BIOLOGA CELULAR

Iluminacin de Khler
y contraste de fases
Iluminacin Khler
La funcin de la iluminacin Khler es iluminar un espcimen con un campo uniforme de
luz que sea del mismo dimetro que el rea de captura del objetivo. Una imagen del
campo diafragma se enfoca por el lente condensador sobre el plano del espcimen,
iluminando de esta manera con un cono slido de luz homognea. El ajuste del campo iris
limita el dimetro del cono de luz de manera que slo el campo de visin (y no ms) de
cualquier lente objetivo dada sea iluminada. Iluminando slo el campo de visin
disminuye la degradacin de luz por dispersin. La iluminacin Khler es un pre requisito
para todos los otros mtodos de visualizacin.

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Pasos para el ajuste de iluminacin Khler:

1.- Enfoca el espcimen.
2.- Con el diafragma completamente cerrado localizado lo ms cerca del origen de luz
(campo iris) de manera que puedas ver los lmites del diafragma.
3.- Trae los mrgenes del campo iris a enfoque aumentando o disminuyendo el enfoque
con la rueda del condensador. Tanto el espcimen como el iris deben estar en foco.
4.- Centra la imagen del campo iris usando las ruedas de condensador-centrado.
5.- Abre el centrado y enfoca el campo iris de manera que los mrgenes del campo iris
estn ms all del campo de visin.
6.- Ajusta el condensador iris para incrementar o disminuir el contraste de la imagen. La
apertura ptima depende del espcimen. Nunca uses esta apertura para controlar la
intensidad de luz.
7.- Ajusta la intensidad de luz con el potencimetro o con filtros de densidad neutra (para
fotografa en color).
En un microscopio con un ajuste Khler adecuado, el contraste del espcimen se obtiene
ajustando el condensador del diafragma. La intensidad de iluminacin se vara ajustando
el voltaje de la fuente luminosa o poniendo filtros de densidad neutra frente al
iluminador.

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Contraste de Fases
El microscopio de contraste de fases en un sistema diseado por Zernike, el cual traduce
los cambios de amplitud; hay que recordar que el ojo humano no es capaz de
distinguir cambios de fase en un curso de luz.
Segn la teora de formacin de la imagen microscpica de Abbe, para que pueda existir
una buena imagen de un objeto microscpico, sta debe estar formada por rayos
directos y por rayos difractados y de estos ltimos deben existir por lo menos tres
rdenes de difraccin. Abbe nota que la intensidad luminosa de la imagen final estaba
formada en un 75% aproximadamente por los rayos directos y en 25% por los rayos
difractados, esto hace que los rayos directos sean visibles al ojo humano, es decir,
enmascaran o deslumbran la imagen formada por los rayos difractados.
La cantidad de informacin que manifiestan los rayos directos y difractados es
inversamente proporcional a la intensidad luminosa que muestran ambos cursos de
luz. Esto permite comprender el por qu las imgenes proporcionadas por el
microscopio de campo claro son buenas slo cuando se observan objetos de gran
contraste, mientras que para los objetos de poco contraste (objetos de fase) ofrece
imgenes muy pobres de informacin estructural. Los objetos de fase son aquellos que
al ser atravesados por un haz luminoso modifican el curso de este, atrasndolo con
respecto a las longitudes de onda que han atravesado el medio que las rodea.
Zernike encontr la forma de igualar la intensidad luminosa de los rayos directos y
difractados y adems logr la traduccin de los cambios de fase en cambios de amplitud.
En microscopios de contraste de fases se diferenca del campo claro en los aditamentos
que lo componen: diafragmas anulares en el condensador y placa de fase o zernike en los
objetivos.
En el microscopio de contraste de fases, el objeto iluminado por el vrtice de un cono
hueco de luz, que facilita la orientacin de rayos directos y difractados.
En cada una de las partes del objeto se forman rayos directos y difractados, los cuales
entran al objetivo, en este se aumenta su separacin para imprimir en ellos el aumento
caracterstico del objetivo. En la pupila del objetivo se reproduce la misma imagen que se
tiene en el diafragma del condensador ms las modificaciones introducidas por el objeto,
en este punto es donde se coloca la placa de fases, la cual reduce la amplitud de los rayos
directos y desfasa en un cuarto de longitud de onda los rayos difractados con respecto a
los directos.
El objetivo que se persigue al desfasar un cuarto de longitud de onda los rayos
difractados, es incrementar su retraso original de un cuarto de longitud de onda (1/4 )
introducido por el objeto (en promedio la materia viva en preparacin microscpica
desfasa 1/4 de la de la luz que la atraviesa), con el fin de lograr situaciones que
permitan la interferencia de los rayos directos con los difractados al llegar al diafragma
del ocular.

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La ptica del microscopio de fases est calculada para modular longitudes de onda de
550 nm por lo que debe usarse siempre filtro verde en la salida de la lmpara.
La imagen final del microscopio de contraste de fases es la resultante de la interaccin de
los rayos directos con los difractados y es rica en informacin estructural de las partes del
objeto en fase.
El propsito de esta prctica es conocer y manejar el microscopio de contraste de fases.

Materiales:
Portaobjetos
Cubreobjetos
Frasco gotero
Agua destilada
Abatelenguas
Microscopio de contraste de fases
Material biolgico (agua encharcada)
Bulbo de cebolla
Clulas de la mucosa bucal.

Metodologa
El manejo del microscopio de contraste de fases y la manera de ajustarlo son las
siguientes:
Enfocar la preparacin con el objetivo de menos aumento restando el condensador en
posicin de campo claro
Realizar la iluminacin Khler.
Girar el revolver del condensador hasta hacer coincidir el diafragma anular que el
objetivo requiera, segn lo indique le color de sus grabados o el nmero que siga a las
letras pH, por ejemplo: el objetivo 40X indica pH 2 , lo que significa que ha de usarse el
diafragma anular nmero 2.
Quitar el ocular del microscopio y en su lugar colocar la lente Amici-Bertrand u ocular
telescopiable (lente auxiliar) para observar con mas claridad el diafragma anular
(crculo brillante) y la placa de fase (crculo opaco).
Centrar el diafragma anular con respecto a la placa de fase mediante los tornillos
colocados cerca del condensador.
Quitar el lente de Amici-Bertran y colocar nuevamente el ocular del microscopio.
Si es necesario rectificar la iluminacin Khler.

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