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Enfoque determinista
Durante este apartado, gran parte del desarrollo se ha seguido el planteamiento propuesto por
Timothy S. Gardner en el estudio: Design and construction of synthetic gene regulatory
networks [2] publicado por la Facultad de Ingeniera de la Universidad de Boston en el ao
2000.
Enfoque Determinista
15
16
Enfoque Determinista
1. Especies y reacciones
El ncleo biestable
Promotores
ARNm
Represores
Adems, estas especies reaccionan entre s de la forma que muestra la siguiente imagen:
Enfoque Determinista
17
18
+
+ |
+
+
+ |
Enfoque Determinista
El biestable bsico
Para completar el esquema hasta llegar al del biestable simple, debemos aadir sobre el
ncleo anterior, las especies y dinmicas de las acciones que nos permitirn controlar el
estado activo, adems de los indicadores.
INDICADORES
Es necesario el modelado de los indicadores ya que cuando analicemos los resultados
que se hagan en laboratorio, no obtendremos las evoluciones de las protenas
represoras sino de los indicadores. Por lo tanto es necesario conocer su dinmica para
poder extrapolar los datos que extraigamos de los experimentos hacia un conocimiento
interno del sistema. Analizamos este hecho de forma detenida.
Cuando el transcriptor, se encuentra con un promotor, comienza a leer la cadena y
cuando termina de leer su cdigo es cuando comienza a crear la cadena de ARN
transcrito.
Prm
LacI
RFP
Plac
cI
GFP
De la transcripcin obtendremos una ARNm, una para la protena represora y otra para
el indicador. Las cadenas negras de la imagen, reflejan la presencia de terminadores.
Estos entes tienen una significacin y un objetivo claro para la traduccin. La polimerasa
detendr su copia al encontrarse con un doble terminador, como la imagen patenta.
Una vez el mensajero se ha creado completamente, una ribosoma tomar este mensaje
y crear la protena anloga. Los terminadores indican al ribosoma el fin de una protena
y el comienzo de otra.
Por lo tanto, la sntesis de los indicadores se puede igualar a la dinmica de creacin de
protenas represoras.
ACCIONES
Las acciones son el aumento de temperatura y la adicin de un inductor.
Enfoque Determinista
19
20
+ +
+ |
+
+ +
+ |
| + | +
+ |
Enfoque Determinista
El biestable modificado
De nuevo este sistema se basa en el anterior. Por tanto todo lo explicado hasta el
momento se mantendr, al menos las especies y su aportacin. Las nuevas reacciones
son la protelisis y la inhibicin por ARNas, llevando asociadas proteasas y ARN
antisentido respectivamente.
PROTELISIS
Tras el promotor Plac se encuentra el cdigo de la protena represora pero antes de
llegar al indicador est insertada la cadena de la proteasa (encargada de digerir las
protenas). Observar que tanto la proteasa (Sspb) como el indicador (RFP) llevan un
prefijo (Ompn). stas sern las cadenas de ARN sobre las que se pegar la ARN
antisentido, obligndolas a quedar inservibles hasta su degradacin. El represor del fago
lambda no se consume.
Plac
cI(ts)
Ompn::Sspb
Ompn::RFP
ARN ANTISENTIDO
En esta rama del plsmido tenemos la misma estructura que en el biestable simple. Tras
el promotor Prm se encuentra el cdigo de la protena represora y el indicador. Tambin
podemos ver como en este caso se han aadido un sufijo (Das4) a las protenas. Este
cdigo quedar transcrito en una especia de cola unida a las protenas originales. Esto
implica que las proteasas sern sensibles a digerir esta cola, digiriendo tras ella el resto
de la protena
Prm
LacI::Das4
Prm
ARNas
GFP::Das4
La creacin de las ARN antisentido, se crea con el mismo promotor Prm, sin embargo
este mdulo no lo comparte con el resto de la cadena, sino que tiene una copia propia.
Esto significa que su transcripcin no se sita en el mismo instante que la del resto (LacI
y GFP).
Enfoque Determinista
21
Incluimos una tabla que recoge todas las especies intervinientes de este sistema:
Promotores
ARNm
Represores
Inhibidores
Ahora vemos una tabla resumen de todas las reacciones que se nombran en la imagen
anterior.
Transcripcin LacI
Traduccin LacI
Represin LacI
Transcripcin cI
Traduccin cI
Represin cI
22
+ +
+ |
+
+ +
+ |
Enfoque Determinista
Enfoque Determinista
+
+
+
| + | +
+ |
23
+ + +
= + ( + )
= ( + )
E = Promotor;
S = ARNp;
ES = Cc ;
P = ARNm
[]
=
[]0 []
[] +
( + )
24
Enfoque Determinista
[]
=
[] +
Donde = []0
Traduccin
+ +
[]
=
[] []
;
[] +
es, tambin, una ponderacin de las cinticas que intervienen, y adems, ocurre de nuevo
que tanto como son especies de la bacteria y del sistema, respectivamente.
Represin
La reaccin de la represin, no podemos modelarla con la formulacin de MichaelisMenten, ya que su comportamiento cooperativo difiere del predicho por ste. Sin
embargo, como vimos, dentro de las cinticas no Michaelianas, podemos usar la
formulacin planteada por Hill.
+ |
Enfoque Determinista
25
Evitndose as su lectura.
Tras formarse el multmero, se une competitivamente con la ARN polimerasa a los
operadores del gen. La cooperatividad se patenta en la formacin de multmeros.
|
=
[]
+ []
Transformando esta ecuacin podemos ver el efecto de las constantes que aparecen en
el modelo.
[]
|
=
[]
1+
Degradacin
Las protenas son sistemas vivientes que se sustituyen continuamente. Por tanto, todas
mueren tras un periodo activo variable (desde unos minutos hasta semanas). La muerte
o degradacin en sus aminocidos, es un proceso relativamente sencillo de modelar, ya
que no nos interesa tanto el proceso de la degradacin de la protena sino cun rpido
se produce para cada tipo. El tiempo caracterstico de cada protena se mida en base a
su vida media, de la cual se puede extraer la tasa de mortalidad (mortalidad/unidad de
tiempo). Cualquier compuesto (ARNp, ARNm, protena, proteasa, ARNas,) que
intervine en un sistema biolgico tendr una valor caracterstico de vida media desde el
cual estimaremos el valor del parmetro. En este sentido, la ecuacin diferencial que
modela esta desactivacin es de primer orden (ley de accin de masa).
[]
= []
26
Enfoque Determinista
Protelisis
La cintica que suponemos a este proceso ser la accin de masa, una suposicin
apoyada sobre el argumento expuesto en el proceso de degradacin: no nos interesa la
dinmica propia de esta reaccin sino saber cuntas protenas se vern afectadas en el
tiempo en funcin de la poblacin de proteasas. En este proceso se consume protena,
mientras que la proteasa vuelve a quedar libremente funcional cuando se separa del
degradado.
[]
= [] []
La inhibicin del ARN mensajero gracias a un ARN antisentido anlogo, se produce como
se indic en los fundamentos biolgicos. La cintica de esta reaccin no es conocida, sin
embargo podemos suponerla como una reaccin de primer orden (ley de accin de
masa), ya que su efecto en el sistema es el comienzo de la unin entre las cadenas.
+
El bloqueo de la traduccin del ARNm se produce desde el instante en que estas dos
hebras se aparean. Una vez que se ha formado este complejo, no queda ms que
esperar su degradacin enzimtica, ya que no puede participar de otro proceso y en el
estudio general se tomar como una degradacin.
[]
= [] []
Al igual que en la protelisis, la constante cintica tiene las mismas unidades al tratarse
de un proceso de dinmica de orden mayor:
[]1 []1
Enfoque Determinista
27
[]
=
[]
[]
[] + 1 +
[]
=
28
[]
[]
[] + 1 +
[]
Enfoque Determinista
[]
= 0,
[] =
[]
[]
[] + 1 +
Traduccin
La cintica de es:
[]
=
[] []
[] +
[]
=
[] +
[]
[]
[] + 1 +
[]
([] + )
[]
[]
=
[]
1+
1 +
[]
= [] []1
= = = []
= = []1
Parmetros
[]
([] + )
[]
[]
=
[]
1+
1 +
[]
Sobre esta ecuacin, hacemos un estudio de los parmetros que aparecen tratando de
reducir la expresin final
Enfoque Determinista
29
[]
([][]1 )
([] + )
[]
[]
1 + 1 + []
=
[]
[]
1 + 1 + []
=
[]
30
1 +
Enfoque Determinista
[]
1 + []
=
[]
[]
1 + []
=
[]
Con el ltimo cambio de constantes, no varan las unidades de tales parmetros, aunque
si una modulacin.
= [][]1
=
[] =
= []1
[] = []
Enfoque Determinista
31
Para establecer las ecuaciones diferenciales de cada especie, debemos definir cada
proceso que ocurre en el sistema e identificar con ms detalle la rama del biestable que
estamos estudiando. A pesar de que los sistemas tengan el mismo ncleo biestable, la
adicin de nuevos inhibidores, afectarn a las cinticas ya descritas.
Comenzamos definiendo los procesos y las cinticas.
TRANSCRIPCIN + REPRESIN
[]
=
[]
[]
[] + 1 +
1 + []
TRADUCCIN
[]
=
[] []
= []
[] +
[]
= []
= [] []
PROTELISIS
[]
= [] []
DEGRADACIN
[]
= []
32
Enfoque Determinista
PROCESO
SE CREA
SE CONSUME
[]
1 +
[ ]
[ ]
[]
[]
1 +
[]
1 +
[ ]
[]
[ ]
[]
[]
Enfoque Determinista
33
Agrupacin de ecuaciones
[ ]
[]
1 +
= [ ] []
[]
1+
[]
[] +
[ ]
= [ ] []
[]
[]
=
[ ] +
[]
[]
1 +
= [ ]
[ ]
[]
1 +
= [ ] + []
[]
] =
[
[]
1 +
[] +
[ ]
= [ ] []
[]
= [ ]
[]
=
34
[ ] +
[]
[]
1 +
Enfoque Determinista
=
1
1
1 +
2
2
=
2
2
1 +
1
1
1
=
1 1
2
2
=
2 2
Parmetros generales:
35
es a travs de una protena fluorescente asociada a tal molcula. Sucede que cuando se
crea una protena de LacI, una GFP (protena fluorescente verde) tambin lo hace en el
mismo instante.
Hasta este momento no se ha incluido esta realidad en los modelos ni en los anlisis. El
motivo por el que se ha decidido hacer esto, es porque realmente no aporta
conocimiento en el estudio determinista y de estabilidad. Sin embargo, llegamos al
modelo estocstico resulta mucho ms sencillo aadir este hecho sin implicar cambios
sustanciales en los modelos.
Continuando con el modelado, pasamos a identificar la matriz estequiomtrica de las
reacciones mostradas
Matriz Estequiomtrica
Reacciones
1
1
2
0
1
0
2
0
1 1 + 1 +
2 2 + 2 +
-1
-1
-1
-1
-1
-1
As, con esto definido, pasamos a definir las propensidades de la cada reaccin.
Id
1
2
3
4
36
Reaccin
Funcin de propensidad
1 () = 1+ 1
1 1 + 1 +
2 2 + 2 +
2 () =
1+2 1
3 () = 1 1
4 () = 2 2
Enfoque Determinista
5
6
7
8
9
5 () = 1
7 () = 1
1
2
10
6 () = 2
8 () = 2
9 () =
10 () =
Para comprender con ms detalle cmo se comporta el sistema, debemos atender a los
procesos o reacciones elementales que tienen lugar entre las molculas. Por ejemplo,
uno de los casos ms llamativos es el siguiente, que nos servir para comprender como
la expresin matemtica puede ocultar la complejidad que encierra.
Mientras que en el modelo anterior se representaba la sntesis del ARN mensajero con
una ecuacin cintica como la siguiente,
1
=
1 +
Enfoque Determinista
37
Tipo de Agente
Rama 1
Promotor
ARN mensajero
Protena represora
Promotor/Represor
Rama 2
En los apartados anteriores se han dado las nociones suficientes para la comprensin de
la funcin de cada agente dentro del sistema. Veamos el conjunto reactivo:
Nombre
Reaccin
Propensidad
Transcripcin LacI
1 =
Traduccin LacI
Dimerizacin LacI
Des-dimerizacin LacI
Represin LacI
Des-represin LacI
Transcripcin cI
Traduccin cI
Dimerizacin cI
Des-dimerizacin cI
Represin cI
Des-represin cI
Degradacin
Degradacin
Degradacin
Degradacin
Degradacin 2
Degradacin 2
38
+ +
+ 2
2 +
2 + 2
2 2 +
+
+ +
+ 2
2 +
2 + 2
2 2 +
2
2
2 =
3 = 2
4 = 2
5 = 2
6 = 2
7 =
8 =
9 = 2
10 = 2
11 = 2
12 = 2
13 =
14 =
15 =
16 =
17 = 2
18 = 2
Enfoque Determinista
= 2 2
= 2 2
2
= ( 1) + 2 2 2 2
2
= ( 1) + 2 2 2 2
Enfoque Determinista
39
2
= 2 2
2
= 2 2
2
=
= 0 ( + 2 )
= 0 ( + 2 )
2
= 2 2 2
2
= 2 2 2
40
Enfoque Determinista
0
+ 2
0
+ 2
+ 2
0
=
+ 2
2
= 2 2 2
2
= 2 2 2
+ 2
0
+ 2
2 =
2
+ 2
2
+ 2
Enfoque Determinista
41
Por ltimo, aadiendo estas expresiones, obtenemos la expresin del sistema equivalente:
1 + + 2
0
1 + + 2
Ahora, procedemos a comparar los dos modelos y comprar los parmetros hasta encontrar sus
relaciones:
= 0
=
=
Aunque acabamos de identificar todos los parmetros de uno y otro modelo, de forma que
podemos concluir que se tratan del mismo, aunque expresado de formas diferentes; tenemos
que notar que existe una pequea diferencia entre ambos:
1
1
1
=
1
1 + 2
1 + + 2
Enfoque Determinista
Este modelo, y las suposiciones hechas para extraer las ecuaciones, se han basado en el
documento de Michail Stamatakis y Nikos V. Mantzaris [8], en el cual se indica:
A LacI dimer is sufficient for specific binding to the operator sequence... However, a
LacI monomer is unable to bind lacO and exert any repressive effect (53). Thus, we
assume that the repressor dimer binds to the operator (denoted as species O) with a oneto-one stoichiometry
Significando que la protena represora no tendr un efecto apreciable en las acciones de
inhibicin de la transcripcin del promotor adverso.
Enfoque Determinista
43
Consideraciones de modelado
Tipo de Agente
Rama 1
Promotor
Rama 2
( )
ARN mensajero
Protena represora
Inhibidor
Promotor/Represor
2 (2 )
En los apartados anteriores se han dado las nociones suficientes para la comprensin de
la funcin de cada agente dentro del sistema. Veamos el conjunto reactivo:
Nombre
Reaccin
Propensidad
Transcripcin LacI
1 =
Traduccin Laci
Dimerizacin LacI
Des-dimerizacin LacI
Represin LacI
Des-represin LacI
Transcripcin cI
Traduccin cI
Dimerizacin cI
Des-dimerizacin cI
Represin cI
Des-represin cI
Transcripcin de ARNas
Represin de ARNas
Des-represin de ARNas
44
+
+ 2
2 +
2 + 2
2 2 +
+
+ +
+ 2
2 +
2 + 2
2 2 +
2 + 2
2 2 +
2 =
3 = 2
4 = 2
5 = 2
6 = 2
7 =
8 =
9 = 2
10 = 2
11 = 2
12 = 2
13 =
14 = 2
15 = 2
Enfoque Determinista
Digestin LacI
Digestin LacI2
Inhibicin ARNas
Degradacin
Degradacin
Degradacin ARNas
Degradacin
Degradacin
Degradacin Proteasa
Degradacin 2
Degradacin 2
16 =
18 =
+ 2
2
2
17 = 2
19 =
20 =
21 =
22 =
23 =
24 =
25 = 2
26 = 2
Realizamos el mismo esfuerzo que hicimos con el modelo del biestable simple para la
identificacin de parmetros. Comenzamos con detallar las relaciones de cada reaccin
descrita con cada especie.
Volvemos a suponer la relacin entre promotor y promotor reprimido que hicimos en el
modelo del biestable simple:
2 () = 0 ();
0
+ 2
0
+ 2
0
+ 2
Enfoque Determinista
45
2
= 2 2 2 2
2
= 2 2 2
2
+
2
+ +
1 + + 2
0
1 + + + 2
46
Enfoque Determinista
(5)
(6)
1+
2
+
0
=
( + )
1 + + + 2
TRNL 0
=
( )
2
1 + +
Antes de pasar a relacionar los parmetros de un modelo y otro, debemos notar una
diferencia de forma entre las dinmicas del ARN mensajero de cI. Esta diferencia de
forma en la funcin es, comparndola con el modelo extrado al comienzo de este
documento:
] =
[
[]
1 +
[] +
[ ]
0
=
( + )
1 + + + 2
Es sencillo encontrar la relacin entre los parmetros de ambos modelos, sin embargo,
para el siguiente caso, tenemos que pararnos a observar:
+ +
47
48
Enfoque Determinista
=
=
Enfoque Determinista
49
1 +
1 +
Biestable modificado.
1 +
=
( + )
1 +
=
( )
1 +
50
Enfoque Determinista