PRUEBAS BIOQUMICAS REALIZADAS

A ENTEROBACTERIAS
CATALASA

NITRITOS

CITOCROMO OXIDASA

PRUEBA AMINO-ACIDOS (CALDO

DESCARBOXILASA DE MOELLER)

CITRATO

ROJO DE METILO(RM)

(EOSINA-AZUL METILENO) EMB

SIM (SULFURO-INDOL-MOTILIDAD)

HECKTOEN-ENTERICO (HE)

SS (SALMONELLA SHIGELLA)

LIA ( LISINA-HIERRO)

TSI (TRES AZUCARES-HIERRO)

MALONATO

UREA

MAC CONKEY

VOGES PROSKAUER (VP)

MOTILIDAD

XLD ( XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO)

(PRINCIPAL)

(ENTEROBACTERIAS)

(GLOSARIO)

CATALASA

La catalasa es una enzima que descompone el peroxido de Hidrogeno (H2O2) en

agua y oxigeno. El peroxido de Hidrogeno se forma como uno de los productos
finales del metabolismo aerobio de los hidratos de carbono. Si se permite que se
acumule resulta letal para la clula bacteriana.

FUNDAMENT
O
La prueba de la catalasa se usa con mucha frecuencia para diferenciar miembros
de la familia Micrococaceae de miembros de la familia Streptococcaceae.

MATERIALES *Peroxido de Hidrogeno al 3% almacenado en frasco mbar en fro.

Y
*Cultivo de 18-24 horas del microorganismo a probar
REACTIVOS
*Con un asa o palillo de madera, transferir parte del centro de una colonia a la
superficie de un portaobjetos
PROCEDIMIE
*Agregar 1 gota de Peroxido de Hidrgeno al 3% y observar la produccin de
NTO
burbujas

la produccin rpida y sostenida de burbujas o efervescencia constituye una

INTERPRETA reaccin positiva.
CION

NOTA

los eritrocitos poseen ctalasa, por lo cual se debe evitar tomar colonias de agar
sangre para evitar falsos positivos.

ACTIVIDAD CITOCROMO-OXIDASA

Los citocromos son Hemoproteinas que contienen hierro y actan como el ultimo
eslabn de la cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (Hidrogeno) al
oxigeno, con formacin de agua. El sistema citocromo se encuentra en los
organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de
FUNDAMENT Oxidasa es importante para identificar aquellos organismos que carecen de esta
O
enzima (anaerobios obligados). La prueba es muy til para diferencia
Enterobacterias (Todas Oxidasa negativas) de otras especies como Pseudomona
o Neisserias oxidasa positiva.

Hay dos compuestos susceptibles a oxidarse por la accin de esta enzima,

produciendo un color inicialmente rosado y luego azul oscuro a negro. Dichos
MATERIALES
compuestos son dimetil-fenil-diamina y tetrametil-parafenil-endiamina. Siendo el
Y
ms utilizado el segundo, tambin se dispone en el mercado de tirillas de
REACTIVOS Oxidasa o el reactivo ya preparado.

Las colonias bacterianas con actividad de Citocromo-Oxidasa en segundos toman

un color azul intenso en el sitio de la prueba. Para esta tcnica no se debe utilizar
INTERPRETA asas de acero inoxidable, dado que los productos de Oxidacin formados al
esterilizarlas a la llama pueden producir reacciones falsas positivas. Por lo cual
CION
debemos utilizar palillos de madera.

MAC CONKEY

Agar selectivo y diferencial para el aislamiento de Enterobacterias. El medio

contiene sales biliares y cristal violeta que son inhibidores de la microbiota Gram
FUNDAMENT positiva. La lactosa junto al indicador Rojo neutro sirven para la comprobacin de
la degradacin de dicho azcar, dividiendo el grupo en 2: Bacterias
O
fermentadoras y no fermentadoras de Lactosa.

TECNICA:

Sembrar en el agar realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del
microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37 C.

Las colonias fermentadoras de lactosa dan un color rosado. Las colonias no

INTERPRETA fermentadoras de lactosa son incoloras, lo anterior por el comportamiento del
indicador de pH.
CION

(REGRESAR)

HECKTOEN-ENTERICO (HE)

FUNDAMENTO

TECNICA

INTERPRETACION

El agar HE es un medio de cultivo selectivo para la identificacin de

bacterias intestinales patgenas. La alta concentracin de sales biliares
inhibe el desarrollo de las bacterias Gram positivas. La Fucsina acida junto
con el azul de Bromotimol reaccionan virando a amarillo al bajar le pH del
medio por la accin de los cidos producidos a partir de la fermentacin de
los 3 hidratos de carbono (Lactosa, Sacarosa, Salicina) que contiene el
medio. La combinacin de tiosulfato y una sal de hierro dan una coloracin
negra a las colonias H2S positivas.

Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del

microorganismo en estudio. Incubar a 37 C por 24 horas.

Las bacterias fermentadoras rpidas de lactosa como Escherichiae coli

forman colonias de color naranja brillante a rosa salmn.

* Las colonias de Salmonella spp. Son de color azul verdoso con tpicos
centros negros por el gas H2S.
*Las colonias de Shigella spp. Son verde azulosas.
* Las cepas de Proteus spp son algo inhibidas, las colonias que se
desarrollan son pequeas y transparentes.

(REGRESAR)

XLD ( XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO)

FUNDAMENTO

TECNICA

INTERPRETACION

La degradacin a acido a partir de la Xilosa, lactosa y sacarosa

producen un viraje a amarillo del indicador Rojo de fenol. El tiosulfato y
sal de hierro revelan la formacin de H2S por la precipitacin del
sulfuro de hierro negro en las colonias. Las bacterias que descarboxilan
la lisina, producen cadaverina, se reconocen por la presencia de un
color rojo-purpreo debido al aumento de pH alrededor de las colonias.
El efecto inhibidor es muy dbil.

Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del

microorganismo en estudio, incubar a 37 C por 24 horas.

Los microorganismos como E. coli, Klebsiella sp y Enterobacter so.

Pueden utilizar ms de un hidrato de carbono y formar colonias

amarillas brillantes.
*La mayor parte de las especies de Salmonella y Arizona forman
colonias Rojas, la mayoria con centro negro debido a la produccin de
H2S.
*Los gneros Shigella, Providencia y algunas cepas de Proteus no
utilizan ningn hidrato de carbono y forman colonias translucidas.
*Las colonias que solo fermentan la Xilosa presentaran un color
Naranja.

(REGRESAR)

SS (SALMONELLA SHIGELLA)

FUNDAMENTO

TECNICA

El agar SS es un medio altamente selectivo que inhibe el desarrollo de la

mayoria de coniformes y permite el desarrollo de las especies de
Salmonella y Shigella. La alta concentracin de sales biliares y citrato se
sodio inhibe a todas la bacterias Gram positivas y a algunas Gram
negativas. La Lactosa es el nico hidrato de carbono y el Rojo neutro
detecta la produccin de acido. El tiosulfato de sodio es una fuente se
azufre y las bacterias que producen H2S se detectan por la presencia de
un precipitado negro por el citrato ferrico.

Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del

microorganismo en estudio, incubar a 37 C por 24 horas.

INTERPRETACION

las cepas de Shigella y la mayoria de Salmonella presentan colonias

incoloras. Colonias trasparentes con centro negro: Proteus y algunas
Salmonellas. Las bacterias fermentadoras de Lactosa presentan colonias
rojas a rosadas.

(REGRESAR)

EMB
(EOSINA-AZUL METILENO)

FUNDAMENTO

TECNICA

Es una agar selectivo para el aislamiento de Enterobacterias patgenas.

Los colorantes de anilina (Eosina y azul de metileno) inhiben las
bacterias Gram positivas y las Gram negativas exigentes
nutricionalmente. Tambin se combinan precipitndose a pH acido
actuando como indicadores de produccin de cidos de los
carbohidratos presentes en el medio (Lactosa y Sacarosa)

Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del

microorganismo en estudio, incubar a 37 C por 24 horas.

INTERPRETACION

Las colonias fermentadoras son de color rosado. Escherichiae coli

fermenta los azucares y forma colonias verdes con brillo metlico. Las
colonias no fermentadoras son incoloras,

(REGRESA

CITRATO

FUNDAMENTO

El citrato de sodio es una sal del acido ctrico, un compuesto orgnico

simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de los cidos
tricarboxilicos. Generalmente los microorganismos que emplean el
citrato como nica fuente de carbono, utilizan sales de amonio como
nica fuente de nitrgeno. El metabolismo del citrato realizado, por
algunas bacterias se realiza por el ciclo de krebs y requiere el
desdoblamiento del citrato por la enzima citritasa (citrato-oxalacetatoliasa o citrato desmolasa) en presencia de magnesio o manganeso y
de transportadores como citrato permeasas.
La citritasa acta sobre el citrato produciendo acido oxalacetico y
acetato; productos que son convertidos enzimaticamente a piruvato y

dixido de carbono. Durante esta reaccin el medio comienza a

alcalinizarse por el CO2 que se genera, el cual se combina con el agua
y el sodio para formar Carbonato un producto alcalino, este carbonato
da la alcalinidad que produce el cambio de color del indicador de pH
del medio de verde a azul Prusia oscuro (indicador: azul de bromotimol,
amarillo a pH< de 6.0 y azul a pH > de 7.6). El medio incluye citrato
como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente
de nitrgeno.

TECNICA

INTERPRETACION

(REGRESAR)

Inocular el tubo con agar citrato de Simmons realizando siembra por

estra tomando una colonia del microorganismo en estudio. Incubar a
37 grados C por 24 horas.

El desarrollo de un color azul intenso en 24-48 horas indica una prueba

positiva y revela que el microorganismo en estudio ha sido capaz de
utilizar el citrato en el medio con la formacin de productos alcalinos.
La prueba tambin es positiva en ausencia de color azul si existe
crecimiento del microorganismo a lo largo de la estra de inoculacin.

TSI
( TRES AZUCARES-HIERRO)

FUNDAMENTO

Es una prueba usada para la fermentacin de la glucosa, lactosa y

sacarosa y la produccin de H2S por parte de la bacteria sumndole
produccin de gas. El cambio de color rojo-anaranjado (color inicial del
medio) a amarillo indica fermentacin. Si se fermenta nicamente la
glucosa el cambio de color del medio ocurre solamente en el fondo
debido a que se encuentra 10 veces menos concentrada que la
sacarosa y la lactosa, adems los radicales libres no son suficientes
para hacer virar el medio.
Si se fermentan los 3 azucares hay cambio de color tanto en la
superficie como en el fondo. La presencia de burbujas que rompen el
medio y a veces tienden a expulsarlo indica presencia de gas como
producto final de la fermentacin.
La produccin de H2S se manifiesta por la aparicin de un precipitado
color negro debido a la reduccin de la sal de hierro presente en el
medio.

TECNICA

Inocular el medio realizando siembra mixta del microorganismo en

estudio, incubar a 37 grados C por 24 horas.

A: Reaccin acida. Color amarillo

INTERPRETACION

K: Reaccin alcalina. Color roja naranja K/A: Fermentacin de la

glucosa
Burbujas: Produccin de gas
los 3
Precipitado negro: Formacin H2S

(REGRESAR)

A/A: Fermentacin 3 azucares

K/K: No hay fermentacin de

LIA
( LISINA-HIERRO)

FUNDAMENTO

Es un medio que sirve para demostrar la produccin de dos enzimas: la

lisina descarboxilasa y la lisina desaminasa, adems la presencia de
sales de hierro sirve para detectar la produccin de H2S por algunos
microorganismos.
La descarboxilacion de la lisina ocurre en ambiente anaerbico o sea
en el fondo del tubo y se pone de manifiesto por la alcalinizacin del
medio produciendo un viraje del indicador prpura de bromocresol. La
presencia de glucosa en los componentes del LIA determina primero
una reaccin de fermentacin, produciendo acidificacin y cambio de
color del medio a amarillo y el pH favorable para la reaccin de
descarboxilacion que ocurre despus, volviendo a su color violeta
original la parte del fondo del tubo.
La desaminacion de la lisina que se puede producir por los gneros
Proteus y Providencia tiene lugar en la parte superior del tubo
produciendo acido a cetocarbonico que al combinarse con la sal de
hierro y en presencia de oxigeno forma un color violeta rojizo. La
produccin de H2S se evidencia por la presencia de un precipitado

negro por utilizacin de las sales de hierro.

TECNICA

Inocular realizando siembra mixta con doble picadura a partir de una

colonia del cultivo del microorganismo en estudio e incubar 24 horas a
37 grados C

A: Reaccin acida. Color amarillo

K: Reaccin alcalina. Color violeta
R: Reaccin alcalina: color rojo
INTERPRETACION

K/K: Descarboxilacion lisina

K/A: Fermentacin glucosa. Descarboxilacion lisina
R/A: Desaminacion lisina. Fermentacin glucosa

(REGRESAR)

SIM
( SULFURO-INDOL-MOTILIDAD)

FUNDAMENTO

El indol, es uno de los productos de la degradacin metablicas del

amino acido triptofano. Las bacterias que producen la enzima
triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con
produccin de Indol, acido piruvico y amoniaco. La prueba del indo esta
basada en la formacin de un complejo rojo cuando el Indol reacciona
con el grupo aldehdo p-dimetilaminobenzaldehido. Este es el principio
activo del reactivo de Kovacs.
MEDIO DE CULTIVO: agar SIM o caldo triptofano

TECNICA

INTERPRETACION

Inocular al medio realizando siembra por picadura hasta la mitad del

medio a partir del cultivo del microorganismo en estudio. Incubar 24
horas a 37 grados C. al finalizar este periodo aadir 5 gotas del
reactivo de Kovacs por la pared del tubo.

El desarrollo de un color rojo-fucsia en la interfase del reactivo y de los

medio segundos despus aadir el reactivo de Kovacs indica la
presencia de indol y por lo tanto una prueba positiva.

(REGRESAR)

MOTILIDAD

FUNDAMENTO

Me permite determinar la capacidad de movimiento por parte de un

microorganismo.

TECNICA

Siembra en picadura con el microorganismo a estudiar, incubar 24 horas

a 37 grados C

INTERPRETACION

Formacin de nata la parte superior de medio indica viabilidad del

microorganismo, desarrollo de turbidez hacia los lados de la estra de
inoculacin indica motilidad positiva.

(REGRESAR)

ROJO DE METILO
(RM)

FUNDAMENTO

REVELADOR

TECNICA

INTERPRETACION

Determinar la capacidad de un microorganismo para producir y

mantener estables los productos terminales cidos de la fermentacin
de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. La
prueba Rojo de metilo es cuantitativa para la produccin de acido y
requiere que los microorganismos produzcan cidos fuertes a partir de la
glucosa, de forma que el medio del pH descienda a menos de 4.4. Esta
distincin puede hacerse a travs del indicador Rojo de metilo que
presenta color amarillo por encima de un pH de 5.1 y solo presenta color
rojo cuando el pH desciende a 4.4.

Rojo de metilo

Inocular en el caldo RMVP con una colonia del cultivo del

microorganismo en estudio. Incubar 24-48 horas a 37 C. finalizado este
periodo adicionar 5 gotas del revelador Rojo de metilo.

El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica

que la produccin de acido es suficiente como para bajar el pH a 4.4 y es

una prueba positiva. Cuando ocurre la formacin de un color amarillo la

prueba es negativa.

(REGRESAR)

VOGES PROSKAUER
(VP)

FUNDAMENTO

Determinar la capacidad de algunas bacterias para generar un producto

final neutro (acetoina y 2,3 Butanodiol) a partir de la fermentacin d ela
glucosa. Los productos neutros formados en la presencia de oxigeno
atmosfrico, alcalisis (Hidrxido de Potasio al 40%) y peptonas, se oxidan
en diacetilo, reactante para el color producido en la reaccin. El Alfa
naftol acta como catalizador para revelar un complejo color rojo.

Solucin A: Alfa naftol al 5% en etanol absoluto

REVELADOR

Solucin B: Hidrxido de Potasio al 40% en agua destilada.

TECNICA

Inocular en RMVP con una colonia del cultivo del microorganismo en

estudio. Incubar a 37 C por 24 horas. Al finalizar este periodo adicionar 6
gotas (0.6ml) de la solucin A y 2 gotas (0.2ml) de la solucin B. dejar en

reposo durante 10-15 minutos.

INTERPRETACION

Una prueba positiva esta indicada por el desarrollo de un color rojo a los
15 minutos de aadido los reactivos reveladores por la presencia de
acetoina. Una prueba negativa da un color cobrizo.

MALONATO

FUNDAMENTO

El malonato de sodio, es una sal orgnica que es utilizada por las

bacterias como nica fuente de carbono con formaron de productos
alcalinos que se evidencia por un viraje de verde a azul del indicador del
medio, azul de Bromotimol. Si un microorganismo es capaz de utilizar el
malonato de sodio como nica fuente de carbono, al mismo tiempo que
utilizar el sulfato de amonio como fuente de nitrgeno, se produce un
aumento de la alcalinidad que se debe a la formacin de Hidrxido de
sodio (NaOH).

TECNICA

inocular 1-2 asadas del microorganismo en el Caldo Malonato, incubar a

37 C por 24 horas.

INTERPRETACION

El cambio de color de verde a azul indica una prueba positiva.

(REGRESAR)

UREA

FUNDAMENTO

TECNICA
INTERPRETACION

Los microorganismos que poseen la enzima Ureasa tienen la capacidad

de hidrolizar la urea contenida en el medio con produccin de
amoniaco, para esta prueba se utiliza el caldo urea de stuart o agar
urea de christensen. El caldo sturat esta estabilizado con sales de
fosfato a un pH de 6.8. el microorganismo en estudio debe producir
cantidades relativamente grandes a fin de superar el sistema
estabilizador del medio y elevar el pH del medio los suficiente como
para virar el indicador (por encima de 8.0)

inoculacin en caldo, incubar a 37 C por 24 horas.

Un cambio de color Rojo fucsia indica que la urea fue hidrolizada por la

ureasa del microorganismo. Ausencia de cambio de color indica

reacciona negativa

(REGRESAR)

PRUEBA AMINO-ACIDOS (CALDO DESCARBOXILASA DE MOELLER)

FUNDAMENTO

El caldo descarboxilasa de Moeller es el medio base mas comnmente

utilizado para determinar la capacidad de descarboxilacion de aminocidos por las Enterobacterias.
El amino-acido por ensayar se aade al medio base antes de inocular el
microorganismo en estudio. Se debe emplear paralelamente un control
que consiste en un tubo con medio base sin el amino-acido. Ambos se
incuban anoxignicamente adicionando una capa de aceite mineral
estril.
Durante las etapas iniciales de incubacin ambos tubos se vuelven
amarillos debido a la fermentacin de la pequea cantidad de glucosa
del medio (pH 5.6). Si el amino-acido es descarboxilado se forman

aminas alcalinas y el medio retorna a su color prpura inicial. Los

amino-cido Lisina, Arginina y Ornitina son 3 amino-cidos ensayados y
producen las siguientes aminas especficas.
Lisina

TECNICA

INTERPRETACION

arginina (+)
(REGRESAR)

Cadaverina (Descarboxilasa)

Ornitina

Putrescina (Descarboxilasa)

Arginina

Citrulina ( Dihidrolasa)

Inocular con material de una colonia del cultivo del microorganismo en

estudio, dos tubos de caldo de Moeller, uno con el amino-acido y otro
sin este (control). Cubrir ambos tubos con una capa de aceite mineral
estril. Incubar a 37 C por 24 horas.

El desarrollo de un color amarillo en el tubo control indica que el

microorganismo es viable y que el pH del medio ha disminuido lo
suficiente para activar las enzimas descarboxilasas. El retorno al color
prpura o violeta del tubo que contiene el amino-acido indica una
reaccin positiva debido a la liberacin de aminas por descarboxilacion.

ornitina (+)

lisina (+)

NITRITOS

Determinar la capacidad de un microorganismo de reducir los Nitratos o gas

Nitrgeno libre. La reduccin de Nitrato (NO3) a Nitrito (NO2) y a Nitrgeno
gaseoso (N2) se produce en condiciones de anaerobiosis, en las cuales el
FUNDAMENT microorganismo produce su oxigeno del Nitrato. El oxigeno acta como un
aceptor de Hidrgeno; es decir el protn y el aceptor final de protones. La
O
mayora de las bacterias aerobias son anaerobias facultativas y solo pueden
reducir los Nitratos en ausencia de oxigeno.

REVELADOR: La presencia de Nitritos se detecta en el medio, aadiendo el reactivo de Griessllovays, con al formacin de un colorante Rojo de Diazonio.

Inocular el medio de Nitrato con una parte de la colonia del cultivo Axenico del
PROCEDIMIE microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37 C. despus de este tiempo
aadir 5 gotas del reactivo de Griess-llovays.
NTO

El desarrollo de un color rojo despus de aadir el reactivo, indica la presencia de

Nitritos y representa una prueba positiva. La ausencia del color tras el agregado
del reactivo puede indicar que los nitritos no han sido reducidos (Una verdadera
prueba negativa), o que han sido reducidos a productos distintos de los nitritos,
como Amoniaco, Nitrgeno molecular u Oxido Nitroso e Hidroxilamina. Por lo
tanto es necesario aadir una pequea cantidad de polvo de zinc a todas las
INTERPRETA reacciones negativas. Los iones de Zinc reducen los nitratos a Nitritos y el
CION
desarrollo de un color Rojo tras agregar polvo de zinc indica la presencia de
nitratos residuales y confirma la reaccin negativa verdadera. Si no hay cambio
de color tras agregar el polvo de zinc indica que los nitratos fueron reducidos a
otros compuestos como amoniaco, Nitrgeno molecular, Oxido Nitroso e
Hidroxilamina.

(REGRESAR)