Histologa

Medicina 2015

Generalidades de las tcnicas utilizadas en histologa

La mayor parte de los contenidos se puede formular en los trminos de la microscopa
ptica, pero la interpretacin ms detallada de la microanatoma se fundamenta en la
microscopa electrnica (ME), tanto con el microscopio electrnico de transmisin
(MET) como en el microscopio electrnico de barrido (MEB). Hoy, el microscopio de
fuerza atmica (MFA), tambin puede proveer imgenes de alta resolucin
comparables con las entregadas por el MET.
Existen tcnicas auxiliares de la histologa, las cuales incluyen:
Histoqumica y citoqumica.
Inmunocitoqumica y tcnicas de hibridacin.
Radioautografa.
Cultivo de tejidos y rganos.
Separacin de clulas y orgnulos por centrifugacin diferencial.
Microscopios y tcnicas microscpicas especializadas.
Preparacin del tejido. Tincin con hematoxilina eosina de muestras fijadas
en formalina.
1. Fijacin: Conserva la estructura del tejido en forma permanente para permitir
el tratamiento ulterior. Las muestras tienen que sumergirse en el fijador
inmediatamente despus de extraerse del organismo. La fijacin se utiliza para:
Abolir
el
mecanismo
celular.
Impedir la degradacin enzimtica de las clulas y los tejidos por autolisis
(autodigestin).
Destruir los microorganismos patgenos como las bacterias, los hongos o los virus.
Endurecer el tejido como consecuencia de la formacin de enlaces cruzados o la
desnaturalizacin de las molculas proteicas.
El fijador de uso ms comn es la formalina, una solucin acuosa de formaldehdo al
37%, en diluciones variadas y en combinacin con otras sustancias qumicas y
amortiguadoras. El formaldehdo preserva la estructura general de la clula y de los
componentes extracelulares al reaccionar con los grupos amino de las protenas.
Adems, como el formaldehdo no altera su estructura tridimensional, las protenas
mantienen su capacidad de reaccionar con anticuerpos especficos. Esta propiedad es
importante en los mtodos de tincin Inmunocitoqumica. El formaldehdo no
reacciona con los lpidos, y por tanto, es un mal fijador de las membranas.
2. Inclusin: Para poder examinar la muestra hay que infiltrarla con un medio de
inclusin que permita realizar cortes muy delgados (5 a 15 micrmetros). Luego
de la fijacin, la muestra se lava y se deshidrata con una serie de soluciones
alcohlicas de concentracin creciente hasta alcanzar alcohol al 100%.

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3. Aclaramiento: Se utilizan solventes orgnicos como xileno o tolueno, que son

miscibles tanto en alcohol como en parafina, para extraer el alcohol al 100%
antes de la infiltracin de la muestra con parafina fundida.
4. Corte: Cuando la parafina fundida se ha enfriado y endurecido, se empareja
para formar un bloque de tamao adecuado. Este bloque, llamado taco, se
coloca entonces en una mquina cortadora especial, el micrtomo, que lo corta
en rebanadas finas con una cuchilla de acero. Luego, los cortes se montan sobre
un porta objetos, a los cuales se les aade anteriormente una cantidad pequea
de albmina para que sirva de adhesivo.
5. Extraccin de la parafina: Se utiliza Xileno o tolueno.
6. Rehidratacin de la muestra: Se utiliza una serie de alcoholes de
concentracin decreciente.
7. Tincin de la muestra: Primero, el tejido colocado sobre los portaobjetos se
tie con hematoxilina en agua. Como el colorante de contraste, eosina, es ms
soluble en alcohol que en agua, se vuelve a deshidratar la muestra en soluciones
alcohlicas de concentracin creciente y despus se tie con eosina en alcohol.
8. Finalizacin del preparado: Luego de la coloracin de la muestra, se hace
pasar por xileno o tolueno y se le coloca un medio de montaje no acuoso antes
de cubrirla con un cubreobjetos para lograr un preparado permanente.

A) Hematoxilina sola (color morado/azul uniforme). Tincin bsica. Se adhiere a los

cidos. *Cuando algo se tie con un colorante bsico, se le denomina basfilo.
B) Eosina sola (color rosa/rojizo). Tincin cida. Se adhiere a los componentes
bsicos. *Cuando algo se tie con un colorante cido, se le denomina acidfilo.
C) Hematoxilina Eosina (Ncleos de color morado y citoplasma rosado).

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Otros fijadores
La formalina no preserva todos los componentes de las clulas y los tejidos. Adems,
muchos componentes se pierden durante la preparacin de la muestra. Para conservar
estos componentes y estructuras hay que utilizar otros mtodos de fijacin. Estos
mtodos se fundamentan en un conocimiento slido de la qumica.
Para conservar los lpidos neutros, como los de las clulas adiposas, deben utilizarse
cortes por congelacin de tejido fijado en formalina y colorantes solubles en
grasas; para conservar estructuras de la membrana hay que usar fijadores especiales
con metales pesados, como permanganato y osmio, que se unan a los fosfolpidos.
En las microfotografas electrnicas, el tetrxido de osmio es el responsable del
excelente estado de conservacin de las membranas celulares.
Composicin qumica de las muestras histolgicas
Los componentes que perduran luego de la fijacin son principalmente molculas
grandes que no se disuelven con facilidad, en especial despus de aplicar el fijador.
Estas molculas grandes, en particular las que reaccionan con otras molculas
semejantes para formar complejos macromoleculares, son las que suelen conservarse
en un corte histolgico. Los siguientes son ejemplos de estos complejos
macromoleculares grandes:
Nucleoprotenas
Protenas intracelulares del citoesqueleto
Protenas extracelulares
Complejos de fosfolpidos y protenas (o carbohidratos) en las membranas
Algunos componentes como el glucgeno, proteoglicanos y glucosaminoglicanos
se pierden durante la fijacin de rutina en fijadores acuosos.
Fundamentos qumicos de la coloracin
Un colorante cido, como la eosina, tiene una carga neta negativa en su parte
coloreada y se describe con la formula general (Na+ anilina-).
Un colorante bsico, como la hematoxilina, tiene una carga neta positiva en su parte
coloreada y se describe con la frmula general (Anilina+ Cl-).
Desde el punto de vista estructural, la hematoxilina no es un colorante bsico, pero
tiene propiedades de tincin muy semejantes a las de las anilinas bsicas.
Los colorantes bsicos reaccionan con los componentes aninicos de las clulas y
los tejidos. (Grupos fosfato de los cidos nucleicos, los grupos sulfato de los
glucosaminoglicanos, y los grupos carboxilos de las protenas).
Sustancias dentro de las clulas y en la matriz extracelular que presentan basofilia:
Heterocromatina y nuclolos.
Componentes citoplasmticos.
Material extracelular (como los carbohidratos complejos).
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Sustancias dentro de las clulas y en la matriz extracelular que presentan acidofilia:

Filamentos citoplasmticos.
Componentes membranosos intracelulares.
Fibras extracelulares.
Metracromasia: Cuando algunos tipos de tejidos (cartlago, grnulos de
heparina de mastocitos, etc.) son teidos con un colorante bsico
(generalmente azul), hacen cambiar su color desde el azul al rojo. Por ejemplo,
el azul de toluidina se ver prpura o rojo cuando se utilice para teir los
componentes mencionados.
Reaccin del PAS (cido peridico-reactivo de Schiff): Tie carbohidratos y
macromolculas con abundancia de carbohidratos. Se usa para detectar glucgeno en
las clulas, moco en varios tipos de clulas y tejidos, la membrana basal que se
encuentra debajo de los epitelios y las fibras reticulares del tejido conjuntivo. Los
carbohidratos se convierten en aldehdos.

Reaccin de Feulgen: Se utiliza para teir DNA, por medio de una hidrlisis cida dbil
con HCL. Adems, esta tcnica es til para cuantificar el DNA en el ncleo celular.
Inmunocitoqumica
Los anticuerpos, tambin llamados inmunoglobulinas, son glucoprotenas
producidas por clulas especficas del sistema inmunitario en respuesta a una protena
extraa o antgeno. En el laboratorio, los anticuerpos pueden purificarse de la sangre
y conjugarse con un colorante fluorescente. En general estos colorantes
(fluorocromos) son sustancias qumicas que absorben luz de longitudes de onda
diferentes, y luego emiten luz visible de una longitud de onda especfica. La

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fluorescena, el colorante de uso ms

frecuente, absorbe la luz ultravioleta y emite
luz verde.
En la Inmunocitoqumica se utilizan dos
tipos
de
anticuerpos:
anticuerpos
policlonales producidos por animales
inmunizados y anticuerpos monoclonales
producidos por lneas celulares productoras
de
anticuerpos
inmortalizadas
(de
duplicacin continua).

Tejido epitelial
El tejido epitelial tapiza la superficie del cuerpo, reviste las cavidades corporales y forma
glndulas. El epitelio es un tejido avascular compuesto por clulas que recubren las
superficies externas del cuerpo y revisten las cavidades internas cerradas, y los tubos
que comunican con el exterior (aparatos digestivo, respiratorio y genitourinario). El
epitelio tambin forma la porcin secretora (parnquima) de las glndulas y sus
conductos excretores. Adems, hay clulas epiteliales especializadas que funcionan
como receptores sensoriales (olfato, gusto, odo y visin).
Las clulas que integran los epitelios poseen 3 caractersticas principales:

Estn dispuestas muy cerca unas de otras y se adhieren entre s por medio
de molculas de adhesin clula-clula especficas, que forman uniones
intercelulares especializadas.
Tienen polaridad morfolgica y funcional, lo que significa que las
diferentes funciones se asocian con tres regiones superficiales de
morfologa distinta: la regin apical, la regin lateral y la regin basal. Las
propiedades de cada regin se determina por los lpidos especficos y
protenas integrales inmersas en esa zona.
Su superficie basal est adherida a una membrana basal subyacente, que
es una capa de material acelular, con protenas y polisacridos abundantes.

Los epitelios a su vez, cumplen con la tarea de servir como barrera selectiva capaz de
facilitar o inhibir el intercambio de sustancias especficas entre el exterior y el
compartimiento de tejido conjuntivo subyacente.
Clasificacin de los epitelios

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