o azcar para desarrollarse. Tales organismos se denominan Osmfilos, cuando son capaces de
desarrollarse en medios con alta concentracin de azcar o Haloflicos, cuando requieren grandes cantidades de
sal para su desarrollo.
Existe otro grupo de bacterias capaces de crecer a concentraciones moderadas e incluso en ausencia de
NaCl, las Halotolerantes.
Para determinar el efecto de la presin osmtica y la concentracin de sal sobre el crecimiento de las bacterias,
se proceder de la siguiente manera:
a) A cada grupo se le har entrega de 5 placas de AN con diferentes concentraciones de sucrosa: 0; 5; 15; 30 y 60%,
respectivamente. Divida cada placa en cuatro cuadrantes e inocule en cada uno, una suspensin previamente
estandarizada; preparada con cada uno de los microorganismos de prueba. Incube las placas a 37C por 24
horas. Lea e interprete los resultados obtenidos.
b) Proceda de manera semejante a inocular 4 placas de AN con diferentes concentraciones de NaCl (0; 0,5; 5; 15
y 25%, respectivamente). Incube de la misma manera. Lea e interprete los resultados obtenidos.
En ambos casos, interprete el comportamiento del microorganismo segn la presin osmtica. Reporte el
grado del crecimiento bacteriano de la siguiente forma: ausente, escaso, moderado, abundante.
1. Compare una bacteria aerotolerante y una anaerobia estricta en trminos de su capacidad para crecer en presencia
de O2.
2. En qu se diferencia un microorganismo anaerobio aerotolerante de un microaeroflico?.
3. Por qu las bacterias que infectan al hombre corresponden al grupo de los mesfilos?.
4. Cmo se puede lograr un ambiente anaerobio y uno microaeroflico utilizando mtodos qumicos?.
5. Explique el fenmeno que sucede cuando las bacterias se colocan en un medio hipotnico.
6. Indique tres factores fsicos que pueden influir en las caractersticas de crecimiento de una bacteria en un medio
que contiene agar.
70

1. Las bacterias que crecen en el fondo de un caldo tioglicolato son referidas como______________.
2. Las bacterias____________ crecen a temperaturas que oscilan entre 20-40C.
3. Las bacterias ______________ requieren del oxgeno para su crecimiento.
4. Las bacterias___________ crecen a pH cido.
71

MEDICIN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
1. Realizar el contaje de colonias bacterianas, previa dilucin de la muestra.
2. Efectuar mediciones turbidimtricas de un cultivo bacteriano.
3. Relacionar el contaje de colonias con la absorbancia mediante la elaboracin de un grfico.
Cuantificacin del Crecimiento Bacteriano
No solamente es importante el aislamiento de las bacterias, sino tambin, conocer el nmero o masa
de clulas en una muestra. Existen muchas formas de cuantificar el crecimiento bacteriano para determinar la
velocidad de crecimiento y el tiempo de generacin. Se puede medir tanto la masa como el nmero celular en la
poblacin, porque el crecimiento origina un incremento en ambos.
En la actualidad, se dispone de un gran nmero de mtodos directos para medir el crecimiento bacteriano:
determinacin del numero ms probable (NMP), contaje microscpico directo, contadores automticos de clulas,
contaje en placa, determinacin del peso seco. Adems, existen mtodos indirectos, tales como: mediciones
turbidimtricas de un cultivo lquido y medicin de un componente celular importante, como las protenas.
En la presente actividad prctica se aplicarn dos mtodos ampliamente utilizados para medir el crecimiento
bacteriano: contaje en placa (directo) y turbidimetra (indirecto), y se relacionarn ambos parmetros a travs de
la elaboracin de un grfico, que nos permitir determinar la concentracin celular de un cultivo puro de un
microorganismo.
Contaje en Placas
El contaje en placas se lleva a cabo determinando el nmero de clulas capaces de generar colonias sobre
la superficie de un medio slido. Por esta razn, frecuentemente a este mtodo se le denomina contaje de colonias.
Este tipo de contaje se basa en que cada clula viable puede dar lugar a una colonia. Se dice que una clula es
viable cuando es capaz de dividirse para dar lugar a descendencia.
El nmero original de microorganismos viables en la muestra puede calcularse a partir del nmero de
colonias formadas y la dilucin de la muestra. Por ejemplo, si 1 ml de una dilucin de 1x10-6 produce 150 colonias,
la muestra original contendra alrededor de 1,5 x 108 UFC/ml Normalmente, el recuento es ms exacto si se utiliza
un contador especial de colonias.
Se pueden emplear dos tcnicas de siembra para realizar el contaje en placas: siembra por extensin y
siembra en profundidad (vaciado). En la tcnica de siembra por extensin, un volumen no mayor de 0,1 ml de la
dilucin de la muestra, se extiende por toda la superficie del medio utilizando una varilla de vidrio estril, doblada
en forma de L. La placa se incuba bajo las condiciones de tiempo, temperatura y atmsfera apropiadas (Figura
19).
Figura 19: Aislamiento por Extensin

Fuente: Madigan M, 1998
En la tcnica de siembra en profundidad, se coloca 1 ml de la dilucin de la muestra en un medio de cultivo

previamente fundido y enfriado hasta aproximadamente 40-45C; despus de mezclado se vierte rpidamente en
una placa de Petri estril, se deja solidificar y se incuba bajo las condiciones apropiadas (Figura 20).
72
Figura 20: Aislamiento por Vaciado

Fuente: Madigan M, 1998
Con los dos mtodos anteriores, el nmero de colonias que se desarrollan en las placas no debe ser muy
elevado para poder contar adecuadamente y, por otra parte, el nmero de colonias no debe ser muy bajo para que
el contaje tenga significado estadstico. La prctica habitual es que el nmero de colonias oscile entre 30 y 300 por
placa.
Por lo general, para obtener el nmero apropiado de colonias, la muestra debe ser diluida. Debido a
que habitualmente no se conoce la carga microbiana de la muestra, es necesario realizar diluciones seriadas,
generalmente en base 10 (ejemplo: 10-1, 10-2, 10-3). Mientras mayor sea la carga microbiana de la muestra (alimento,
agua, suelo) mayor ser el nmero de diluciones a preparar para conseguir el nmero apropiadas de colonias para
el contaje (entre 30 y 300).
Fuentes de error en el mtodo de contaje en placa
El nmero de colonias obtenido en un contaje en placa depende no solamente del tamao del inculo; sino
tambin, del medio de cultivo y las condiciones de incubacin empleadas. El recuento ser bajo si el medio
de cultivo empleado no puede respaldar el crecimiento de todos los microorganismos viables presentes en la
muestra.
En la siembra en profundidad, si la temperatura del agar fundido es elevada (por encima de 45C) puede
daar o destruir clulas sensibles; por ello, la siembra por extensin ofrece a veces recuentos superiores en
comparacin a la tcnica en profundidad.
En relacin con el tiempo de incubacin, no todas las colonias se desarrollan al mismo tiempo, de modo que
si el tiempo de incubacin es corto, se obtendr un recuento ms bajo que el real.
El tamao de las colonias vara ampliamente, de modo que colonias muy pequeas pudieran pasar inadvertidas
y no ser contadas.
Debido a que existen muchas fuentes de error en el contaje en placa, se debe sembrar por duplicado cada
dilucin.
Para representar el resultado ms claramente, el contaje de clulas viables se expresa como unidades
formadoras de colonias (UFC) en lugar de nmero de microorganismos (ya que una colonia contiene ms de una
clula).
A pesar de las dificultades asociadas con el recuento de colonias en placas, este procedimiento es
ampliamente utilizado en la industria alimentaria y farmacutica; as como tambin, en la microbiologa acutica.
Este mtodo posee una alta sensibilidad puesto que muestras con escasa cantidad de microorganismos
pueden ser procesadas; adems, la disponibilidad de medios de cultivos altamente selectivos, permite realizar el
recuento de un tipo particular de microorganismo a partir de muestras heterogneas.
Turbidimetra
Este mtodo mide la reduccin de la transmisin de luz debida a las partculas en suspensin y cuantifica
la luz residual transmitida (Figura 21).
Es una tcnica sensible y rpida que se basa en la capacidad de las clulas bacterianas de dispersar la luz
que incide sobre llas. Como el tamao de las clulas en una poblacin es casi constante, el grado de dispersin
es proporcional a la concentracin de clulas presentes. Cuando la concentracin de las bacterias alcanza casi
73
10 millones de clulas por ml, el medio aparece ligeramente turbio. Un aumento de la poblacin produce un
incremento de la turbidez y una disminucin de la luz transmitida a travs del medio.
Figura 21: Turbidimetra

Fuente: Prescott L, 1999
Se puede medir el grado de dispersin de la luz con un espectrofotmetro y prcticamente se observa una
relacin lineal con la concentracin bacteriana hasta un cierto nivel de absorbancia. Por ello, el crecimiento de
una poblacin microbiana puede medirse mediante tcnica de espectrofotometra, siempre que la poblacin sea lo
suficientemente grande y se pueda medir la turbidez. Sin embargo, antes de utilizar la turbidez como mtodo de
contaje, es necesario realizar una curva estndar que relacione el nmero de UFC/ml de muestra con la absorbancia
de cada una de las diluciones utilizadas para efectuar el contaje en placas.
Materiales

Cultivo en caldo de E. coli (18-24 horas).

5 tubos de ensayo con 2 ml de Caldo Soya Tripticasa (CST) cada uno.

6 tubos con Agar Nutritivo (AN)

6 placas de Petri estriles.

Pipetas estriles de 1 y 2 ml

4 Frascos de dilucin con 99 ml de CST cada uno.

Espectrofotmetro

Contador de colonias
Procedimiento
A. Determinacin del Contaje Bacteriano por unidad de volumen.
Se procede a determinar el nmero de UFC/ml a partir del cultivo original del microorganismo en estudio.
1. Rotular 4 frascos de dilucin conteniendo 99 ml de SSF como: 10-2; 10-4; 10-6 y 10-8.
2. Fundir los 6 tubos con AN, luego enfriar hasta 45C en Bao de Mara. Mantener a esta temperatura hasta
el momento de utilizarlos.
3. Con una pipeta de 1 ml, transferir 1 ml del cultivo original de E. coli al primer frasco de dilucin marcado
como 10-2. Descartar la pipeta. Mezclar por inversin. Guardar el cultivo original.
4. Con una nueva pipeta, transferir 1 ml de la primera dilucin (10-2) al segundo frasco marcado como 10-4.
Descartar la pipeta y mezclar la dilucin como se indic en el paso anterior.
5. Con una nueva pipeta, transferir 1 ml de la segunda dilucin (10-4) al frasco marcado como 10-6. Descartar la
pipeta. Mezclar.
6. Con una nueva pipeta, transferir 1 ml de la tercera dilucin (10-6) al frasco marcado como 10-8. Mezclar.
7. Tome dos placas rotuladas como 10-6 y transfiera 1 ml de la dilucin marcada 10-6 a cada una de ellas. Luego
coloque 0,1 ml de la misma dilucin en dos placas estril marcada como 10-7. Descartar la pipeta.
74
8. Con una nueva pipeta, transferir 1 ml de la cuarta dilucin (10-8) a dos placas marcada como 10-8
9. Vaciar el contenido de un tubo con AN dentro de cada placa de Petri y rotar suavemente para mezclar el agar
y la muestra. Mover lentamente, para evitar que el agar salpique la tapa de la placa.
10. Dejar solidificar. Invertir e incubar las placas a 37C durante 24-48 horas (Figura 22).
Figura 22: Diluciones de la Muestra para Contaje en Placas

Fuente: Kelly S, 2002
B. Mediciones Turbidimtricas
Ahora se determinar la absorbancia de una serie de diluciones del cultivo original y se graficar una curva.
Al medir la absorbancia de un cultivo desconocido del mismo microorganismo en el mismo medio de cultivo, se
puede determinar el nmero de clulas por unidad de volumen a partir de la curva.
1. Con el remanente del cultivo original de E. coli procesar como se indica a continuacin (Figura 23):
2. Preparar 5 tubos conteniendo 2 ml de CST.
3. Transferir 2 ml del cultivo original de E. coli; al primer tubo con CST. Mezclar. Rotular un tubo como 1:2. No
descartar el cultivo original.
4. Transferir 2 ml del tubo 1:2 al otro tubo. Mezclar y rotular como 1:4.
5. Transferir 2 ml del tubo 1:4 a otro tubo. Mezclar y marcar como 1:8.
6. Transferir 2 ml del tubo 1:8 a otro tubo. Mezclar y marcar como 1:16.
7. No transferir al ltimo tubo y rotular como Blanco o Control.
8. Usando un espectrofomtro, ajustar la longitud de onda a 525 nm.
9. Colocar el blanco dentro del receptculo y tapar. Ajustar el espectrofotmetro a 0% de Absorbancia (100%
Transmitancia). De esta manera, se mide la absorbancia de un tubo no inoculado del medio de cultivo y se fija
la absorbancia a cero. Todos los cambios en la absorbancia en otros tubos son producto de la turbidez debida a
las clulas bacterianas en suspensin.
10. Comenzar con el tubo del cultivo original de E. coli, insertar cada dilucin preparada dentro del receptculo
y anotar la absorbancia de cada tubo en la hoja de datos.
Figura 23: Diluciones de la Muestra para Turbidimetra

Fuente: Kelly S, 2002
75
C. Reglas para el Contaje de Colonias

1. Finalizado el perodo de incubacin, se seleccionan las placas donde aparezcan entre 30 y 300 colonias. Con la
ayuda de un contador de colonias, se cuentan todas las colonias, incluyendo las que se observan como pequeos
puntos y se anota la dilucin correspondiente. Debe evitarse contar como colonias, partculas de muestra,
pequeas burbujas, etc.
2. Si las placas de todas las diluciones tienen ms de 300 colonias, se seleccionan aquellas que tengan el valor ms
cercano a 300.
3. Si las placas de todas las diluciones tienen menos de 30 colonias, se seleccionan aquellas que tengan el valor
ms cercano a 30. El nmero de colonias promedio de las dos placas de una misma dilucin se multiplican por
la dilucin correspondiente y este ser el resultado final.
4. Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan entre 30 y 300 colonias, se multiplica cada recuento por
la dilucin correspondiente, se establece el promedio y este ser el resultado final. Si el recuento ms alto es el
doble del ms bajo, se descarta el primero y se toma como resultado el valor ms bajo.
Expresin de los resultados
1. Los resultados se expresan como UFC por mililitro o gramo de muestra.
2. El nmero de colonias obtenido en el contaje, se multiplica por la dilucin correspondiente y se expresa como
Estimado del recuento estndar.
3. Si no hay colonias en ninguna de las placas, el recuento se reporta como menos de 1 multiplicado por la
primera dilucin de la muestra y se expresa como Estimado del recuento estndar.
D. Relacin Contaje de Colonias-Absorbancia.
1. Con el valor de las UFC/ml obtenidas en el contaje en placas del cultivo original (sin diluir), calcule las UFC/ml
en cada una de las diluciones correspondientes. Para tal fin, proceda a dividir el resultado entre 2 para calcular
las UFC/ml de la dilucin 1:2, y as sucesivamente para cada una de llas. De tal manera que, en la dilucin 1:2
el contaje ser la mitad del obtenido en el cultivo no diluido; para la dilucin 1:4 el contaje ser la cuarta parte
del obtenido en cultivo sin diluir,etc.
2. Con los resultados obtenidos, grafique la absorbancia de cada dilucin versus el nmero de UFC/ml de la
muestra. Este grfico permitir determinar el nmero de UFC/ml de un cultivo similar, tomando como referencia,
la absorbancia de los caldos.
Complete los siguientes enunciados:
1. El nmero de bacterias es directamente proporcional a la _______________ e inversamente proporcional a la

__________.
2. La forma correcta de reportar 5.365.000 bacterias/ml es ____________________.
3. Si el promedio de colonias obtenidas en la dilucin 10-3 fue de 189, el total de UFC/ml de la muestra original
es____________.
4. Si ninguna dilucin present entre 30-300 colonias; pero la dilucin 10-1 presenta 25 colonias, el total de UFC/
ml es________.
5. Si un cultivo contiene 2 x 109 UFC/ml, la dilucin 1:4 contiene__________UFC/ml
6. Con los siguientes valores de absorbancia determine el nmero de UFC/ml, utilizando la curva elaborada durante
el ejercicio prctico:
ABSORBANCIA
0,8
0,5
0,1
Reporte los resultados________________
76
UFC/ml
7. En una prueba de contaje en placa se obtuvo los siguientes resultados:

Nmero de Colonias
Dilucin
Placa 1
Incontables
270
100
10-1
10-2
10-3
Placa 2
Incontables
330
150
Reporte los resultados________________

8. En una prueba de contaje en placa se obtuvo los siguientes resultados:
Dilucin
Nmero de Colonias
Placa 1
Placa 2
10-1
Incontables
Incontables
10
-2
350
400
10
-3
50
60
Reporte los resultados_____________
77
UNIDAD IV
METABOLISMO BACTERIANO
Objetivo terminal
Al finalizar la unidad, el estudiante estar en capacidad de:
Ejecutar adecuadamente las pruebas bioqumicas usadas para el estudio del metabolismo bacteriano,
interpretando sus resultados.

PRUEBAS BIOQUMICAS UTILIZADAS EN LA IDENTIFICACIN DE
BACTERIAS EN EL LABORATORIO
1. Explicar los fundamentos de las pruebas bioqumicas ms utilizadas en la identificacin bacteriana.
2. Practicar correctamente las pruebas bioqumicas de uso frecuente en la identificacin bacteriana.
3. Interpretar adecuadamente los resultados de las pruebas bioqumicas utilizadas para la identificacin de
bacterias en el laboratorio.
Generalidades
Para la identificacin de las bacterias en el laboratorio, pueden utilizarse gran variedad de mtodos: mtodos
convencionales, sistemas multipruebas y sistemas automatizados. En la presente actividad prctica se tratar
lo concerniente a los mtodos convencionales utilizados rutinariamente en el laboratorio para la identificacin
bacteriana.
Identificacin utilizando Mtodos Convencionales
En el laboratorio de bacteriologa, las pruebas usadas para evaluar la actividad bioqumica o metablica
de las bacterias, por medio de la cual puede hacerse la identificacin final de especie, se llevan a cabo mediante el
subcultivo del aislamiento primario en una serie de medios diferenciales e indicadores, cuyos resultados pueden
interpretarse despus de un da o ms de incubacin.
Debido a que muchas bacterias presentan morfologa colonial y celular similar, se requieren caractersticas
adicionales para lograr su identificacin. A este fin, se recurre al estudio del metabolismo bacteriano, tomando
en consideracin el (los) sustrato(s) que utiliza una determinada bacteria y los productos finales que genera. En
consecuencia, se han diseado pruebas de laboratorio con la finalidad de determinar las enzimas y vas metablicas
presentes en una bacteria.
La identificacin por mtodos convencionales requiere la ejecucin de una serie de pruebas bioqumicas
especificadas en un esquema predeterminado que contiene las caractersticas bacterianas claves. Estas pruebas
deben ser efectuadas en una secuencia especfica para poder llegar a la identificacin final. Es labor del bacterilogo,
elegir conjuntos apropiados de caractersticas diferenciales que permitan la identificacin de cada grupo de
bacterias. A continuacin, se estudiarn detalladamente algunas de las pruebas bioqumicas que pueden utilizarse
en el laboratorio para la identificacin de especies bacterianas.
Indol
Fundamento:
La prueba se basa en determinar si la bacteria posee el complejo enzimtico triptofanasa que le permite
degradar el triptfano para producir indol. El indol es un benzil-pirrol, producto de la degradacin metablica del
aminocido triptfano. Las bacterias que poseen el complejo triptofanasa, son capaces de hidrolizar y desaminar
el triptfano con la produccin de indol, cido pirvico, amonaco y energa. Esta reaccin ocurre con el agregado
de una molcula de agua y en presencia de fosfato de piridoxal como coenzima.
La prueba se basa en la combinacin del indol liberado con el aldehdo que contiene el reactivo de Kovacs o
el de Erlich para dar un color rojo. Esta reaccin ocurre por hidrlisis cida de las protenas contenidas en el medio
provocado por el HCl concentrado. La capa alcohlica, concentra la quinona (complejo coloreado de rojo).
Medios y reactivos:
Medio: Caldo triptfano (1%) o agua peptonada con cloruro de sodio (NaCl).
Agua peptonada con NaCl
Peptona o digesto pancretico de casena (tripticasa)......................................2,0 g
Cloruro de sodio...............................................................................................0,5 g
pH final: 7,0 + 0,2
81
Caldo Triptfano (1%)

Peptona de carne...........................................................................................10,00 g
DL-triptfano....................................................................................................1,0 g
Agua destilada.............................................................................................100,0ml
pH final: 7,2 + 0,2
Reactivo de Kovacs:
Alcohol amlico o isoamlico......................................................................150,0 ml
-dimetil-amino-benzaldehdo.......................................................................10,0 g
cido clorhdrico concentrado.....................................................................50,0 ml
Reactivo de Erlich:
Alcohol etlico absoluto..............................................................................190,0 ml
-dimetil-amino-benzaldehdo.........................................................................2,0 g
cido clorhdrico concentrado.....................................................................40,0 ml
Procedimiento:
1. A partir de un cultivo puro con 18 a 24 horas de incubacin, inocular un caldo triptfano o agua peptonada con
NaCl.
2. Incubar a 35C por 24-48 horas en aerobiosis.
3. Transcurrido este tiempo, aadir 15 gotas del reactivo de Kovacs y agitar suavemente el tubo. Si se va utilizar
el reactivo de Erlich, previamente se debe agregar 1 ml de xilol, agitar suavemente el tubo y agregar luego el
reactivo de Erlich (15 gotas).
Lectura e interpretacin: (Lmina 37 )
Prueba positiva: el desarrollo de un anillo rojo en la capa alcohlica, dentro de segundos posteriores a la
adicin del reactivo es indicativo de la presencia de indol y la prueba es positiva; lo que revela que la bacteria
posee el complejo enzimtico de la triptofanasa.
Prueba negativa: no se produce color en la capa alcohlica (toma el color del reactivo). La bacteria carece del
complejo enzimtico de la triptofanasa.
Ureasa
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de producir la enzima ureasa
(rea amidohidrolasa). sta, hidroliza la rea con la produccin de dixido de carbono, agua y dos molculas
de amonaco. El amonaco reacciona en solucin para formar carbonato de amonio, lo que da como resultado
alcalinizacin del medio, haciendo virar el indicador de pH (rojo de fenol) a un color fucsia intenso.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Urea de Christensen
Peptona...........................................................................................................1,00 g
Glucosa...........................................................................................................1,00 g
Fosfato monopotsico.....................................................................................8,00 g
Urea..............................................................................................................20,00 g
Rojo de fenol................................................................................................0,012 g
82
Agar..............................................................................................................15,00 g
Agua destilada.......................................................................................1.000,00 ml
pH final: 6,8 + 0,2
Procedimiento:
Sembrar por estras slo la superficie del bisel (plano inclinado del agar) con un inculo denso del
microorganismo de prueba. No debe hacerse puncin del taco porque ste sirve para control del color. Incubar a
35C por 24-48 horas en aerobiosis.
Lectura e interpretacin: (Lmina 38)
Prueba positiva: se observa un color fucsia intenso en todo el medio, o slo en el bisel, provocado por la
liberacin de amonaco a partir de la hidrlisis enzimtica de la rea.
Prueba negativa: no se produce cambio de color (el medio permanece amarillo plido). La bacteria no posee
la enzima ureasa.
Citrato
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de utilizar citrato de sodio como
nica fuente de carbono y, sales inorgnicas de amonio, como nica fuente de nitrgeno. Las sales de amonio
(fosfato de amonio) son degradadas a amonaco (NH3), provocando la alcalinizacin del medio por la produccin
de hidrxido de amonio; lo que se evidencia por el cambio de color del indicador de pH que contiene el medio,
azul de bromotimol, de verde (pH neutro) a azul (pH alcalino).
Medios y reactivos:
Medio: Agar Citrato de Simmons
Fosfato dehidrogenado de amonio..................................................................1,00 g
Fosfato dipotsico...........................................................................................1,00 g
Citrato de sodio...............................................................................................2,00 g
Sulfato de magnesio.......................................................................................0,20 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
Azul de bromotimol........................................................................................0,08 g
Agua destilada........................................................................................1000,00 ml
pH final: 6,9+ 0,2
Procedimiento:
Inocular la superficie del bisel del medio agar citrato. Incubar a 35C por 2448 horas en aerobiosis. A
veces es necesaria una incubacin ms prolongada.
Resultados e interpretacin: (Lmina 39)
Prueba positiva: crecimiento con la aparicin de un color azul intenso en el bisel. Indica que el microorganismo
utiliza el citrato como nica fuente de carbono para crecer.
Prueba negativa: no se observa crecimiento, ni cambio de color (el medio se observa verde). Indica que el
microorganismo no utiliza el citrato como nica fuente de carbono.
Nota: Esta prueba tambin puede realizarse en medio lquido (caldo citrato) o en placas con agar citrato. El mismo
fundamento es aplicable a otros sustratos que pueden ser utilizados por las bacterias como nica fuente de carbono
para crecer, tales como: acetato de sodio, malonato de sodio, y acetamida, entre otros.
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Movilidad
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar si un microorganismo es mvil o no. Generalmente, las bacterias son
mviles debido a la presencia de flagelos, los cuales son ms frecuentes en bacilos; aunque existen cocos mviles.
Las bacterias no mviles, carecen de flagelos. La presencia y disposicin de los flagelos es una caracterstica til
para la identificacin de bacterias en el laboratorio.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Movilidad
Triptosa...........................................................................................................10,0 g
Agar..................................................................................................................5,0 g
Agua destilada.........................................................................................1.000,0 ml
Procedimiento:
pH final: 7,2 + 0,2
Utilizando un cultivo puro del microorganismo en estudio y con ayuda de un asa en punta, inocular el
medio por puncin vertical del taco en la parte central del agar sin llegar al fondo, teniendo la precaucin de
retirar el asa siguiendo la misma trayectoria por donde se introdujo. La temperatura de incubacin es fundamental,
generalmente, es de 35C por un tiempo de 24-48 horas en aerobiosis. Algunas bacterias expresan la movilidad a
temperatura ambiente y no a 35C.
Se recomienda utilizar sales de tetrazolio (cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio, TTC al 0,005%) para ayudar
a detectar la movilidad, en particular cuando es difcil la interpretacin. Las sales de tetrazolio son incoloras; pero
cuando el microorganismo crece, el colorante es incorporado en el interior de las clulas bacterianas donde es
reducido a un pigmento rojo insoluble, el formazn. El color rojo se forma slo en la zona del medio de cultivo
donde crecen las bacterias.
Prueba positiva: los organismos mviles migran de la lnea de siembra y difunden de forma radial en el medio, provocando turbidez. Indica que el microorganismo posee flagelos.
Prueba negativa: sin movilidad, crecimiento slo en la lnea de inoculacin. El medio se mantiene claro.
Indica que el microorganismo no posee flagelos.
Decarboxilacin de Aminocidos (Lisina, Arginina y Ornitina)
Fundamento:
Esta prueba se usa para determinar si un microorganismo posee enzimas decarboxilasas que le permiten
extraer el grupo carboxilo de un aminocido y formar aminas con la consiguiente alcalinizacin del medio.
La decarboxilacin es el proceso por el cual, las bacterias que poseen enzimas decarboxilasas (especficas
para cada sustrato) son capaces de atacar a los aminocidos en su grupo carboxilo terminal (COOH), generando
una amina (diamina) y CO2 como producto secundario.
Las enzimas decarboxilasas son numerosas y cada una es especfica para un sustrato determinado. En
un laboratorio de bacteriologa, las decarboxilasas ms importantes utilizadas para la identificacin bacteriana
son: Lisina Decarboxilasa y Ornitina Decarboxilasa. La reaccin de la arginina es mediada ms bien por una
Arginina Dehidrolasa.
La lisina sufre la decarboxilacin para producir cadaverina (una diamina) y anhdrido carbnico por
accin de la enzima especfica lisina-decarboxilasa.
La ornitina es decarboxilada por la enzima ornitina-decarboxilasa produciendo putrescina (diamina) y
anhdrido carbnico.
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La arginina es catabolizada en un proceso a travs de dos pasos: la arginina, primero es dehidrolizada

a citrulina, que luego se convierte en ornitina. La ornitina luego se decarboxila a putrescina, que produce los
mismos cambios en el indicador de pH, como se mencion para los otros aminocidos.
Las decarboxilasas son enzimas adaptativas o inducibles, formadas por el organismo en un medio cido
en presencia de sustrato especfico, y los productos de la decarboxilacin provocan una desviacin del pH hacia
la alcalinidad. La decarboxilacin ocurre anaerbicamente, es un proceso irreversible, no oxidativo, que requiere
fosfato de piridoxal como coenzima.
Medios y Reactivos:
Medio: Caldo Base de Meller
Peptona...........................................................................................................5,00 g
Extracto de carne............................................................................................5,00 g
Prpura de bromocresol....................................................................................0,1 g
Rojo de cresol.............................................................................................. 0,005 g
Glucosa.............................................................................................................0,5 g
Fosfato de piridoxal......................................................................................0,005 g
L-Aminocidos*.............................................................................................10,0 g
*Agregar 10 g (concentracin al 1%) del aminocido deseado:
1. L-(+)+-diclorhidrato de Lisina
2. L-(+)+-diclorhidrato de Ornitina
3. L-(+)+-monoclorhidrato de Arginina
pH final: 6,0 + 0,2
El caldo de Meller es la base que se emplea con mayor frecuencia contiene una pequea cantidad de
glucosa, de tal manera, que el microorganismo al crecer, fermenta la glucosa y produce cido (el medio que
originalmente es de color prpura, cambia a amarillo). Si el aminocido es decarboxilado, se forman compuestos
alcalinos (aminas) y el medio revierte a su color prpura original.
Procedimiento:
Inocular el caldo decarboxilasa de Meller con un cultivo puro del microorganismo de prueba (usar un
inculo liviano). Con cada batera de investigacin, inocular un tubo control de caldo base que contiene glucosa sin
aminocido (Control de Decarboxilacin, DC). Agregar a todos los tubos, incluyendo el control, 1 ml de petrolato
o parafina estril. En estas condiciones, el oxgeno del medio es consumido por el microorganismo y esto controla
el pH (la reaccin slo ocurre en medio cido y en anaerobiosis). Incubar los tubos a 35C por 24-48 horas. A veces
se necesita una incubacin ms prolongada (de 6 a 10 das) para demostrar reacciones dbiles debidas a la escasa
capacidad de decarboxilacin de un organismo.
Prueba positiva: la reaparicin de un color prpura en el caldo que contiene el aminocido, indica una prueba
positiva debido a la liberacin de aminas por la reaccin de decarboxilacin.
Prueba negativa: color amarillo. El microorganismo no posee la enzima decarboxilasa; slo ferment la
glucosa.
Control DC: color amarillo (siempre). La aparicin de color amarillo en el control DC indica que el
microorganismo es viable y que el pH del medio ha disminuido en forma suficiente como para activar la
decarboxilacin.
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Fenilalanina Deaminasa
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar si un organismo posee la enzima fenilalanina deaminasa, la cual es
capaz de producir la desaminacin oxidativa de la fenilalanina con produccin de cido fenil-pirvico y liberacin
de amonaco (NH3). La reaccin se evidencia mediante la deteccin de cido fenil-pirvico en el medio de prueba
a travs del agregado de una solucin de Cloruro frrico al 10%. Este compuesto acta como agente quelante con
el cido fenil-pirvico para dar un color verde debido a la formacin de una hidrazona. La exposicin de la prueba
al oxgeno atmosfrico despus de agregado el FeCl3 incrementa la velocidad de produccin y la intensidad de una
reaccin positiva.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Fenilalanina
DL-fenilalanina.................................................................................................2,0 g
Extracto de levadura.........................................................................................3,0 g
Fosfato disdico................................................................................................1,0 g
Agar................................................................................................................12,0 g
Reactivo: Cloruro Frrico (FeCl3) al 10%
pH final: 7,3 + 0,2
Cloruro frrico...............................................................................................10,00g
Agua destilada...........................................................................................100,00ml
Procedimiento:
Inocular el bisel del agar fenilalanina. Incubar a 35C por 24-48 horas. Transcurrido el tiempo de incubacin,
agregar 4 a 5 gotas del reactivo directamente a la superficie del agar sembrado. Hacer rotar suavemente el tubo para
que el reactivo impregne todo el crecimiento bacteriano sobre el bisel. En el trmino de 1 a 5 minutos se produce
la aparicin del color verde en el bisel.
Prueba positiva: color verde en el bisel; indicando la presencia de cido fenil- pirvico; el microorganismo
posee fenilalanina deaminasa. Se debe interpretar la reaccin inmediatamente, dado que el color producido es
inestable y se desvanece rpidamente.
Prueba negativa: no se produce cambio de color, el medio se mantiene amarillo debido al color del reactivo
FeCl3. El microorganismo no posee la enzima fenilalanina deaminasa.
Rojo de Metilo
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para probar la capacidad de un microorganismo de elaborar y mantener productos
finales cidos estables a partir de la fermentacin de la glucosa, superando la capacidad amortiguadora del
sistema.
Esta prueba detecta la produccin de cidos fuertes, tales como: lctico, actico y frmico, a partir de la
glucosa, mediante la va de fermentacin de cidos mixtos. Slo los microorganismos capaces de mantener este pH
bajo despus de una incubacin prolongada (48-72 horas) superando el sistema amortiguador del pH del medio,
pueden denominarse rojo de metilo positivos.
El rojo de metilo es un indicador de pH con un espectro entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), detectando
cido a pH considerablemente ms bajos que otros indicadores comnmente utilizados en medios de cultivo
bacteriolgicos. Por ende, para producir un cambio de color, el microorganismo en estudio debe producir grandes
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cantidades de cido a partir de la fermentacin de hidratos de carbono.

Medios y reactivos:
Medio: Caldo MR/VP (Rojo de Metilo/Voges-Proskaer). Este medio tambin sirve para efectuar la prueba de
Voges-Proskaer que se estudiar posteriormente. Consiste en un caldo glucosado amortiguado.
Caldo MR/VP
Polipeptona.....................................................................................................7,00 g
Glucosa...........................................................................................................5,00 g
Fosfato dipotsico (buffer)............................................................................ 5,00 g
Reactivo: Rojo de Metilo
pH final: 6,9 + 0,2
Rojo de metilo..................................................................................................0,1 g
Alcohol etlico (95%)....................................................................................300 ml
Agua destilada...............................................................................................200 ml
Procedimiento:
Sembrar el caldo MR/VP con un inculo ligero a partir de un cultivo puro. Incubar a 35C por un tiempo
mnimo de 48 horas. En ocasiones, es necesario prolongar la incubacin hasta por 5 das. Transcurrido este tiempo,
divida el caldo con crecimiento en dos partes (utilice para este fin, tubos estriles), agregar a un tubo, el indicador
de pH rojo de metilo (aproximadamente, 5 gotas) directamente al caldo. La otra parte del cultivo en caldo ser
utilizada para la prueba de VogesProskaer.
Prueba positiva: color rojo estable. La aparicin de un color rojo que se mantiene en el caldo indica suficiente
produccin de cido para reducir el pH a 4,4 y constituye una prueba positiva. El microorganismo elabora
productos cidos estables a partir de la fermentacin de la glucosa.
Prueba negativa: color amarillo en el caldo. Indica que la acidez del medio no se mantiene, sino que los
productos cidos del metabolismo han sido transformados en otros compuestos.
Voges - Proskaer
Fundamento:
La prueba de Voges-Proskaer se basa en la deteccin de acetona (acetil-metil-carbinol), un producto final
neutro derivado del metabolismo de la glucosa. La acetona es un precursor de la produccin del 2,3-butanediol.
La formacin de acetona y 2,3-butanediol es un proceso reversible de reduccin-oxidacin, en el que
la acetona se convierte por reduccin en 2,3-butanediol ste es oxidado a acetona. En presencia de oxgeno
atmosfrico y medio alcalino, los productos finales neutros son oxidados a diacetilo, que es el reactante para
el color producido en la reaccin. En consecuencia, el diacetilo es un producto de oxidacin de la acetona. El
-naftol utilizado en la reaccin, sirve como intensificador del color para producir un complejo rojo.
La elaboracin de productos finales neutros a partir del metabolismo de la glucosa indica que el
microorganismo utiliza la va fermentativa del 2,3-butanediol (butilen-glicol).
Medios y reactivos:
Medio: Caldo RM/VP (ya descrito en la prueba de rojo de metilo).
Reactivos: -naftol (5%)
-naftol...........................................................................................................5,00 g
Alcohol etlico absoluto............................................................................100,00 ml
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KOH (40%):
Hidrxido de potasio....................................................................................40,00 g
Procedimiento:
Inocular el caldo RM/VP con el microorganismo de prueba. Incubar a 35C por un tiempo mnimo de 48
horas. Luego de este lapso, pasar una alcuota de 1 ml del caldo a un tubo de prueba estril. Aadir los reactivos
en el siguiente orden: 0,6 ml (12 gotas) de -naftol y luego, 0,2 ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo suavemente
para exponer el medio al oxgeno atmosfrico, a fin de oxidar la acetona y obtener una reaccin de color. Dejar
descansar el tubo, por lo menos, durante 10 a 15 minutos antes de intentar la interpretacin de la prueba. En
ocasiones se requiere una incubacin ms prolongada, hasta de 10 das.
Prueba positiva: est representada por la aparicin de un color rojo 15 minutos o ms despus de agregar los
reactivos, lo que indica la presencia de diacetilo, el producto de oxidacin de acetona. El microorganismo
genera productos neutros a partir de la fermentacin de la glucosa.
Prueba negativa: color amarillo en el caldo (el mismo color del reactivo). El microorganismo no genera
productos neutros a partir de la fermentacin de la glucosa.
Gas de Glucosa
Fundamento:
Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato especfico (glucosa), incorporado
a un caldo base de rojo de fenol, produciendo cido con gas visible.
Las bacterias que fermentan la glucosa con produccin de gas, se denominan aerognicas y las que no lo
producen, anaerognicas.
Cuando se utiliza un medio de cultivo en caldo con hidrato de carbono, se coloca un tubo de fermentacin
o tubo de Durham en posicin invertida, para evidenciar la produccin de gas. Una sola burbuja en el tubo de
Durham basta para registrar la produccin de gas.
Medios y reactivos:
Medio: Caldo base rojo de fenol con glucosa (1%)
Peptona.........................................................................................................10,00 g
Extracto de carne (opcional)...........................................................................1,00 g
Rojo de fenol................................................................................................0,018 g
Glucosa (1%)................................................................................................10,00 g
Procedimiento:
pH: 7,4 + 0,2
Inocular el caldo glucosa con un cultivo puro del microorganismo en prueba (inculo denso). Incubar a
35C durante 2448 horas en aerobiosis.
Prueba positiva: se observan burbujas de gas en el tubo de Durham o el medio se halla completamente
desplazado por el gas, dejando una parte vaca en el tubo invertido. El medio debe observarse cido (amarillo)
por la fermentacin de la glucosa. La bacteria es aerognica.
Prueba negativa: no se observan burbujas de gas; aunque debe haber acidez, pues el microorganismo puede
fermentar la glucosa sin liberar gas. La bacteria es anaerognica (fermenta el carbohidrato sin produccin de
gas).
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Coagulasa
Fundamento:
Esta prueba se usa para detectar si el microorganismo posee la enzima coagulasa. La coagulasa es una
protena de composicin qumica desconocida, con actividad semejante a la protrombina, capaz de convertir el
fibringeno en fibrina, produciendo un cogulo visible en un medio con plasma.
La coagulasa est presente en dos formas, libre y ligada (unida), cada una con diferentes propiedades que
requieren el uso de pruebas separadas:

Coagulasa ligada (Prueba en portaobjetos): la coagulasa ligada, tambin denominada Factor de Agregacin,
est unida a la pared de la clula bacteriana y no se encuentra presente en los filtrados de cultivos. Las hebras
de fibrina se forman entre las clulas bacterianas suspendidas en el plasma (fibringeno), haciendo que se
agrupen en agregados visibles cuando se observan en la prueba del portaobjetos. La actividad de la coagulasa
ligada no es inhibida por los anticuerpos formados contra la coagulasa libre. Tiene la capacidad de convertir al
fibringeno en fibrina directamente, sin intervencin de los factores plasmticos.

Coagulasa Libre (Prueba en tubo): la coagulasa libre es una sustancia semejante a la trombina presente
en el filtrado de cultivos. Cuando una suspensin de bacterias productoras de coagulasa se mezcla con igual
cantidad de plasma en un tubo de prueba, se forma un cogulo visible como resultado del empleo de los factores
plasmticos de la coagulacin, de manera semejante a cuando se agrega trombina.
Medios y reactivos:
Medio: Plasma humano que puede obtenerse de una muestra de sangre fresca o plasma de conejo,
liofilizado, preparado comercialmente, porque es ms fcil mantener el control de calidad. No deben usarse
productos de sangre que contengan citrato como anticoagulante, porque aquellos microorganismos que utilizan el
citrato, pueden liberar calcio y causar resultados falsos-positivos.
Procedimiento:

Prueba en Portaobjetos (Coagulasa Ligada): se coloca una gota de una suspensin bacteriana en SSF estril
sobre una lmina portaobjetos. Se coloca una gota del plasma reconstituido al lado de la gota de la suspensin
bacteriana. Se mezcla. Imprimir al portaobjetos un suave movimiento de rotacin hacia delante y hacia atrs,
observando la inmediata formacin de un precipitado granular.

Prueba en tubo (Coagulasa libre): en forma asptica, se colocan 0,5 ml de plasma humano o de conejo
reconstituido en el fondo de un tubo de prueba estril. Se agregan 0,5 ml de un cultivo puro en caldo soya
tripticasa o caldo infusin cerebro-corazn, de 18 a 24 horas del microorganismo en estudio. Alternativamente,
pueden resuspenderse en el plasma varias colonias del microorganismo de prueba. Se mezcla con suavidad
rotando el tubo, con la precaucin de no revolver o sacudir la mezcla. Se incuba el tubo a 37C por 18-24 horas.
Se recomienda revisar peridicamente la prueba, por ejemplo, cada cuatro horas para evidenciar la produccin
de un cogulo visible a simple vista.
Lectura e interpretacin:
Prueba en Portaobjetos:

Prueba Positiva: se detecta, por lo general, en 15 a 20 segundos, con la aparicin de un precipitado granular.
Indica que el microorganismo posee coagulasa ligada.

Prueba negativa: no se observa agregacin en 2-3 minutos. Indica que el microorganismo carece de coagulasa
ligada. Esta prueba se considera slo presuntiva y todos los resultados negativos o positivos tardos, deben ser
verificados con la prueba en tubo, porque algunas cepas de Staphylococcus aureus producen slo coagulasa
libre que no reacciona en la prueba en lmina.
Prueba en Tubo: (Lmina 47):

Prueba positiva: la reaccin se considera positiva si se observa cualquier grado de coagulacin visible del
plasma. Esta prueba se observa mejor inclinando suavemente el tubo. El cogulo o gel permanecer en el fondo
de ste si la prueba es positiva. Indica que el microorganismo posee la enzima coagulasa libre.
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Algunos microorganismos pueden formar fibrinolisinas potentes que son capaces de disolver el cogulo
despus que ste se ha formado. En consecuencia, pruebas positivas pueden ser pasadas por alto si no se observa
el tubo a intervalos frecuentes.
Otras cepas pueden producir coagulasa suficiente como para dar slo resultados positivos tardos despus
de 18-24 horas de incubacin; por lo tanto, todas las pruebas negativas a las 4 horas deben observarse de nuevo
despus de 18 a 24 horas de incubacin.

Prueba negativa: no se evidencia formacin de cogulo; es decir, el plasma permanece lquido. La bacteria no
posee la enzima coagulasa libre.
Citocromo-oxidasa
Fundamento:
Esta prueba se fundamenta en determinar la presencia de la enzima intracelular citocromo-oxidasa
en la bacteria; utilizando la capacidad de algunos colorantes como el tetrametil--fenilendiamina o dimetil-fenilendiamina de actuar como sustitutos del oxgeno; es decir, como aceptores artificiales de los electrones
en la cadena respiratoria. Estos colorantes son incoloros en estado reducido y pueden oxidarse rpidamente en
presencia de citocromo-oxidasa y oxgeno atmosfrico, produciendo formas coloreadas (azul prpura o rosado,
respectivamente), lo que indica una reaccin positiva.
Los citocromos son protenas que forman parte de las cadenas transportadoras de electrones, propias del
metabolismo respiratorio. Actan como el ltimo eslabn en la cadena respiratoria aerobia transfiriendo electrones
(hidrgeno) al oxgeno, con la formacin de agua. El sistema de citocromos se halla en microorganismos aerbicos,
microaeroflicos y anaerbicos facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para identificar
microorganismos que carecen de la enzima o son anaerbicos obligados.
La prueba citada anteriormente, no debe realizarse en medios que contengan sangre; ya que los eritrocitos
contienen la enzima citocromo-oxidasa y pueden dar falsos positivos. No deben usarse asas o alambres de
inoculacin de acero inoxidable o nichrome para esta prueba porque productos de oxidacin superficial formados
al esterilizar el asa o alambre con la llama del mechero de Bunsen pueden dar como resultado reacciones falsopositivas (emplear asas de platino, o en su defecto, aplicadores de madera estriles). De igual manera, esta prueba
debe efectuarse en medios libres de inhibidores, por lo tanto, no debe realizarse a partir de cultivos en medios
selectivos o diferenciales que contengan una elevada concentracin de glucosa, ya que esta puede inhibir la
actividad de oxidasa.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Nutritivo
Digesto pancretico de tejido animal.............................................................1,00 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
Agua destilada.............................................................................................. 1,00Lt.
Reactivos:
pH final: 7,3 + 0,2
Clorhidrato de tetrametil--fenilendiamina (1%)

Tetrametil--fenilendiamina dihidrocloruro.....................................................1,0 g
Agua destilada.......................................................................................... .....1,0 Lt.
Clorhidrato de dimetil--fenilendiamina (1%)
Dimetil--fenilendiamina monohidrocloruro...................................................1,0 g
Agua destilada............................................................................................... 1,0 Lt.
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Procedimiento:
Usualmente, la prueba se lleva a cabo por medio de dos mtodos:
1. El mtodo directo en placa (Mtodo de Steel), en la que 2 3 gotas del reactivo se agregan directamente a
colonias bacterianas aisladas en un medio de agar nutritivo en placa.
2. El mtodo indirecto (Mtodo de Kovacs) con tira de papel de filtro, en la cual se agregan unas pocas gotas
del reactivo y luego, con un asa o aplicador de madera se coloca una pequea cantidad del microorganismo
de prueba.
Prueba positiva: cuando se utiliza el reactivo tetrametil, las colonias bacterianas que tienen actividad de
citocromo-oxidasa desarrollan un color azul intenso en el sitio de inoculacin en 10-15 segundos. El color se
va haciendo ms intenso hasta que se torna negro, en este punto, la bacteria es no viable. Cuando se utiliza el
derivado dimetil, la reaccin oxidasa positiva est indicada por la aparicin de un color rosado que se hace ms
intenso hasta llegar a negro. El microorganismo posee la enzima citocromo-oxidasa.
Prueba negativa: no se produce cambio de color en las colonias. El microorganismo carece de la enzima
citocromo-oxidasa.
TSI (Triple Azcar Hierro)
Fundamento:
Esta prueba utiliza un medio diferencial slido en tubo que tiene como propsito: 1) demostrar la
fermentacin de carbohidratos (glucosa, lactosa y sucrosa) con o sin la produccin de gas y 2) demostrar la
produccin de H2S.
Un microorganismo puede exhibir las siguientes reacciones: 1) fermentar solamente la glucosa; 2) fermentar
glucosa y lactosa; 3) fermentar glucosa y sucrosa; 4) fermentar glucosa, lactosa y sucrosa y, 5) no fermentar ningn
carbohidrato.
El medio contiene rojo de fenol como indicador de pH, el cual en medio alcalino es de color rojo, en medio
cido, es amarillo y, en medio neutro, toma una coloracin rojo-naranja. Debido a que el medio tiene taco y bisel;
presenta dos cmaras de reaccin: una anaerbica en el taco; ya que no est en contacto con el aire y, una aerbica
en el bisel, que est en contacto con el oxgeno atmosfrico. El medio contiene una proporcin de glucosa: lactosa
y sucrosa de 1:10; es decir, que para una concentracin de glucosa de 1 g/L; la concentracin de sucrosa y lactosa,
ser de 10 g/L para cada una.
Si el microorganismo fermenta slo la glucosa: se observa un TSI con bisel alcalino (Alc, rojo) y taco
cido (Ac, amarillo). Cuando esto ocurre, la cantidad de cido producida es poca (debido a que este carbohidrato
se encuentra en una pequea concentracin). Inicialmente, la cantidad de cido producida por la fermentacin
de la glucosa es suficiente para acidificar todo el medio (tanto el taco como el bisel); por lo que el indicador de pH
rojo de fenol cambia a amarillo; sin embargo, el bisel alcalino indica que se ha producido la degradacin aerbica
(va descarboxilacin oxidativa) de las peptonas. Esto obedece a que, despus de 18-24 horas de incubacin, la
baja concentracin de glucosa ha sido consumida y el microorganismo comienza a utilizar las peptonas para su
crecimiento. El catabolismo de las peptonas produce liberacin de amonaco (NH3) dando un pH alcalino con el
rojo de fenol (indicador de pH). Sin embargo, el taco cido indica degradacin anaerbica de la glucosa. Aqu se
forman productos terminales cidos, dando un pH cido.
Si el microorganismo fermenta adems de la glucosa, sucrosa y/o lactosa: se observa un TSI Ac/Ac.
Estos carbohidratos se encuentran en una concentracin diez veces mayor que la de glucosa. En un perodo de 1824 horas, an no se han consumido completamente y permanece una condicin cida en el bisel; ya que los lcalis
producidos a partir de la degradacin aerbica de las peptonas no son suficientes para revertir la acidez producida
por la fermentacin de los carbohidratos, por lo que todo el medio (taco y bisel) sern de color amarillo (cido).
Si el microorganismo no fermenta ningn carbohidrato: el TSI se observa ALc/Neutro (ALc/N)
Alc/Alc. Algunos microorganismos, sobre todo los BGNNF son incapaces de fermentar los carbohidratos presentes
en el medio, por lo que, recurren a las peptonas para obtener sus nutrientes. Cuando las peptonas son degradadas se
produce un pH alcalino por la liberacin de amonaco que imparte al medio un color rojo intenso. Estas peptonas
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pueden ser degradadas por va anaerbica y aerbica, dando una reaccin Alc/Alc , por va aerbica solamente,
produciendo una reaccin Alc/N.
Produccin de gas: Se puede determinar si el microorganismo produce gas como producto terminal del
metabolismo de los carbohidratos. La bacteria que produce gas (CO2+H2) se denomina aerognica, lo que se
manifiesta por el desdoblamiento del medio, la presencia de burbujas de gas, desplazamiento total del medio del
fondo del tubo dejando una lnea clara o una ligera muesca del medio en el costado del tubo. Si la bacteria no
produce gas, se denomina anaerognica.
Produccin de H2S: Otro sistema de diferenciacin presente en el TSI, est constituido por indicadores
de la produccin de H2S (sulfuro de hidrgeno). Este es un gas que producen los microorganismos a travs de la
desasimilacin, bajo condiciones anaerbicas, de aminocidos que contienen azufre (metionina, cistina y cistena) o
a travs de la reduccin de compuestos sulfurados inorgnicos (tiosulfato, sulfito y sulfato). Tales microorganismos
poseen enzimas que reducen el tomo de azufre de compuestos inorgnicos sulfurados o remueven el grupo sulfuro
de aminocidos azufrados, tal como: la cistena desulfurasa; que hidroliza a la cisteina produciendo H2S. Las sales
de hierro (citrato frrico) y el tiosulfato de hierro reaccionan con el sulfuro de hidrgeno (gas incoloro) para formar
sulfuro ferroso, que se evidencia por la aparicin de un precipitado negro.
La produccin de H2S puede detectarse en otros medios, adems del TSI; como por ejemplo, el Peptona
Hierro Agar (PIA), Kliger Hierro Agar (KIA), Lisina Hierro Agar (LIA) y las tiras impregnadas con sales de plomo. Estas ltimas, no son muy utilizadas, debido a su toxicidad.
Medios y reactivos:
Medio: Triple Azcar Hierro (TSI).
Extracto de levadura.......................................................................................3,00 g
Peptona.........................................................................................................20,00 g
Lactosa..........................................................................................................10,00 g
Sucrosa.........................................................................................................10,00 g
Glucosa...........................................................................................................1,00 g
Citrato frrico amnico...................................................................................0,20 g
Tiosulfato de sodio.........................................................................................0,30 g
Agar..............................................................................................................12,00 g
Rojo de fenol................................................................................................0,024 g
Agua destilada........................................................................................1000,00 ml
Procedimiento:
pH: 7,4 + 0,2
A partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba, inocular el TSI con el asa en punta, punzando
primero el taco y luego, estriando sobre el bisel o viceversa (la puncin del taco debe llegar hasta el fondo). Incubar
a 35C por 24-48 horas.
Lectura e interpretacin: En la lectura del TSI, se debe indicar siempre cual es el taco y cual, el bisel. Adems,
se debe leer y reportar la presencia o no de gas y/o H2S (Lmina 49).

Bisel: Alc; Taco: Ac; H2S: +/-; Gas: +/-: Indica que el microorganismo slo fue capaz de fermentar la glucosa;
con o sin produccin de H2S y con o sin la produccin de gas.

Bisel: Ac; Taco: Ac; H2S: +/-; Gas: +/-: Indica que el microorganismo fue capaz de fermentar la glucosa;
lactosa y/o sucrosa; con o sin produccin de H2S y con o sin la produccin de gas.
92

Bisel: Alc; Taco: Alc Bisel: Alc; Taco: N; H2S: -; Gas: -: Indica que el microorganismo no fermenta ningn
carbohidrato;sin produccin de H2S y sin la produccin de gas. Ocurri degradacin de las peptonas.
LIA (Lisina Hierro Agar)
Fundamento:
Esta prueba se usa para determinar si un bacilo gramnegativo decarboxila o deamina la lisina. Adems,
permite detectar la produccin de gas a partir de la fermentacin de la glucosa y la formacin de cido sulfhdrico
(H2S). Cuando la glucosa es fermentada, el taco y el bisel se vuelven cidos (amarillos). Si el organismo produce
lisina decarboxilasa, se forma una amina (cadaverina) que neutraliza los cidos orgnicos formados por la
fermentacin de la glucosa y, el taco revierte al estado alcalino (prpura). Si no ocurre decarboxilacin, el taco
permanece cido.
Cuando ocurre desaminacin oxidativa de la lisina, se forma cido -cetocarboxlico, el cual reacciona
con las sales de hierro (citrato frrico amnico) cerca de la superficie del medio (en presencia de oxgeno) y en
presencia de flavina mononucletido, lo que se evidencia por la aparicin de un color rojo (borgoa) en el bisel
del medio.
El medio posee tambin un sistema para detectar la produccin de H2S (citrato frrico amnico y tiosulfato
de sodio); los microorganismos que producen sulfuro de hidrgeno causan el ennegrecimiento del medio debido
a la produccin de sulfuro ferroso.
La produccin de gas a partir de la fermentacin de la glucosa tambin puede evidenciarse en el medio, de
igual manera, como ocurre en el TSI (ya estudiado anteriormente).
Medios y reactivos:
Medio: Lisina Hierro Agar (LIA)
Peptona...........................................................................................................5,00 g
Dextrosa..........................................................................................................1,00 g
Hidrocloruro de L-lisina...............................................................................10,00 g
Citrato frrico amnico...................................................................................0,50 g
Tiosulfato de sodio.........................................................................................0,04 g
Prpura de bromocresol..................................................................................0,02 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
Procedimiento:
pH: 6,7 + 0,2
Con un asa en punta, inocular por puncin hasta el fondo y estriar el bisel del LIA (o viceversa), teniendo
la precaucin de pinchar varias veces el taco. Incubar a 35C por 18-24 horas. Transcurrido este tiempo, proceder
a su lectura e interpretacin.
Lectura e interpretacin: En la lectura del LIA, al igual que en el caso del TSI, se debe indicar siempre cual es el
taco y cual, el bisel. Adems, se debe leer y reportar la presencia o no de gas y/o H2S (Lmina 50).
Bisel: Alc; Taco: Ac; H2S: +/-; Gas: +/-: Se observa el taco cido (de color amarillo) y el bisel alcalino (de
color prpura). Indica que el microorganismo no es capaz de decarboxilar, ni deaminar la lisina. Puede o no
haber produccin de H2S y gas.
Bisel: Alc; Taco: Alc o Bisel: Alc; Taco: N; H2S: +/-; Gas: +/-: Se observan alcalinos (prpura) tanto el taco,
como el bisel. Indica que el microorganismo es capaz de decarboxilar la lisina. Puede o no haber produccin
de H2S y gas.
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Bisel: Rojo; Taco: Ac; H2S: +/-; Gas: +/-:: Esta es la nica reaccin del LIA que se lee por color, bisel rojo y
taco cido. Indica que el microorganismo deamina la lisina.
Oxidacin Fermentacin de la Glucosa (OF-Glucosa)
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar por cual va utiliza la glucosa un microorganismo (fermentativa u
oxidativa) o si no la utiliza.
Algunas bacterias catabolizan la glucosa por va oxidativa, produciendo dixido de carbono y agua. El
catabolismo oxidativo requiere la presencia de oxgeno molecular (O2). La mayora de las bacterias; sin embargo,
pueden fermentar la glucosa sin utilizar el oxgeno. El catabolismo fermentativo no requiere oxgeno; aunque
puede ocurrir en su presencia. Los productos finales de la fermentacin son generalmente, pequeas molculas de
cidos orgnicos.
En esta prueba se emplea el medio basal de Rudolph Hugh y Einar Leifson al cual se le aade glucosa
(OF-glucosa). El medio de oxidacin/fermentacin (OF) es un medio semislido en taco (0,25-1,5% de agar)
que contiene una elevada concentracin de glucosa (0,5-1%) y una baja concentracin de peptonas (0,2-1%).
Las peptonas sustentarn el crecimiento de las bacterias no oxidativas, no fermentadoras (que no utilizan los
carbohidratos). El medio contiene azul de bromotimol como indicador de pH, el cual se torna amarillo en medio
cido, evidenciando el catabolismo del carbohidrato. Las condiciones alcalinas debidas al uso de las peptonas y no
de los carbohidratos, se detectan por la aparicin de un color azul intenso.
La baja relacin peptona-hidratos de carbono, reduce la formacin de aminas alcalinas capaces de neutralizar
la escasa cantidad de cidos dbiles que pueden formarse por el metabolismo oxidativo. El contenido relativamente
mayor del carbohidrato permite incrementar la cantidad de cidos que pueden formarse potencialmente. La
consistencia semislida del agar permite que los cidos que se forman en la superficie del agar infiltren todo el
medio, lo que facilita la visualizacin del cambio de pH del indicador.
Medios y Reactivos:
Medio: Medio basal de Hugh y Leifson
Peptona...........................................................................................................2,00 g
D-glucosa......................................................................................................10,00 g
Azul de bromotimol........................................................................................0,03 g
Agar................................................................................................................2,50 g
Fosfato dipotsico...........................................................................................0,30 g
Agua destilada............................................................................................. 1,00 Lt.
Procedimiento:
pH: 7,1 + 0,2
Para la prueba de OF-glucosa se requieren dos tubos, cada uno inoculado con el microorganismo en
estudio, usando un asa en punta, punzando el taco varias veces (3 a 4) hasta la mitad (sin llegar al fondo). Aadir a
un tubo de cada par, una capa de 1 cm. de aceite mineral o parafina lquida estril. Ambos tubos se incuban a 35C
y se examinan a diario por varios das.
La produccin de cidos se detecta por la aparicin de un color amarillo. Los siguientes son los patrones
de reacciones:
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Tubo
Abierto
Tubo Cerrado
cido
Neutro
Oxidativo
cido
cido
Fermentativo
Alcalino
Neutro
Neutro
Inactivo
Lectura del OF-glucosa
Interpretacin
La bacteria metaboliza la glucosa por va
oxidativa
La bacteria metaboliza la glucosa por va
fermentativa
La bacteria no metaboliza la glucosa por
ninguna va; utiliza las peptonas para su
crecimiento.
NOTA: Esta prueba tambin puede hacerse con otros azcares, tales como: xilosa, maltosa, fructosa y manitol;
entre otros.
Fermentacin de Carbohidratos
Fundamento:
Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato especfico produciendo cido.
El carbohidrato puede estar representado por: azcar, polihidroxialcohol, glucsido o sal de cido orgnico
especfico.
Medios y reactivos:
Medio: Caldo base rojo de fenol
Peptona.........................................................................................................10,00 g
Extracto de carne (opcional)...........................................................................1,00 g
Rojo de fenol................................................................................................0,018 g
Carbohidrato................................................................................................. 0,5-1%
pH: 7,4 + 0,2
Carbohidratos que pueden probarse adems de glucosa: manitol, sorbitol, inositol, adonitol, dulcitol,
sucrosa, lactosa, fructosa, xilosa, salicin, ramnosa, galactosa, glucosa, trehalosa, arabinosa, rafinosa, celobiosa,
inulina y melobiosa.
Procedimiento:
Inocular aspticamente los caldos con carbohidratos a partir de un cultivo puro del microorganismo
de prueba. Incubar a 35C por 24-48 horas en aerobiosis. En ocasiones, puede requerirse una incubacin ms
prolongada para considerar negativo un resultado.
Prueba positiva: se observa acidez en el medio (hay cambio de color, el medio se torna amarillo). El microorganismo ferment el carbohidrato probado.
Prueba negativa: el medio se observa alcalino (rojo), se produce crecimiento (turbidez); pero no hay cambio
de color del indicador. El microorganismo no ferment el carbohidrato probado.
Reduccin de Nitratos a Nitritos:
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de reducir los nitratos a nitritos
por accin de la enzima nitrato reductasa y mediante el agregado de los reactivos: cido sulfanlico y -naftilamina. El cido sulfanlico y los nitritos reaccionan y forman una sal de diazonio. A continuacin, la sal de diazonio
se une con la -naftil-amina para producir un colorante azoico rojo (-sulfobenceno-azo--naftil-amina).
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Medios y reactivos:
Medio: Caldo Nitrato
Peptona...........................................................................................................5,00 g
Nitrato de potasio (KNO3)............................................................................. 1,00 g
pH: 7,00 + 0,2
-naftil-amina
-naftil-amina................................................................................................ 5,00 g
Acido actico (5N), 30%............................................................................. 1,00 Lt.
Acido sulfanlico
Acido sulfanlico............................................................................................8,00 g
Acido actico (5N), 30%............................................................................. 1,00 Lt.
Procedimiento:
Inocular el caldo nitrato con el microorganismo en estudio. Incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al
terminar la incubacin, agregar 1 ml de cada uno de los reactivos: cido sulfanlico y -naftil-amina.
Prueba positiva: la aparicin de un color rojo en los 30 segundos posteriores al agregado de los reactivos,
indica la presencia de nitritos y representa una reaccin positiva.
Prueba negativa: si no aparece color rojo luego del agregado de los reactivos, esto puede indicar que los nitratos
no han sido reducidos (una verdadera reaccin negativa) o que han sido reducidos a otros productos, como
amonaco, nitrgeno molecular (denitrificacin), xido ntrico (NO) u xido nitroso (N2O) e Hidroxilamina.
Dado que los reactivos de prueba detectan slo nitritos, este ltimo proceso llevara a una lectura falsa
negativa. Por ende, es necesario agregar una pequea cantidad de polvo de zinc a todas las reacciones aparentemente,
negativas. Los iones de zinc reducen los nitratos a nitritos y la aparicin de color rojo despus del agregado del zinc
indica la presencia de nitratos residuales y confirma una reaccin verdaderamente negativa.
Por otra parte, si hay reduccin del nitrato a nitrgeno molecular, no hace falta agregar los reactivos y se
observara desplazamiento de lquido en el tubo de Durham.
Lectura
Interpretacin
La bacteria posee la enzima nitrato reductasa y redujo los nitratos a

nitritos
La bacteria posee la enzima nitrato reductasa y redujo los nitratos a
Burbuja en el tubo de Durham: Positivo
N2
No hay cambio de color al agregar el polvo de Zinc: La bacteria posee la enzima nitrato reductasa y redujo los nitratos a
Positivo
compuestos diferentes al N2 y nitritos
La bacteria no posee la enzima nitrato reductasa; fue el polvo de
Color rojo al agregar el polvo de Zinc: Negativo
zinc quien redujo los nitratos a nitritos
Color rojo al agregar los reactivos: Positivo
Bilis Esculina
Fundamento:
Esta prueba se basa en verificar si la bacteria tiene la capacidad de hidrolizar el glucsido esculina a
96
esculetina y glucosa en presencia de 1-4% de sales biliares (equivalentes a 10-40% de bilis), por accin de la
enzima esculinasa.
La esculetina reacciona con las sales de hierro presentes en el medio (citrato frrico) y forma un complejo
fenlico frrico, de color marrn oscuro o negro que difunde en el medio.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Bilis-Esculina
Peptona...........................................................................................................5,00 g
Esculina..........................................................................................................1,00 g
Sales biliares.................................................................................................40,00 g
Citrato frrico.................................................................................................0,50 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
pH final: 6,6 + 0,2
El medio de Bilis-Esculina habitualmente se prepara en agar inclinado en tubos; aunque tambin se ha
utilizado con xito en placas de agar y en caldo.
Procedimiento:
Inocular la superficie del bisel del agar bilis-esculina con un cultivo puro del microorganismo en prueba; o
en su defecto, sembrar la superficie de una placa de agar, o un medio en caldo. Incubar a 35C por 24- 48 horas. Si
la prueba es para un presunto enterococo, debe incubarse a 42C; pues en este caso, la prueba determina adems,
la capacidad del microorganismo de crecer a temperaturas elevadas.

Prueba positiva: se observa el ennegrecimiento difuso en el medio; o un halo negro o marrn alrededor de las
colonias en la placa de agar. Indica que el microorganismo posee la enzima esculinasa.

Prueba negativa: no se ha producido el ennegrecimiento del medio. Puede producirse crecimiento; pero
esto no indica la descomposicin de la esculina; solamente indica que la concentracin de bilis no inhibi el
crecimiento de los organismos; pero carecen de la enzima esculinasa.
Catalasa
Fundamento:
Esta prueba se usa para determinar si un microorganismo posee la enzima catalasa que descompone el
perxido de hidrgeno (H2O2) en agua y oxgeno, reaccin que se evidencia por el desprendimiento de burbujas
de gas (efervescencia).
El perxido de hidrgeno es uno de los productos oxidativos finales en el metabolismo aerobio de los
carbohidratos. Si se acumula, el perxido de hidrgeno es letal para las clulas bacterianas. Salvo los estreptococos,
la mayor parte de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad de catalasa. La mayora de las
bacterias anaerobias que descomponen el H2O2 lo hacen mediante enzimas peroxidasas, que actan en forma
semejante a la catalasa.
Medios y reactivos:
Medio:
Se prefiere utilizar Agar nutritivo (AN)(ya descrito en la prueba de oxidasa). No deben utilizarse medios
que contengan sangre; ya que los eritrocitos poseen la enzima catalasa, pudiendo producir resultados falsos
positivos.
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Reactivo: Perxido de Hidrgeno (3%)

Perxido de hidrgeno, 30% (Superoxol)............................................................10 ml
Agua destilada......................................................................................................90 ml
Procedimiento:
Existen dos mtodos para efectuar esta prueba:
1.
Prueba en portaobjetos: transferir con el asa o un aplicador de madera, una pequea porcin de una
colonia bien aislada, a la superficie de una lmina portaobjetos. Agregar una o dos gotas del H2O2 (3%).
Se recomienda que el microorganismo no sea agregado al reactivo (revirtiendo el orden), en especial, si se
utilizan asas con contenido de hierro; porque pueden haber resultados falsos-positivos.
2.
Prueba en tubo o placa de agar: Agregar unas gotas del reactivo (alrededor de 1 ml) directamente sobre
la superficie del agar en placa o en bisel.
Lectura e interpretacin: (Lmina 55a y 55b)

Prueba positiva: La produccin rpida y sostenida de burbujas de gas o efervescencia constituye un
resultado positivo. El microorganismo posee la enzima catalasa.
Prueba negativa: no hay formacin de burbujas (no se libera O2). El microorganismo no posee la enzima
catalasa.
Hidrlisis del Hipurato
Fundamento:
Esta prueba se fundamenta en determinar si el microorganismo posee la enzima hipuricasa (hipurato
hidrolasa), que puede hidrolizar el cido hiprico, con la formacin de benzoato de sodio y glicina. La hidrlisis
del cido hiprico puede detectarse por dos mtodos:
1. Prueba lenta para detectar Benzoato (cido benzoico) usando cloruro frrico al 12%: el cloruro frrico
precipita las protenas, el hipurato y el benzoato; sin embargo, las protenas y el hipurato son ms solubles
que el benzoato en un exceso de cloruro frrico. As, la presencia de un precipitado en un caldo de cultivo
con hipurato despus de agregar cloruro frrico en exceso, indica la presencia de benzoato y una reaccin
positiva para la hidrlisis del hipurato. La cantidad de precipitado depende del grado en que el hipurato sea
hidrolizado.
2. Prueba rpida para detectar glicina usando Ninhidrina como reactivo: la ninhidrina es un fuerte agente
oxidante que deamina los grupos -amino con liberacin de NH3 y CO2. El amonaco liberado reacciona con
la ninhidrina residual y produce un color prpura. La ninhidrina puede usarse para detectar glicina, el nico
compuesto -amino formado en la prueba del hipurato, indicando hidrlisis. La prueba es sensible, rpida y a
menudo, puede interpretarse despus de 2 horas de incubacin.
Medios y reactivos:
Deteccin de Benzoato :
Medio: Caldo Hipurato de Sodio:
Caldo infusin corazn.................................................................................10,00 g
Hipurato de sodio.........................................................................................10,00 g
pH final: 7,4 + 0,2
Reactivo: Cloruro Frrico (12%):
FeCl36H2O....................................................................................................12,00 g
Acido clorhdrico concentrado...................................................................40,00 ml
98
Deteccin de Glicina :
Medio: Solucin acuosa de Hipurato de sodio (1%)
Hipurato de sodio...........................................................................................1,00 g
Reactivo: Ninhidrina:
Ninhidrina.......................................................................................................3,50 g
Acetona/Butanol (1:1)............................................................................. 100,00 ml
Procedimiento:

Deteccin de Benzoato: Inocular un caldo hipurato de sodio con el microorganismo en estudio, incubar a 37C
durante 18-24 horas. Centrifugar el medio (10 minutos a 2.500 rpm) para compactar las clulas y trasvasar 0,8
ml del sobrenadante a un tubo de ensayo estril. Agregar 0,2 ml del reactivo (cloruro frrico) al tubo de prueba
y mezclar bien.

Deteccin de Glicina: Hacer una suspensin densa del microorganismo en estudio en 0,4ml de una solucin
de hipurato de sodio al 1%. Incubar a 37C por 2 horas. Agregar 0,2 ml (4 gotas). del reactivo (ninhidrina) y
mezclar bien. Reincubar a 37C por 10 minutos.
1.-Deteccin de Benzoato: despus del agregado del cloruro frrico se formar un precipitado denso. El resultado
de la prueba depende del tiempo que se mantenga ese precipitado (Lmina 56a).

Prueba positiva: si el precipitado persiste despus de 10 minutos; indica que se ha formado benzoato a partir
de la hidrlisis del hipurato por la enzima hipuricasa.

Prueba negativa: si la solucin se aclara dentro de los diez minutos siguientes a la adicin del reactivo, la
reaccin no es especfica y se debe a la interaccin con el hipurato no hidrolizado o con las protenas del medio;
por lo tanto, la prueba es negativa. El microorganismo carece de la enzima hipuricasa.
2.-Deteccin de Glicina: (Lmina 56b)
Prueba positiva: la aparicin de un color prpura despus del agregado de la ninhidrina indica la presencia
de glicina y un resultado positivo para la hidrlisis del hipurato. El color prpura debe aparecer dentro de los
diez minutos posteriores a la adicin del reactivo.
Prueba negativa: no aparece el color prpura, el medio permanece del color original. La bacteria no posee
la enzima hipuricasa.
Hidrlisis del Almidn
Fundamento:
Esta prueba se basa en la capacidad de la bacteria de hidrolizar el almidn contenido en el medio por
accin de la enzima amilasa que hidroliza el almidn a glucosa; a fin de que sta pueda atravesar la membrana
citoplasmtica y penetrar al interior de la clula. Una prueba cualitativa para detectar la hidrlisis del almidn
consiste en la aparicin de un color azul al aadir una solucin de iodo (lugol). Cuando el almidn es hidrolizado,
sus productos de degradacin (dextrina, maltosa o glucosa) no dan este color azul a la reaccin.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Almidn
Peptona.............................................................................................................5,0 g
Agar................................................................................................................15,0 g
99
Almidn soluble...............................................................................................2,0 g
pH final: 7,4 + 0,2
Las concentraciones de almidn sugeridas varan entre 0,2; 1 y 5%; se recomienda primera para el estudio
de bacterias anaerobias.
Reactivo: Solucin de Lugol (Iodo).
Cristales de yodo..............................................................................................1,0 g
Ioduro de Potasio..............................................................................................2,0 g
Procedimiento:
Inocular un agar almidn con el microorganismo de prueba (se recomienda inocular por estra nica ya
que se pueden estudiar varios cultivos en una misma placa, si se siembran desde el borde hacia el centro). Incubar
a 35C por 18-24 horas. Para evidenciar la hidrlisis del almidn, agregar a la placa, solucin de iodo; el almidn
intacto presente en el medio forma un complejo coloreado de azul.
Prueba positiva: la ausencia de color azul alrededor del crecimiento indica que el almidn ha sido hidrolizado
por accin de la amilasa; mientras que el resto del medio se vuelve azul.
Prueba negativa: el medio se vuelve azul hasta en la zona inoculada, indicando que el almidn no ha sido
hidrolizado; el microorganismo carece de amilasa.
Hidrlisis de la Casena
Fundamento:
Esta prueba se fundamenta en detectar si una bacteria posee la enzima caseinasa; que hidroliza la casena
(principal protena de la leche que le da una apariencia blanca y opaca), provocando el aclaramiento de un medio
agar leche descremada. Es conveniente refrigerar las placas durante 2 das antes de ser utilizadas para aumentar la
opacidad del medio.
Medios y reactivos:
Medios: Agar leche descremada
Leche descremada en polvo..........................................................................28,00 g
Casena...........................................................................................................5,00 g
Dextrosa (glucosa)..........................................................................................1,00 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
pH final: 7,0 + 02
Procedimiento:
Sembrar un agar leche descremada con el microorganismo de prueba (se sugiere inocular por estra nica).
Incubar a 35C por 18-24 horas en aerobiosis.
Lectura e Interpretacin: (Lmina 58)
Reaccin positiva: las colonias de microorganismos que digieren la casena (bacterias proteolticas) estarn
rodeadas de un halo claro.
Reaccin negativa: si el microorganismo no hidroliza la casena, el medio permanece opaco.
100
Produccin de Hemolisinas
Fundamento:
Esta prueba se emplea para determinar si una bacteria posee enzimas citolticas con capacidad de degradar
los eritrocitos y la hemoglobina en su interior. Estas enzimas se denominan hemolisinas. Existen tres tipos de
hemlisis: beta-hemlisis (-hemlisis), alfa-hemlisis (-hemlisis) y gamma-hemlisis (-hemlisis).
El tipo de hemlisis producido en agar sangre es til para la identificacin de patgenos bacterianos,
especialmente, los estreptococos. Estas bacterias producen dos tipos de hemolisinas: la Estreptolisina O, antignica
y oxgeno lbil, puede ser inhibida mediante la produccin de H2O2 por estreptococos creciendo en condiciones
aerbicas o en presencia de niveles elevados de CO2 y, la Estreptolisina S, no antignica pero estable al oxgeno.
Estas producen una destruccin total de los eritrocitos, lo que se conoce como beta-hemlisis (-hemlisis). Si
las colonias estreptoccicas no producen hemlisis, se dice que presentan una gamma-hemlisis (-hemlisis),
nombre inapropiado ya que no ocurre destruccin de eritrocitos.
Otro tipo de reaccin caracterstica de estos microorganismos es la alfa-hemlisis (-hemlisis),
evidenciada por la destruccin parcial de la membrana de los eritrocitos y la prdida de algo de hemoglobina en el
agar, lo que resulta en una coloracin verdosa del medio, alrededor del crecimiento bacteriano.
Medios y reactivos:
Medio: La base de agar utilizada en la preparacin del medio debe estar libre de azcares reductores, ya
que stos suprimen la accin ltica de los estreptococos sobre los eritrocitos, tal vez mediante la disminucin del
pH. La estreptolisina O es inactivada a pH bajos; por lo tanto, la presencia de cualquier azcar reductor en el medio
puede suprimir la expresin de -hemlisis por las colonias estreptoccicas en la superficie de las placas de agar
incubadas de forma aerobia.
En la actualidad, el medio ms usado es agar sangre de carnero (5%); ya que la sangre humana o
de otros animales puede contener anticuerpos (anti-estreptolisinas) que neutralizan el efecto de las hemolisinas,
produciendo en consecuencia, falsos negativos.
Agar Sangre de Carnero (5%)
Extracto de carne........................................................................................500,00 g
Triptosa.........................................................................................................10,00 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
Sangre de carnero desfibrinada estril.................................................................5%
Procedimiento:
pH final: 7,3 + 0,2
Inocular por estra, la superficie de las placas de ASC con el microorganismo de prueba. Incubar a 35C
por 18-24 horas en atmsfera anaerbica. Alrededor del 2-5% de los estreptococos del grupo A slo producen
estreptolisina O y pueden perderse en cultivos incubados en una atmsfera aerbica, salvo que se tomen medidas
para reducir la tensin de oxgeno en, al menos, una parte del medio de cultivo. Se recomienda punzar el agar en
varios puntos con el asa, o colocar una lmina cubreobjetos sobre el rea inoculada. Esta manipulacin permite
observar mejor la hemlisis debajo de la superficie, donde prevalecen condiciones relativamente anaerobias.
Se ha comprobado que la incubacin anaerobia aumenta significativamente la tasa de recuperacin de
estreptococos -hemolticos de cultivos mixtos. La extensin del perodo de incubacin a 48 horas tambin mejora
el ndice de recuperacin de estos microorganismos.
-Hemlisis: destruccin (lisis) total de los eritrocitos, las colonias se observan rodeadas de un halo claro,
incoloro y libre de eritrocitos intactos (Lmina 59).
101
-Hemlisis: destruccin parcial de los eritrocitos, las colonias aparecen rodeadas de un halo de color verdoso
(Lmina 60).
-Hemlisis (Gamma): no se observa destruccin de los eritrocitos; no hay hemlisis, el medio se conserva
intacto (Lmina 61).
Susceptibilidad a la Bacitracina (Taxo A)

Fundamento:
Esta prueba se usa para determinar el efecto de una baja concentracin de bacitracina (0,04 U) sobre un
microorganismo. Los estreptococos del Grupo A son susceptibles a esta concentracin del antibitico polipeptdico;
mientras que otros estreptococos -hemolticos; por lo general, son resistentes.
La prueba de bacitracina provee un mtodo fcil y econmico para la identificacin presuntiva de los
estreptococos -hemolticos del Grupo A y B; aunque este mtodo es todava usado en muchos laboratorios, esta
prueba ha sido suplantada por procedimientos serolgicos.
Medios y Reactivos:
Medio: esta prueba debe realizarse en agar sangre de carnero (ASC) 5%; ya descrito en la prueba de
hemlisis.
Taxo A: Taxo diferencial de bacitracina (0,04 Unidades/Disco); no debe emplearse disco de sensibilidad (10
Unidades/Disco)
Procedimiento:
Tomar 3 4 colonias del estreptococo -hemoltico e inocular a manera de csped, una placa de ASC.
Aspticamente, con ayuda de una pinza estril, colocar el disco de antibitico (taxo A) en el rea inoculada.
Incubar la placa a 35C en aerobiosis por 18-24 horas.
Positivo: presencia de cualquier halo de inhibicin del crecimiento alrededor del disco. Indica que el
microorganismo es sensible o susceptible al antibitico (S).
Negativo: presencia de crecimiento alrededor del disco (no hay halo de inhibicin). Indica que el
microorganismo es resistente al antibitico (R).
Limitaciones:
Slo es aplicable a estreptococos -hemolticos.

No existe informacin en relacin a que los dimetros del halo de inhibicin deban ser medidos.
El inculo debe ser confluente. Si ste es muy ligero, provocar que estreptococos -hemolticos no Grupo A,
aparezcan como susceptibles a la bacitracina.
Desoxirribonucleasa (DNasa)
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de producir la enzima
desoxirribonucleasa, que hidroliza el ADN.
Para la deteccin de la enzima pueden utilizarse dos medios: agar verde de metilo o el agar azul de toluidina.
El agar verde de metilo, es de color verde claro debido a la formacin de un complejo estable entre el ADN
intacto y el colorante. Si el microorganismo que crece en el medio, hidroliza el ADN, produce oligonucletidos y
mononucletidos que liberan el verde de metilo, el cual al no estar combinado con el ADN, palidece, tornando el
medio incoloro alrededor del crecimiento del organismo de prueba.
Si la prueba se realiza en el agar azul de toluidina, la positividad viene dada por una zona rosada intensa
(magenta) alrededor de la zona inoculada donde se ha producido la hidrlisis del ADN; mientras que el resto de
la placa permanece azul. Este cambio de color se debe a que el colorante, con el ADN intacto toma un color azul
rey; mientras que al ser hidrolizado por accin de la DNasa, cambia su espectro de absorcin de luz y se colorea
de rosado.
102
Medios y Reactivos:
Medio: Agar DNasa con verde de metilo
Triptosa.........................................................................................................20,00 g
ADN...............................................................................................................2,00 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
Verde de metilo...............................................................................................0,05 g
Agua destilada...............................................................1.000,00 ml
Agar DNasa con azul de toluidina
pH final: 7,3 + 0,2
Cloruro de calcio........................................................................................ 0,0011 g

ADN...............................................................................................................0,30 g
Cloruro de sodio...........................................................................................10,00 g
Agar..............................................................................................................10,00 g
Azul de toluidina..........................................................................................0,083 g
Tris (hidroximetil) aminometano....................................................................6,10 g
Agua destilada...............................................................1.000,00 ml
pH final: 9,0 + 0,2
Procedimiento:
Inocular el agar DNasa con el microorganismo de prueba (se recomienda inocular por estra nica o en
forma circular ).
Agar DNasa verde de metilo: (Lmina 63a)
Prueba positiva: el medio se observa incoloro alrededor del crecimiento del microorganismo de prueba.
Indica que el microorganismo posee la enzima DNasa.
Prueba negativa: si no hay degradacin del ADN, el medio permanece del color original (verde claro).
Indica que el microorganismo carece de la DNasa.
Agar DNasa azul de toluidina: (Lmina 63b )
Prueba positiva: se observa un halo rosado alrededor del crecimiento bacteriano, indicando hidrlisis del
ADN, por accin de la enzima DNasa.
Prueba negativa: si no hay degradacin del ADN, el medio permanece del color original (azul). Indica que
el microorganismo carece de la enzima DNasa.
Prueba de Camp
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para verificar si un microorganismo produce o no el factor CAMP. Este, es una
protena extracelular difusible que acta en forma sinrgica con la -lisina de S. aureus para incrementar la accin
hemoltica sobre los eritrocitos
El fenmeno CAMP fue informado por primera vez en 1.944 por Christie, Atkins y Munch-Peterson, cuya
contribucin se reconoce en el acrnimo que identifica la prueba.
Medios y Reactivos:
Medio: esta prueba debe realizarse en agar sangre de carnero (ASC) 5%; ya descrito anteriormente.
103
Cepa: S. aureus -lisina positiva

Procedimiento:
Esta prueba se realiza inoculando una estra nica de los estreptococos a ser identificados, perpendicular a una
estra de S. aureus productora de -lisina. Las dos estras no deben tocarse (1 cm. de separacin aproximadamente)
(Figura 24).
Microorganismo de Prueba
S.aureus
-lisina positiva
Zona de Hemlisis
Aumentada
Figura 24: Inoculacin de la Prueba de Camp
Las placas inoculadas deben incubarse en atmsfera aerbica a 37C por 18-24 horas. Aunque la incubacin
en una atmsfera microaeroflica puede acelerar la reaccin, tambin se observar un mayor nmero de falsos
positivos.
La prueba tambin puede realizarse empleando discos impregnados de -lisina que se colocarn sobre la
placa de ASC para inocular en forma perpendicular, el microorganismo de prueba.

Prueba positiva: en la interseccin de las dos estras inoculadas, la zona de -hemlisis aumentada, adquiere
la forma de una punta de flecha; indicando que el microorganismo posee el factor CAMP.

Prueba negativa: no se observa aumento de la hemlisis; reflejando que el microorganismo no produce el
factor CAMP.
Susceptibilidad a la Optoquina (Taxo P)

Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar el efecto de la optoquina sobre un organismo. El clorhidrato de etilhidroxicuprena (optoquina), un derivado de la quinina, inhibe selectivamente el crecimiento de Streptococcus
pneumoniae en concentraciones muy bajas (5 g/ml menos).
La optoquina es soluble en agua y difunde con rapidez en el medio de agar. Las clulas de neumococo
alrededor del disco de antibitico, son lisadas debido a cambios en la tensin superficial (la optoquina acta como
detergente), y se produce una zona de inhibicin del crecimiento. Este antibitico tambin puede inhibir a otros
estreptococos -hemolticos; pero slo a concentraciones ms elevadas.
Medios y Reactivos:
Medio: Agar sangre de carnero (5%) (Ya descrito anteriormente)
Disco de Optoquina (5 g) (Taxo P)
Procedimiento:
Seleccionar 3 4 colonias bien aisladas del microorganismo de prueba e inocular, a manera de csped, un
ASC. Usando una pinza previamente esterilizada a la llama del mechero, colocar el disco de optoquina en el tercio
superior del rea sembrada. Con las pinzas, presionar suavemente el disco, para que se adhiera a la superficie del
agar. Invertir la placa e incubar a 35C durante 18 a 24 horas en atmsfera microaeroflica. Transcurrido el tiempo
de incubacin, proceda a medir el halo de inhibicin (incluyendo el dimetro del disco).
Prueba positiva: se observa una zona de inhibicin de 14 mm. ms alrededor del disco de optoquina de
6 mm una de 16 mm. ms si se utiliza un disco de 10 mm. Indica que el microorganismo es sensible o

susceptible a la optoquina (S).
104
Prueba negativa: no se observa halo de inhibicin del crecimiento, o se observa una zona de inhibicin
de dimetro inferior al mencionado anteriormente para la prueba positiva. Indica que el microorganismo es
resistente a la optoquina (R).
Solubilidad en bilis
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para saber si un estreptococo -hemoltico es sensible o no a las sales biliares. Las
sales biliares, en especial el desoxicolato y el taurocolato de sodio, tienen la capacidad de lisar de forma selectiva
las clulas de Streptococcus pneumoniae cuando se agrega a clulas bacterianas en crecimiento activo en un
medio de cultivo artificial. Este microorganismo produce enzimas autolticas, que son responsables de la depresin
central o umbilicamiento caracterstico de las colonias viejas en medio de agar. Se cree que el agregado de sales
biliares acelera este proceso, aumentando la reaccin ltica asociada con la disminucin de la tensin superficial
entre el medio y la membrana celular bacteriana.
Medios y Reactivos:
Medio: Agar sangre de carnero 5% (Prueba en agar).
Solucin salina fisiolgica (Prueba en caldo).
Reactivos: Desoxicolato de sodio (10%)( Prueba en caldo)
Desoxicolato de Sodio..................................................................................10,00 g
H2O destilada.................................................................................................100 ml
Tambin puede utilizarse Taurocolato de sodio al 10% en solucin acuosa.
Reactivos: Desoxicolato de sodio (2%)( Prueba en agar)
Diluir el reactivo al 10% en proporcin 1:5 con agua destilada.
Procedimiento:
1.-Prueba en Placa (Prueba Rpida):
a) En un cultivo puro del microorganismo de prueba en ASC, marcar un crculo alrededor de una colonia bien
aislada, con un marcador indeleble, sobre el fondo de la placa de Petri, para ayudar a localizarla despus
de la prueba. Agregar una gota de desoxicolato de sodio al 2% sobre la colonia.
b) Sin invertir la placa, incubar a 35C por 30 minutos en atmsfera aerbica.
2.-Prueba en tubo:
a) Preparar una suspensin densa del microorganismo de prueba en SSF estril, a partir de un cultivo de 18
a 24 horas en agar sangre.
b) Marcar dos tubos estriles, uno como muestra y uno, como control.
c) Agregar 0,5 ml de la suspensin bacteriana a cada tubo.
d) Agregar 0,5 ml de desoxicolato de sodio al 10 % al tubo marcado como muestra.
e) Agregar 0,5 ml de SSF estril al tubo marcado como control.
f) Agitar con suavidad ambos tubos y colocarlos en la incubadora a 35-37C o en Bao de Mara, durante 3
horas, controlando cada hora.
1.-Prueba en agar: (Lmina 66a)
Prueba Positiva: la colonia se desintegra. Deja un rea parcialmente hemolisada en la superficie del medio de
cultivo donde se encontraba la colonia. Indica que el microorganismo es sensible a las sales biliares.
Prueba Negativa: la colonia se mantiene intacta. Indica que el microorganismo es resistente a las sales
biliares.
2.-Prueba en Caldo: (Lmina 66b)

Prueba Positiva: los microorganismos solubles en bilis aclaran visiblemente la turbidez del caldo dentro de
las 3 horas. El tubo de control con solucin salina debe permanecer turbio. Indica que el microorganismo es
105
sensible a las sales biliares.
Prueba Negativa: la suspensin se mantiene turbia, igual que el control. Indica que el microorganismo es
resistente a las sales biliares.
Licuefaccin de la Gelatina
Fundamento:
Esta prueba se usa para determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas proteolticas
(gelatinasas) que den como resultado la licuefaccin de la gelatina.
La gelatina es una protena derivada del colgeno encontrado en la piel y tejido conectivo animal. La
degradacin enzimtica de la gelatina conduce a la prdida de la capacidad de solidificacin de esta protena.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Gelatina
Peptona...........................................................................................................5,00 g
Gelatina.......................................................................................................120,00 g
pH: 6,8 + 0,2
Procedimiento:
Inocular el medio de agar gelatina por puncin con asa en punta a partir de un cultivo puro (inculo denso).
La puncin debe tener una profundidad de 1,5-2,5 cm. Rotular un tubo como control (sin inocular). Incubar ambos
tubos a 35C por 24 horas. En ocasiones, se requiere incubacin prolongada de hasta 14 das. Observar si hay
crecimiento y licuefaccin.
Al trmino de cada perodo de incubacin (24 horas), colocar ambos tubos en un refrigerador o un bao de
hielo durante un perodo suficiente (aproximadamente 2 horas) para determinar si se ha producido o no la digestin
de la gelatina (licuefaccin). Hacer el traspaso de la incubadora al refrigerador sin agitar los tubos.
Prueba positiva: medio licuado, indica que el microorganismo posee enzimas proteolticas (gelatinasas).
Prueba negativa: el medio se mantiene slido. Indica que el microorganismo no tiene actividad proteoltica
(gelatinasa).
Tubo de control: El medio se mantiene slido.
Crecimiento en presencia de Cetrimida
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de crecer en presencia de
cetrimida (bromuro de cetil-trimetil-amonio), una sustancia txica que inhibe el crecimiento de muchas bacterias.
La cetrimida es un detergente catinico de amonio cuaternario que acta como agente inhibidor en
medios selectivos para el aislamiento de Pseudomonas aeruginosa, que al entrar en contacto con la bacteria,
produce la liberacin del nitrgeno y el fsforo de la clula bacteriana; aunque tambin puede inhibir otras especies
de Pseudomonas.
El medio de prueba (agar cetrimida) contiene adems, cloruro de magnesio y sulfato de potasio para
incrementar la produccin de pigmentos (pioverdina y piocianina) en Pseudomonas aeruginosa.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Cetrimida:
Digesto pancretico de casena.....................................................................20,00 g
K2SO4. ..........................................................................................................10,00 g
106
MgCl2.............................................................................................................1,40 g
Cetrimida........................................................................................................0,30 g
Agar..............................................................................................................13,60 g
Glicerina.....................................................................................................10,00 ml
pH final: 7,2 + 0,2
Procedimiento:
Inocular el bisel de un medio de agar cetrimida con un cultivo puro del microorganismo de prueba. Incubar
aerbicamente a 35-37C hasta 7 das.

Prueba Positiva: se observa crecimiento. Adicionalmente puede observarse la produccin de un pigmento
amarillo-verdoso (fluorescena o pioverdina) o azul verdoso (piocianina).

Prueba Negativa: no se observa crecimiento.
Hidrlisis de PYR (L-pirrolidonil--naftilamida)
Fundamento:
Esta prueba se usa para detectar si la bacteria posee la enzima L-pirrolidonil-amidasa (PYR); tambin
denominada pirrolidonasa L-pirroglutamil-aminopeptidasa, que desdobla el sustrato L-pirrolidonil--naftilamida en L-pirrolidona y -naftilamina libre; una sustancia incolora. Esta ltima reacciona con el -dimetil-aminocinamaldehdo, que acta como un colorante acoplador diazo y forma un color rojo brillante.
El reactivo cinamaldehdo es un reactivo acoplado que forma una base de Schiff cuando se combina con
aminas en condiciones cidas.
Medios y reactivos:
Medio: Caldo PYR:
Caldo basal Tod-Hewitt que contiene (g/L):
Infusin cerebro corazn ...............................................................................3,10 g
Peptona.........................................................................................................20,00 g
Glucosa.........................................................................................................10,00 g
Fosfato disdico..............................................................................................0,40 g
Carbonato de sodio.........................................................................................2,50 g
Sulfato de colistina.......................................................................................0,010 g
cido nalidxico...........................................................................................0,015 g
pH final: 7,8 + 0,2
A este medio se le agrega el sustrato L-pirrolidonil--naftilamida (0,01%).
Reactivo:
-dimetil-amino-cinamaldehdo (1%):
-dimetil-amino-cinamaldehdo ....................................................................1,00 g
HCl concentrado (10%).................................................................................100 ml
Esta solucin se debe preparar cada dos meses.
107
Procedimiento:
A partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba, preparar una suspensin densa en el caldo/
sustrato PYR cuya turbidez sea similar al estndar 2,0 de McFarland (3 x 108 UFC/ml). Incubar a 35C en aerobiosis
por 4 horas. Despus de la incubacin, agregar 1 gota del reactivo PYR sin mezclar. Observar el cambio de color
despus de 2 minutos.
Lectura e interpretacin: (Lmina 69):

Prueba Positiva: la aparicin de un color rojo cereza a rojo prpua oscuro es indicativo de que el PYR ha sido
hidrolizado.

Prueba Negativa: el desarrollo de un color rosa, naranja o amarillo (sin cambios) despus de agregar el reactivo es indicativo que el PYR no ha sido hidrolizado.
Nota: Esta prueba puede efectuarse tambin utilizando agar PYR (Agar Soya triticasa (AST) con el sustrato al
0,01%) o utilizando sistemas comercialmente disponibles, tales como: discos o tiras impregnadas con el PYR.
Crecimiento a 42C
Fundamento:
Esta prueba se utiliza determinar la capacidad de un microorganismo de crecer a 42C.
Medios y reactivos:
Medio: Agar Soya Tripticasa (AST):
Triptosa.........................................................................................................15,00 g
Peptona...........................................................................................................5,00 g
Glucosa...........................................................................................................5,00 g
Agar.................................................................................................................15,00
pH: 7,2 + 0,2
Procedimiento:
Sembrar por estra, el bisel de dos tubos de AST, con inculo liviano del microorganismo de prueba.
Incubar uno a 35C y el otro a 42C, en atmsfera aerbica durante 18 a 24 horas.

Prueba Positiva: se observa buen crecimiento tanto a 35C como a 42C.

Prueba Negativa: ausencia de crecimiento a 42C; pero buen crecimiento a 35C.
Prueba de Tolerancia a la Sal (Caldo salado)
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo de crecer en presencia de
concentraciones altas de sal. Se aplica para diferenciar enterococos (positivos) de los estreptococos (negativos).
La alta concentracin de sal presente en el medio acta como agente selectivo, alterando la permeabilidad
de la membrana celular y el equilibrio osmtico de la mayora de las bacterias; as los microorganismos tolerantes
a la sal crecern produciendo turbidez en el caldo; mientras que en el caso contrario, el caldo permanecer claro.
108
Medios y reactivos:
Medio: Caldo Cerebro Corazn con 6,5% de NaCl:
Caldo cerebro corazn....................................................................................50,0 g
Triptosa...........................................................................................................1,00 g
pH: 7,4 + 0,2
Nota: se aade slo 6,00 gramos de sal; debido a que el caldo cerebro corazn contiene 0,5% de NaCl.
Procedimiento:
Sembrar el caldo salado con un cultivo puro del microorganismo de prueba. Incubar a 35C en aerobiosis
durante 24-48 horas.
Prueba Positiva: turbidez visible en el caldo (crecimiento); indica que el microorganismo es tolerante a la
sal.
Prueba Negativa: ausencia de turbidez en el caldo (sin crecimiento); indica que el microorganismo no es
tolerante a la sal.
Requerimiento de Factores X y V
Fundamento:
Esta prueba se usa para determinar el requerimiento de factores de crecimiento X y V para favorecer el
desarrollo in vitro de especies de Haemophilus.
El requerimiento de los factores X y V es una prueba cualitativa para la diferenciacin de especies de
Haemophilus; en la cual, el desarrollo depende de manera parcial de la presencia del factor X, del factor V de
ambos.
El factor X es la porcin hemo de la hemoglobina (protoporfirina) necesaria para la sntesis de las enzimas
respiratorias, tambin denominada hemina y hematina; es termoestable; por su parte, el factor V est constituido
por la coenzima nicotinamida adenina dinucletido (NAD), es termolbil. Normalmente, ambos factores, X y V, se
encuentran dentro de los glbulos rojos intactos.
Medios y reactivos
Medio: Agar Meller Hinton (MH)
Hidrolizado cido de casena........................................................................17,50 g
Almidn..........................................................................................................1,50 g
Agar..............................................................................................................17,00 g
pH final: 7,3 + 0,1
Reactivos:
Tiras o discos de papel de filtro impregnados con los factores X y V (Taxo X y V) disponibles
comercialmente.
Procedimiento:
Preparar una suspensin estandarizada al 0,5 de McFarland a partir de un cultivo puro de la cepa de
Haemophilus a probar, utilizando un caldo soya tripticasa (CST).
Preparar una dilucin 1:100, tomando 0,1 ml de la suspensin preparada previamente y mezclar con 9,9
ml de SSF estril. Con esta dilucin y con la ayuda de un hisopo estril, inocular la superficie de una placa de agar
MH a manera de csped. Dejar que la superficie del agar se seque durante unos pocos minutos. Colocar los discos
(taxos) conteniendo los factores X y V sobre el rea del inculo, cuidando dejar una separacin de 4-5 cm entre
taxo y taxo.
109
Presionar con suavidad sobre los taxos de manera que se adhieran a la superficie del agar para permitir que
los factores difundan en el medio. Incubar a 35C durante 18-24 horas en atmsfera microaeroflica. Transcurrido
el tiempo de incubacin, inspeccionar visualmente la superficie del agar para determinar el crecimiento visible
entre los taxos o alrededor de ellos.
Lectura e Interpretacin: (Figura 25 y Lmina 72)
Prueba positiva: El crecimiento alrededor del taxo X, sin crecimiento alrededor del taxo V y crecimiento
alrededor del taxo XV; indica que el microorganismo requiere el factor X para crecer.
El crecimiento alrededor del taxo V, sin crecimiento alrededor del taxo X y crecimiento alrededor del taxo
XV; indica que el microorganismo requiere el factor V para crecer.
El crecimiento alrededor del disco XV, sin crecimiento alrededor de los taxos individuales, indica que el
microorganismo requiere ambos factores para crecer.
Prueba negativa: se observa crecimiento sobre toda la superficie del agar; indicando que el microorganismo
no requiere de los factores probados para crecer.
Figura 25
Lectura e interpretacin de la prueba de requerimiento de los
Factores X y V
Tabla 1
Crecimiento de las especies de Haemophilus con los Factores X y V
Factor
Especie de Haemophilus
X
+
H. influenzae
+
H. influenzae biotipo aegyptius
+
H. haemolyticus
H. parahaemolyticus
H. parainfluenzae
H. paraphrophilus
H. segnis
+
H. ducreyi
H. aprophilus
Satelitismo
V
+
+
+
+
+
+
+
-
Fuente: Garca L, 2007.
Fundamento
Esta prueba se usa en cepas de Haemophilus para verificar el fenmeno conocido como satelitismo,
segn el cual un microorganismo crece alrededor de un cultivo de S. aureus en agar sangre (5%) que es capaz de
proveerle el factor V (NAD); mientras que el factor X es suministrado por el medio de agar sangre.
H. influenzae requiere del factor X y el factor V para crecer. El medio de agar sangre provee el factor
X; pero no el V; por lo tanto, este microorganismo no puede crecer; a menos que sea hemoltico y libere el NAD
al producir la hemlisis de los eritrocitos; sin embargo, es capaz de crecer alrededor de una colonia de S. aureus
que le provee el NAD, que difunde al medio y estimula el crecimiento de Haemophilus alrededor de la colonia de
estafilococo.
110
Medios y reactivos
Medio: Agar sancre de carnero (5%): ya descrito previamente.
Procedimiento:
Preparar una suspensin estandarizada al 0,5 de McFarland a partir de un cultivo puro de la cepa de
Haemophilus a probar, utilizando un caldo soya tripticasa (CST).
Preparar una dilucin 1:100, tomando 0,1 ml de la suspensin preparada previamente y mezclar con 9,9
ml de SSF estril. Con esta dilucin y con la ayuda de un hisopo estril, inocular la superficie de una placa de agar
sangre a manera de csped. Dejar que la superficie del agar se seque durante unos pocos minutos. Sembrar por estra
nica, una cepa de S. aureus productora de -lisina. Incubar a 35C x 18-24 horas en atmsfera microaeroflica.
Lectura e Interpretacin: (Lmina 73)
Prueba Positiva: crecimiento de Haemophilus alrededor de la estra del estafilococo.
Prueba Negativa: no se observa crecimiento de la cepa de Haemophilus.
Prueba de la Hebra (String test)
Fundamento:
La prueba de la hebra permite observar el desarrollo de un filamento mucoso cuando una colonia del
microorganismo de prueba es resuspendida en una solucin acuosa de desoxicolato de sodio al 0,5%. Es til para
diferenciar especies no pertenecientes al gnero Vibrio, particularmente Aeromonas sp.
Medios y reactivos
Medio: La prueba debe realizarse a partir del crecimiento de un cultivo puro en un medio libre de inhibidores, tal
como agar nutritivo (AN) (ya explicado anteriormente).
Reactivo: Solucin de desoxicolato de sodio al 0,5%
Procedimiento:
Esta prueba se puede ejecutar sobre lmina portaobjeto o una placa de Petri, resuspendiendo un cultivo
del microorganismo de prueba de 18 a 24 horas en un medio no selectivo, en una gota de solucin acuosa de
desoxicolato de sodio al 0,5%. Si el resultado es positivo, la clula bacteriana puede ser lisada por el desoxicolato
de sodio y se libera el ADN, lo que se evidencia por la formacin de un filamento mucoso (hebra) cuando un asa
de inoculacin se levanta suavemente por encima de la suspensin.

Prueba Positiva: formacin de una hebra que indica lisis celular y liberacin de ADN

Prueba Negativa: no hay formacin de hebra.
Reduccin del telurito de potasio
Fundamento:
Esta prueba se utiliza para diferenciar especies de enterococos en medios con base de agar sangre y una
concentracin de telurito de potasio de 0,04%.
El telurito de potasio es una sustancia txica que ejerce un efecto bacteriosttico, empleado como agente
selectivo para inhibir la gran mayora de microorganismos grampositivos y gramnegativos que forman parte de
la flora normal del tracto gastrointestinal. Los microorganismos que pueden crecer en su presencia, reducen el
telurito a telurio y producen colonias negras en el agar de prueba.
Medios y reactivos
Medio: Agar sangre telurito
Biopeptonas..........................................................................................................10,00 g
Cloruro de sodio.....................................................................................................5,00 g
Fosfato hidrgeno dipotsico.................................................................................4,00 g
111
Almidn de maz....................................................................................................1,00 g
Fosfato monopotsico............................................................................................1,00 g
Agar......................................................................................................................10,00 g
Sangre de carnero...............................................................................................50,00 ml
Telurito de potasio..................................................................................................0,40 g
Agua destilada..................................................................................................950,00 ml
pH 7,2 0,2
Procedimiento:
Inocular el bisel de un medio agar sangre telurito con un cultivo puro del microorganismo de prueba.
Incubar en aerobiosis, a 35C durante 24-48 horas.
Prueba Positiva: desarrollo de colonias negras, debido a la reduccin del telurito de potasio por la bacteria.
Prueba Negativa: no hay crecimiento; debido a que el microorganismo fue inhibido por el telurito.
A cada grupo de trabajo le ser entregado el material y las cepas bacterianas necesarias para proceder a
la ejecucin de las pruebas bioqumicas estudiadas en la presente unidad prctica. Proceda segn lo aprendido y
registre los resultados obtenidos.
1. Si una bacteria no fermenta la glucosa, por qu no se prueba su capacidad para fermentar otros
carbohidratos?
2. Por qu se utiliza agar y no gelatina como agente solidificante de los medios de cultivo?
3. Puede un microorganismo ser RM y VP positivo?. Explique.
4. Si un caldo con carbohidrato no cambia de color despus de ser inoculado, cmo puede usted decir si ha
ocurrido una falla del microorganismo al crecer o al fermentar el carbohidrato?
5. En ausencia de azcares, la descomposicin de protenas conduce a una alcalinizacin o acidifacin del
medio?. Explique.
6. Enumere dos productos finales del metabolismo de la glucosa en microorganismos VP positivos.
7. Qu diferencia existe entre el reactivo de Erlich y el de Kovacs para la prueba de indol?.
8. Explique brevemente por qu un carbohidrato como la glucosa, no debe aadirse a un medio donde se quiera
determinar denitrificacin.
9. Por qu el medio para la prueba de indol no debe contener glucosa?.
10. Indique cules son los productos finales de la decarboxilacin de ornitina, lisina y arginina, esquematizando
las reacciones.
11. Por qu las pruebas de oxidasa y catalasa no deben realizarse en medios que contengan sangre?.
12. La reduccin de los nitratos ocurre con mas frecuencia en presencia o ausencia de oxgeno. Explique.
13. Qu es un agente quelante?.
14. Indique dos consideraciones especiales que debe tener en cuenta para realizar la prueba de oxidasa.
15. Explique por qu en el agar gelosa chocolate (GC) no se puede observar hemlisis?.
16. Describa que ocurrira si inocula un microorganismo aerobio estricto en un caldo tioglicolato pre-reducido.
17. Qu prueba se utiliza en el laboratorio para determinar la capacidad del microorganismo de metabolizar la
glucosa por la va de los cidos mixtos?, y en la butilen-gliclica?
18. Indique si los siguientes enunciados son verdaderos o falsos:
Las amilasas son enzimas que degradan almidn______
La naturaleza coloidal de la leche sirve de base para interpretar la hidrlisis de la caseina________
El agar nutritivo es el medio utilizado para detectar la produccin de hemolisinas_______
112
Los tubos de Durham se utilizan para determinar la produccin de cido a partir de la fermentacin de
carbohidratos________
La produccin de H2S es una reaccin anaerbica________
El indol es producto de la desaminacin de la fenilalanina______
Un anaerobio estricto, dar la prueba de oxidasa positiva_______
La coagulasa contribuye a la patogenicidad bacteriana________
El empleo del citrato requiere condiciones de aerobiosis________
El medio de agar rea contiene prpura de bromocresol como indicador de pH
La ninhidrina es el reactivo utilizado en la prueba de hidrlisis del hipurato mediante la deteccin de benzoato________
El medio para la prueba de movilidad es slido_________
La catalasa se lee mediante la formacin de un cogulo visible______
Las decarboxilasas son enzimas constitutivas__________
113
Laminero Prctica 4.1: Pruebas Bioqumicas para la

Identificacin de Bacterias en El Laboratorio
LAMINERO: PRCTICA 4.1: PUEBAS BIOQUMICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE

BACTERIAS EN EL LABORATORIO
Lmina 37: Prueba de Indol

Negativo; Positivo
Lmina 40: Prueba de Movilidad

Negativa; Positiva
Fuente: Fuente: De La Maza L, 1997
Lmina 43: Prueba de Rojo de

Metilo
Negativo; Positivo
Lmina 46: Prueba de Coagulasa

Unida Negativa; Positiva
Lmina 38: Prueba de Ureasa

Negativa; Dbil Positiva; Positiva
Lmina 39: Prueba de Citrato

Negativo; Positivo
Lmina 41: Prueba Decarboxilacin de Lmina 42: Prueba de Fenilalanina

Deaminasa
Aminocidos
Negativa; Positiva
Negativa; Positiva
Lmina 44: Prueba de VogesProskaer

Negativo; Positivo
Lmina 47: Prueba de Coagulasa Libre

Positiva; Negativa Fuente:
Digitalizacin
Lmina 45: Prueba de Gas de Glucosa

Negativa; Positiva
Fuente: Steve A , 2001
Lmina 48: Prueba de Citocromo-Oxidasa

Negativa; Positiva Fuente: Fuente: De La
Maza L, 1997
117
BISEL: Alc
TACO: Alc
H2S:Gas:-
BISEL: Ac
TACO: Ac
H2S:Gas:+
BISEL: Ac
TACO: Ac
H2S:+
Gas:+
BISEL: Ac
TACO: Ac
H2S:Gas:-
Bisel: Alc
TACO: Ac
H2S:Gas:+
BISEL: Alc
TACO: Ac
H2S: Gas: -
BISEL:Alc
TACO: Ac
H2S:+
Gas: +
TSI sin
inocular
Lmina 49: Diferentes Reacciones en el TSI

BISEL: Rojo
TACO: Ac
H2S:Gas:-
BISEL: Alc
TACO: Ac
H2S:+
Gas:+
Bisel: Alc
TACO: Alc
H2S:Gas:-
BISEL: Alc
TACO: Alc
H2S: +
Gas: -
Lmina 50: Diferentes Reacciones en el LIA

118
BISEL:Alc
TACO: Ac
H2S:Gas: +
LIA sin
inocular
Fermentativo
Oxidativo
Inactivo
Lmina 51: Prueba de OF-Glucosa

Positiva
Negativa
Negativa
con Zn
Positiva
con Zn
Positiva
con gas
Caldo Nitrato
sin inocular
Lmina 53: Prueba de Reduccin de Nitratos a Nitritos

Lmina 55a: Prueba de Catalasa en Tubo

Positiva; Negativa
Fuente Fuente: De La Maza L, 1997
Lmina 56b: Prueba de Hidrlisis del Hipurato

(Mtodo Lento)
Positiva ; Negativa
Positivo; Negativo
Lmina 52: Fermentacin de
Carbohidratos
Fuente: Mac Faddin, 2000
Positiva
Positiva
Negativa
Dbil
Lmina 54: Prueba de Hidrlisis de la Esculina
Lmina 55b: Prueba de Catalasa en Lmina

Negativa ; Positiva
Lmina 57: Prueba de Hidrlisis del Almidn

Positiva; Negativa
Lmina 56a: Prueba de Hidrlisis del

Hipurato (Mtodo Rpido)
Negativa; Positiva
Lmina 58: Prueba de Caseinasa

Negativa; Positiva
119
Lmina 59: Prueba de Hemolisinas

Beta-hemlisis en ASC
Lmina 62: Prueba de Taxo A

Negativa; Positiva
Lmina 64: Prueba de Camp

Positiva; Negativa
Lmina 66b: Prueba de Solubilidad en Bilis

(Tubo)
Negativa; Positiva
Lmina 69: Prueba de Hidrlisis del PYR

Positiva; Negativa
Fuente: De La Maza L, 1997
120
Lmina 60: Prueba de Hemolisinas

Alfa-hemlisis en ASC
61: Prueba
de Hemolisinas
LminaLmina
61: Prueba
de Hemolisinas
Colonias no
Colonias
no hemolticas
hemolticas
en ASCen ASC
Fuente:Digitalizacin
Digitalizacin
Fuente:
Lmina 63a: Prueba de DNAsa (Verde

de Metilo)
Negativa; Positiva
Lmina 65: Prueba de Taxo P

Positiva; Negativa
Lmina 67: Prueba de Hidrlisis de

Gelatina
Positiva; Negativa
Lmina 70: Prueba de Crecimiento a 42C

Positiva; Negativa
Fuente: De La Maza, 1997
Lmina 63b: Prueba de DNAsa

(Azul de Toluidina)
Negativa; Positiva
Lmina 66a: Prueba de Solubilidad en Bilis

(Placa)
Negativa; Positiva
Lmina 68: Prueba de Crecimiento en

Cetrimide
Negativa; Positiva
Lmina 71: Prueba de Crecimiento en Caldo

Salado
Positiva; Negativa
Fuente: Manual HiMedia, 2003
Lmina 72: Prueba de Requerimiento de Factores

XV: Positivo; V: Positivo; X: Negativo
Lmina 73: Prueba de Satelitismo Positiva

Lmina 74: Prueba de la Hebra (String test) Positiva

Lmina 75: Prueba de Reduccin del Telurito

Positiva
Fuente: De La Maza, 1997
121
UNIDAD V
GENTICA BACTERIANA
Objetivo Terminal:
Verificar el proceso de transferencia de material gentico por conjugacin entre las bacterias.

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO POR CONJUGACIN
Objetivo Especfico:
1. Demostrar la capacidad de los plsmidos de transferir resistencia antimicrobiana de una bacteria a otra y
expresar dicha resistencia en su nuevo hospedero.
Generalidades
La conjugacin bacteriana es el proceso de transferencia de material gentico de una bacteria donante a
otra receptora mediante contacto directo entre las clulas a travs de un pilis sexual.
La conjugacin est mediada por plsmidos, elementos genticos extracromosmicos que se replican
independientemente del cromosoma bacteriano y son capaces de codificar diversas funciones en la clula bacteriana,
entre ellas, resistencia a los antibiticos; estos elementos se transfieren fcilmente de una especie bacteriana a otra
lo que permite la rpida diseminacin de genes que confieren resistencia a las drogas.
A este fin se utilizar, como receptora, una cepa de Escherichia coli resistente a cido nalidxico (E. coli
NAR) pero sensible al resto de los antimicrobianos conocidos; tambin se utilizar, como donante, una cepa de
Klebsiella pneumoniae resistente a ceftazidima (K. pneumoniae CAZR).
Mediante conjugacin, se transferir el plsmido de la cepa donante (K. pneumoniae CAZR), a la cepa
receptora (E. coli NAR) por lo que las bacterias receptoras despus del proceso de conjugacin, expresarn
resistencia a CAZ.
1. Inocular un Caldo Soya Tripticasa (CST) con cada una de las cepas (E. coli NAR y K. pneumoniae CAZR).
Incubar en agitacin a 37C hasta alcanzar la fase exponencial del crecimiento, lo cual se logra, generalmente,
despus de 2 a 2,5 horas de incubacin. Para ese momento, el caldo contiene una poblacin bacteriana de
aproximadamente 2 x 108 UFC/ml
2. A partir de cada uno de estos caldos, realizar un antibiograma para determinar los patrones de susceptibilidad
y resistencia, utilizando el mtodo de Kirby y Baer, siguiendo los criterios del CLSI (Instituto para la
Estandarizacin de Laboratorios Clnicos, segn sus siglas en ingls). El antibiograma se realizar en agar
Meller Hinton (MH), preparando una suspensin estandarizada del microorganismo, equivalente al tubo 0,5
de McFarland. Probar los discos de CAZ y NA a ambas cepas; posteriormente, incubar las placas a 37C por
18-24 horas.
3. Una vez finalizado el perodo de incubacin, se procede a leer el antibiograma, la cepa donante debe ser
resistente a CAZ y sensible a NA; por otra parte, la cepa receptora, debe ser resistente a NA y sensible a CAZ.
4. Para que ocurra la conjugacin bacteriana, primero se incuban ambas cepas (donante y receptora) en agitacin
a 37C, una vez alcanzado el crecimiento deseado, se mezclan volmenes iguales (1 ml), de la cepa donante y
la receptora, en un tubo estril y se incuban durante la noche a 37C.
5. A partir de este cultivo, prepar diluciones 1/10, desde 100 hasta 10-6, en 9,00 ml de SSF. Inocular placas de agar
Mac Conkey (MC), Mac Conkey con cido nalidxico (MC/NA) y Mac Conkey/cido nalidxico/ceftazidima
(MC/NA/CAZ), dispensando 0,01 ml de cada dilucin a la placa correspondiente, extendiendo el inculo sobre
la superficie del medio de cultivo con ayuda de una varilla de vidrio en forma de L, para obtener crecimiento
confluente. Incubar las placas a 37C por 18 a 24 horas, para luego seleccionar aquellas ms apropiadas para
efectuar el contaje de colonias y poder establecer la frecuencia con la cual se transfiere la resistencia.
6. Despus de la incubacin, en las placas de MC se puede observar el crecimiento tanto de la cepa donante
como de la receptora, ya que el medio no contiene ningn agente antimicrobiano que acte como inhibidor del
crecimiento. Esta placa sirve para controlar que ambos microorganismos estn viables. En la placa de MC/NA
se observa el crecimiento slo de la cepa receptora ( E. coli NAR), ya que posee resistencia a NA (antibitico
agregado al medio); esta placa se utiliza para calcular el nmero total de clulas receptoras. Por ltimo, en la
125
placa de MC/NA/CAZ se observa el crecimiento slo de las cepas receptoras (NAR) que han adquirido resistencia
a CAZ, mediante el proceso de conjugacin. Esta placa indica el nmero total de receptoras resistentes a CAZ
y NA (cepas transconjugantes).
7. La frecuencia de transferencia de los plsmidos de resistencia se expresa como la relacin entre el nmero de
colonias transconjugantes resistentes y el nmero de colonias receptoras totales.
Frecuencia de
=
Transferencia
No. colonias transconjugantes resistentes

No. total de receptoras totales
8. Para corroborar la transferencia de resistencia a CAZ producida durante la conjugacin, se seleccionan 5

colonias aisladas de la placa de MC/NA/CAZ y se siembran cada una en CST. Incubar durante 2-2,5 horas a
37C hasta alcanzar una turbidez adecuada; posteriormente, realizar un antibiograma y probar el disco de CAZ.
Incubar las placas a 37C por 18-24 horas y proceder a leer el antibiograma (la cepa transconjugante debe ser
resistente a CAZ).
1. Por qu es importante probar el disco de cido nalidxico en la cepa donante antes de realizar un protocolo
de conjugacin?
2. Explique que sucedera en los tres grupos de placas si la cepa donante no tuviese un plsmido conjugativo.
3. Qu ocurrira si durante la conjugacin se somete el cultivo a una brusca y violenta agitacin?
4. Cules son los mecanismos utilizados por las bacterias para la transferencia de material gentico?. En qu
consiste cada uno?
5. Si en un experimento de conjugacin no ocurre transferencia de resistencia. Explique las posibles razones del
fracaso.
6. Observe los resultados del siguiente proceso de conjugacin y realice el calculo de la tasa de transferencia.
Dilucin
10
10-4
10-5
10-6
-3
No de Colonias
MC/Na
Incontables
500
375
170
MC/Na/CFP
Incontables
520
360
200
7.-Observe los resultados del siguiente proceso de conjugacin y realice el clculo de la tasa de transferencia.
Dilucin
10
10-4
10-5
10-6
-3
No de Colonias
MC/Na
Incontables
280
154
80
MC/Na/CFP
Incontables
300
160
90
8.-Observe los resultados del siguiente proceso de conjugacin y realice el clculo de la tasa de transferencia.
Dilucin
10
10-4
10-5
10-6
-3
126
No de Colonias
MC/Na
Incontables
900
400
220
MC/Na/CFP
Incontables
850
430
200
UNIDAD VI
CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
Objetivo Terminal
Al finalizar la unidad, el estudiante estar en capacidad de:
Aplicar las pruebas de laboratorio que se utilizan para la evaluacin de la efectividad de los agentes
antimicrobianos in vitro.

EVALUACIN DE MTODOS FSICOS PARA EL
CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
Objetivo Especfico:
1. Evaluar el efecto del calor y las radiaciones ultravioletas sobre el crecimiento bacteriano.
Efecto del Calor sobre el Crecimiento Bacteriano
El control de la temperatura es un mtodo ampliamente utilizado para el control del crecimiento bacteriano.
Generalmente, cuando se aplica calor sobre las bacterias, stas mueren; mientras que cuando se usan bajas
temperaturas, el crecimiento se inhibe.
Al aumentar la temperatura y rebasar la temperatura mxima de crecimiento, aparecen los efectos letales.
La muerte por calentamiento es una funcin exponencial y ocurre rpidamente a medida que la temperatura se
eleva. Estos hechos tienen importantes consecuencias prcticas. Si se desea eliminar todas las clulas de un cultivo
(esterilizar una poblacin), tomara ms tiempo a temperaturas bajas que a temperaturas elevadas.
Los objetos pueden ser esterilizados ya sea por calor seco, aplicado en un horno de aire caliente, o por calor
hmedo en forma de vapor. De ambos mtodos, se prefiere el calor hmedo por su accin destructiva ms rpida.
Una temperatura de 80C durante 5 a 10 minutos destruye las formas vegetativas de todas las bacterias.
La esterilizacin por calor hmedo puede hacerse de diversas formas: ebullicin, tindalizacin,
pasteurizacin y vapor a presin (autoclave). De stas, el vapor a presin es el ms eficaz porque permite
temperaturas por encima del punto de ebullicin del agua, tales temperaturas son necesarias debido a la alta
resistencia al calor de las esporas de algunas especies bacterianas.
El procedimiento usual es calentar con vapor de agua a presin de 15 libras, a una temperatura de 121C,
por 15-20 minutos. Si se esterilizan objetos voluminosos, la transferencia del calor a su interior ser lenta y el
tiempo de calentamiento debe ser suficientemente largo para que el material est a 121C durante 15 a 20 minutos.
En este procedimiento, los microorganismos son destruidos por la alta temperatura que se alcanza cuando el vapor
es sometido a la presin indicada.
La esterilizacin con calor seco requiere temperaturas ms elevadas y un perodo de calentamiento ms
prolongado. El tipo ms ampliamente utilizado de calor seco es el horno de aire caliente. Se requiere un tiempo de
esterilizacin de 2 horas a 180C para destruir todos los microorganismos, incluyendo los formadores de esporas.
Materiales
Placas de Petri conteniendo Agar Nutritivo (2 por grupo).
Termmetro
Tubos de ensayo
Vaso de precipitado
Bao de Mara
Cultivos
Bacillus subtilis (24 horas)
Bacillus subtilis (72 horas)
Staphylococcus epidermidis
Escherichia coli
Procedimiento
1. A cada grupo de estudiantes se le asignar un cultivo en caldo de alguno de los microorganismos arriba mencionados y dos placas de agar nutritivo (AN).
129
2. Dividir cada una de las placas en cinco (5) secciones y marcarlas de la siguiente manera: tiempo 0; 15 seg;
2 min; 5 min y 15 min. Identificar cada una de las placas con las temperaturas de prueba (63C y 72C,
respectivamente).
3. Ajustar la temperatura de dos Baos de Mara, uno a 63C y el otro a 72C.
4. Inocular el microorganismo asignado sobre la seccin marcada como tiempo 0, en el segmento correspondiente
de la placa.
5. Inmediatamente, colocar el caldo inoculado dentro del Bao. Despus de 15 segundos, retirar el tubo,
resuspender el cultivo e inocular sobre la seccin correspondiente en la placa de AN identificada con el tiempo
correspondiente
6. Colocar nuevamente el caldo en el Bao de Mara y repetir el procedimiento a los 2; 5 y a los 15 minutos.
7. Este procedimiento debe repetirse dos veces; una para incubar los microorganismos a 63C y la otra, para
incubarlos en el Bao de Mara a 72C.
8. Incubar las placas a 35C durante 24 horas.
9. Registrar los resultados obtenidos en una tabla, de acuerdo a los siguientes criterios: Negativo: sin crecimiento;
Positivo +: crecimiento escaso; Positivo ++: crecimiento moderado y Positivo +++: crecimiento abundante.
10. Interpretar los resultados
Efecto de las Radiaciones sobre el Crecimiento Bacteriano
El ambiente est bombardeado con radiacin electromagntica de varios tipos. Esta radiacin acta como
si estuviese compuesta de ondas que se desplazan en el espacio, como las olas lo hacen sobre la superficie del
agua. La distancia entre dos picos o valles de una onda se denomina longitud de onda. A medida que disminuye
la longitud de onda de la radiacin electromagntica, aumenta la energa de la radiacin. Los rayos gamma y rayos
X son mucho ms energticos que la luz visible o las ondas de infrarrojo.
La luz solar es la principal fuente de radiacin de la Tierra. Comprende: luz visible, radiacin ultravioleta
(UV), rayos infrarrojos y ondas de radio.
Muchas formas de radiacin electromagntica son perjudiciales para los microorganismos. Esto es
especialmente cierto en el caso de las radiaciones ionizantes, de longitud de onda muy corta o de energa
alta, que puede provocar que los tomos pierdan electrones; es decir, que se ionicen. Dos formas principales de
radiacin ionizante son: los rayos X, que se producen artificialmente, y los rayos gamma, que se emiten durante
la desintegracin de radioistopos. Aunque los microorganismos son ms resistentes a la radiacin ionizante que
los organismos superiores, pueden ser destruidos con una dosis suficientemente elevada.
La radiacin ultravioleta es un tipo de radiacin no ionizante que puede producir la muerte de todas
las clases de microorganismos, debido a su longitud de onda corta (aproximadamente de 10 a 400 nm.) y alta
energa. Sin embargo, la radiacin UV no atraviesa eficazmente el cristal, las pelculas de suciedad, el agua y
otras sustancias. Debido a este inconveniente, la radiacin UV se emplea como agente esterilizante en muy pocas
situaciones. Las lmparas UV se utilizan para descontaminar ambientes, como: quirfanos, reas de procesamiento
de alimentos y, en cabinas de seguridad biolgica, para esterilizar el aire y cualquier superficie expuesta. Tambin
se dispone de unidades de UV comerciales para el tratamiento del agua. La longitud de onda ms letal corresponde
a 260 nm, debido a que es absorbida ms eficazmente por el ADN. El principal mecanismo de destruccin por
radiacin UV es la formacin de dmeros de timina que inhiben la replicacin y funcin del ADN.
El ADN daado se puede reparar mediante diferentes mecanismos. En la fotorreactivacin, una enzima
fotorreactivadora emplea la luz azul para separar los dmeros de timina. Este proceso se produce en ausencia de
luz y se denomina reactivacin oscura. Cuando la exposicin a UV es demasiado fuerte, el dao es tan extenso
que no es posible repararlo.
Muchos microorganismos usan pigmentos carotenoides para protegerse frente a la fotooxidacin. Los
carotenoides inactivan eficazmente el oxigeno en estado de singlete (molcula con gran poder oxidante, que
destruye rpidamente una clula); es decir, absorben energa de ste y lo convierten de nuevo en estado elemental
no excitado.
130
Materiales
Placas de Petri conteniendo Agar Nutritivo (2 por grupo).
Hisopos de algodn estriles
Materiales de cobertura: gasa, papel, tela, papel aluminio, vidrio transparente, plstico.
Lmpara UV (265 nm).
Cultivos
Serratia marcescens
Bacillus subtilis
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Procedimiento
1. Asignar a cada grupo de estudiantes, uno de los cultivos arriba mencionados.
2. Inocular con un hisopo, la superficie de cada placa de AN, con el cultivo en caldo del microorganismo de
prueba. Para garantizar una completa cobertura de la superficie del agar, rayar la superficie del medio en dos
direcciones. Rotular las placas como: A y B.
3. Retirar la tapa de las placas inoculadas y cubrir la mitad con uno de los materiales de cobertura.
4. Colocar cada placa directamente debajo de la luz UV, dejando aproximadamente 24 cm. entre la lmpara y la
cobertura.
Placa A: Exponer por 30 seg
Placa B: Exponer por 15 seg
5. Incubar las dos placas, a 22C o a temperatura ambiente durante 24 horas (la placa B en oscuridad).
6. Transcurrido el tiempo de incubacin, examinar todas las placas y anotar los resultados.
7. Interprete los resultados obtenidos.
1. Compare la sensibilidad al calor del cultivo joven de Bacillus subtilis y el cultivo viejo de ste mismo
microorganismo, explique y razone su respuesta.
2. Qu ventajas presenta un microorganismo pigmentado frente a uno no pigmentado en relacin a la exposicin
a la luz UV?
3. Explique el mecanismo de accin bactericida de la luz UV.
4. Explique por qu la placa B fue incubada en oscuridad, razone su respuesta?
131

EVALUACIN DE DESINFECTANTES Y ANTISPTICOS
1. Evaluar la efectividad del lavado y cepillado de las manos.
2. Explicar la importancia de las medidas de asepsia en el laboratorio de Bacteriologa.
Generalidades
La estructura de la piel y la capa grasa que recubre las manos, dificultan la remocin de los microorganismos
presentes en ella; por lo que el uso de jabn y cepillo ayudan a eliminar la capa oleaginosa y por ende, las bacterias
existentes.
El personal que labora en instituciones dispensadoras de salud, debe lavarse las manos antes y despus
de atender a un paciente. Estas recomendaciones tambin deben ser seguidas por las personas que trabajan en
laboratorios donde se manipulan muestras biolgicas. El lavado y cepillado de las manos con agua y jabn durante
10 a 15 minutos, remueve la microflora transitoria.
En este ejercicio, se evaluar la efectividad del lavado de la piel de las manos con agua y jabn.
Materiales
Agar Nutritivo en placa (AN).(2 por grupo)
Cepillo de lavado.
Diferentes tipos de jabones antispticos y de tocador.
Procedimiento:
1. Tomar dos placas de AN y rotularlas, una como agua y la otra como jabn, colocando el nombre del jabn a
evaluar; dividir cada una de las placas en cuatro cuadrantes y marcarlas del 1 al 4.
2. Comenzar con la placa rotulada como agua, tocando la primera seccin con los dedos sin lavar; lavar las
manos solo con agua, escurrir el exceso y tocar la seccin 2.
3. Sin secar sus dedos, repetir el lavado efectuado en la seccin 2 y tocar la seccin 3; lavar por tercera vez las
manos slo con agua y tocar la seccin 4.
4. Para trabajar con la placa marcada como jabn, se emplea la otra mano. Lavar con agua y jabn, enjuagar y
escurrir el exceso y tocar la seccin 1.
5. Repetir el procedimiento efectuado en el paso anterior y tocar la seccin 2.
6. Usando un cepillo, cepillarse las manos con agua y jabn, por 2 minutos enjuagar bien, eliminar el exceso, y
tocar la seccin 3.
7. Efectuar el mismo procedimiento del paso 6 pero durante 4 minutos, y colocar los dedos en la seccin 4.
8. Incubar las placas a una temperatura de 35-37C, durante 24 horas, observar el crecimiento y reportarlo de
la siguiente forma: Negativo: sin crecimiento; Positivo +: crecimiento escaso; Positivo ++: crecimiento
moderado y Positivo +++: crecimiento abundante.
9. Interprete los resultados obtenidos.
1. En qu difiere la microflora normal de la transitoria?
2. Compare los resultados obtenidos en el laboratorio entre un jabn en barra y uno lquido y entre un jabn lquido y un gel antibacterial.
3. Si la mayora de la microbiota normal y la transitoria no son dainas, explique por qu las manos deben ser
lavadas y cepilladas antes de cualquier ciruga?.
132

PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD Y RESISTENCIA BACTERIANA A LOS ANTIBITICOS
Objetivos especficos:
1. Realizar apropiadamente los diferentes mtodos para determinar la susceptibilidad y resistencia de las
bacterias a los antibiticos.
2. Interpretar los resultados obtenidos por los mtodos utilizados.
3. Reportar adecuadamente los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los antibiticos.
Generalidades
El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de las funciones ms
importantes de los laboratorios de Microbiologa Clnica. Esto se realiza mediante las pruebas de sensibilidad o
antibiograma, cuyo principal objetivo es evaluar la respuesta de un microorganismo frente a varios antibiticos.
El antibiograma define la actividad in vitro de un antibitico frente a un microorganismo determinado
y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una poblacin bacteriana. El resultado de la prueba de
susceptibilidad, la farmacologa del antimicrobiano, el sitio de la infeccin y los aspectos clnicos del paciente,
sustentan la eleccin de las drogas adecuadas para el tratamiento de las enfermedades infecciosas.
El panorama actual de la resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos hace ineludible su
determinacin. Cada laboratorio de microbiologa establecer segn su estructura, demanda asistencial y poltica
de antibiticos, un esquema de organizacin y tcnicas de trabajo que aseguren la realizacin e informacin
posterior de los antibiogramas.
Los ensayos de sensibilidad deben estar estandarizados y sujetos a procesos de control de calidad que
aseguren su reproducibilidad. En la presente actividad, se estudiarn los mtodos bsicos utilizados para el estudio
de la sensibilidad, as como los criterios para su interpretacin y control de acuerdo al CLSI.
Indicaciones para la realizacin de las Pruebas de Susceptibilidad
Es preciso realizar en el laboratorio las pruebas de sensibilidad antimicrobiana porque son una ayuda
invaluable para la seleccin del agente apropiado para el tratamiento de la infeccin. Como en los ltimos aos se
ha venido observando una mayor frecuencia de resistencia bacteriana, es menester, hacer un estudio de cul es el
agente causal de la infeccin y cul es la droga indicada para ste. Sin embargo, algunos tratamientos se hacen de
manera emprica, sin conocer estos dos factores y las consecuencias pueden ser: 1) crear resistencia a las drogas,
y 2) destruir la flora normal bacteriana.
Existen microorganismos que mantienen su sensibilidad original a algunas drogas, por lo que en esos
casos, la terapia emprica es totalmente reconocida y no es necesario realizar pruebas de sensibilidad. Por
ejemplo, los estreptococos Grupo A han permanecido sensibles a penicilina G, al igual que los meningococos;
desafortunadamente, esto es cada vez menos comn.
Las pruebas de sensibilidad pueden ser necesarias cuando an, conocindose la sensibilidad del
microorganismo a drogas altamente efectivas, el paciente no puede recibir dicho tratamiento. Por ejemplo, en
casos de infecciones por estreptococo grupo A, en pacientes alrgicos a penicilina, se debe probar la sensibilidad
a otros antibiticos alternativos como eritromicina y otros macrlidos.
Sin embargo, los patrones de resistencia cambian en forma constante. No importa cuan rpidamente se
introduzcan los nuevos agentes teraputicos, las bacterias parecen estar dispuestas a sobrepasarlos.
Mtodos para determinar la Susceptibilidad Bacteriana a los Antibiticos
a.
b.
c.
d.
e.
Dilucin en caldo
Dilucin en agar
Difusin del disco en agar
Mtodos de Gradiente de Antibiticos
Otras pruebas
133
A.
Mtodo de dilucin en caldo
Este mtodo fue descrito en los aos 1940 y a pesar de ser una de las primeras tcnicas en ser descritas, es
an considerada como mtodo de referencia. En este mtodo se colocan concentraciones decrecientes del agente
antimicrobiano, generalmente diluciones al doble (1:2), en tubos que contienen un medio de cultivo lquido (caldo)
que sostendr el desarrollo del microorganismo de prueba. El caldo ms comnmente utilizado para estas pruebas
es el Meller-Hinton suplementado con cationes magnesio y calcio.
Los agentes antimicrobianos se preparan en soluciones concentradas en un solvente adecuado, y luego
se diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones apropiadas. Los solventes ms utilizados para preparar las
soluciones madre de los antibiticos a probar son: buffer fosfato pH 6,0 8,0/0,1 M; etanol, HCl 0,04-0,05 N;
metanol; NaOH 1 M 2,5 M. Los diluyentes ms empleados son: agua destilada y buffer fosfato.
Un inculo estndar del microorganismo (1 x 105 UFC/ml) se agrega a un volumen igual (por lo general,
1 ml) de cada concentracin de antibitico y a un tubo con caldo sin antimicrobiano que servir de control de
crecimiento. Luego de la incubacin adecuada, se observa la turbidez de los caldos, que indicar desarrollo del
microorganismo. La bacteria crecer en el tubo control y en todos los caldos que no contengan suficiente antibitico
como para inhibir su desarrollo.
El mtodo de dilucin es un mtodo cuantitativo para determinar la Concentracin Inhibitoria Mnima
(CIM) y la Concentracin Bactericida Mnima (CBM) del antibitico probado. La CIM se define como la
menor concentracin del antibitico capaz de inhibir el crecimiento bacteriano. Se expresa en microgramos por
mililitro del antibitico (g/ml). Por CBM, se entiende la mnima concentracin del antibitico que destruye el
99,99% de las bacterias probadas. Se conoce tambin como Concentracin Letal Mnima (CLM).
Si la concentracin del antimicrobiano representada por la CIM puede ser alcanzada fcilmente en el suero
del paciente por las vas normales de administracin, se dice que el microorganismo es sensible a ese agente. Por
el contrario, si la CIM es mayor que el nivel alcanzable, o se encuentra dentro de los lmites de toxicidad para el
hospedador, se dice que el microorganismo es resistente a este agente antimicrobiano.
Existen dos modalidades de las pruebas de dilucin en caldo: la macrodilucin y la microdilucin.
Mtodo de Macrodilucin:
Procedimiento
1. Rotular con nmeros del 1 al 10, diez tubos estriles.
2. Agregar a los tubos 2 al 10, 0,5 ml de Caldo Soya Tripticasa (CST).
3. Agregar a los tubos 1 y 2, 0,5 ml de una dilucin previamente preparada del antibitico con una concentracin
de 100 g/ml de 200 g/ml (tubo 1: control del antibitico; siempre deber estar claro).
4. Mezclar bien el contenido del tubo 2 y traspasar 0,5 ml al tubo 3. Mezclar bien y traspasar 0,5 ml para el tubo
4 y, as sucesivamente, hasta llegar al tubo 9. De este ltimo tubo, tomar 0,5 ml y descartarlos. De esta manera,
se obtienen diluciones seriadas al doble, desde 100 g/ml hasta 0,4 g/ml; de 200 g/ml hasta 0,8 g/ml. El
tubo 10 no contiene antibitico y servir como control de crecimiento microbiano.
5. Agregar a todos los tubos 0,5 ml de una suspensin bacteriana estandarizada*(105 bacterias/ml).
6. Incubar los tubos de prueba a 35C por 18-24 horas.
7. Una vez transcurrido el perodo de incubacin, se examinan los tubos en busca de crecimiento, el cual se
evidencia por la presencia de turbidez. La CIM se interpreta como la concentracin del antibitico, contenida
en el primer tubo de la serie, que inhibe el crecimiento bacteriano (Figura 26).
*Estandarizacin del inculo
Inocular un CST a partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba (4 5 colonias) e incubar
a 35C por 18-24 horas. Transcurrido este tiempo, comparar la turbidez con el estndar 0,5 de McFarland que
contiene aproximadamente 1,5 x 108 clulas bacterianas/ml Ajustar la turbidez si es necesario, utilizando para ello,
CST SSF estril). De esta dilucin, preparar una dilucin 1:100, tomando 0,1 ml de la suspensin estandarizada
y traspasarla a un tubo que contenga 9,9 ml de SSF (la concentracin bacteriana ser ahora de 106 clulas/ml,
aproximadamente). De aqu, preparar una dilucin 1:10, tomando 1 ml de la suspensin anterior y traspasarlo a un
134
tubo conteniendo 9,00 ml de CST. Mezclar bien. Esta dilucin contiene un estimado de 105 clulas bacterianas/ml
y ser utilizada para la inoculacin de las pruebas de susceptibilidad a los antibiticos por el mtodo de dilucin
0,5ml
en caldo.
0,5ml
0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml
Descartar
Solucin del
Antibitico
1024 g/ml
0,5 ml
Caldo MH
Concentracin
del ATB
g/ml
512
256
128
64
32
16
0,5 ml Inculo estandarizado
Figura 26: Mtodo de Macrodilucin

Digitalizacin
Preparacin de los Estndares Nefelomtricos de McFarland

1. Preparar 10 tubos de ensayo de igual tamao y buena calidad que hayan sido cuidadosamente lavados y
enjuagados.
2. Preparar cido sulfrico puro al 1%.
3. Preparar una solucin acuosa de cloruro de bario puro al 1%. Mantenga la suspensin en agitacin continua
mientras agrega el BaCl2.
4. Colocar en los tubos, las cantidades de cada solucin indicadas en el cuadro siguiente, completando un volumen
final de 10 ml por tubo:
Tubo
5
6
Cloruro de Bario (ml)
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
cido Sulfrico (ml)
9,9
9,8
9,7
9,6
Densidad celular aproximada (108UFC/ml)
12
10
0,6 0,7
0,8
0,9
1,0
9,5
9,4 9,3
9,2
9,1
9,0
15
18
24
27
30
21
Para preparar el inculo estandarizado, diluir a la mitad (1:2) el tubo N 1 de McFarland. Verificar la densidad
ptica del estndar, usando un espectrofotmetro con un paso de luz de 1 cm. El estndar 0,5 de McFarland debe
tener una absorbancia de 0,08-0,13 a 625 nm. Mantenga los estndares hermticamente cerrados a temperatura
ambiente y al abrigo de la luz. Agite vigorosamente el estndar en agitador mecnico (vrtex) antes de su uso para
logar una turbidez homognea. Este estndar contiene aproximadamente 1,5 x 108 UFC/ml
Mtodo de Microdilucin
Los mtodos descritos anteriormente, pueden ser utilizados para estudiar muchos tipos de bacterias tanto
aerobias como anaerobias; pero son lentos y laboriosos. Para cada sistema bacteria-antibitico debe prepararse
una serie completa de tubos, lo cual hace prohibitivo probar ms de unos pocos antimicrobianos frente a cada cepa
aislada de un paciente. Sin embargo, la adaptacin del mtodo de dilucin en caldo a una tcnica de microdilucin
ahorra reactivos y tiempo del operador.
Este procedimiento es semejante, en principio, al mtodo de macrodilucin en caldo, excepto en que
la susceptibilidad de los microorganismos a los antibiticos es determinada en una serie de orificios que estn
moldeados en una placa plstica. Cada placa puede contener 80, 96 ms orificios.
Las ventajas de este mtodo son el uso de pequeos volmenes de reactivos y el gran nmero de bacterias
que pueden ser probadas de forma simple y poco costosa.
El examen de las microplacas se efecta directamente sobre una fuente de luz o se leen observando el fondo
sobre un lector con espejo. Aunque las microplacas se preparan empleando el mismo medio de crecimiento y las
135
mismas concentraciones de antimicrobianos, existe una diferencia importante. El inculo bacteriano, 5 x 105 UFC/
ml, disminuye considerablemente en cada microcubeta, dado el pequeo volumen sembrado. Estas microcubetas,
por lo general, tienen una capacidad de 0,1 ml, por lo tanto el inculo final ser 5 x 104 UFC/ml
El inculo pequeo tambin hace difcil determinar la CBM, ya que el nmero de UFC puede no ser
suficiente para permitir la determinacin del 99,99% de destruccin bacteriana; por lo que se recomienda que los
micromtodos se empleen slo para la determinacin de la CIM y que los resultados de la CBM, se obtengan por
la tcnica de macrodilucin.
Ventajas y Limitaciones de los Mtodos de Dilucin en Caldo
Se consideran de referencia para la determinacin cuantitativa de la actividad de los antimicrobianos.
Son los mtodos adecuados, cuando adems de la actividad inhibitoria, se quiere determinar tambin, la actividad
bactericida. En comparacin con los mtodos de difusin, son tcnicamente ms complejos y casi siempre ms
costosos, en particular cuando se utilizan paneles comerciales de microdilucin.
Proceda a realizar la determinacin de la CIM por el mtodo de dilucin en caldo a los microorganismos
de prueba. Registre los valores de CIM obtenidos para cada microorganismo y antibitico.
B. Mtodo de Dilucin en Agar
Este mtodo ha sido exitosamente adaptado para su uso de rutina en los laboratorios. Consiste en probar
concentraciones seleccionadas de antibiticos. Se diferencia del anterior, nicamente en el medio de cultivo; aqu,
se utiliza agar. Se inocula una suspensin estandarizada de bacterias en una serie de placas, cada una con una
concentracin determinada de antibitico. Aquellos microorganismos susceptibles a la concentracin dada de
antibitico, no crecen; mientras que los organismos resistentes, crecern produciendo colonias.
Procedimiento
1. Rotular las placas de Petri con las concentraciones de antibiticos que se desean probar, incluyendo una marcada
como 0 g/ml (libre de antibitico, control de crecimiento bacteriano). Para cada serie de concentraciones, se
debe incluir al comienzo y al final de la misma, placas de medio sin antibitico que servirn para controlar el
crecimiento y la posibilidad de contaminacin.
2. Preparar el medio de cultivo a utilizar, generalmente agar Meller-Hinton; pero en funcin de los
microorganismos y de sus necesidades nutritivas puede ser necesario, aadir algn suplemento a este medio
o utilizar un medio diferente.
3. Previo a la esterilizacin, el agar fundido es distribuido en tubos estriles con tapa de rosca, en alcuotas
que permitan obtener las diluciones deseadas del antibitico (generalmente, 19 ml de medio por 1 ml de
la correspondiente concentracin del antibitico); de manera que, para placas de 100 mm de dimetro son
necesarios, 20 ml de medio con antibitico).
4. Esterilizar los tubos conteniendo el medio a 121C a 15 libras de presin por 15 minutos y estabilizar luego
en Bao de Mara a 45-50C. Aadir los suplementos (si es necesario).
5. Agregar el antibitico a cada tubo. Mezclar por inversin.
6. El medio conteniendo antibiticos, se vierte cuanto antes en las placas de Petri estriles, evitando la formacin
de burbujas que dificultara la posterior inoculacin de las placas.
7. Dejar solidificar el medio en las placas, las cuales se utilizarn inmediatamente o se almacenarn en
refrigeracin a 4-8C, en bolsas plsticas.
8. Antes de la inoculacin, las placas se deben dejar a temperatura ambiente unos 30 minutos, comprobando que
no existe agua de condensacin en la superficie de las mismas.
9. Preparacin del Inculo: el inculo recomendado se prepara con una suspensin bacteriana estandarizada
con el tubo 0,5 de McFarland que contiene aproximadamente 108 UFC/ml, que posteriormente se diluye 1:10
para ajustar la concentracin a 107 UFC/ml
136
10. Una vez que se ha preparado el inculo, las placas debe sembrarse antes de los 15-30 minutos, para evitar que
la demora pueda provocar cambios significativos en el tamao del inculo. La inoculacin puede hacerse de
dos maneras: utilizando un asa calibrada estril o un dispositivo de inoculacin (replicador), el cual dispensa
0,001 0,002 ml de la suspensin bacteriana en la superficie de las placas de agar. De esta forma, se depositan
cerca de 1 x 104 UFC por gota sobre la superficie del agar que contiene las diferentes concentraciones de los
agentes antimicrobianos. Para la inoculacin, se deben preparar las series de placas de modo que se comience
inoculando un control sin antibiticos, se contina inoculando a partir de la placa con mayor concentracin de
antibitico y se finaliza sembrando una nueva placa de control sin antibitico.
11. Cada una de las cepas a probar, se debe sembrar por rayado en una placa sin antibitico para comprobar la
pureza de las mismas.
12. Las placas inoculadas se dejarn a temperatura ambiente hasta que las gotas de inculo estn secas.
13. Incubar las placas a 35C durante 16-24 horas.
14. Luego de la incubacin en condiciones apropiadas, los microorganismos se desarrollarn en aquellas placas
que no contengan suficiente concentracin de antibitico para inhibir su crecimiento. La CIM es la mayor
dilucin (menor concentracin) del antibitico que inhibe el crecimiento bacteriano.
Ventajas y Limitaciones del Mtodo de Dilucin en Agar
Es un mtodo bien estandarizado con resultados confiables y reproducibles que puede utilizarse como
referencia para evaluar la exactitud de otros sistemas de prueba. Adicionalmente, permite probar simultneamente
varios aislamientos y detectar ms fcilmente, contaminacin de los cultivos que los mtodos de dilucin en
caldo. La mayor desventaja es que consume mucho tiempo y es muy laborioso. Adems, no permite determinar la
CBM.
C. Mtodo de Difusin del Disco en Agar (Mtodo del Disco Unico de Alta Potencia o Mtodo de Baer y
Kirby)
Es el mtodo estandarizado debido a que se economiza tiempo y dinero, hay facilidad y reproducibilidad
en los resultados, adems, da un margen de seguridad del 96%.
Fundamento
Este mtodo utiliza discos de papel de filtro impregnados con antibitico. Inmediatamente que los discos
son colocados sobre la superficie del medio de cultivo, previamente inoculado con el microorganismo de prueba,
el antibitico difunde de manera radial, creando una reduccin logartmica en la concentracin del antibitico. Si
la bacteria es sensible al efecto del antibitico, se producir un halo de inhibicin del crecimiento alrededor del
disco; en caso contrario, la bacteria crecer normalmente.
Los dimetros de los halos de inhibicin han sido correlacionados con las CIM de los antibiticos, obtenidas
por pruebas de dilucin seriada con inculos bacterianos estandarizados.
El mtodo de difusin del disco en agar es utilizado de rutina para la determinacin de la susceptibilidad
antimicrobiana; pero la CIM y la CBM determinadas mediante pruebas de dilucin se estn convirtiendo en rutinarias,
especialmente cuando existen infecciones severas en pacientes hospitalizados y se requiere una informacin ms
exacta; siendo particularmente tiles en pacientes spticos, inmuno-comprometidos, con meningitis o endocarditis
bacteriana, en pacientes que no responden al tratamiento de eleccin y en aquellos que requieren altas dosis de
antibiticos potencialmente txicos para el tratamiento de la infeccin.
Procedimiento
1. Se toman 4 5 colonias de la bacteria aislada en cultivo puro y se inocula un CST (3-4 ml).
2. Incubar el CST a 35C por 18-24 horas (mnimo 2-8 horas), con el objeto de obtener una suspensin bacteriana
de 108 UFC/ml, aproximadamente. Dicha concentracin es similar al tubo N 0,5 de McFarland.
3. Si es necesario, ajustar la turbidez del CST, empleando para ello SSF estril o CST.
4. Cuando se obtiene esta concentracin aproximada de bacterias, se procede a inocular el medio de cultivo. Se
recomienda el Agar Meller-Hinton (MH)*, el cual se ambienta 30 minutos antes de su inoculacin. Para este
137
fin, la suspensin bacteriana se toma con un hisopo de algodn estril, el cual se rota contra las paredes del tubo,
antes del sembrarlo en forma masiva, para eliminar el exceso de lquido.
*Nota: se recomienda el agar MH para las bacterias no exigentes; en caso de estreptococos pueden emplearse
modificaciones como el MH enriquecido con 5% de Sangre (MHS) y para microorganismos ms exigentes como
Haemophilus, se recomienda el Haemophilus Test Medium (HTM) y para Neisseria, el Gelosa Chocolate Isovitalex
(GCI). Lo ideal es tener un medio de cultivo de bajo contenido de cationes (magnesio y calcio); ya que stos
afectan la actividad de los ciertos antibiticos, tales como: aminoglicsidos y tetraciclinas; y adems, el medio no
debe presentar variacin entre lotes.
5. Inocular a manera de csped toda la superficie del agar, rotando la placa en ngulos de 60, al igual que el
hisopo.
6. Despus de 3-5 minutos el inculo est seco y con ayuda de una pinza flameada a la llama del mechero, colocar
cada uno de los discos de antibiticos sobre la superficie del agar. Hacer ligera presin con la pinza para
asegurar la adherencia del disco a la superficie del agar. Puede utilizarse un dispensador de discos, que es un
instrumento que permite colocar varios discos simultneamente.
7. Una vez colocados todos los discos, incubar las placas en la estufa a 35C por 18-24 horas.
8. La lectura e interpretacin de las zonas de inhibicin se hace de acuerdo al dimetro de la zona donde no ha
crecido la bacteria, la cual se determina al medir con una regla por la parte dorsal de la placa de Petri.
8. Los resultados se expresan de manera cualitativa en tres categoras, como: Resistente (R), Sensible (S) o
Intermedio (I), segn los resultados obtenidos en las tablas correspondientes del CLSI (ver anexo 1).
La categora sensible implica que una infeccin dada por las cepas en estudio puede ser tratada
apropiadamente con la dosis de antibitico recomendada para el tipo de infeccin y el agente causal, a menos que
existan contraindicaciones.
La categora intermedio, incluye cepas que pueden ser inhibidas por concentraciones ms elevadas del
antibitico, siempre que la dosis usada pueda ser incrementada (por ejemplo, -lactmicos) o que sean concentrados
fisiolgicamente en el tejido infectado, por ejemplo, -lactmicos y quinolonas en orina. Tambin indica una zona
buffer que debera evitar que pequeos factores tcnicos difciles de controlar causen mayores discrepancias de
interpretacin, especialmente, para drogas con limitado margen frmaco-txico.
La categora resistente indica que las cepas no son inhibidas por las concentraciones sricas normalmente
alcanzadas a las dosis habituales y la eficacia clnica no ha sido comprobable.
Interpretacin de los resultados:
El tamao de la zona de inhibicin que se observa en una prueba de difusin en agar no tiene significado
por s mismo. Las normas interpretativas provistas por el CLSI, derivan de una correlacin entre las medidas de las
zonas y las CIM de aquellas especies que pueden ser estudiadas mediante un mtodo de difusin en agar.
Ventajas del Mtodo de Difusin en Agar
1. Su tcnica es de fcil ejecucin y sus resultados son reproducibles.
2. Los reactivos utilizados son relativamente econmicos.
3. No requiere equipos especiales.
4. Sus resultados son de fcil interpretacin.
5. Presenta flexibilidad en la seleccin de los antibiticos a probar.
Limitaciones del Mtodo de Difusin en Agar
1. Ha sido estandarizado para un reducido espectro de microorganismos.
2. Sus resultados son de carcter cualitativo y no cuantitativo.
3. Slo permite probar una concentracin de cada antibitico.
138
Figura 27 Mtodo de Difusin en Agar

Digitalizacin
Proceda a realizar un antibiograma por la tcnica de Kirby & Baer a una bacteria gramnegativa y uno
grampositiva, segn le indique su profesor. Registre los dimetros de los halos de inhibicin obtenidos para cada
microorganismo y antibitico (mm). Interprtelos y reporte correctamente los resultados obtenidos.
D. Mtodos de Gradiente de Antibiticos
Estos mtodos combinan los principios de la tcnica de difusin del disco y la dilucin en agar. Utilizan
tiras de plstico no poroso, de 6 cm de largo x 5 mm de ancho, impregnadas de antibitico, presentes en un
gradiente de concentracin predefinido, las cuales son colocadas en la superficie del medio de cultivo previamente
inoculado y que, una vez incubadas en condiciones apropiadas por el tiempo conveniente, van a producir zonas de
inhibicin del crecimiento con forma elipsoidal y simtrica. El punto donde la elipse toca la escala graduada de la
tira, indica directamente, la CIM del antibitico en cuestin.
Estos mtodos incluyen: E-TEST (PDM-Epsilometer Test, Ab Biodisk; Suecia) y el M.I.C.E: Minimal
Inhibitory Concentration Evaluator (OxoidTM).
Procedimiento
1. Preparar un inculo estandarizado de manera similar al utilizado en el mtodo de Kirby & Baer (1,5 x 108
UFC/ml).
2. Durante los 15 minutos posteriores al ajuste del inculo, introducir un hisopo estril dentro de la suspensin
y al retirarlo, rotar varias veces contra la pared del tubo por encima del nivel del lquido con la finalidad de
eliminar el exceso de inculo. Inocular las placas de agar MH uniformemente, sin dejar ninguna zona libre.
3. Dejar absorber el inculo de 10-15 minutos para asegurarse que la superficie del agar est completamente seca
antes de aplicar las tiras. Este punto es crtico para optimizar la realizacin de la prueba.
4. Tanto si se utiliza el aplicador de las tiras como las pinzas, se debe asegurar que la escala de CIM est
orientada hacia arriba y que la mxima concentracin est cercana al extremo de la placa. Asegrese que la
tira contacte completamente con la superficie del agar. Elimine las gotas de aire que puedan encontrarse por
debajo de la tira presionndola ligeramente con las pinzas. Es importante no mover la tira una vez que han
sido colocadas en la superficie del agar; ya que el antibitico empieza a difundir rpidamente.
5. Cuando se utiliza una placa de Petri de 100 mm. de dimetro, deposite slo dos tiras por placa; mientras que
cuando se utilizan placas de 150 mm. No se deben colocar ms de 6 tiras y siempre deben disponerse de
manera radial.
6. Por lo general, las placas son incubadas inmediatamente. La temperatura, tiempo y atmsfera de incubacin
utilizadas deben ser ptimas para el crecimiento de la especie bacteriana en estudio.
7. Lectura de los resultados: despus del perodo de incubacin, leer la CIM en el punto de interseccin entre
el extremo de inhibicin de la elipse y la tira con el antibitico.
8. Cuando el crecimiento tiene lugar a lo largo de toda la tira y no se observa formacin de la elipse de inhibicin,
la CIM se informar como superior al valor mximo de la escala de lectura y, por el contrario, cuando la elipse
139
de inhibicin se encuentre por debajo de la tira, debe ser informado como inferior al valor mnimo de la escala
de lectura (Figuras 28 y 29).
CIM
CIM
Figura 28: Mtodo de Gradiente de Antibiticos (E-test)
Figura 29: Mtodo de Gradiente de Antibiticos (M.I.C.ETM)
Ventajas y Limitaciones de los Mtodos de Gradiente

En contra de lo que ocurre en el mtodo de difusin de Kirby & Baer, donde la orientacin del disco no
tiene importancia; en los mtodos de gradiente si la tira est al revs, no se observa elipse de inhibicin ya que el
gradiente de concentraciones se sita slo sobre una de las caras de la tira.
Los mtodos de gradiente, se consideran como un mtodo alternativo para el estudio cuantitativo de la
sensibilidad antimicrobiana. Del mismo modo, cabe destacar, su sencillez y buena correlacin con la tcnica
estndar de dilucin en caldo o agar para el estudio de la CIM. Esta es una tcnica sumamente fcil de ejecutar y
de interpretar; pero tiene la desventaja que las tiras son sumamente costosas.
Proceda a realizar la determinacin de la CIM por el mtodo de gradiente de antibiticos a los
microorganismos que le indique su profesor. Registre los valores de CIM obtenidos para cada microorganismo y
antibitico. Reprtelos correctamente e interprete los resultados.
E.- Otras pruebas
Pruebas para detectar beta-lactamasas
Las beta-lactamasas (-lactamasas) son enzimas bacterianas heterogneas que rompen el anillo -lactmico
de las penicilinas, cefalosporinas y otros antibiticos del grupo, dando lugar a compuestos sin actividad
antibacteriana. Se encuentran en una amplia variedad de especies bacterianas Gram positivas y Gram negativas.
Pueden estar localizadas en los cromosomas bacterianos o en los plsmidos que pueden transferirse de una bacteria
a otra. Se dice que son constitutivas, cuando estn presentes en ausencia del antibitico, a menudo en grandes
cantidades; o inducibles, cuando son producidas slo despus que la bacteria ha tenido contacto con el antibitico.
Algunas afectan de forma predominante a las penicilinas; otras, a las cefalosporinas; mientras que algunas poseen
una actividad ms amplia.
La presencia de estas enzimas puede detectarse rpidamente, indicando en forma temprana que el
aislamiento no responder a los antibiticos -lactmicos.
La mayora de los mtodos para detectar la presencia de -lactamasas, se basan en los cambios qumicos
producidos en la molcula de penicilina y cefalosporinas al ser hidrolizado el anillo -lactmico:
a) Por formacin de un grupo carboxlico extra que da un compuesto dicido (cido penicilinoico) que puede
ser detectado usando un indicador de pH o por su habilidad para reducir el yodo.
b) Por deteccin microbiolgica de la baja actividad antibacteriana del producto formado.
c) Por cambio en la disposicin de electrones en la molcula de una cefalosporina cromognica al ser
hidrolizada, observndose un cambio de color atribuido al producto formado.
De estos mtodos, el ms utilizado es el de la cefalosporina cromognica que se explica a continuacin:
140
Mtodo de la Cefalosporina Cromognica (Nitrocefina):

La nitrocefina es una cefalosporina cromognica, cuyo color amarillo es atribuido al sustituyente dinitrotirilo
en la posicin 3 de su molcula. Al ser hidrolizada por las -lactamasas, cambia su color al rojo intenso debido a
la formacin de una base de Shiff cromognica dada por la fuerte conjugacin del anillo -lactmico y la doble
ligadura en el anillo dihidrotiazina con el grupo dinitrotiril.
El mtodo cromognico es altamente especfico; aunque est limitado por la capacidad de hidrlisis que
ejerzan las -lactamasas sobre la nitrocefina; la cual generalmente, se comercializa en forma de discos. Estos
deben colocarse sobre un portaobjetos de vidrio o placa de Petri y rehidratarse con 1 2 gotas de agua destilada.
La aparicin de un color rojo intenso en 1-2 minutos despus de colocar 2-3 colonias de un cultivo puro del
microorganismo de prueba sobre la superficie de los discos, indicar la presencia de -lactamasa.
En ocasiones, se emplea una solucin de nitrocefina 0,5 mM que se prepara disolviendo 2,56 mg de
nitrocefina en 9,5 ml de bffer fosfato 0,1 M, pH 7,0 y 0,5 ml de dimetilsulfxido. La prueba suele realizarse
emulsionando las colonias del microorganismo a estudiar en 20 l de la solucin de nitrocefina. La aparicin de un
color rojo intenso en 1-2 minutos, indicar la presencia de -lactamasa.
Tambin existen sistemas comerciales en los que la nitrocefina viene prefijada en barritas plsticas que son
impregnadas con el microorganismo de prueba y en caso de que el microorganismo sea -lactamasa positivo, se
observar la aparicin de un color rojo en el extremo de la barrita. Este es el caso del -lactamase Touch Strip
(OXOIDTM) (Figura 30).
Figura 30: Deteccin de -lactamasas

(-lactamase Touch Strip (OXOIDTM)
Negativa; Positiva
Digitalizacin
Proceda a investigar la produccin de -lactamasas, por el mtodo de la cefalosporina cromognica, en las
cepas bacterianas que le indique su profesor. Registre e interprete los resultados.
1. Defina: a) Antibiograma; b) CIM y c) CBM
2. El mtodo de difusin en agar determina actividad bacteriosttica o bactericida?. Explique brevemente.
3. Indique en qu fase del crecimiento un microorganismo es ms sensible a los antibiticos.
4. Por qu el mtodo de difusin en agar no es un indicador perfecto de cmo actuar la droga in vivo?Qu otros
factores deben ser considerados antes de usar un agente quimioterpico in vivo?
5. Explique Qu efecto tendra la administracin de tetraciclina durante el curso de una terapia con penicilina?
6. Seale las ventajas y desventajas de los diferentes mtodos utilizados para determinar la susceptibilidad de
las bacterias a los antibiticos. Indique Por qu debe utilizarse un inculo estandarizado en las pruebas de
susceptibilidad?
7. Cules son los controles que se utilizan en la determinacin de la CIM?. Para qu sirven?
8. En qu casos est indicado realizar pruebas de sensibilidad antimicrobiana?
9. En una prueba de dilucin seriada en caldo, se obtuvo los siguientes resultados que fueron registrados como (+)
si hubo crecimiento y (-) sin crecimiento. Indique: Cul es la CIM?Cul es la CBM? Qu antibitico es ms
efectivo contra el microorganismo probado?
141
Antimicrobiano
142
Dilucin
1:10-1:70
1:80
1:90
1:100
1:200-1:500
1:10-1:150
1:160
1:170
1:180
1:190-1:500
Crecimiento
+
+
+
+
Subcultivo
+
+
+
+
+
+
+
UNIDAD VII
INTERACCIN BACTERIA-HOSPEDERO
Objetivo Terminal:
Verificar la presencia de flora normal en diferentes sitios anatmicos del cuerpo humano.

FLORA NORMAL
Objetivo Especfico:
1. Observar las formas bacterianas de la flora normal presentes en diversas muestras de origen humano.
Generalidades
Normalmente, los microorganismos crecen abundantemente dentro y en la superficie del cuerpo humano.
Esta poblacin microbiana se conoce como flora normal, autctona, indgena o habitual.
Segn las condiciones de permanencia y colonizacin en el organismo, dentro de la flora habitual, se
pueden considerar dos grupos: la flora residente, constituida por microorganismos relativamente constantes
en un rea determinada y la flora transitoria, que incluye microorganismos, generalmente provenientes del
ambiente, no especficos, que pueden permanecer en piel o mucosas, durante un perodo relativamente corto (horas,
das o semanas) y de poca significacin desde el punto de vista ecolgico.
En el tero, el feto es estril; la colonizacin microbiana del recin nacido comienza inmediatamente
despus del nacimiento, en el paso a travs del canal del parto, por el contacto con la madre, medio ambiente y
otros seres humanos. Inicialmente, es colonizado por una gran variedad de microorganismos, dependiendo de
diversos factores ambientales; slo semanas despus, la flora microbiana del infante es similar a la del adulto.
La relacin entre la microflora normal y una persona saludable puede ser clasificada como una de dos
tipos de simbiosis (asociacin estrecha entre dos organismos): comensalismo o mutualismo. En una relacin
de comensalismo, un organismo es beneficiado y el otro resulta ileso. Por ejemplo, muchas bacterias que viven
en el intestino grueso, utilizan como nutrientes algunos productos de la digestin de los alimentos; mientras el
hospedero no es beneficiado, ni daado.
En una relacin de mutualismo, ambos organismos son beneficiados. Por ejemplo, los miembros de la flora
residente intestinal reciben un suministro constante de nutrientes, a la vez que sintetizan vitamina K, intervienen en
la produccin de pigmentos y de cidos biliares, absorcin de nutrientes y desdoblamiento de productos, as como
en el antagonismo a patgenos microbianos.
Un tercer tipo de asociacin biolgica es el parasitismo. En esta relacin, uno de los organismos se
beneficia y el otro, se perjudica. En la enfermedad infecciosa, el microorganismo es un parsito que produce dao
al hospedador. Este microorganismo recibe el nombre de patgeno.
Algunos miembros de la microflora normal se convierten en patgenos bajo ciertas condiciones. Estos
organismos se conocen como oportunistas.
Flora Normal del Cuerpo Humano
Las regiones anatmicas del cuerpo humano colonizadas por microorganismos comprenden: piel y mucosas,
odo externo, tracto respiratorio superior, tracto gastrointestinal y parte externa del aparato genito-urinario.
Los rganos y regiones del cuerpo generalmente libres de microorganismos (reas anatmicas normalmente
estriles) son: el tracto respiratorio inferior, uretra posterior, crvix, sangre y otros lquidos orgnicos, sistema
nervioso y huesos, entre otros.
No existe un patrn sobre la distribucin de los microorganismos en el cuerpo humano, ya que esto depende
de una serie de variables difcilmente controlables. En la tabla 2 aparecen los microorganismos ms frecuentemente
encontrados formando parte de la flora normal de las diferentes zonas anatmicas.
145
Tabla 2
Flora Normal predominante en diferentes reas Anatmicas
Sitios del cuerpo
Microflora
S. aureus (escaso)
Piel y mucosas
S. epidermidis
Streptococcus grupo viridans
Bacillus sp.
Corynebacterium sp.
Odo Externo
S. aureus
S. epidermidis
Corynebacterium sp.
Moraxella sp.
Ojo
Neisseria sp.
S. epidermidis
Neisseria sp.
Lactobacillus sp.
S. epidermidis
Corynebacterium sp.
Bacteroides sp.
Tracto Respiratorio Superior
Fusobacterium sp.
Prevotella sp.
Cantidades menores de los siguientes cuando se acompaan de los microorganismos antes
mencionados:
Haemophilus influenzae
Streptococcus pneumoniae
S. aureus
Bacilos Gram negativos
N. meningitidis.
Enterobacterias, excepto Salmonella, Shigella y Yersinia,
Streptococcus hemolticos y no hemolticos.
Bacteroides sp.
Bacillus sp.
Tracto Gastro intestinal
Clostridium sp.
Fusobacterium sp.
Lactobacillus sp.
Peptostreptococcus sp.
Bacilos Gram negativos no fermentadores de la glucosa.
Enterococcus sp.
Corynebacterium sp.
Lactobacillus sp.
Streptococcus hemolticos y no hemolticos.
Tracto Genito-urinario
Enterococcus sp.
Enterobacterias
S. epidermidis
Anaerobios (Prevotella, Clostridium, Bacteroides, Peptostreptococcus)
146
Materiales
Placas conteniendo agar sangre humana (una por grupo)
Hisopos con torunda de algodn estriles
Tubos conteniendo SSF
Depresores linguales
Colorantes de Gram
Lminas portaobjeto
Procedimiento
A cada grupo le corresponder la toma y procesamiento de muestras provenientes de diferentes reas
anatmicas. Para la obtencin de dichas muestras, proceda segn se describe a continuacin:
Exudado Farngeo
1. Seleccionar para la toma de muestra a un estudiante que no presente signos de faringitis; es decir, aparentemente
sano.
2. Bajo visin directa, con la ayuda de un depresor lingual, presionar la lengua hacia abajo para observar los
pilares de la faringe y el rea tonsilar.
3. Utilizando un hisopo, frotar las criptas tonsilares y la pared posterior de la faringe, evitando tocar la mucosa
oral, lengua o vula.
4. Inocular directamente una placa de agar sangre, e incubar en aerobiosis a 35-37C durante 24 horas.
5. Pasado el perodo de incubacin, realizar la lectura del cultivo, observando los diferentes tipos de colonias
presentes. Seleccionar varias colonias y realizar un frotis coloreado con Gram de cada una de ellas. Anote los
resultados.
Boca
1. Con la ayuda de un hisopo estril, frotar varias zonas de la boca.
2. Inocular directamente una placa de agar sangre. Incubar a 35-37C, durante 24 horas en aerobiosis.
3. Pasado el perodo de incubacin, observar la morfologa colonial y seleccionar varios tipos de colonias a partir
de las cuales debe realizar frotis coloreados con Gram. Observar y anotar los resultados.
Piel
1. Utilizando un hisopo, previamente humedecido en SSF, frotar un rea determinada de la piel (cuello, axilas).
2. Inocular directamente sobre una placa de agar sangre, e incubar en aerobiosis a 35-37C durante 24 horas.
presentes. Seleccionar varias colonias y realizar un frotis coloreado con Gram de cada una de ellas. Anotar los
resultados.
Exudado Nasal
1. Inserte un hisopo, previamente humedecido en SSF, dentro de las fosas nasales. Rotar el hisopo contra la
mucosa nasal.
2. Inocular directamente sobre una placa de agar sangre, e incubar en aerobiosis a 35-37C durante 24 horas.
presentes. Seleccionar varias colonias y realizar un frotis coloreado con Gram de cada una de ellas. Anote los
resultados.
1. Mencione los tipos de microflora normal y diga en qu se diferencian.
2. Mencione tres microorganismos que forman parte de la flora normal de piel, tracto respiratorio superior y
tracto gastrointestinal.
3. Mencione tres reas anatmicas normalmente estriles.
4. Defina microorganismos oportunistas.
5. De acuerdo a los resultados obtenidos en la prctica, indique en cuales sitios anatmicos, se observ mayor
cantidad de flora normal. Razone y justifique su respuesta.
147
UNIDAD VIII
CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO
Objetivo Terminal:
Aplicar correctamente el control de calidad en la preparacin de medios de cultivo

PREPARACIN Y CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO
1. Preparar adecuadamente medios de cultivo utilizados para el crecimiento de bacterias.
2. Identificar las posibles causas de error en la preparacin de medios de cultivo.
3. Practicar correctamente las pruebas de control de calidad de medios de cultivo en el laboratorio de
Bacteriologa.
Generalidades
Para estudiar debidamente los microorganismos se requiere cultivarlos en condiciones de laboratorio.
Para lograr esto, es preciso conocer cuales son los nutrientes y las condiciones fsicas que requieren para su
crecimiento. Mediante investigaciones extensas se han determinado las necesidades nutricionales de las bacterias,
y esta informacin ha permitido el desarrollo de numerosos medios de cultivo. Ya que las necesidades nutricionales
de las bacterias varan de manera muy amplia, existen diferencias importantes en cuanto a la composicin de los
medios empleados. Las bacterias tambin presentan notables diferencias en lo que respecta a las condiciones del
ambiente que favorecen su proliferacin.
Medios de Cultivo
Son sustancias de origen natural o sinttico, slidos o lquidos, que le proporcionan a los microorganismos,
los nutrientes necesarios para su crecimiento.
Algunas bacterias pueden crecer bien en cualquier medio de cultivo; otras, son ms exigentes y requieren
medios especiales que contengan factores de crecimiento y, algunas, no son capaces de desarrollarse en ninguno
de los medios artificiales disponibles hasta ahora.
cultivo.
Los microorganismos que se multiplican en o sobre la superficie de un medio de cultivo, constituyen un
Caractersticas de los Medios de Cultivo

a) Contener los nutrientes esenciales en la proporcin adecuada para soportar el crecimiento de los
microorganismos: fuente de energa, de carbono y de nitrgeno, oligoelementos, factores de crecimiento y
agua.
b) Poseer una cantidad adecuada de sal (generalmente, en forma de cloruro de sodio) para estabilizar el medio.
c) Tener humedad suficiente para permitir la proliferacin de las formas vegetativas de los microorganismos.
d) Estar libre de sustancias inhibidoras para el microorganismo a cultivar.
e) Poseer un pH adecuado para el metabolismo del microorganismo. La mayora de las bacterias crecen mejor
a pH neutro o cercano a la neutralidad (6,8-7,1); pero los hongos crecen a pH ms cidos.
f) El medio, originalmente, debe ser estril (libre de toda forma de vida) a fin de garantizar que slo los
microorganismos inoculados estn presentes en el medio.
g) Poseer una consistencia adecuada (slido, semislido o lquido).
h) Finalmente, debe ser incubado en condiciones apropiadas: temperatura, atmsfera y tiempo.
Conservacin de los medios de cultivo deshidratados
Una amplia variedad de medios de cultivo est actualmente disponible para el crecimiento de los
microorganismos en el laboratorio. La mayor parte de estos medios, poseen componentes pre-mezclados que slo
requieren la adicin de agua y esterilizacin. Constantemente, estos medios son evaluados para optimizar su uso
en el aislamiento e identificacin de microorganismos de inters en los diferentes campos microbiolgicos de
aplicacin.
151
Los medios de cultivo deshidratados son higroscpicos y la absorcin de agua del exterior, as como la
formacin de agua dentro de la botella, como consecuencia de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente,
favorecen el crecimiento bacteriano. Esto puede conducir al consumo de nutrientes, variaciones de pH y cambios
en el color del medio. Adems, la exposicin a la luz puede llevar a importantes alteraciones en los constituyentes
del medio. En consecuencia, los medios de cultivo deshidratados deben conservarse siempre en sitio fresco y seco,
protegidos de la luz. Los frascos con tapa de rosca, deben cerrarse bien despus de cada toma.
Utilizando condiciones de almacenamiento adecuadas, los medios deshidratados tienen una vida til de
al menos 1 ao. Si se observan alteraciones sustanciales, tales como: hidratacin, endurecimiento, presencia de
grumos y cambio de color, deben descartarse.
Precauciones Especiales en la Preparacin de los Medios de Cultivo
La preparacin de medios de cultivo para uso en el laboratorio, a partir de medios deshidratados, es
esencialmente una simple manipulacin dirigida por unos cuantos principios de sentido comn. El procedimiento
requiere precisin, exactitud y atencin hacia la pureza y la esterilidad, las cuales son consideraciones rutinarias
para el personal de Bacteriologa. Debe tenerse especial cuidado en relacin con:
Medios deshidratados: Registrar en el recipiente, la fecha de recepcin y de apertura. Almacnelos como
se indica en la etiqueta, con escasa luz, baja humedad ambiental y con el recipiente correctamente tapado.
Asegrese de que las caractersticas fsicas del polvo son las tpicas y adecuadas antes de su empleo.
Equipo: Utilizar material de vidrio, en perfectas condiciones, totalmente limpio, y que haya sido aclarado
con agua destilada o desionizada. Los equipos utilizados como dispositivos de medida, escalas, medidores
de pH y autoclaves, deben ser frecuentemente calibrados con precisin.
Agua: usar agua destilada o desionizada libre de plomo, cloro, cobre y detergentes.
Tcnica de Preparacin de Medios de Cultivo
Pesar con exactitud la cantidad de medio deshidratado requerido, segn las indicaciones del fabricante.
El grado de disolucin de un medio deshidratado, as como la eficacia del mismo ya preparado, depende
en gran medida del procedimiento empleado en la rehidratacin. Se recomienda disolver completamente
en el volumen adecuado de agua, utilizando recipientes con capacidad que duplique el volumen final del
medio a preparar. Si el medio va a distribuirse en tubos, debe agitarse constantemente para asegurar una
adecuada homogenizacin al momento de repartirlo.
Calentar a temperatura de ebullicin los medios que contienen agar o gelatina para disolverlos
completamente. Los medios con agar, particularmente aquellos que lo contienen en poca cantidad, pueden
hervir de forma inesperada y repentina y derramarse fuera de la fiola. Durante el calentamiento, se debe
agitar frecuente pero suavemente, para evitar el sobrecalentamiento del medio y la prdida de su valor
nutritivo. Los medios lquidos (no contienen agar) no requieren calentamiento.
Verificar el pH del medio y, si es necesario, ajustarlo
Cuando se va a esterilizar deben seguirse las instrucciones de tiempo, presin y temperatura para la
obtencin de medios de cultivo ptimos: 121C, 15 libras de presin, por 15 minutos, son suficientes
para la mayora de los medios. Cuando se preparan medios termolbiles deben utilizarse otros mtodos de
esterilizacin, por ejemplo: filtracin o tindalizacin.
Estabilizar el medio en Bao de Mara a una temperatura entre 45-55C para disminuir gradualmente
la temperatura y evitar la solidificacin del agar y la formacin de agua de condensacin. Los medios
lquidos, luego de repartidos, se esterilizan en el autoclave y no requieren estabilizacin.
Aadir aspticamente las sustancias enriquecedoras o aditivos. Estos suplementos (sangre, hemoglobina,
entre otros), son sensibles al calor, se aaden al medio despus de la esterilizacin y la estabilizacin para
evitar el deterioro del enriquecimiento debido al calor. Mezclar cuidadosamente, evitando la formacin de
burbujas o espuma.
Repartir aspticamente el medio en las placas de Petri o en tubos de ensayo.
Dejar solidificar a temperatura ambiente (si el medio contiene agar).
152
Rotular todos los medios preparados, tanto en placas como en tubos, indicando la fecha de preparacin.
Almacenar el medio preparado a la temperatura indicada por el fabricante. El almacenamiento a 4C es
adecuado para la mayora de los medios. Sin embargo, medios de cultivo como el caldo tioglicolato y
agar sangre anaerobiosis deben guardarse a temperatura ambiente. Deben ajustarse bien las tapas, una vez
cerrados los tubos y colocar las placas preparadas, de forma invertida, en bolsas plsticas para evitar la
evaporacin excesiva de la humedad del medio.
Los medios deben mantenerse preferiblemente en sitios oscuros, ya que la luz puede afectar algunos de
sus componentes.
Fuentes de Error en la Preparacin de Medios de Cultivo
Medio inadecuado: dado que los medios suelen estar dispuestos por orden alfabtico en un estante, es
posible seleccionar inadvertidamente un frasco equivocado o un suplemento inadecuado, con lo cual el
medio resulta no apto para su uso. Es siempre importante leer el rtulo, particularmente cuando se recibe
en el laboratorio un nuevo lote de medios.
Agua: se debe medir cuidadosamente la cantidad de agua que se aade al reconstituir el medio. Dado
que las impurezas hacen inapropiada el agua corriente para la mayora de los medios biolgicos, los
laboratorios deben usar agua destilada, desionizada o que haya recibido ambos tratamientos.
Pesaje: emplear balanzas adecuadas para pesar los medios deshidratadados (en polvo). Los errores de
pesaje alteran significativamente la composicin y el pH final del medio.
Distribucin de los medios: los medios deben repartirse exacta y aspticamente en placas y tubos. La
medicin errnea de la cantidad a dispensar, puede ocasionar, por ejemplo, un medio de agar con espesor
demasiado fino o grueso, siendo ambos inadecuados para su empleo.
Esterilizacin: un error comn en la preparacin de los medios de cultivo es la esterilizacin a una
temperatura demasiado elevada y/o durante un perodo demasiado largo. Esto puede producir el deterioro
o descomposicin de algunos componentes de los medios hacindolos inadecuados.
Material de vidrio: se debe tener la precaucin de utilizar material de vidrio limpio; ya que los residuos
adheridos al vidrio pueden inhibir, particularmente, algunos microorganismos exigentes.
Control de Calidad de Medios de Cultivo
Todo programa de control de calidad para medios de cultivo persigue asegurar que un medio respalde
el desarrollo de los microorganismos de inters, exhibir una respuesta bioqumica tpica, ser estable y tener un
tiempo de preservacin razonable.
La calidad de cada lote de medio de cultivo preparado se prueba antes de su uso, mediante la inoculacin
de microorganismos cuyas reacciones se conocen. Las cepas de control deben verificarse para corroborar su
pureza, sembrndolas en placas de agar.
Los procedimientos en Bacteriologa dependen de que los microorganismos viables en el cultivo sean
capaces de mantener sus caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y que sean tpicas, estables y reproducibles.
Existen varias fuentes de cultivos de referencia que pueden utilizarse para el Control de Calidad:
American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, USA.
National Collection of Type Culture (NCTC), Inglaterra.
Nacional Collection of Industrial Bacteria (NCIC) Survey, Inglaterra.
Japanese Federation of Culture Collection of Microorganisms (JFCC), Japn.
Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos (CVCM) en Caracas, Venezuela.
Tambin pueden utilizarse cepas puras aisladas en el laboratorio, si son conservadas, se les caracteriza
adecuadamente y sus reacciones son bien verificadas y reproducibles.
El Control de Calidad de un medio de cultivo incluye:
Prueba de esterilidad
Prueba de desarrollo
Prueba de inhibicin
153
Prueba de respuesta bioqumica

Prueba de Esterilidad:
Todos los medios deben ser estriles cuando se inoculan. Cada lote de medio preparado en el laboratorio,
debe ser controlado para asegurar su esterilidad. Esta prueba se realiza incubando una muestra (1-5%) del lote de
medio preparado, en la estufa durante 24-48 horas a 35C. Si al efectuar la prueba no se produce crecimiento, la
prueba de esterilidad es positiva.
Si aparece contaminacin en el medio, la prueba de esterilidad es negativa, pues hubo crecimiento en el
medio (sin inocular) como resultado de esterilizacin inadecuada. En estos casos, debe repetirse el procedimiento
con otro porcentaje igual del lote y si el resultado persiste, el medio se descarta, no puede ser utilizado. En caso
contrario, si puede utilizarse el medio; ya que la contaminacin pudo ser accidental.
Los medios utilizados para realizar las pruebas de esterilidad deben descartarse al ser completada la
prueba; ya que son inadecuados para la inoculacin a causa de la deshidratacin producida luego de 24-48 horas
de incubacin.
Prueba de Desarrollo
Tiene por finalidad determinar la capacidad del medio de cultivo, de respaldar el crecimiento de
microorganismos, inoculndolos con un tpico aislamiento de reserva. Cuando se prueba la capacidad del medio
de respaldar desarrollo, debe utilizarse una suspensin diluida. Esta suspensin va a dar mayor seguridad de que el
medio es adecuado para el desarrollo de un pequeo nmero de microorganismos presentes en una muestra.
Este inculo se prepara resuspendiendo varias colonias en SSF hasta obtener una turbidez igual a la del
estndar 0,5 de McFarland, posteriormente, se realiza una dilucin 1/100 (0,1 ml de la suspensin estandarizada +
9,9 ml de SSF). Inocular el medio con 10 l de la suspensin.
Posteriormente, incubar a 35C x 24-48 horas; transcurrido este tiempo debe observarse el medio, para
buscar el desarrollo de colonias en la superficie del agar si es un medio slido; o la presencia de turbidez en el
caldo, si es un medio lquido; en cuyo caso la prueba se considerar como positiva. Un resultado positivo indica
que el medio es capaz de respaldar el crecimiento (desarrollo) de un microorganismo aunque se encuentre presente
en una baja concentracin.
Por el contrario, si la prueba es negativa (no hay crecimiento bacteriano) debe proceder a repetirse la
prueba, verificando cada una de las variables intervinientes, como por ejemplo: la viabilidad del microorganismo
de prueba y las condiciones de incubacin de la prueba, entre otras. Si el resultado negativo persiste, el medio debe
descartarse. Si el resultado es positivo, el resto del lote de medio preparado, puede utilizarse en el laboratorio para
el cultivo de muestras biolgicas.
En ciertos medios de cultivo selectivos, como es el caso del MC, XLD, SSA y TCBS, la prueba de
desarrollo lleva implcita una prueba de respuesta bioqumica ya que el microorganismo al desarrollarse en el
medio, puede producir diferentes tipos de colonias de acuerdo a sus caractersticas metablicas.
Prueba de Inhibicin
Se aplica a los medios selectivos y de enriquecimiento. Para demostrar el efecto inhibidor del medio se
utiliza un inculo abundante; ya que si el medio va a impedir el desarrollo de un gran inculo, va a inhibir el
pequeo nmero de microorganismos que pueden estar presentes en la muestra primaria.
Este inculo se prepara suspendiendo varias colonias en SSF hasta obtener una turbidez igual a la del
estndar 0,5 de McFarland. Posteriormente, se realiza una dilucin 1/10 (1 ml de la suspensin estandarizada +
9,00 ml de SSF). Inocular el medio con 10 l de la suspensin.
Posteriormente, incubar a 35C x 24-48 horas; transcurrido este tiempo debe observarse el medio, para
verificar la ausencia de crecimiento; en cuyo caso, la prueba se considerar como positiva. Un resultado positivo,
indica que el medio es capaz de inhibir el crecimiento (desarrollo) de un microorganismo aunque se encuentre
presente en alta concentracin.
Por el contrario, si la prueba es negativa (presencia de crecimiento bacteriano) debe proceder a repetirse
la prueba. Si resultado negativo persiste, el medio debe descartarse. Si el resultado es positivo, puede utilizarse en
el laboratorio para el cultivo de muestras biolgicas.
154
Prueba de Respuesta Bioqumica

Al inocular medios empleados para verificar una reaccin especfica, tal como fermentacin de
carbohidratos o produccin de H2S, por ejemplo, es necesario usar cepas puras de caractersticas bioqumicas
conocidas, a fin de verificar que esas caractersticas puedan ser expresadas por el microorganismo al desarrollarse
en un medio de cultivo determinado.
Generalmente, se utilizan cepas que permitan verificar las diferentes reacciones potencialmente observables
en un determinado medio de prueba y no debe realizarse dilucin de las mismas; ya que lo importante, es detectar
la reaccin metablica expresada por el microorganismo, ms no, su crecimiento o desarrollo.
La Tabla 3 puede considerarse como gua a la hora de efectuar el Control de Calidad a un medio de cultivo
en particular:
Tabla 3
Pruebas de control de calidad de Medios de Cultivo
Prueba de Control de Calidad
Medio
Esterilidad
Desarrollo
Basal
Selectivo*
Diferencial
Enriquecido
Indicador
Enriquecimiento
Transporte
Inhibicin
Respuesta
Bioqumica
x
x
x
x
x
* Nota: Para ciertos medios de cultivo selectivos, que contienen carbohidratos e indicadores de pH en su
composicin, tales como: MC, XLD, SSA y el TCBS, la prueba de desarrollo, lleva mplicita la de respuesta
bioqumica; puesto que pueden evidenciarse distintas reacciones metablicas del microorganismo en el medio de
cultivo.
A cada grupo le corresponder la preparacin de uno o varios medios de cultivo. Preprelos segn las
indicaciones del fabricante y efecte las pruebas de control de calidad correspondientes segn el tipo de medio.
Reporte e interprete los resultados obtenidos.
1. Explique los pasos para la preparacin de un medio de cultivo, resaltando las diferencias entre los medios de
cultivo lquidos y slidos.
2. Por qu los medios de cultivo lquidos no requieren estabilizacin?
3. Indique por qu los suplementos deben ser aadidos al medio despus de la estabilizacin.
4. Mencione algunos medios de cultivo que no pueden esterilizarse en autoclave.y explique por qu?
5. Qu importancia tiene el control de calidad de medios de cultivo en el laboratorio de Bacteriologa?
6. Explique por qu a los medios selectivos y diferenciales se les aplica pruebas de inhibicin y respuesta
bioqumica?.
7. Qu finalidad tiene la aplicacin de la prueba de desarrollo en medios enriquecidos?
8. Por qu algunos medios de cultivo no requieren esterilizacin?.
155
ANEXOS
ANEXO 1: TABLA DE INTERPRETACIN DEL DIMETRO DE LA ZONA DE INHIBICIN PARA

DISCOS DE ANTIBITICOS
Agente antimicrobiano
Cdigo
Potencia del
disco
AN-30
30g
Interpretacin del dimetro de la zona de inhibicin (mm)

Resistente
Intermedio
14
15 - 16
17
Enterobacteriaceae
13
14 17
18
Staphylococcus spp.
19
---
20
Enterobacteriaceae y V. cholerae
13
14 - 16
17
Staphylococcus spp.
28
---
29
Enterococcus spp
16
---
17
Listeria monocytogenes
19
---
20
Haemophilus spp.
18
19 - 21
22
11
12 - 14
15
13
14 - 17
18
---
---
12
16
---
17
16
---
17
Enterobacteriaceae y Acinetobacter
19
20 - 22
23
P. aeruginosa
13
14 - 16
17
13
14 - 16
17
14
15 - 17
18
16
17 - 19
20
14
15 - 17
18
14
15 - 17
18
Amikacina
Enterobacteriaceae, P. aeruginosa
Acinetobacter y staphylococcus
Amoxicilina/Ac Clavulnico
Ampicilina
Ampicilina/Sulbactam
AMC-30
AM-10
SAM-20
20/10g
10g
10/10g
Acinetobacter y staphylococci
Azitromicina
AZM-15
15g
Staphylococcus spp.
Haemophilus spp
Aztreonam
ATM-30
30g
Enterobacteriaceae, P. aeruginosa Acinetobacter

Carbenicilina
Cefaclor
CB-100
CEC-30
100g
30g
Enterobacteriaceae y stapylococci
Haemophilus spp
Cefamandol
30g
MA-30
30g
CZ-30
30g
Cefazolina
Cefdinir
CDR-5
5g
Haemophilus spp.
Enterobacteriaceae y staphylococci
Cefepime
FEP-30
Susceptible
---
---
20
16
17 - 19
20
30g
14
15 - 17
18
Haemophilus spp.
---
---
26
N. gonorrhoeae
---
---
31
23
24 - 25
26
15
16 - 18
19
Haemophilus spp.
---
---
21
N. gonorrhoeae
---
---
31
Streptococci (no-S. pneumoniae)

Cefixima
CFM-5
5g
Enterobacteriaceae
Cefmetazol
CMZ-30
30g
159
12
13 - 15
16
N. gonorrhoeae
27
28 - 32
33
14
15 - 17
18
Haemophilus spp
16
17 - 19
20
15
16 - 20
21
15
16 - 20
21
14
15 - 22
23
Haemophilus spp.
---
---
26
N. gonorrhoeae
---
---
31
25
26 - 27
28
12
13 - 15
16
N. gonorrhoeae
19
20 - 25
26
14
15 - 17
18
N. gonorrhoeae
23
24 - 27
28
17
18 - 20
21
---
---
21
---
---
29
14
15 - 17
18
Haemophilus spp
14
15 - 17
18
Cefonicid
Cefoperazona
CID-30
CFP-75
30g
75g
Cefoperazona/sulbactam
CFP/S
75/30g
Cefotaxima
CTX-30
30g
Streptococci (no-S pneumoniae)

Cefotetan
Cefoxitina
Cefpodoxima
CTT-30
FOX-30
CPD-10
30g
30g
10g
Haemophilus spp.
N. gonorrhoeae
Cefprozil
Ceftazidima
CPR-30
CAZ-30
10g
30g
14
15 - 17
18
Haemophilus spp.
---
---
26
N. gonorrhoeae
---
---
31
17
18 - 20
21
---
---
28
14
15- 19
20
Haemophilus spp.
---
---
26
N. gonorrhoeae
---
---
38
Ceftibuten
CTB-30
30g
Enterobacteriaceae
Haemophilus spp.
Ceftizoxima
ZOX-30
30g
Enterobacteriaceae,P. aeruginosa
Ceftriaxona
CRO-30
30g
13
14 - 20
21
Haemophilus spp.
---
---
26
N. gonorrhoeae
---
---
35
160

24
25 - 26
27
12
13 - 15
16
N. gonorrhoeae
27
28 - 32
33
14
15- 17
18
Enterococci y V. cholerae
12
13 - 17
18
Haemophilus spp.
25
26 - 28
29
S. pneumoniae
20
---
21
17
18 - 20
21
14
15 - 18
19
15
16 - 20
21
---
---
21
27
28 - 40
41
Stapylococcus spp
13
14 - 17
18
Haemophilus spp.
10
11 - 12
13
16
17 - 20
21
14
15 - 20
21
15
16 - 18
19
9 - 10
11
12
13 - 15
16
14
15 - 17
18
N. gonorrhoeae
31
32 - 35
36
Staphylococcus spp y enterococci
13
14 - 22
23
S pneumoniae y otros streptococci
15
16 - 20
21
12
13 - 15
16
7-9
10
Enterobacteriaceae
13
14 - 20
21
P. aeruginosa, Acinetobacter y staphylococci
12
13 - 14
15
14
15 - 17
18
Cefuroxima(sodio)
Cefalotina
CXM-30
CF-30
30g
30g
Cloranfenicol
C-30
30g

Cinoxacina
CIN-100
100g
Enterobacteriaceae
Ciprofloxacina
CIP-5
5g
Acinetobacter, staphylococci y enterococci
Haemophilus spp
N. gonorrhoeae
Claritromicina
CLR-15
15g
Streptococci
Clindamicina
CC-2
2g
Stapylococcus spp
Colistina
CL-10
10g
Enoxacina
Eritromicina
Fosfomicina
ENX-10
E-15
FOS-200
10g
15g
200g
E. coli y E. faecalis solamente

Gentamicina
Enterococcus spp.
GM-120
120g
Para alto nivel de resistencia
Haemophilus spp
N. gonorrhoeae
Imipenem
IPM-10
---
---
24
27
28 - 36
37
15
16 - 18
19
10g
161
Haemophilus spp
Kanamicina
K-30
30g
LVX-5
5g
Enterobacteriaceae y staphylococci.
Levofloxacina
13
14 - 15
16
---
---
16
13
14 - 17
16
13
14 - 16
17
13
14 - 16
17
18
19 - 21
22
---
---
22
26
27 - 37
38
14
15 - 17
18
15
16 - 18
19
13
14 - 15
16
---
---
20
17
18 - 20
21
15
---
16
14
15 - 18
19
14
15 - 22
23
10
11 - 12
13
13
14 - 18
19
12
13 - 15
16
12
13 - 14
15
14
15 - 16
17
12
13 - 16
17
14
15 - 16
17
Acinetobacter, staphylococci y enterococci.
Haemophilus spp.
Lomefloxacina
LOM-10
10g
Enterobacteriaceae
Acinetobacter y stapylococci
Haemophilus spp
N. gonorrhoeae
Loracarbef
LOR-30
30g
Haemophilus spp
Meropenem
MEM-10
10g
Acinetobacter y stapylococi
Haemophilus spp
Mezlocilina
MZ-75
75g
P. aeruginosa
Minociclina
MI-30
30g
Moxalactam
Acinetobacter y stapylococci
Nafcilina
NF-1
1g
Staphylococcus aureus
Acido Nalidxico
NA-30
30g
Neomicina
N-30
30g
Netilmicina
NET-30
30g
Enterobacteriaceae
Nitrofurantoina
F/M-300
300g
Enterobacteriaceae, staphylococci y enterococci

Norfloxacina
NOR-10
10g
Novobiocina
NB-30
30g
Enterobacteriaceae y staphylococci.
Ofloxacina
162
OFX-5
5g

12
13 - 15
16
---
---
16
N. gonorrhoeae
24
25 - 30
31
S pneumoniae y otros streptococci no -hemolticos
12
13- 15
16
< 10
11 - 12
>13
< 24
> 25
Stapylococcus spp
28
---
29
Enterococcus
14
---
15
L. monocytogenes
19
20- 27
28
N. gonorrhoeae
26
27 - 46
47
19
20 - 27
28
17
18 - 20
21
P. aeruginosa
17
---
18
17
18 - 20
21
Staphylococcus spp y P. aeruginosa
17
---
18
9 - 11
12
Staphylococcus spp y Enterococcus
16
17 - 19
20
Haemophilus spp.
16
17 - 19
20
16
17 - 18
19
Staphylococcus
15
16 - 18
19
S pneumoniae
15
16 - 18
19
14
15- 17
18
Haemophilus spp.
Oxacilina
OX
1g
S. aureus; S. lugdunensis
SCN (excepto S. lugdunensis)
Penicilina
P-10
10U
Streptococci (no-S pneumoniae)

Piperacilina
Piperacilina/ Tazobactam
Polimixina B
PIP-100
TZP-110
100g
100/10g
PB-300
300U
RA-5
5g
Rifampina
S pneumoniae
Sparfloxacina
Espectinomicina
SPX-5
SPT-100
5g
1g
N. gonorrhoeae
Estreptomicina
Enterococci
S-300
300g
7- 9
18
S-100
10g
11
12- 14
15
G-25
25g
12
13 - 16
17
Enterococci y V. cholerae
14
15 - 18
19
Haemophilus spp.
25
26 - 28
29
N. gonorrhoeae
30
31 - 37
38
18
19 - 22
23
14
15 - 19
20
P. aeruginosa
14
---
15
Para altos niveles de resistencia

Enterobacteriaceae
Sulfisozaxol
Acinetobacter, staphylococci y V. cholerae
Tetraciclina
Te-30
30g
Enterobacteriaceae P. aeruginosa
Acinetobacter, staphylococci
Ticarcilina
Ticarcilina/ Acido
Clavulnico
TIC-75
TIM-85
75g
75/10g
163
14
15 - 19
20
P. aeruginosa
14
---
15
Staphylococcus spp
22
---
23
12
13 - 14
15
10
11 - 15
16
Acinetobacter, staphylococci y V. cholerae
10
11 - 15
16
Haemophilus spp.
10
11 - 15
16
S pneumoniae
15
16 - 18
19
Tobramicina
NN-10
10g
Trimetoprim
TMP-5
5g
Trimetoprim/
Sulfametoxazol
SXT-100
1,25g
23,75g
Vancomicina
Staphylococcus spp
Enterococcus spp
S. pneumoniae y otros streptococci
164
Va-30
30g
---
---
15
14
15 - 16
17
---
---
17
ANEXO 2: PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO DE USO FRECUENTE EN

BACTERIOLOGA
AGAR SANGRE HUMANA (ASH):
(Usando como base agar soya tripticasa).
Frmula en gramos/litro):
Digesto pancratico de casena.....................................................................15,00 g
Digesto pancratico de harina de soya...........................................................5,00 g
Agar..............................................................................................................15,00 g
Preparacin:
pH final: 7,3 + 0,2
1. Suspenda 40 gramos en 950 ml de agua destilada o desionizada y caliente hasta la ebullicin, mezclando
suavemente para que se disuelva por completo.
2. Esterilice en autoclave a 121C durante 15 minutos a 15 libras de presin.
3. Enfre hasta 4550C y aada aspticamente 5% (50 ml) de sangre humana defribrinada estril.
4. Mezcle a fondo, evitando la formacin de burbujas de aire y dispense en placas de Petri estriles.
Uso:
El ASH es usado para el aislamiento y cultivo de los estreptococos y otros microorganismos de crecimiento
fastidioso. Permite tambin, la deteccin de la actividad hemoltica. Este medio deriva sus nutrientes de la infusin
de peptonas que suministra compuestos nitrogenados y de carbono, azufre, vitaminas e ingredientes traza. El
cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmtico del medio.
Control de Calidad:
Streptococcus pyogenes: crecimiento, -hemlisis.
Streptococcus pneumoniae: crecimiento, -hemlisis.
Staphylococcus aureus: crecimiento
Escherichia coli: crecimiento.
AGAR GELOSA CHOCOLATE (GC)
Frmula en gramos/litro:
Digesto pancretico de casena.........................................................................7,5 g
Digesto pptico de tejido animal......................................................................7,5 g
Almidn de maz..............................................................................................1,0 g
Fosfato dipotsico.............................................................................................4,0 g
Fosfato monopotsico.......................................................................................1,0 g
Agar................................................................................................................10,0 g
pH: 7,2 + 0,2
165
Preparacin:
1. Suspenda 72 gramos del polvo deshidratado en 900 ml de agua destilada para preparar una base de doble
concentracin. Mezcle vigorosamente.
2. Caliente con agitacin frecuente y deje hervir un minuto para que se disuelva completamente el agar.
3. Esterilice por autoclave a 121C por 15 minutos a 15 libras de presin.
4. Esterilice por autoclave 100 ml de una solucin de Hemoglobina (2%).
5. Enfre la solucin a 50C en Bao de Mara.
6. Aada 2 ml de Isovitalex a la base y luego aada la solucin de Hemoglobina.
7. Mezcle cuidadosamente y reparta en placas de Petri (aproximadamente 20 ml por placa) evitando la formacin
de burbujas.
Uso:
Es un medio enriquecido usado para el aislamiento y cultivo de microorganismos fastidiosos, especialmente
Neisseria y Haemophilus. Contiene peptona de casena y de carne como fuente de nutrientes, buffer fosfato
para controlar el pH y almidn de maz para neutralizar los cidos grasos txicos que pudieran estar presentes
en el agar. Se aade como suplemento: hemoglobina e isovitalex. El primero, provee el factor X (hemina) para
especies de Haemophilus y el segundo, provee el factor V (nicotamida-adenina- dinucletido) para especies de
Haemophilus y adems, vitaminas, aminocidos, coenzimas, glucosa, iones frricos y otros factores que mejoran
el crecimiento de neiserias patgenas.
Control de Calidad:
Neisseria gonorrhoeae: crecimiento
Neisseria meningitidis: crecimiento
Haemophilus influenzae: crecimiento
Streptococcus pneumoniae: crecimiento
AGAR MC CONKEY (MC)
Digesto pancretico de gelatina........................................................17,0 g
Digesto pancretico de casena...........................................................1,5 g
Digesto pptico de tejido animal.........................................................1,5 g
Lactosa..............................................................................................10,0 g
Mezcla de sales biliares.......................................................................1,5 g
Cloruro de sodio..................................................................................5,0 g
Agar.....................................................................................................3,5 g
Rojo neutro........................................................................................0,03 g
Cristal violeta..................................................................................0,001 g
pH final: 7,1+ 0,2
Preparacin:
1. Suspender 50 gramos del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Mezcle hasta que se obtenga una
suspensin uniforme.
2. Calentar suavemente, agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C y
15 libras de presin por 15 minutos.
3. El medio estril fundido se estabiliza a 4550C, en Bao de Mara y se dispensa en placas de Petri estriles.
Uso:
166
Es un medio selectivo que permite slo el crecimiento de bacilos Gram negativos. La concentracin de
sales biliares en el medio es relativamente baja en comparacin con otros medios para bacterias entricas (SSA,
entre otros), el colorante cristal violeta inhibe los organismos grampositivos, especialmente, enterococos y
estafilococos.
La diferenciacin entre los organismos entricos se logra por la combinacin de lactosa y el indicador de pH
rojo neutro. Las colonias incoloras (no fermentadoras de la lactosa, NFL) o rosadas (colonias fermentadoras de la
lactosa, CFL) se producen dependiendo de la habilidad del microorganismo para fermentar o no la lactosa.
Control de Calidad:
Escherichia coli: crecimiento, CFL.
Proteus mirabilis: crecimiento, CNFL.
Salmonella typhimurium: crecimiento, CNFL.
Enterococcus faecalis: inhibicin (parcial o total).
Staphylococcus aureus: inhibicin (parcial o total).
TIOSULFATO CITRATO BILIS SUCROSA (TCBS)
Peptona de casena..............................................................................5,0 g
Peptona de carne.................................................................................5,0 g
Extracto de levadura............................................................................5,0 g
Citrato de sodio.................................................................................10,0 g
Tiosulfato de sodio............................................................................10,0 g
Oxgall (bilis de buey)..........................................................................5,0 g
Colato de sodio....................................................................................3,0 g
Sucrosa..............................................................................................20,0 g
Cloruro de sodio................................................................................10,0 g
Citrato frrico......................................................................................1,0 g
Azul de timol.....................................................................................0,04 g
Azul de bromotimol..........................................................................0,04 g
Agar...................................................................................................14,0 g
pH: 8,4 + 0,6
Preparacin:
1. Suspender 88 gramos del medio en polvo en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente. Calentar con
agitacin frecuente. Hervir por un minuto para que se disuelva completamente el polvo.
2. Enfriar a 4550C en Bao de Mara y repartir en placas de Petri estriles.
3. NO AUTOCLAVAR.
4. Dejar solidificar a temperatura ambiente.
Uso:
Es un medio altamente selectivo (de nico propsito) para el aislamiento de V. cholerae y otras especies del
gnero, a partir de una variedad de especmenes. La inhibicin de las bacterias grampositivas se logra mediante la
adicin de bilis de buey y colato de sodio. El tiosulfato de sodio sirve como fuente de carbono y, en combinacin
con el citrato frrico detecta la produccin de sulfuro de hidrgeno (H2S) (aunque los miembros del gnero
Vibrio no producen H2S; por lo tanto, esta no es la finalidad principal del medio). La sucrosa se incluye como
carbohidrato fermentable para el metabolismo de los vibrios. El pH alcalino del medio aumenta la recuperacin
de V. cholerae. El doble indicador de pH (azul de timol y de bromotimol) facilita la deteccin de la produccin de
cido a partir de la sucrosa; an a pesar del pH alcalino del medio.
167
Control de Calidad:

V.cholerae: colonias amarillas (CFS, colonias fermentadoras de la sucrosa).

V. parahaemolyticus: colonias azul-.verdosas o verde-azuladas (CNFS)

E.coli: inhibicin parcial o completa.

P. aeruginosa: inhibicin parcial o completa.
AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD)
Xilosa................................................................................................3,50 g
Lactosa..............................................................................................7,50 g
Sucrosa..............................................................................................7,50 g
L-Lisina.............................................................................................5,00 g
Extracto de levadura..........................................................................3,00 g
Rojo de fenol.....................................................................................0,08 g
Agar.................................................................................................13,50 g
Desoxicolato de sodio.......................................................................2,50 g
Citrato de Hierro y Amonio..............................................................0,80 g
pH final:7,5 + 0,2
Preparacin:
1. Realizar una suspensin con 55 gramos del material deshidratado en un litro de agua destilada. Calentar para
disolver el agar, agitando frecuentemente, dejar hervir un minuto. Evitar el sobrecalentamiento. NO AUTOCLAVAR.
2. Estabilizar en Bao de Mara a una temperatura de 50-55C. El medio debe tener un color rojizo claro, sin
precipitado. El calentamiento excesivo o la permanencia prolongada en el Bao de Mara puede producir
precipitacin.
3. Repartir aspticamente en placas de Petri y dejar solidificar a temperatura ambiente.
Uso:
Recomendado para el aislamiento y diferenciacin de enteropatgenos, especialmente especies de Shigella

y Salmonella. Es un medio selectivo que utiliza el desoxicolato de sodio como agente selectivo y, por lo tanto,
inhibe el crecimiento de las bacterias grampositivas. La xilosa se incorpora al medio, puesto que, este carbohidrato
es fermentado por, prcticamente, todas las enterobacterias, excepto por especies de Shigella y esta propiedad
incrementa la diferenciacin de especies de este gnero. La lisina se incluye para diferenciar Salmonella del grupo
de los no patgenos; ya que sin lisina, las salmonelas rpidamente fermentan la xilosa y seran indistinguibles
de las especies no patgenas. Despus que las salmonelas agotan el suministro de xilosa, la lisina es atacada va
enzimtica, a travs de la lisina decarboxilasa, con reversin al pH alcalino que enmascara la reaccin de las
shigelas. Para prevenir tal reversin por coliformes lisina-positivos, se aade al medio, sucrosa y lactosa para
lograr la produccin de cido en exceso.
La adicin de un sistema indicador de pH, aumenta la capacidad diferencial del medio. Este consiste en
tiosulfato de sodio y citrato frrico-amnico, los cuales se incluyen para la visualizacin del H2S producido,
resultando en la formacin de colonias con centros negros. Los no enteropatgenos productores de sulfuro de
hidrgeno, no decarboxilan la lisina.
168
Control de Calidad:
S. thyphimurium: colonias rojas con H2S.
S. flexneri: colonias rojas sin H2S.
S. aureus: inhibicin parcial
E. coli: inhibicin parcial; colonias amarillas sin H2S.
Salmonella Grupo III: colonias amarillas con H2S.
SALMONELLA- SHIGELLA AGAR (SSA)
Extracto de carne de res......................................................................5,0 g
Peptona polipeptona............................................................................5,0 g
Lactosa..............................................................................................10,0 g
Sales biliares.......................................................................................8,5 g
Citrato de sodio...................................................................................8,5 g
Tiosulfato de sodio..............................................................................8,5 g
Citrato de hierro..................................................................................1,0 g
Agar...................................................................................................13,5 g
Verde brillante.................................................................................0,003 g
Rojo neutro (indicador)...................................................................0,025 g
Preparacin:
pH final: 7,0 + 0,2
1. Suspender 60 gramos del medio en un litro de agua destilada. Calentar frecuentemente y dejar hervir por un
minuto para que se disuelva completamente.
2. Enfriar el medio, aproximadamente hasta 45-50C, en Bao de Mara y dispensar en las placas de Petri.
3. Permita que las placas se sequen por aproximadamente dos horas con la tapa entreabierta. NO
AUTOCLAVAR.
Uso:
Es un medio selectivo para aislamiento de bacilos enteropatgenos, especialmente, los pertenecientes al
Gnero Salmonella. Este medio no es recomendado para el aislamiento primario de Shigella.
Es considerado un medio moderadamente selectivo, basado en el grado de inhibicin del crecimiento de los
grampositivos, que son inhibidos por el contenido de sales biliares, verde brillante y citrato. La diferenciacin de
los bacilos entricos se logra mediante la incorporacin de lactosa en el medio. Los organismos que fermentan
este carbohidrato, producen cidos que en presencia del indicador de pH, rojo neutro, provocan la aparicin de
colonias rosadas. Los no fermentadores, producen colonias incoloras. Este ltimo grupo, abarca la mayora de los
patgenos intestinales, incluyendo Salmonella y Shigella. El tiosulfato de sodio y el citrato frrico permiten la
deteccin de H2S que se evidencia por la aparicin de centros negros en las colonias.
Control de Calidad:
S. thyphimurium: colonias no fermentadoras de la lactosa con H2S.
S. flexneri: colonias no fermentadoras de la lactosa sin H2S.
Salmonella Grupo III: colonias fermentadoras de la lactosa con H2S.
E. coli: inhibicin parcial.
S. aureus: inhibicin completa.
169
SABOUROUD DEXTROSA AGAR (SB)

Digesto pptido de tejido animal.......................................................5,0 g
Dextrosa............................................................................................40,0 g
Agar...................................................................................................15,0 g
pH final: 5,6 + 0,2
Preparacin:
1. Suspender 65 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Calentar con agitacin frecuente y dejar hervir
por un minuto para que se disuelva completamente el polvo.
2. Esterilizar en autoclave a 121C por 15 minutos a 15 libras de presin.
3. Si se desea agregar cloranfenicol, aadir 0,05 g del antibitico a los ingredientes anteriores.
Uso:
Es un medio de propsito general desarrollado para el cultivo de hongos. El bajo pH de aproximadamente 5,6
es favorable para el crecimiento de los hongos, especialmente los dermatofitos, y ligeramente inhibitorio para las
bacterias contaminantes en las muestras clnicas. Este medio se recomienda para el recuento total de hongos. La
adicin de cloranfenicol es una modificacin diseada para incrementar la inhibicin bacteriana.
Es un medio a base de peptona suplementado con dextrosa para soportar el crecimiento de los hongos. Las
peptonas proporcionan los factores nitrogenados de crecimiento; la dextrosa provee la energa para el crecimiento
fngico. El cloranfenicol es un antibitico de amplio espectro, inhibidor para una amplia variedad de bacterias
grampositivas y gramnegativas, cuando se aade a su formulacin.
Control de Calidad:

C. albicans: crecimiento.
T. mentagrophytes: crecimiento
E. coli: inhibicin parcial o completa (slo si contiene cloranfenicol)
BASE DE PEPTONAS PARA PREPARAR INDOL
Peptona..............................................................................................10,0 g
Preparacin:
pH: 7,0 + 0,2
1. Rehidratar 10 gramos de peptona en un litro de agua destilada. Aadir cloruro de sodio a una concentracin de
10 %. Dispensar un volumen de 3 ml en cada tubo (13 x 100).
2. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 15 libras de presin a una temperatura de 121C.
3. Dejar enfriar y conservar en refrigeracin hasta su empleo.
Uso:
Peptona, es un trmino qumicamente indefinido que se utiliza para describir los productos hidrosolubles
obtenidos despus de la hidrlisis de las protenas. Contienen una mezcla de minocidos libres y polmeros de
aminocidos (pptidos) que van hasta pptidos de mayor tamao, capaces de permanecer en solucin despus de
calentarlos a 100C.
Las peptonas se fabrican utilizando enzimas o cidos minerales fuertes para hidrolizar las protenas que
pueden ser de origen animal (peptona de carne: incluye la casena y gelatina) o de origen vegetal (peptona de soya).
Las peptonas producidas a partir de estas diversas fuentes se pueden subdividir ulteriormente en las producidas
170
por cidos o por enzimas, tales como: tripsina, pepsina o papana.

Las distintas enzimas rompen los enlaces peptdicos de las molculas de protenas en lugares diferentes,
liberando as una variedad de pptidos y de aminocidos libres. Por su parte, la hidrlisis cida, rompe todos los
enlaces peptdicos de forma que produce solamente aminocidos libres. Desafortunadamente, destruye tambin
algunos aminocidos valiosos, como el triptfano. As, las peptonas ricas en triptfano se seleccionan para las
pruebas de produccin de indol.
El caldo triptofano se ha desarrollado especialmente, como sustrato para la produccin de indol. Debido a su
alto contenido de triptofano, es ms fiable que el caldo peptonado para este propsito.
Control de Calidad:
E. coli: indol positivo.
K. pneumoniae: indol negativo.
AGAR UREA DE CHRISTENSEN
Peptona..............................................................................................1,00 g
Glucosa..............................................................................................1,00 g
Fosfato monopotsico.......................................................................0,80 g
Fosfato disdico................................................................................1,20 g
Rojo de fenol...................................................................................0,012 g
Agar.................................................................................................15,00 g
Agua destilada..........................................................................1.000,00 ml
pH final: 6,8 + 0,2
Preparacin:
1.
2.
3.
4.
5.
Disolver 24 gramos del polvo en 950 ml de agua destilada.

Calentar en agitacin suave y frecuente. Dejar hervir.
Esterilizar en autoclave a 15 libras de presin (121C) por quince minutos.
Dejar enfriar a 50C y aspticamente aadir 50 ml de una solucin estril de urea al 40% y mezclar bien.
Dispensar 3-5 ml. en tubos estriles (13 x 100) y permitir solidificar para la formacin del plano inclinado.
Uso:
El agar urea permite la rpida diferenciacin de las especies de Proteus y otros bacilos gram negativos
urea positivos. Debe utilizarse un inculo fuerte. Cuando la urea es hidrolizada, la liberacin de aminas durante
la incubacin, alcaliniza el medio, mostrando un color rosado producto del viraje del indicador de pH, rojo de
fenol, que puede abarcar slo el bisel (en cuyo caso, la prueba ser dbil positiva); o tanto, el taco como el bisel,
(entonces, la prueba ser fuertemente positiva).
Esta prueba tambin puede realizarse en placas o en medio lquido (caldo urea).
Control de Calidad:
E. coli: negativa
P. mirabilis: positiva
171
AGAR MOVILIDAD
Extracto de carne.................................................................................3,0 g
Digesto pancretico de gelatina........................................................10,0 g
Agar.....................................................................................................4,0 g
pH final: 7,3 + 0,2
Preparacin:
1. Disolver 22 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Calentar en agitacin suave y frecuente. Dejar
hervir. Dispensar en tubos (3 ml) y esterilizar en autoclave a 121C por 15 minutos a 15 libras de presin.
2. Si se desea, se puede aadir al medio 0,05 gramos de trifenil-tetrazolium (TTC, colorante vital) antes de la
esterilizacin (o alternativamente, aada 5 ml de una solucin al 1 % de TTC aspticamente despus de la
esterilizacin).
Uso:
Se emplea en la deteccin de la movilidad de los bacilos gramnegativos entricos. Esta puede ser observada
directamente por examen de los tubos posterior a la incubacin. El crecimiento se disemina desde la lnea de
inoculacin, si el microorganismo es mvil. Organismos con gran movilidad producen turbidez en todo el tubo. El
crecimiento de los microorganismos no mviles, slo ocurre a lo largo de la lnea de inoculacin.
El uso opcional de TTC en el medio, permite la visualizacin del crecimiento bacteriano. Este se incorpora
al interior celular durante el metabolismo. El color rojo impartido a las clulas ayuda en la determinacin de la
movilidad.
Control de Calidad:
E. coli: mvil
K. pneumoniae: no mvil.
AGAR CITRATO DE SIMMONS
Sulfato de magnesio............................................................................0,2 g
Fosfato dihidrgeno de amonio...........................................................1,0 g
Fosfato dipotsico...............................................................................1,0 g
Citrato de sodio...................................................................................2,0 g
Agar...................................................................................................15,0 g
Azul de bromotimol..........................................................................15,0 g
pH final: 6,8 + 0,2
Preparacin:
1. Para rehidratar el medio, suspender 24,2 gramos en un litro de agua destilada o desionizada y calentar hasta la
ebullicin mezclando suavemente para que se disuelva por completo. Distribuir en tubos de ensayo.
2. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos a 15 libras de presin. Dejar solidificar en forma inclinada
para que se forme taco y bisel.
172
Uso:
Se emplea en la investigacin de bacilos gramnegativos usando como base el empleo del citrato. Los
organismos capaces de utilizar el citrato de sodio y el fosfato de amonio como fuente de carbono y nitrgeno,
respectivamente, crecern en el medio y producirn una reaccin alcalina evidenciada por el cambio de color del
indicador azul de bromotimol, de verde (neutro) a azul (alcalino).
Control de Calidad:
K. pneumoniae: positivo (crecimiento, el medio se torna azul)
E. coli: negativo (sin crecimiento)
CALDO BASE ROJO DE FENOL CON MANITOL
Digesto pancretico de casena.........................................................10,0 g
D-manitol............................................................................................5,0 g
Rojo fenol........................................................................................0,018 g
pH final: 7,3 + 0,2
Preparacin:
1. Resuspender 20 gramos del polvo en un litro de agua.

2. Dispensar en tubos (13 x 100), a razn de 3 ml por tubo, aproximadamente.
Uso:
Se emplea para determinar la habilidad de un microorganismo para fermentar o no, el manitol, este es el
nico carbohidrato fermentable en el medio, puesto que la peptona de casena no contiene carbohidratos. Los
fermentadores del manitol producen una reaccin cida en el medio que causa el cambio de color del indicador
rojo de fenol (del rojo al amarillo). Si se quiere evidenciar la produccin de gas, se aade un tubo de Durham al
medio.
Control de Calidad:
E. coli: positivo (crecimiento con produccin de gas)
S. aureus: positivo (crecimiento con produccin de cido)
P. vulgaris: negativo.
S. epidermidis: negativo.
AGAR NUTRITIVO (AN)

Digesto pancretico de gelatina..........................................................5,0 g
Agar...................................................................................................15,0 g
Preparacin:
pH final: 6,8 + 0,2
1. Suspender 23 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente. Calentar con agitacin
frecuente y hervir por un minuto para que se disuelva por completo el agar.
173
3. Repartir aspticamente en las placas.

Uso:
Es usado para el cultivo de bacterias y para el recuento de organismos en agua, heces y otros materiales.
Su composicin, relativamente simple, provee los nutrientes necesarios para la replicacin de gran cantidad de
microorganismos que no son exigentes para crecer. El extracto de carne contiene sustancias solubles en agua,
incluyendo carbohidratos, vitaminas, compuestos de nitrgeno orgnico y sales. Las peptonas constituyen la
principal fuente de nitrgeno orgnico, particularmente, aminocidos y pptidos de cadena larga.
Control de Calidad:
S. aureus: crecimiento moderado a fuerte.
E. coli: crecimiento moderado a fuerte.
AGAR THAYER MARTIN (VCN)
Peptona de carne.................................................................................7,5 g
Almidn de maz.................................................................................1,0 g
Fosfato dipotsico...............................................................................4,0 g
Fosfato monopotsico.........................................................................1,0 g
Agar...................................................................................................12,0 g
Hemoglobina.....................................................................................10,0 g
Isovitalex.........................................................................................10,0 ml
VCN suplemento.............................................................................10,0 ml
Preparacin:
pH final: 7,2 + 0,2
1. Disolver la base GC en la cantidad conveniente de agua destilada (ver preparacin de GC). Mezclar
vigorosamente.
2. Calentar hasta que hierva.
3. Esterilizar en autoclave a 121C a 15 libras de presin por 15 minutos.
4. Estabilizar en Bao de Mara a 50C por 30 minutos.
5. Agregar una solucin de Hemoglobina al 2%, Isovitalex al 1% y el suplemento VCN (1%).
6. Mezclar cuidadosamente y repartir en placas estriles.
Uso:
Es usado en el aislamiento de especies de Neisseria patgenas en especmenes que conllevan flora asociada.
Tiene como base el GC. Adicionalmente contiene los agentes antimicrobianos: vancomicina, colistina y nistatina,
que constituyen el suplemento inhibidor del medio. La vancomicina es activa primariamente contra bacilos
grampositivos. La colistina inhibe los bacilos gramnegativos, incluyendo especies de Pseudomonas; pero no,
especies de Proteus. La nistatina inhibe los hongos que pudieran estar presentes en la muestra.
Control de Calidad:
N. gonorrhoeae: crecimiento.
N. meningitidis: crecimiento.
N. sicca: inhibicin completa.
C. albicans: inhibicin completa.
174
S. aureus: inbibicin completa

E. coli: inhibicin completa
AGAR MELLER-HINTON (MH)
Hidrolizado cido de casena............................................................17,5 g
Almidn..............................................................................................1,5 g
Agar...................................................................................................17,0 g
pH final: 7,3 + 0,1
Preparacin:
1. Disolver 38 gramos del medio en un litro de agua destilada.
2. Calentar con agitacin constante. Dejar hervir por un minuto para que se disuelva completamente.
3. Esterilizar por autoclave a 121C por 15 minutos a 15 libras de presin. No sobrecalentar.
4. Estabilizar en Bao de Mara a 45-55C.
5. Aadir los suplementos, tales como: 5 % de sangre defibrinada estril (MHS). Mezclar bien.
6. Repartir en placas de petri estriles.
Uso:
Recomendado para las pruebas de susceptibilidad por el mtodo de difusin del disco de Baer y Kirby,
procedimiento estandarizado por el CLSI. El suplemento con sangre o isovitalex se ha sugerido para su uso en
pruebas para Haemophilus y Streptococcus.
Control de Calidad:
MH: S. aureus ATCC 25923
MHS: S. pneumoniae ATCC 6305
MH: E. coli ATCC 25922
MH: P. aeruginosa ATCC 27853
CALDO SOYA TRIPTICASA (CST)
Digesto papaico de soya......................................................................3,0 g
Fosfato dipotsico.............................................................................. 2,5 g
Dextrosa..............................................................................................2,5 g
Preparacin:
1.
2.
3.
4.
pH final: 7,3 + 0,2
Suspender 30 gramos del medio en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente.

Calentar gentilmente hasta disolucin completa.
Dispensar en tubos de 13 x 100, a razn de 3 ml por tubo.
Esterilizar en autoclave a 121C por 15 minutos a 15 libras de presin.
Uso:
Es un medio basal o simple, de propsito general, usado en procedimientos cualitativos para el cultivo
de microorganismos fastidiosos y no fastidiosos a partir de una variedad de muestras de diferente origen. Los
componentes peptdicos proveen los aminocidos y otros compuestos nitrogenados. La dextrosa acta como
fuente de energa. El NaCl mantiene el equilibrio osmtico del medio. El fosfato dibsico acta como buffer para
controlar el pH.
175
Control de Calidad:

B. subtilis: crecimiento
C.albicans: crecimiento
S. aureus: crecimiento
E. coli: crecimiento
CALDO THIOGLICOLATO (CT)
Digesto papaico de soya......................................................................3,0 g
Dextrosa..............................................................................................6,0 g
Thioglicolato de sodio.........................................................................0,5 g
Agar.....................................................................................................0,7 g
L- cisterna...........................................................................................0,1 g
Sulfito de sodio....................................................................................0,1 g
Hemina............................................................................................0,005 g
Vitamina K......................................................................................0,001 g
Preparacin:
pH final: 7,0 + 0,2
1. Suspender 30 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente.

2. Calentar con agitacin frecuente y dejar hervir un minuto para que se disuelva completamente el polvo.
3. Dispensar en tubos (16 x 150) con tapa de rosca (hasta ms de la mitad, aproximadamente 8-10 ml).
5. Almacenar el medio preparado a 15-30 C. Despus de almacenamiento prolongado, se debe recalentar el
medio una vez y hervirlo (100C por 10 minutos) para eliminar el oxgeno absorbido antes de su uso.
6. Los suplementos deben aadirse aspticamente, despus de la esterilizacin.
Uso:
Es un medio enriquecido que se usa para el cultivo de microorganismos fastidiosos y no fastidiosos a partir de
diferentes tipos de muestras. El tioglicolato de sodio, como agente reductor, mantiene una baja tensin de oxgeno
en el medio. La vitamina K sirve como factor de crecimiento para algunos microorganismos, incrementando el
crecimiento de ciertas especies de anaerbicos y esporulados. La hemina es una fuente de factor X que estimula el
crecimiento de organismos exigentes.
Control de Calidad:
B. fragilis: crecimiento
C. perfringens: crecimiento
E. coli: crecimiento
P. aeruginosa: crecimiento.
CALDO SELENITO F
Selenito cido de sodio............................................................................................4,0 g
Digesto pancretico de casena...............................................................................5,0 g
176
Lactosa....................................................................................................................4,0 g
Fosfato disdico......................................................................................................3,0 g
Fosfato monopotsico.............................................................................................7,0 g
pH final: 7,0 + 0,2
Preparacin:
1. Suspender 23 gramos del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente.

2. No requiere esterilizacin, si el medio es usado inmediatamente. Si va a ser almacenado, calentar a 100C por
30 minutos. El exceso de calor es daino. NO AUTOCLAVAR.
3. Almacenar el medio a una temperatura de 2- 8C. La pequea cantidad de precipitado coloreado no es
perjudicial.
Uso:
Es usado en el enriquecimiento para el aislamiento de Salmonella y algunas especies de Shigella, a partir de

muestras de heces, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria. Las peptonas de casena y carne proveen
los compuestos esenciales de nitrgeno y carbn. La lactosa en el medio sirve para mantener un pH uniforme.
Cuando el selenito es reducido por el crecimiento de la bacteria se produce alcalinidad; un incremento
en el pH podra disminuir la toxicidad del selenito y resultara en el sobrecrecimiento de bacterias extraas. En
realidad, el cido producido por la fermentacin de la lactosa sirve para mantener un pH neutral o ligeramente
disminuido.
La funcin del fosfato es doble: sirve para mantener estable el pH y tambin, disminuye la toxicidad
del selenito, aumentando la capacidad de enriquecimiento del medio. El selenito cido de sodio inhibe muchas
especies de bacterias grampositivas y gramnegativas, incluyendo enterococos y coliformes.
Los subcultivos deben hacerse entre las 6-18 horas de incubacin; de lo contrario, el efecto inhibidor de
las sales de selenito disminuye.
Control de Calidad:
Microorganismo
S. typhimurium
S. sonnei
E. coli
Crecimiento en MC despus de subcultivar el Selenito F

0 horas
24 horas
Crecimiento escaso a moderado de colonias Crecimiento moderado a fuerte de colonias
incoloras
incoloras
Crecimiento escaso a moderado de colonias Crecimiento moderado a fuerte de colonias
incoloras
incoloras
Crecimiento moderado a fuerte de colonias Crecimiento moderado a escaso de colonias
rosadas
rosadas
MEDIO DE TRANSPORTE CARY & BLAIR

Thioglicolato de sodio.........................................................................1,5 g
Fosfato disdico..................................................................................1,1 g
Agar.....................................................................................................5,0 g
pH final: 8,0 + 0,5
177
Preparacin:
1. Suspender 12,6 gramos del medio en 991 ml de agua destilada. Mezclar vigorosamente.
2. Calentar en agitacin constante y dejar hervir por un minuto para que se disuelva completamente.
3. Enfriar a 50C y aadir 9 ml de una solucin al 1% de cloruro de calcio (BaCl2). Ajustar el pH si es necesario
(8,4).
4. Dispensar en tubos con tapa de rosca (aproximadamente, 7 ml en cada tubo). Vaporizar por quince minutos.
Enfriar y ajustar la tapa.
Uso:
Se emplea para la coleccin y conservacin de especmenes clnicos. Contiene un mnimo de nutrientes
para incrementar la supervivencia del microorganismo; sin replicacin. El tioglicolato de sodio se aade para
proporcionar un bajo potencial redox. El pH relativamente alto, minimiza la destruccin de las bacterias debido a
la produccin de cido.
Control de Calidad:
S. aureus: crece cuando se subcultiva a un agar nutriente despus de 18 horas.
E. coli: crece cuando se subcultiva a un agar nutriente despus de 18 horas.
AGAR TRIPLE AZUCAR-HIERRO (TSI)
Extracto de carne...............................................................................3,00 g
Peptona............................................................................................20,00 g
Lactosa............................................................................................10,00 g
Sucrosa............................................................................................10,00 g
Glucosa..............................................................................................1,00 g
Citrato frrico amnico.....................................................................0,20 g
Agar.................................................................................................12,00 g
Rojo de fenol...................................................................................0,024 g
Agua destilada...........................................................................1000,00 ml
pH: 7,4 + 0,2
Preparacin:
Disolver 65 g del medio deshidratado en 1000 ml de agua destilada. Calentar hasta ebullicin para disolver
completamente el agar. Mezclar bien y distribuir en los tubos de prueba (16 x 150 ), a razn de 8-10 ml por tubo.
Esterilizar en autoclave a 15 lbs de presin, 120C por 15 minutos. Inclinar los tubos para permitir la formacin
del bisel sobre el taco de agar.
Uso:
Es un medio desarrollado para la identificacin de bacilos gramnegativos, como las enterobacterias. Las
peptonas, extracto de carne y de levadura, proveen a la bacteria de compuestos nitrogenados, azufre, elementos
traza y vitaminas del complejo B, entre otros nutrientes. El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmtico del
medio. Contiene lactosa, sucrosa y glucosa como carbohidratos fermentables. El indicador de pH del medio es el
rojo de fenol. Posee un sistema indicador de la produccin de H2S, constituido por el tiosulfato de sodio y el citrato
frrico amnico.
Control de Calidad:
C. freundii: Ac/Ac; H2S positivo; Gas: positivo.
E. coli: Ac/Ac; H2S negativo; Gas: positivo.
P. vulgaris: Alc/Ac; H2S positivo; Gas: positivo.
178
Shigella flexneri: Alc/Ac; H2S negativo; Gas: negativo.

P. aeruginosa: Alc/Alc Alc/N; H2S negativo; Gas: negativo.
AGAR LISINA HIERRO (LIA)
Peptona..............................................................................................5,00 g
Glucosa..............................................................................................1,00 g
Hidrocloruro de L-lisina..................................................................10,00 g
Citrato frrico amnico.....................................................................0,50 g
Prpura de bromocresol....................................................................0,02 g
Agar.................................................................................................15,00 g
Agua destilada............................................................................1.000,0 ml
pH: 6,7 + 0,2
Preparacin:
Disolver 34,56 g del medio deshidratado en 1000 ml de agua destilada. Calentar hasta ebullicin para disolver
completamente el agar. Mezclar bien y distribuir en los tubos de prueba (13 x 100 ), a razn de 5-7 ml por tubo.
Esterilizar en autoclave a 15 lbs de presin, 120C por 15 minutos. Inclinar los tubos para permitir la formacin
del bisel sobre el taco de agar.
Uso:
Este medio se utiliza para determinar si un bacilo gramnegativo decarboxila o deamina la lisina. Adems,
permite detectar la produccin de gas a partir de la fermentacin de la glucosa y la formacin de cido sulfhdrico
(H2S). Las peptonas y el extracto de levadura, proveen a la bacteria de compuestos nitrogenados, azufre, elementos
traza y vitaminas del complejo B, entre otros nutrientes. Contiene glucosa como carbohidrato fermentable. El
indicador de pH del medio es el prpura de bromocresol. Posee un sistema indicador de la produccin de H2S,
constituido por el tiosulfato de sodio y el citrato frrico amnico.
Control de Calidad:
P. mirabilis: Rojo/Ac; H2S negativo; Gas: negativo.
Shigella flexneri: Alc/Ac; H2S negativo; Gas: negativo.
Salmonella spp: Alc/Alc; H2S positivo; Gas: positivo.
179
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181

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COLECCIN

Profa. Judith Aular de Durn

Universidad del Zulia

Universidad del Zulia

Manual Prctico De Bacteriologa General; Segunda Edicin

Coleccin Textos Universitarios

Hecho el Depsito de Ley:

Actividad Prctica 1.1: Introduccin al Trabajo Prctico de Bacteriologa

Actividad Prctica 1.2: Observacin de Bacterias y otros Microorganismos in vivo

Actividad Prctica 1.3: Examen al Fresco y tcnica de la Gota Pendiente

UNIDAD II: MORFOLOGA Y ULTRA-ESTRUCTURA DE LA CLULA BACTERIANA

Actividad Prctica 2.1: Tcnicas de Coloracin. Examen microscpico de Preparaciones Coloreadas

UNIDAD I. INTRODUCCIN AL TRABAJO PRCTICO DE BACTERIOLOGA

Unidad III: Nutricin y Crecimiento Bacteriano

Actividad Prctica 3.1: Tcnicas de Siembra y Morfologa Colonial

Actividad Prctica 3.2: Factores que afectan el Crecimiento Bacteriano

Actividad Prctica 3.3.: Medicin del Crecimiento Bacteriano

UNIDAD IV: METABOLISMO BACTERIANO

Actividad Prctica 4.1: Pruebas Bioqumicas utilizadas en la Identificacin de Bacterias en el Laboratorio

UNIDAD V: GENTICA BACTERIANA

Manual prctico de bacteriologa general

Actividad Prctica 5.1: Transferencia de Material Gentico por Conjugacin

UNIDAD VI: CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

Actividad Prctica 6.2: Evaluacin de Desinfectantes y Antispticos

Actividad Prctica 6.3: Pruebas de Susceptibilidad y Resistencia Bacteriana a los Antibiticos

UNIDAD VII: INTERACCIN BACTERIA-HOSPEDERO

Actividad Prctica 7.1: Flora Normal

UNIDAD VIII: CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO

Actividad Prctica 8.1: Preparacin y Control de Calidad de Medios de Cultivo

El Manual Prctico de Bacteriologa General, en su segunda edicin, est dirigido fundamentalmente

ACTIVIDAD PRCTICA 1.1

Manual prctico de bacteriologa general

El material de vidrio utilizado en los Laboratorios de Bacteriologa est representado por:

Manual prctico de bacteriologa general

Manual prctico de bacteriologa general

Defina Normas de Bioseguridad.

ACTIVIDAD PRCTICA 1.2

ACTIVIDAD PRCTICA 1.3

Manual prctico de bacteriologa general

Figura 1: Preparacin de la suspensin bacteriana

Figura 2: Inversin de la lmina excavada sobre la laminilla cubreobjetos

Figura 3: Gota pendiente (Observacin al microscopio)

ACTIVIDAD PRCTICA 2.1

Interpretar los fundamentos de las coloraciones de uso ms frecuente en Bacteriologa.

Figura 4: Preparacin de un frotis o extendido

4. Esterilizar nuevamente el asa a la llama del mechero.

Figura 5: Secado del frotis

Figura 6: Fijacin del frotis a la llama del mechero

Manual prctico de bacteriologa general

Alternativamente, puede calentarse la preparacin en un dispositivo adecuado (plancha de calentamiento) a

Figura 7: Aplicacin de colorantes (Tincin propiamente dicha)

Manual prctico de bacteriologa general

Manual prctico de bacteriologa general

Manual prctico de bacteriologa general

Manual prctico de bacteriologa general

en que la tincin primaria resulta dbil.

Manual prctico de bacteriologa general

Manual prctico de bacteriologa general

La coloracin de Ziehl Neelsen se utiliza para identificar___________.

2.Por qu un organismo Gram positivo puede aparecer como Gram negativo?.

LAMINERO PRCTICA 2.1: COLORACIONES

LAMINERO PRCTICA 2.1: COLORACIONES

Lmina 1: Etapas de la Coloracin de Gram

Lmina 3: Bacilos Gram positivos en empalizadas y letras