I.1.

Definicin
La PCR es una elegante simple ensayo, enzimtico que permite la amplificacin de
un fragmento de ADN especfico de un complejo grupo de ADN. Kary Mullis, quien
ide el ensayo de PCR, explic que "le permite elegir el trozo de ADN que le
interesa y tener tanto de l como desee "(Mullis, 1990). PCR se puede realizar
utilizando DNA fuente de una variedad de tejidos
y organismos, incluyendo sangre perifrica, piel, cabello, saliva, y microbios. Slo
se necesitan pequeas cantidades de ADN para PCR para generar copias
suficientes para ser analizados utilizando tecnologas convencionales mtodos de
laboratorio. Por esta razn, la PCR es un ensayo sensible. (3. Mullis KB. The unusual origin
of the polymerase chain reaction. Sci Am. 1990; 262 (4): 56-61,64-5. 4.( Polymerase Chain Reaction Lilit

Garibyan1 and Nidhi Avashia2)

Cada ensayo de PCR requiere la presencia de ADN molde, cebadores, nucletidos y

ADN polimerasa. La ADN polimerasa es la enzima clave que enlaza nucletidos
individuales juntos para formar el producto de PCR. Los nucletidos incluyen Las
cuatro bases adenina, timina, citosina y guanina (A,T, C, G), es decir se encuentra
en el ADN. Estos actan como el edificio
bloques que son utilizados por la ADN polimerasa para crear el producto de PCR.
Los cebadores en la reaccin especifican la exacta producto de ADN a amplificar.
Los cebadores son ADN corto fragmentos con una secuencia definida
complementaria a la ADN diana que ha de ser detectado y amplificado. estos
sirven como un punto de extensin para la polimerasa de ADN para construir. 4.(
Polymerase Chain Reaction Lilit Garibyan1 and Nidhi Avashia2)

La PCR es una tcnica de biologa molecular altamente especfica, rpida, sensible

y verstil para detectar cantidades nfimas de un cierto ADN especfico,
posibilitando su fcil identificacin y prescindiendo del uso de radioistopos,
indispensables antes de su invencin.
(Artculo a dos dcadas de su invencin)

I.2. Historia
El desarrollo de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) con frecuencia se
ha comparado con el desarrollo de Internet, y aunque esto hace el riesgo de
exagerar el impacto de PCR fuera de la comunidad cientfica, la comparacin
funciona bien en un nmero de niveles. Ambos inventos han surgido en los
ltimos 20 aos hasta el punto en que es difcil imaginar la vida sin ellos.
Ambos han crecido mucho ms all de los confines de su diseo simple original
y han creado oportunidades inimaginables antes de su invencin. Ambos
tambin han dado lugar a un vocabulario totalmente nuevo y profesionales de
leer y escribir en ese vocabulario. Es difcil de creer que la tcnica que se form
la piedra angular del proyecto del genoma humano y es fundamental para
muchos protocolos de laboratorio de biologa molecular fue descubierto hace
slo 20 aos. Para muchos, la historia y algunas de las controversias duraderas
son desconocidos, sin embargo, al igual que con el descubrimiento de la
estructura del ADN en la dcada de 1950, el descubrimiento de la PCR es el
tema de la demanda y la reconvencin que an no se ha resuelto
completamente. Las etapas clave son revisadas aqu en breve a aquellos para

quienes la historia y la aplicacin de la ciencia mantienen el inters. (A Short

History of the Polymerase Chain Reaction)

Los orgenes de la PCR tal como la conocemos hoy surgieron de la

investigacin fundamental realizada a principios de 1980 en Cetus Corporation
en California. La historia es que en la primavera de 1983, Kary Mullis tuvo la
idea original para la PCR mientras se navega en un Honda Civic en la carretera
128 de San Francisco a Mendocino. Esta idea afirma que es el origen de la
moderna tcnica de PCR utilizado en todo el mundo de hoy que constituye la
base de las patentes clave de PCR. Los resultados para Mullis no fueron menos
satisfactorios; despus de un bono de $ 10.000 inicial de Cetus Corporation,
fue galardonado con el Premio Nobel de Qumica 1993. (A Short History of the
Polymerase Chain Reaction)

El concepto original para la PCR, al igual que muchas buenas ideas, era una
amalgama de varios componentes que ya existan: la sntesis de tramos cortos
de ADN de una sola hebra (oligonucletidos) y el uso de stos para dirigir la
sntesis especfica de la diana de nuevo copias de ADN utilizando ADN
polimerasas que ya eran las herramientas estndar en el repertorio de los
bilogos moleculares de la poca. La novedad en el concepto de Mullis estaba
usando la yuxtaposicin de dos oligonucletidos, complementarios a cadenas
opuestas del ADN, para amplificar especficamente la regin entre ellos y para
lograr esto de una manera repetitiva para que el producto de la primera ronda
de la actividad de la polimerasa se aadi a la piscina de plantilla para la
siguiente ronda, por lo tanto, la reaccin en cadena. (A Short History of the
Polymerase Chain Reaction)

De hecho, aunque Mullis se le atribuye la invencin original de la PCR, la

aplicacin con xito de la PCR tal como la conocemos hoy en da requiere un
considerable desarrollo adicional por sus colegas de Cetus Corp., incluyendo
colegas en el laboratorio de Henry Erlich, y el aislamiento oportuno de una
enzima polimerasa termoestable de una bacteria termfila aislado de los baos
termales. Por otra parte, los desafos a las patentes PCR en poder de Hoffman
La Roche han cobrado al menos una incidencia de "estado de la tcnica", es
decir, que la invencin original de PCR era conocido antes de la obra de Mullis
a mediados de la dcada de 1980. Este reto se basa en principios de los
estudios realizados por Khorana et al. en la dcada de 1960 y principios de
1970). El trabajo de Khorana utiliza un mtodo que l denomina replicacin de
reparacin, y su similitud con la PCR se puede ver en los siguientes pasos: (1)
hibridacin de los cebadores a las plantillas y extensin del molde; (2) la
separacin de la hebra recin sintetizada a partir de la plantilla; y (3) rerecocido del cebador y la repeticin del ciclo. (A Short History of the Polymerase
Chain Reaction)

La polimerasa de ADN utilizado originalmente para la PCR fue extrado de la

bacteria Escherichia coli. Aunque esta enzima ha sido una herramienta valiosa
para una amplia gama de aplicaciones y ha permitido la explosin de las
tecnologas de secuenciacin de ADN en la dcada anterior, que tena claras
desventajas en la PCR. Para la PCR, la reaccin debe ser calentada para

desnaturalizar el producto de doble cadena de ADN despus de cada ronda de

sntesis. Desafortunadamente, calefaccin tambin inactivado
irreversiblemente la ADN polimerasa de E. coli, y por lo tanto alcuotas frescas
de la enzima tuvo que ser aadido a mano en el inicio de cada ciclo. Lo que se
necesitaba era una ADN polimerasa que se mantuvo estable durante la etapa
de desnaturalizacin del ADN realizado en torno a 95 C. La solucin se
encontr cuando la bacteria thermophilus aquaticus se aisl de aguas
termales, donde sobrevivieron y proliferaron a temperaturas extremadamente
altas, y produjo una ADN polimerasa que no se inactiva rpidamente a altas
temperaturas. Gelfand y sus asociados en Cetus purificaron y se clonaron
posteriormente esta polimerasa (5,6), lo que permite una completa
amplificacin por PCR para crearse sin necesidad de abrir el tubo de reaccin.
Adems, dado que la enzima se aisl a partir de un organismo termfilo,
funcion de manera ptima a una temperatura de alrededor de 72 C, lo que
permite el paso de la sntesis de ADN que se lleva a cabo a temperaturas ms
altas de lo que era posible con la enzima de E. coli, lo que asegur que el ADN
molde hebra se podra copiar con mayor fidelidad como resultado de una
mayor rigurosidad de imprimacin de unin, la eliminacin de los productos no
especficos que haban plagado los intentos anteriores en la amplificacin por
PCR. (A Short History of the Polymerase Chain Reaction)
Sin embargo, incluso con esta mejora, la tcnica de PCR fue laboriosa y lenta,
requiriendo la transferencia manual entre baos de agua a diferentes
temperaturas. La primera mquina de termociclado, "Mr Cycle", que replica los
cambios de temperatura requeridos para la reaccin de PCR sin la necesidad
de transferencia manual, fue desarrollada por Cetus para facilitar la adicin de
las polimerasas termolbiles frescas. Despus de la purificacin de la Taq
polimerasa, Cetus y Perkin-Elmer introdujeron el ADN trmica cicladores
cerrados que son ampliamente utilizados hoy en da. (A Short History of the
Polymerase Chain Reaction)

I.3. Funcionamiento
Recordemos que cada ciclo de la PCR se lleva a cabo en tres etapas principales:
desnaturalizacin, hibridacin y extensin. A continuacin explicaremos qu sucede en cada una.
(Fundamentos de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo
real.)
Desnaturalizacin. En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una
temperatura de 95 C durante 20-30 segundos; el tiempo depende de la secuencia del templado,
es decir, si la cantidad de G-C es alta, ser necesario ms tiempo para romper sus uniones debido
a que el apareamiento de estas bases est formado por tres enlaces, uno ms que las
bases de A-T. Adems, depende de la velocidad en la que el termociclador aumenta la
temperatura, esto vara de acuerdo al modelo del equipo. Al final de esta etapa tendremos las
cadenas separadas que servirn como templado para el siguiente paso. (Fundamentos de la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.)

Hibridacin. En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3 del templado previamente
separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el complejo templadoprimers, es importante que la temperatura de hibridacin o temperatura melting (Tm) sea la ptima;
sta generalmente oscila entre 50-60 C. Si el diseo de los primers es el correcto y la temperatura
es la adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo ser eficiente. (Fundamentos de la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.)
Extensin. En esta etapa, la Taq polimerasa acta sobre el complejo templado-primers y
empieza su funcin cataltica a una velocidad muy rpida; agrega dNTPs complementarios para
crear las cadenas completas de ADN. La extensin de las cadenas es en direccin de la sntesis
del ADN, es decir, de 5 a 3. La temperatura ptima para la reaccin es de 72 C, ya que a esa
temperatura la enzima es funcional. Al final del ciclo, se habrn formado los amplicones con un
tamao dictado por el nmero total de pares de bases (pb) que deber ser conocido por el
investigador. (Fundamentos de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR
en tiempo real.)

I.4. Elementos para la reaccion

Para realizar una PCR se necesita mezclar en un tubo el ADN que contiene la
secuencia a amplificar, ambos cebadores que se alinearn a las cadenas simples
del ADN, la mezcla de los cuatro desoxirribonuclesidos trifosfatados (dNTPs) en
cantidades suficientes, el tampn de reaccin para la polimerasa, agua ultrapura
para completar el volumen final de reaccin (que normalmente oscila entre 20 y
100 l), y como ingrediente final crucial para la reacci
n, la enzima ADN polimerasa termoestable. (Barrera Saldaa HA, Ortiz Lpez R, Rojas Martnez A Resndez Prez D. Reaccin en cadena de la polimerasa: Una nueva poca dorada en la biologa
molecular. Ciencia y Desarrollo, (Conacyt) 1993; 18 (108): 50-60.)

I.4.1. Solucin Amortiguadora

El tampn ms utilizado en la PCR es tampn de Tris 10 mM, con un intervalo de pH entre 8,5 y
9,0 a 25 C. Debido a que el pH de Trisbuffers disminuye en 0,3 unidades por cada 10 C
aumento de la temperatura, un tampn hizo a pH 8,8 en 25 C tendr un valor de pH de 7,4 a 72
C, esta valor que es ptimo para la actividad de Taq polimerasa a esta temperatura. El apropiado
concentracin de iones magnesio en el tampn de reaccin tambin es importante para mxima
actividad de la polimerasa Taq y, debido a la dNTPs unirse a iones de magnesio, la reaccin
mezcla debe contener un exceso de magnesio iones. Como regla general, la concentracin de
magnesio en la reaccin de mezcla es generalmente 0,5-2,5 mm mayor que la concentracin de
dNTPs. La concentracin de iones de magnesio tambin influye en la eficiencia del cebador a la
plantilla de recocido. Como resultado, es posible para modificar la concentracin de magnesio en

lugar de la temperatura de recocido para regular especificidad del cebador. (The polymerase chain
Reaction

K R N Baumforth, P N Nelson, J E Digby, J D ONeil, P G Murray)

Otras sales, por ejemplo, KCl o NaCl puede ayudar a facilitar la hibridacin del cebador, pero las
concentraciones en exceso de 50 mM inhibe Taq actividad de la polimerasa. Las sales de fosfato
deben estar evitarse ya que pueden precipitar el magnesio iones a las altas temperaturas usadas
en el Detergentes PCR.14 tales como Tween 20, Triton X-100, o Nonidet P-14 40,13 y / o adicional
protena (por ejemplo, gelatina o suero bovino albmina) se puede aadir tambin a la reaccin de
buffer. La adicin de estos reactivos ayuda a evitar la precipitacin de la Taq hidrfobo polimerasa
en soluciones acuosas. . (The polymerase chain Reaction K R N Baumforth, P N Nelson, J E Digby, J D ONeil, P G
Murray)

I.4.2. Magnesio
Es benfico optimizar la concentracin del in magnesio, ya que
afecta: el alineamiento de los primers, la temperatura de disociacin
de las cadenas, tanto del templado como del producto de PCR, la
especificidad del producto, la formacin de dmeros de primer y la
actividad y fidelidad de la enzima. La Taq polimerasa requiere
magnesio libre en la unin con el templado, los primers y los dNTPs.
Los PCR deben contener 0.5 a 2.5 mM de magnesio sobre el total de
la concentracin de dNTP. La presencia de EDTA u otros quelantes en
el stock del primer o del templado puede alterar la concentracin
ptima aparente de magnesio. (Artculo universidad autnoma de Mxico)
I.4.3. Desoxirribonucleosidos trifosfatados
dNTPs se pueden obtener ya sea como liofilizaron o neutralizar soluciones acuosas. Son tambin
disponible como nucletidos marcados (o radiactivo no radiactivo) y esto puede ser til en el
hibridacin o secuenciacin de subsiguiente productos de la PCR (vase ms adelante). Son
resistentes al calor y tienen una vida media de ms de 40 ciclos de PCR.20 lo general, cada dNTP
se utiliza a una concentracin entre 50 micras y 200 M- Las concentraciones ms altas
fomentan la incorporacin errnea por la ADN polimerasa. Concentraciones de 50 mM y 200 mM
de cada dNTP son suficiente para la sntesis de 6,5 mg y 25 mg de DNA, respectivamente. (The
polymerase chain Reaction

K R N Baumforth, P N Nelson, J E Digby, J D ONeil, P G Murray)

I.4.4. Cebadores e Iniciadores

Los oligonucletidos iniciadores o primers son fragmentos complementarios
que se van a unir a cada una de las dos cadenas separadas del templado de
ADN. (Artculo universidad autnoma de Mxico)
La seleccin de oligonucletidos iniciadores es muy importante en la reaccin
en cadena de la polimerasa. De este paso depende el xito en el laboratorio.
(Artculo universidad autnoma de Mxico)

Criterios para la seleccin adecuada de los primers: (Artculo universidad autnoma

de Mxico)

Tamao: Tamao ideal: 20-25 nucletidos de longitud generalmente: 18-30

nucletidos de longitud.

Base en el extremo 3': Debe ser una G o una C.

Temperaturas de fusin (Tm): 50-65 C.
Contenido GC: 40-60%.
Auto-complementariedad: Debe ser evitada Para minimizar la formacin de
estructuras secundarias y los dmeros de primer.
Similaridad: Debe tener un 100% de apareamiento con el molde.
Cuando el objetivo a amplificar es un locus, la posicin de los iniciadores debe
ser relativa a los codones de inicio y terminacin. Es recomendable que el
cebador "forward" se encuentre ms o menos a 35 pb del inicio de la secuencia
que codifica, de la misma forma el cebador "reverse" debe localizarse 35 pb
despus de la regin que codifica. (Artculo universidad autnoma de Mxico)
Las concentraciones ptimas de los primers son generalmente entre 0.1 y 0.5
M. Altas concentraciones de primer pueden promover mispriming y
acumulacin de producto no especfico y puede incrementar la probabilidad de
generar un templado independiente llamado dmero de primer. Los productos
no especficos y los dmeros de primers son por si mismos sustratos para PCR y
compiten con el producto deseado por la enzima, dNTPs y primers, resultando
en un bajo rendimiento del producto deseado. (Artculo universidad autnoma de
Mxico)

Los primers pueden contener extensiones en el extremo 5 o mismatches

para incorporar sitios de enzimas de restriccin, un codn de inicio ATG, o
secuencias promotoras en la secuencia blanco. Pueden ser usados primers
degenerados para extraer genes nuevos en base a su similitud o su secuencia
de aminocidos. (Artculo universidad autnoma de Mxico)
Una razn menos obvia por la que los primers fallan es la presencia de
estructuras secundarias en el templado de DNA. En este caso la substitucin de
dGTP por 7-deazo-2- deoxiGTP ha sido muy usada. (Artculo universidad autnoma de
Mxico)

I.4.5. Enzimas
Slo pueden utilizarse polimerasas que sean capaces de actuar a las
altas temperaturas empleadas en la reaccin. En la actualidad la
mayora de las polimerasas que se suministran comercialmente son
versiones recombinantes e incluso mejoradas por ingeniera gentica.
(Artculo a dos dcadas de su invencin).

Dos enzimas de uso muy extendido son la ADN polimerasa Taq,

proveniente de la bacteria termoflica Thermus aquaticus6 y la Vent de la
bacteria Thermococcus litoralis. Sus temperaturas ptimas de catlisis
oscilan alrededor de los 72C, temperatura a la cual incorporan
aproximadamente 100 nucletidos por segundo, siendo estables a altas
temperaturas, incluso por encima de 92C. (Artculo a dos dcadas de su
invencin).

I.4.6. ADN

Claramente, para PCR con xito, la secuencia que se amplificada deber estar intacto. La mala
calidad del ADN, tal como la obtenida a partir de cera de parafina secciones embebidas,
contendr a menudo corta fragmentos de ADN. En tales casos, los cebadores deben ser
diseados para amplificar las regiones ms cortas dentro de la plantilla de ADN que sea posible.
Bajo Tambin se requiere que las concentraciones de ADN para PCR ptima porque tanto los
cebadores y dNTPs deben ser en exceso; una sobreabundancia de la plantilla de ADN favorecer
recocido de la dos hebras de la secuencia del molde, en lugar de su recocido para el par de
cebadores, y la voluntad Tambin aumentar las posibilidades de la formacin no especfica
productos. Tpicamente, un gen de copia nica puede ser amplificado suficientemente en 30
ciclos de menos de 0,2 g de ADN. mayor nmero de copias por lo tanto, genes requerirn
cantidades ms pequeas de ADN molde para la amplificacin ptima. (The polymerase chain
Reaction K R N Baumforth, P N Nelson, J E Digby, J D ONeil, P G Murray)

I.4.7. Agua (no citar, modificar en mis palabras)

El agua se usa como solvente del resto de los ingredientes y se requiere
al menos destilada.

I.5. Etapas de un ciclo de reaccin

Tres son los pasos a seguir y a repetir por cada ciclo de la PCR. A estos
comnmente se les refiere como desnaturalizacin, alineamiento y extensin.
Si de trabajar con ADN genmico se trata, regularmente se agrega una etapa
previa de desnaturalizacin a 94C, para relajar las posibles estructuras
secundarias y de otros tipos. Despus de concluida esta, se repiten los
diferentes ciclos en los que tanto la temperatura como el tiempo sern
especficos del producto a amplificar y del origen del cido nucleico que servir,
como ya se mencion, de plantilla o molde a copiar por la polimerasa
utilizada.25 (LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA A DOS DCADAS DE SU INVENCIN)
I.5.1. Desnaturalizacin
El sustrato de la enzima de la PCR es el ADN de simple cadena que
acta como molde para la sntesis de su nueva cadena
complementaria. Mediante un calentamiento a 94C, el ADN de doble
cadena logra que sus cadenas se separen o desnaturalicen. (LA REACCIN
EN CADENA DE LA POLIMERASA A DOS DCADAS DE SU INVENCIN)

Esta es una etapa crtica, ya que es muy importante que el ADN

molde se desnaturalice completamente, lo que se consigue a
temperaturas de 94C, durante por lo menos un minuto. Si la
muestra tiene alto contenido de G+C, se recomienda aumentar de
preferencia el tiempo. (LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA A DOS DCADAS DE SU
INVENCIN)

Sin embargo, hay que tener en cuenta que la actividad de la enzima

decrece de manera muy rpida a partir de los 95C (vida media a
92.5C = 2h, a 95C = 40 min. y a 97.5C = 5 min.), por lo que a
estas temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo
de incubacin. En la prctica se suele empezar con un periodo de

desnaturalizacin prolongado (cinco minutos a 94C), para

asegurarse que la desnaturalizacin se lleve a cabo a lo largo de
toda la molcula del ADN. (Barrera Saldaa HA, Ortiz Lpez R, Rojas Mart- nez A
Resndez Prez D. Reaccin en cadena de la polimerasa: Una nueva poca dorada en la
biologa molecular. Ciencia y Desarrollo, (Conacyt) 1993; 18 (108): 50-60).

I.5.2. Alineamiento
La enzima, como todas las ADN polimerasas, necesita del grupo OHlibre en el extremo 3 del iniciador ya apareado al sitio blanco de la
amplificacin, a partir de donde iniciar la sntesis. Este punto
constituye el sitio de crecimiento de la cadena complementaria al
molde. (LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA A DOS DCADAS DE SU INVENCIN)
Mientras que un cebador (referido como el 5 o sentido) es
complementario a la secuencia del extremo 5 de la regin del ADN
molde a amplificar, el otro es al extremo 3 de la misma, pero en la
cadena opuesta. (LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA A DOS DCADAS DE SU
INVENCIN)

El alineamiento especfico de ambos cebadores se produce a una

temperatura determinada por composicin de bases y oscila entre 40
y 72C. Ambas cadenas originales del ADN sirven simultneamente
como
moldes
para
sintetizar
sus
respectivas
cadenas
complementarias nuevas. (LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA A DOS DCADAS DE
SU INVENCIN)

Un aumento de temperatura favorece la especificidad, ya que

disminuye las uniones incorrectas de los cebadores con sitios
apcrifos del ADN molde. (Barrera Saldaa HA, Ortiz Lpez R, Rojas Mart- nez A Resndez
Prez D. Reaccin en cadena de la polimerasa: Una nueva poca dorada en la biologa molecular. Ciencia y
Desarrollo, (Conacyt) 1993; 18 (108): 50-60)

I.5.3. Extensin
Con el ADN molde de cadena sencilla, excepto en los sitios donde los
iniciadores se aparean, la polimerasa empieza a copiar la hebra,
incorporando Desoxirribonucleosidos monofosfatos en direccin 53
. Esta etapa debe realizarse a una temperatura alta, que es la que
coincide con la mxima actividad de la polimerasa (72C) para evitar
alineamientos inespecficos de los iniciadores. (LA REACCIN EN CADENA DE LA
POLIMERASA A DOS DCADAS DE SU INVENCIN)

El tiempo de extensin depende del tamao de la amplificacin,

debiendo estimar 1 min. Para alargar 1000 nucletidos. Es comn
que al finalizar todos los ciclos se realice un ltimo alargamiento por
5 min. A 72C, para asegurarse que todos los productos de
amplificacin estn completamente terminados y tengan, por ende,
exactamente la misma longitud. (Barrera Saldaa HA, Ortiz Lpez R, Rojas Mart- nez A
Resndez Prez D. Reaccin en cadena de la polimerasa: Una nueva poca dorada en la biologa molecular.
Ciencia y Desarrollo, (Conacyt) 1993; 18 (108): 50-60)