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PARTE I
Un enfoque evolutivo
de la clula
Roberto A. Rovasio, Aldo R. Eynard y Mirta A. Valentich
Fig. I-0. Imaginando una protoclula. Estructura vesicular con contenido orgnico,
rodeada por una membrana visible con microscopia de fluorescencia (vase fig. I-1).
Todas la formas de vida estn compuestas por molculas que no estn vivas por s
mismas. Pero, de qu manera difiere la materia viva de la no viva? Cmo podra
surgir una primitiva forma de vida de un conjunto de molculas no vivas? La transicin de la materia no viva a la materia viva usualmente emerge en el contexto del
origen de la vida. (Del prrafo inicial de Rasmussen et al., 2004).
E n el estudio inicial de la clula con frecuencia nos preguntamos sobre el origen

de esta unidad de los seres vivos, y es razonable pensar que no siempre la clula fue
como hoy la conocemos. Hace unos 3 000 millones de aos, cuando la Tierra estaba
en gran parte sumergida en la sopa prebitica, no existan las clulas que daran
origen a todos los seres vivos. Sin embargo, comenzaban a darse las condiciones fisicoqumicas para que ellas existieran luego de una larga evolucin (fig. I-0).
Cules seran esas condiciones? En primer lugar siguiendo a las prolongadas eras
de convulsiones volcnicas y millones de toneladas de materia hirviente que comenzaban a enfriarse, no es difcil imaginar la aparicin de situaciones fisicoqumicas
adecuadas para la formacin de las primeras molculas orgnicas simples. As como
hoy conocemos en detalle las formas de unin de unas molculas con otras, no hay
razn para pensar que en aquella etapa prebitica no existieran afinidades para las
uniones entre esas molculas orgnicas. As, la unin de unas molculas con otras,
con cierto grado de selectividad, dara origen a la formacin de los polmeros primigenios.
PARTE I
Captulo 1
Mtodos generales para el estudio de las clulas
y los tejidos 10
Roberto A. Rovasio, Aldo R. Eynard
y Mirta A.Valentich
Captulo 2
El ncleo como centro interactivo de control
celular 33
Mirta A. Valentich, Guillermina A. Bongiovanni
y Roberto A. Rovasio
Captulo 3
Lneas de montaje, trnsito y destino de
macromolculas y membranas para exportacin
y para uso interno 72
Mirta A. Valentich y R. Olga Caldern
Captulo 4
Evolucin de las fuentes de energa y su
transformacin 90
Mirta A. Valentich y R. Olga Caldern
Captulo 5
Relaciones de la clula hacia su interior y con
su medio exterior 103
Roberto A. Rovasio, Mirta A.Valentich
y Aldo R. Eynard
Parte I - Un enfoque evolutivo de la clula
EL CAMINO HACIA
LA PROTOCLULA
Como se mencion en el prrafo introductorio
avalado por abundante evidencia, podemos imaginar el inicio del largo camino que dar origen a la
clula(*), como un enorme caldero que contiene miradas de las primeras molculas orgnicas simples
(fig. I-1 A). Molculas que, por afinidades fisicoqumicas que no seran necesariamente diferentes de las
del tiempo actual, determinaron uniones entre ellas.
Estos enlaces permitiran el surgimiento de conjuntos moleculares que denominamos los polmeros
primigenios (fig. I-1 B). Considerando el comportamiento fisicoqumico de las molculas modernas,
tampoco es difcil imaginar que en aquella poca los
constituyentes de los primitivos polmeros tuviesen
sus propias preferencias de unin, cuya resultante
sera otro polmero, complementario del primero
(fig. I-1 C). A la luz de nuestros actuales conocimientos, los cambios que acabamos de describir no slo
fueron posibles, sino muy probables. Lo difcil para
nuestra dimensin humana es, precisamente, imaginar que para llegar a esos cambios, hicieron falta muchos millones de aos de evolucin molecular, y
muchos trillones de interacciones moleculares fallidas, hasta que algunas de ellas comenzaron a ser estables. Es difcil de imaginar pero no imposible de
conceptuar que muchos de los cambios que ocurren
en nuestras modernas clulas (o en un tubo de ensayo) en segundos o minutos, demoraron millones de
aos en ensayos hasta llegar a un estado fisicoqumico estable y reproducible.
Cmo contina esta historia prebitica? Ya tenemos molculas orgnicas simples formando polmeros. No hay razn para pensar que las molculas
integrantes de esos polmeros no hayan tenido afinidad para unirse con otras molculas simples y
que stas, a su vez, puedan haberse unido entre s
para formar un nuevo polmero (fig. I-1 D). Podemos agregar a este razonamiento los millones de
aos que hagan falta, que nunca sern pocos Pero, he aqu un nuevo cambio que ser esencial para
la vida tal como hoy la conocemos, cual es la adquisicin de la capacidad de auto-duplicacin de un
polmero (fig. I-1 B-D).
En sntesis, en el viejo y largo camino hacia la protoclula ya tenemos los elementos que sern la base de muchos procesos importantes para la clula
moderna y el ncleo fundamental de todos los sistemas biolgicos. La formacin de polmeros y la
capacidad de autoduplicacin de los mismos forman la base de los procesos de sntesis biolgica y
de la transferencia de informacin (fig. I-1 A-D).
Sin embargo, a pesar de la importancia de esos
millones de aos de evolucin molecular, an esta* Las palabras en negrita se definen en el Glosario.
mos lejos de la protoclula. Para que ella pudiera

existir sobre la base del conocimiento actual fueron necesarias al menos dos condiciones. En primer
lugar, que el nuevo polmero (fig. I-1 D) pudiera tener un efecto favorable o perturbador, es decir,
un efecto regulador sobre los otros polmeros (fig. I1 + y ). Sin embargo, estos efectos estaran tan diluidos en las toneladas de sopa prebitica del antiguo planeta que la accin reguladora en ese sistema
abierto sera intrascendente para la poblacin general de molculas. Para la transformacin en un sistema cerrado fue necesaria la segunda condicin,
bajo la forma de otro tipo de molcula orgnica simple, que seguramente form parte del joven planeta
en aquella primitiva era geolgica. Los lpidos (grasas) como veremos en detalle ms adelante, cuando son agitados en un medio acuoso rico en minerales y sales, tienen la propiedad de autoensamblarse en envolturas con forma de vescula con lquido
encerrado en su interior. En la primitiva sopa, el lquido no faltaba y las agitadas convulsiones tampoco, que hacan muy probable que a lo largo del
tiempo se fueran dando las condiciones para la produccin del primer compartimiento vesicular con
polmeros en su interior (fig. I-1 ). En este sistema
cerrado, si la produccin de un nuevo polmero tuviera un efecto favorable sobre los otros polmeros
(fig. I-1 +), el resultado sera una mayor estabilidad
del sistema; por el contrario, si el efecto fuese perturbador, la resultante sera el estancamiento o la
destruccin del microsistema (fig. I-1 ). Es decir, la
seleccin natural a nivel molecular operara con
mayor eficiencia en un sistema cerrado como el descrito. Y esto nos pone en los umbrales de la primitiva protoclula, un sistema que contiene los elementos bsicos para seguir evolucionando hacia una
mayor complejidad. La seleccin natural en el mbito molecular condicion la evolucin qumica,
precediendo a la evolucin biolgica. Esa primitiva
seleccin natural pudo realizarse debido a la formacin del primer compartimiento.
DE LOS PROCARIONTES A LOS

EUCARIONTES: LA GANANCIA
DE COMPARTIMIENTOS
Con los componentes bsicos de la protoclula y
luego de unos cuantos millones de aos adicionales
de evolucin y seleccin natural, nos encontramos
con la ancestral y actual clula procarionte (bacterias en su mayor parte). stas son las clulas ms
simples y primitivas que podemos conocer en nuestros das. Son pequeas y poseen un nucleoide o
componente nuclear de cido desoxirribonucleico
(DNA) que no est separado del resto del protoplasma. Por otra parte, su envoltura membranosa
adquiri complejidad y frecuentemente se rodea
con cubiertas externas (pared celular) formada por
Fig. I-1. Etapas en la evolucin hacia la protoclula. A. Molculas orgnicas simples. B. Polmero primigenio. C. Polmero complementario. D. Nuevo polmero. (+) y (-) Efecto favorable o desfavorable sobre el polmero primigenio.
Formacin del primer compartimiento = protoclula.
diferentes componentes moleculares que cumplen

funciones definidas. Sin embargo, la membrana celular rara vez, o transitoriamente, forma prolongaciones o tabicamientos intracelulares (cuadro I-1).
El camino desde la clula procarionte primitiva
hasta la clula eucarionte signific un enorme incremento de la complejidad (vase cuadro I-1). Sin
embargo, esa complejidad podra resumirse en un
concepto bsico y general: la compartimentacin.
La clula eucarionte caracterstica de organismos
ms evolucionados posee dos compartimientos
principales (ncleo y citoplasma), delimitados por
estructuras membranosas, al igual que las numerosas estructuras (organoides) localizadas en el compartimiento citoplasmtico.
Las enormes diferencias entre bacterias y clulas
eucariontes son notables en cuanto a tamao, estructura y funciones. Sin embargo, esta diversidad
parece enmascarar las numerosas semejanzas entre
estos diferentes tipos celulares. Por ejemplo, si observamos la composicin qumica de las bacterias,
podremos comprobar que es casi idntica a la de las
clulas eucariontes y que una de las escasas diferencias es su tamao (cuadro I-2). Ms adelante en este libro se notarn otras semejanzas, diferencias e
interacciones entre las clulas procariontes y las clulas eucariontes.

Cmo se lleg a tal grado de compartimentacin
en la clula eucarionte? El simple sentido comn
nos indica que algo frgil (polmero primitivo o moderno DNA) se preserva mejor si est protegido.
Probablemente, la clula primitiva (protoclula o
bacteria ancestral) experiment pequeos cambios
a lo largo de eones, con resultados favorables o desfavorables que marcaron la evolucin de la compartimentacin. La clula eucarionte moderna, que alcanz el nivel ms alto de complejidad, seguramente es el resultado de una seleccin natural que comenz con la formacin y la estabilizacin de un
compartimiento nuclear (fig. I-2 A, B). Por el contrario, otras estirpes celulares como las bacterias actuales, protegen su DNA mediante la especializacin y el reforzamiento de envolturas de su nico
compartimiento protoplasmtico, pero al costo de
mantener una estructura general pequea, primitiva y rgida. Eventualmente, al producirse una invaginacin de la membrana celular, que arrastr y rode el DNA, otras porciones de la misma membrana unida a ribosomas formaron el primitivo retculo endoplasmtico (RE) (fig. I-2 B). Esto explicara
Cuadro I-1. Caractersticas diferenciales entre clulas procariontes y clulas eucariontes

Caractersticas
Procariontes
Eucariontes
Organismos
Bacterias y cianobacterias
Protistas, hongos, plantas y animales
Tamao
Pequeo (1-10 m)
Grande (10-100 m)
Sistema gentico
DNA circular no asociado con

protenas en cromosomas
DNA lineal asociado con protenas en

cromosomas
Nucleoide sin membrana
Ncleo con membrana
Poco DNA repetitivo
DNA repetitivo
Fisin, gemacin, no hay mitosis
Varias formas asociadas con mitosis
Separacin de cromosomas por

unin a la membrana celular
Separacin de cromosomas por arrastre

de microtbulos
Sistema sexual
Transferencia unidireccional de
genes de donador a receptor
Fusin de genomas gamticos asociada con

meiosis
RNA y protenas
Sintetizados en el mismo
compartimiento
RNA sntesis/procesado en ncleo
Membranas internas
Slo transitorias
Numerosos tipos y variedades
Metabolismo
Anaerbico o aerbico
Aerbico
Nutricin
Difusin. Algunos
fotosintetizadores
Absorcin, ingestin, secrecin, fotosntesis.

Mecanismos complejos con organoides
especializados
Organizacin celular
Ausente, principalmente
unicelulares
Compleja, principalmente multicelulares, con

muchas variedades celulares
Motilidad citoplasmtica
No posee citoesqueleto
Citoesqueleto y motores moleculares
Endocitosis y exocitosis ausente
Transporte vesicular
Divisin celular
Protenas en citoplasma
Endocitosis y exocitosis
Motilidad global
Flagelos simples en ciertas

bacterias
por qu, como veremos las membranas interna y externa de la envoltura nuclear se continan con la
membrana del RE. Tambin existen slidos criterios
moleculares que apoyan la propuesta de que la mitocondria se origin de una bacteria aerobia ancestral,
al ser internalizada por un eucarionte primitivo, seguido por la adaptacin simbitica que les permiti
a ambos tipos celulares obtener ventajas funcionales
y evolutivas (fig. I-2 B). El origen del cloroplasto de
las clulas vegetales sera similar, pero por simbiosis
con una bacteria fotosinttica (fig. I-2 C). En ambos
casos, se sabe que muchas caractersticas moleculares de estos organoides (DNA, RNA, enzimas, etc.)
son de tipo bacteriano, ambos estn envueltos por
una doble membrana (la externa derivada de la
membrana plasmtica) y ambos estn fuera del circuito topolgico de endomembranas (fig. I-2 D).
Cilios y flagelos complejos

Migracin sobre sustrato celular o extracelular
COMPARTIMIENTOS Y FUNCIONES:
LA MEMBRANA CELULAR
El concepto de compartimentacin bsico y fundamental para el conocimiento de la biologa celular visualiza el citoplasma como un conjunto de espacios con diferente contenido, limitados por distintos tipos
de membranas (fig. I-2 D). As, todos los organoides
estn rodeados por una membrana (o dos, con menos frecuencia) que delimitan espacios con una organizacin ultraestructural, composicin qumica,
propiedades fsicas y funciones caractersticas. Muchas de las enzimas que catalizan las funciones celulares se encuentran distribuidas en forma selectiva en los diferentes compartimientos, ya sea en sus
componentes membranosos o en los espacios que
delimitan. Las membranas, a la vez que separan
Fig. I-2. Posible evolucin de los compartimientos celulares. A. Adquisicin de envoltura nuclear y retculo endoplasmtico. B. Mitocondrias. C. Cloroplastos. D. Endomembranas de un eucarionte actual. REL: retculo endoplasmtico
liso. RER: retculo endoplasmstico rugoso.
medios de composiciones diversas y con frecuencia

incompatibles, permiten y regulan la interaccin
entre los compartimientos. La coordinacin de las
actividades de la membrana mantiene un funcionamiento eficiente de la clula en tanto reciba el aporte indispensable de nutrientes y oxgeno que asegure las condiciones homeostticas constantes y controladas. Adems, el funcionamiento correcto de la
clula involucra interacciones con otras clulas y
con el medio extracelular, todo lo cual se realiza a
travs de una o ms membranas, lo cual determina

el estado de salud de la clula y del organismo que
integra.
Qu estructura posee la membrana que explique
el elevado nmero y variedad de sus funciones? La
respuesta, tambin en este caso, debe referir a la
evolucin, pero esta vez a la evolucin del conocimiento. A lo largo de muchos decenios resultaba
obvio que la clula deba tener una estructura bidimensional que la contuviera. Sin embargo, el mi-
Cuadro I-2. Diferencias en composicin qumica y volumen entre procariontes y eucariontes

Composicin qumica
Agua
Bacteria (E. coli)
Clula de mamfero
% del peso celular
70
70
Iones inorgnicos
Metabolitos pequeos
15
18
Protenas
RNA
1,1
DNA
0,25
Fosfolpidos
Otros lpidos
Polisacridos
Volumen total
Volumen relativo
2 10
12
2
cm
4 19
cm3
2000
Fig. I-3. La membrana celular segn el modelo de GorterGrendel, con su doble capa de fosfolpidos orientados
con sus cabezas polares (P) hacia el exterior y las cadenas
hidrfobas (CH) hacia el interior de la bicapa. (Gorter y
Grendel, 1925).
Fig. I-4. La membrana celular segn el modelo de Danielli-Davson, con su doble capa de fosfolpidos y las protenas globulares adsorbidas a sus superficies externa e interna. (Danielli y Davson, 1935).
croscopio utilizado durante muchos aos para describir en detalle muchos tipos celulares no permiti
visualizarla, por lo que durante largo tiempo el
concepto de membrana celular permaneci en el mbito de las intuiciones o las especulaciones. Cuando
las herramientas tecnolgicas lo permitieron, se
avanz sobre la idea de la composicin lipdica de
la membrana propuesta por Overton en 1902. Para
ello, dos cientficos seleccionaron un modelo experimental simple, el eritrocito de mamfero formado
esencialmente por una envoltura membranosa y un
contenido homogneo, sin ncleo ni organoides.
Luego de eliminar el contenido, analizaron la envoltura del eritrocito, describieron su composicin
en lpidos y, calculando el espacio que ocupaban,
concluyeron que la membrana plasmtica estara
formada por una doble capa de lpidos, lo que estableci las bases estructurales de lo que se conoce como el modelo de Gorter-Grendel (fig. I-3). Este modelo terico, basado sobre datos biofsicos y qumicos, explicaba parcialmente la permeabilidad de la
membrana a las sustancias lipoflicas y la fusin espontnea entre membranas (vase cap. 5, cuadro 51), pero no poda explicar muchas otras funciones
celulares, para lo cual el modelo resultaba insuficiente.
Durante 25 aos, el concepto de membrana no se
modific, a pesar de que slo explicaba parcialmente el mecanismo de permeabilidad de molculas liposolubles o hidrfobas, y no poda explicar
muchas otras funciones de la membrana celular.
Por esta necesidad funcional, el modelo debi
evolucionar y se propuso el agregado de capas externa e interna de protenas globulares adheridas
(adsorbidas) a la bicapa de fosfolpidos, que conform el modelo de Danielli-Davson (fig. I-4). Esta participacin proteica en la membrana, aunque
tampoco explicaba el mecanismo, ayudaba a visualizar mejor el transporte de molculas hidrfilas y la antigenicidad de la clula (vase cap. 5,
cuadro 5-1).
Sin embargo, el concepto de membrana an no
contena los elementos que permitieran comprender otras funciones y tampoco haba acuerdo en la
estructura molecular y forma de integracin de las
capas proteicas con los lpidos de la membrana. En
la dcada de 1950, la estructura de la membrana se
visualiz con los primeros microscopios electrnicos como una doble capa osmifila y, sobre una base cuantitativa proporcionada por los datos ultraestructurales, Robertson postul en 1962 que las protenas superficiales deban disponerse en forma extendida sobre la superficie lipdica. Esta estructura
y la visualizacin de la bicapa lipdica contribuyeron a consolidar el concepto universal an vigente
de unidad de membrana, apoyado en particular
por la semejanza estructural entre las membranas
artificiales y diferentes tipos de membranas naturales (fig. I-5).
Pasaron casi cuarenta aos para que el modelo de
la membrana celular ganara nuevos componentes,
nueva estructura y mayor dinamismo. Durante esa
tercera etapa se hicieron contribuciones trascendentes a la estructura de la membrana que, con ligeras
variantes, permanecen hasta la actualidad. Sobre la
base de los modelos anteriores se propuso la incorporacin de glucolpidos y glucoprotenas como
parte integral de la membrana y no adsorbidos como
en el modelo anterior. Estas molculas estaran interaccionando con la regin hidrfoba de la bicapa lipdica, exhibiendo su porcin glucdica hacia la superficie externa de la clula. Esta ltima caracterstica permiti tambin que se reconociera la existencia real del glucocliz como un componente intrn-
C
B
Fig. I-5. A. Micrografa electrnica de membrana artificial formada por el ensamble espontneo de lpido-protenaagua. (W. Stoeckenius, tomada de De Robertis et al., fig. 7.7, 1968.) B. Membrana de dos clulas intestinales contiguas.
(Tomada de De Robertis et al., fig. 8.3, 1968.) C. Membrana plasmtica del cuerpo (flecha) y corte transversal de flagelo (f) de Trypanosoma cruzi. (Rovasio, 1976.)
seco de la superficie celular (vase cap. 5, figs. 5-2,

5-3 y 5-13) y no como un simple artefacto de tcnica que los microscopistas visualizaban desde haca
varios aos.
Adems, se agreg al modelo un concepto dinmico que fue muy movilizador en las ciencias biolgicas. Se propuso que los diferentes componentes
de la membrana tenan capacidad para movilizarse
y realizar diferentes tipos de movimientos moleculares, como girar, bascular entre las superficies externa e interna (flip-flop) y desplazarse tangencialmente a lo largo y a lo ancho de la membrana. Se
concretaba as el modelo de Singer-Nicolson (fig. I6).
Este concepto de membrana, tambin denominado modelo del mosaico fluido, concibe un mosaico como zonas ms viscosas de la membrana,
que se mueven entre reas ms fluidas a la temperatura corporal de cada especie. La integracin en
este modelo de los componentes estructurales y dinmicos mencionados, en paralelo con los avances
tecnolgicos y enfoques experimentales que permitieron apoyarlo, contribuyeron a explicar y fundamentar muchas de las funciones celulares para las
cuales la participacin de la membrana es esencial,
como el flujo de membrana, el funcionamiento de
los receptores, el reconocimiento celular, la actividad enzimtica superficial, la adhesin clula-clula y la adhesin clula-sustrato, la motilidad celular en un lquido, la migracin celular sobre sustratos, los fenmenos de endocitosis y exocitosis,
los cambios de forma celular, la interaccin y el reclutamiento de ligandos (capping), muchos fenmenos inmunes y de histocompatibilidad (vase
cap. 5, cuadro 5-1). Paralelamente, permiti determinar la heterogeneidad fisicoqumica entre membranas de diferentes clulas y entre diferentes
dominios de una misma membrana, as como la
asimetra entre los componentes superficiales y citoslicos de una membrana.
NIVELES DE ORGANIZACIN
CELULAR
Llegar al concepto de que la clula actual es el resultado de un prolongado y complejo mecanismo
evolutivo nos permitir introducirnos en los cinco
captulos de la Parte I del libro, en los que trataremos inicialmente algunos mtodos e instrumentos
para estudiar la clula, para detallar a continuacin
sus principales estructuras, funciones y productos.
Esos conocimientos darn las condiciones adecuadas para entender que los organismos de muchos
metazoarios, como el ser humano, estn formados
por un elevado nmero de clulas (cerebro = 1012
clulas!!!) y que stas no se disponen al azar, sino
que se encuentran distribuidas con distintos grados de complejidad en los diferentes niveles de organizacin.
En la Parte II (captulos 6 a 10) veremos cmo las
clulas se agrupan en diversas poblaciones celula-
res y cmo stas se organizan en estructuras ms

complejas para formar los tejidos (epitelial, nervioso, muscular, etc.). La formacin de esos patrones
complejos requieren interacciones celulares y moleculares precisas, con lo cual integraremos la embriognesis, como desarrollo progresivo de niveles
de organizacin de complejidad creciente a partir
de una sola clula. Y tambin estudiaremos la histognesis, es decir, la formacin de los tejidos bsicos y sus derivados a lo largo de las etapas embrionarias y su mantenimiento en la etapa adulta.
Finalmente, en la Parte III (captulos 11 a 15) desarrollaremos un nivel de organizacin superior al
tratar la integracin entre los diversos tejidos para
formar los rganos y la coordinacin de stos en
sistemas. Este tratamiento, en simultneo con las
etapas embrionario-fetales, permitir integrar los
conocimientos de forma y actividad celular-tisular
con su desarrollo a lo largo del tiempo (complejidad espacio-temporal).
En resumen, las clulas, los tejidos, los rganos y
los sistemas son parte de los diferentes niveles que
se organizan en un organismo vivo a lo largo del
tiempo y de cuya equilibrada integracin dependen
todos los procesos vitales. La manera armnica y
coordinada del funcionamiento normal en el estado
de salud se considerar en los ejemplos sobre los
cambios que se producen en las clulas y en los tejidos en el estado de enfermedad, cuando su estructura, funcin o mecanismo de regulacin resultan
alterados.
EL ESTUDIO DE CLULAS
Y TEJIDOS, SU RELACIN CON
OTRAS REAS BIOMDICAS
La biologa celular, la histologa y la embriologa
son reas interdisciplinarias que convergen para el
estudio de diversos aspectos de la estructura, la
funcin y la regulacin de conjuntos celulares integrados y organizados a lo largo del desarrollo de un
organismo desde su etapa unicelular hasta su
muerte. A su vez, esas disciplinas fundamentan y se
involucran en mltiples reas del conocimiento de
las ciencias biomdicas.
La biologa celular proporciona las bases estructurales de los cambios qumicos y metablicos estudiados en qumica biolgica, as como de las
caractersticas funcionales correspondientes a la fisiologa; son numerosos los mecanismos celulares
y moleculares as como las herramientas utilizadas para su estudio que requieren los fundamentos de la biofsica. La histologa se relaciona con la
anatoma, ya que sta no se integra desde lo fun-
Fig. I-6. La membrana celular segn el modelo de Singer-Nicolson, con la doble capa de lpidos y las protenas
integrales que atraviesan total (P1) o parcialmente (P2) la
membrana. Una de las protenas integrales forma un canal o tnel (t) que comunica ambas superficies de la
membrana. Se indican tambin los glucolpidos (Gl) y las
glucoprotenas (Gp) con sus residuos azcares hacia el
lado externo de la membrana formando el glucocliz.
(Singer y Nicolson, 1972)
cional si se desconoce la estructura histolgica, as

como no se comprende el estudio microscpico de
los tejidos y los rganos si no se conoce la anatoma
global. Asimismo, el conocimiento de las estructuras y las funciones normales de clulas y tejidos
forma la base y la sntesis integradora del conocimiento para poder encarar el estudio de la anatoma patolgica. Por otra parte, tanto la biologa celular como la histologa no slo estn estrechamente relacionadas con la embriologa y la biologa
del desarrollo, sino que constituyen sus bases conceptuales, ya que todas las estructuras que forman
el individuo son producto de complejos procesos
de proliferacin, crecimiento, diferenciacin,
cambio de forma y movilizacin celular. A su vez,
los conocimientos de embriologa son fundamentales para un buen desarrollo conceptual de disciplinas como ginecologa, obstetricia y cardiologa,
entre otras. Finalmente, los contenidos y las estrategias de la biologa celular, la histologa y la embriologa en el estado de salud son condicionantes
para la adquisicin de conocimientos sobre el estado de enfermedad, en las reas de clnica, ciruga
y patologa, ya que tanto en situaciones normales
como patolgicas existe una estrecha correlacin
entre la estructura, la qumica y la funcin.
Mtodos generales para el estudio

de las clulas y los tejidos
Roberto A. Rovasio, Aldo R. Eynard y Mirta A. Valentich
Lente montada
en un soporte
metlico
Soporte
para
sostener el
espcimen
Sistema de
enfoque y
movimiento
del espcimen
Fig. 1-0. A. Microscopio simple inventado por Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723), vista posterior (derecha) y lateral (izquierda), y manera de utilizarlo por el autor (recuadro). B. Microscopio compuesto inventado por Robert Hooke (1635-1703).
Resumen conceptual
l conocimiento de la clula y de los tejidos se inicia en el siglo XVI con la invencin de los primeros microscopios, que permitieron cruzar el lmite impuesto por la resolucin del ojo humano.
Durante los primeros aos, la observacin de pequeos organismos o de partes diminutas de estructuras biolgicas mayores estuvo restringida a los objetos tal como podan obtenerse en su estado natural. Posteriormente se desarrollaron mtodos para la preservacin de los especmenes,
para lograr mayores contrastes que permitieran evaluar mejor su estructura y para analizar sus
componentes. Ese largo camino, iniciado hace mucho tiempo, se mantiene en la actualidad y traza un paralelismo permanente entre el avance tecnolgico y los progresivos descubrimientos cientficos.
Aunque los sistemas aplicados para el estudio de clulas y tejidos son numerosos, los requerimientos bsicos que veremos a continuacin son: 1) material de estudio preparado en forma adecuada (tcnicas citohistolgicas) y 2) instrumental para su visualizacin y estudio (microscopios).
En este captulo se pasar revista a algunos mtodos bsicos que permiten estudiar la clula y los
tejidos animales en su estructura y en diversos aspectos de su composicin qumica y funcin.
Mtodos generales para el estudio de las clulas y los tejidos
TCNICA CITOHISTOLGICA
Y MICROSCOPIAS
Tcnica citohistolgica
a tcnica citohistolgica es el conjunto de procedimientos aplicados para preservar la estructura y la

organizacin de clulas y tejidos, a fin de obtener una
preparacin microscpica que permita su examen
con un microscopio ptico (MO). Si bien existen tcnicas para el estudio de clulas vivas, en muchos casos es necesario interrumpir los procesos vitales, es
decir, matar las clulas para hacer posible su estudio
microscpico. Es muy importante saber que el conjunto de tcnicas de preparacin indispensables para
el estudio de los tejidos normales es el mismo que se utiliza para el anlisis de tejidos patolgicos. Los procedimientos de la tcnica citohistolgica incluyen una serie de etapas (cuadro 1-1; figs. 1-1 y 1-2):
Observaciones importantes
Toma de la muestra: manipulacin delicada para
evitar su deformacin. La muestra puede obtenerse
11
de un individuo vivo (biopsia) o muerto (necropsia).

Fijacin: la accin ms importante es la desnaturalizacin de las protenas, entre ellas las enzimas
hidrolticas que produciran la autlisis. Adems
de los fijadores qumicos (con una relacin volumen fijador/volumen muestra de 40/1), puede
utilizarse la congelacin, sobre todo para el estudio
de una biopsia durante el acto operatorio.
Deshidratacin: el alcohol ms utilizado es el etanol en concentraciones crecientes de 70% > 80% >
95% > 100%, durante una hora o ms en cada uno
de ellos, segn el tamao de la muestra.
Aclaracin: en esta etapa intermedia se elimina el
alcohol del tejido y ste se impregna con un solvente de la parafina que, adems, le otorga transparencia.
Inclusin en parafina: la parafina penetra en los
tejidos y desplaza al agente aclarante, durante 5 a
20 horas segn la naturaleza y las dimensiones de la
muestra. Luego, la muestra se deposita en pequeos recipientes y se deja solidificar.
Preparacin del taco: el bloque de parafina con
la muestra incluida se pega en un soporte de madera o plstico (taco), para poder fijarlo al micrtomo.
Cuadro 1-1. Etapas de la tcnica histolgica*

Etapas
Fundamento / Precauciones
Producto / Instrumento
Toma de la muestra
Pequeo tamao (2-3 mm)
Bistur, hoja de afeitar
Fijacin
Detiene procesos vitales, evita la autlisis
Formol 10%, 12-24 h, vol. 40/1
Deshidratacin
Facilita la penetracin de solventes
Etanol en graduacin ascendente
Aclaracin
Favorece la penetracin de la parafina
Xilol, benzol
Inclusin en parafina
Otorga dureza para poder realizar cortes
Parafina (45 a 60 C), estufa
Preparacin del taco
Soporte para el montaje en el micrtomo
Bloque de madera o plstico
Corte
Permite la visualizacin de estructuras

pequeas
Micrtomo
Montaje del corte sobre un Soporte para su observacin al microscoportaobjetos

pio
Portaobjetos
Desparafinacin
Facilita la penetracin del alcohol
Xilol, benzol
Hidratacin
Permite la penetracin de colorantes

acuosos
Etanol en graduacin descendente

hasta el agua destilada
Coloracin
Otorga colores diferenciales a la muestra
Hematoxilina-eosina
Deshidratacin
Facilita el montaje con medios hidrfobos
Etanol en graduacin ascendente
Aclaracin
Otorga transparencia a los tejidos
Xilol, benzol
Montaje de cubreobjetos
Permite obtener una preparacin permanente
Cubreobjetos + resinas
* La descripcin en el cuadro y en el texto se refiere al procesamiento de tejidos slidos. Para procesar clulas aisladas, obtenidas in vivo o in vitro, se modifican algunos procedimientos, mantenindose los lineamientos generales.
12
Fig. 1-1. Tcnica histolgica. Desde la toma de la muestra hasta el montaje del corte.
Corte: se realiza con un instrumento de precisin

llamado micrtomo, a fin de obtener cortes muy
delgados (8-10 m) y uniformes que permitan visualizar estructuras muy pequeas. Los tejidos fijados por congelacin (vase Fijacin) se seccionan
mediante un micrtomo de congelacin o con un
criostato, instrumentos adecuados para mantener
la muestra por debajo de 20 C.
Montaje del corte sobre un portaobjetos: los cortes se depositan en la superficie de un recipiente
con agua y luego se montan sobre un portaobjetos

de vidrio y se dejan secar.
Desparafinacin: este paso intermedio es
necesario para permitir la penetracin del alcohol del paso subsiguiente, ya que los solventes
usados son miscibles tanto en parafina como en
alcohol.
Hidratacin: para permitir la penetracin de los
colorantes, que en su mayora estn en solucin
acuosa, la muestra se debe hidratar en soluciones de
13
Fig. 1-2. Tcnica histolgica. Desde la desparafinacin hasta la preparacin microscpica permanente.
etanol diluidas progresivamente (100% > 95% > 80%

> 70%), hasta el lavado final con agua destilada.
Coloracin: el uso de colorantes es necesario porque el contraste de los tejidos es insuficiente para su
observacin con un microscopio comn. En un colorante hay grupos qumicos que le otorgan propiedades inicas al colorante, los cuales se pueden clasificar en colorantes bsicos (colorantes catinicos)
por la presencia del grupo amino (-NH2), por ejemplo, hematoxilina, fucsina bsica, azul de toluidina,
azul de metileno, o colorantes cidos (colorantes
aninicos) por la presencia del grupo carboxilo (COOH), por ejemplo, eosina.
El mtodo de coloracin convencional ms utilizado en histologa e histopatologa se conoce como hematoxilina-eosina (fig. 1-3). La hematoxilina es un
colorante nuclear que se comporta como un colorante bsico al teir los componentes cidos de los tejidos; por ejemplo, los ncleos celulares, por su contenido en DNA, se observan de color azul-violceo. La
eosina es un colorante citoplasmtico, cido, que tie los componentes bsicos de los tejidos; por ejem-
14
Cuadro 1-2. Coloraciones empricas y sus aplicaciones

Coloraciones
Aplicaciones
Hematoxilina de Mayer
Ncleos celulares
Eosina
Citoplasma
Hematoxilina frrica
Ncleo, estriaciones del msculo esqueltico
Aldehdo fucsina y orcena
Fibras elsticas
Hematoxilina fosfotngstica
Ncleo, mitocondrias, colgeno
Impregnacin argntica
Aparato de Golgi, neuronas
May Grnwald-Giemsa
Clulas sanguneas
plo, el citoplasma celular de distintas tonalidades de

rojo. El fundamento de la accin de estos y otros colorantes no se conoce, por lo que se denominan coloraciones empricas (cuadro 1-2; vase fig. 1-3).
Deshidratacin: debido a que el medio de montaje no es miscible con el agua, sta se debe eliminar
mediante inmersiones del portaobjetos con el corte
histolgico en soluciones de etanol de graduacin
creciente (70% > 80% > 95% > 100%).
Aclaracin: los reactivos utilizados (xilol o benzol), adems de eliminar el alcohol, facilitan la penetracin de la resina del medio de montaje y otorga transparencia al corte de tejido.
Montaje del cubreobjetos: a fin de obtener una

preparacin permanente, el corte se cubre con un
vidrio delgado, adherido con un medio de montaje
natural (Blsamo de Canad) o sinttico.
Artefactos de la tcnica
Los artefactos de la tcnica son alteraciones que
se producen por fallas en alguna etapa de la tcnica
citohistolgica y que se reflejan en la preparacin
microscpica. Defectos en la fijacin, la deshidratacin y la inclusin pueden ser causas de desgarros
y retracciones en los tejidos, que llevan a la aparicin de espacios que no tienen existencia real. Asimismo, si la acidez del formol no se neutraliza, pueden aparecer grnulos coloreados por interaccin
del cido frmico con la hemoglobina (pigmento de
formalina). Durante la seccin con el micrtomo
pueden aparecer rayas producidas por melladuras
de la cuchilla. Si el corte no se extiende perfectamente sobre el portaobjetos, puede haber pliegues y
arrugas. Los defectos en la coloracin tambin pueden ser provocados por la calidad y la preparacin
de las mezclas colorantes o por una fijacin insuficiente. Es importante saber discriminar los artefactos de la tcnica de las estructuras normales en una
preparacin microscpica, ya que de lo contrario se
puede cometer un error en el diagnstico o en la
conclusin del estudio.
Tcnicas citoqumicas
Fig. 1-3. Epitelio cilndrico simple de la mucosa gstrica.

Se observan ncleos teidos con hematoxilina (flechas) y
citoplasma teido con eosina (cabezas de flecha) (mediano aumento).
Las tcnicas citoqumicas proporcionan informacin qumica localizada sobre la clula o tejido en estudio. Algunas son muy especficas y proporcionan
datos cuantitativos, por lo cual permiten obtener resultados analticos y funcionales ms completos que
las tcnicas empricas. No son coloraciones, sino
reacciones fisicoqumicas cuyo producto final es coloreado, con lo cual se identifica y localiza una mo-
15
Fig. 1-4. Reaccin de Feulgen. A. Fundamento, sitios de ataque de la hidrlisis cida (flecha). B. Hgado (mediano aumento). Ntese el DNA de la cromatina nuclear (flecha) y el pequeo puntillado del DNA mitocondrial (cabeza de flecha).
lcula o su actividad en la clula o tejido observado.

La interpretacin correcta de una tcnica citoqumica requiere la realizacin de controles adecuados,
que son particulares para cada caso. Los siguientes
son algunos ejemplos de este tipo de tcnicas.
Reaccin de Feulgen
La reaccin de Feulgen demuestra selectivamente el DNA. Para ello, en un primer paso, la
preparacin se somete a una hidrlisis con cido
clorhdrico (ClH), la cual produce: 1) separacin
de las bases pricas del DNA y 2) apertura del
anillo desoxirribosa (fig. 1-4), que pasa a una forma molecular abierta y deja grupos aldehdos al
descubierto. En el siguiente paso, los aldehdos
reaccionan con el reactivo de Schiff, que produce
un color rojo magenta en las zonas donde se encuentra el DNA. La unin entre aldehdos y reactivo de Schiff es estequiomtrica; es decir, el nmero de molculas del reactivo unido mantiene
una relacin constante con la cantidad de DNA.
Esto permite realizar la cuantificacin del contenido de DNA por medicin de la coloracin obtenida en preparaciones microscpicas mediante un
microespectrofotmetro.
El control negativo se obtiene al someter preparaciones microscpicas del mismo material en estudio
a digestiones previas con desoxirribonucleasa
(DNAasa), enzima que degrada selectivamente el
DNA y, por lo tanto, la reaccin debida al DNA ser negativa. El control positivo consiste en un corte
histolgico de cualquier tejido conocido que contenga ncleos celulares (DNA).
Reaccin de PAS
(periodic acid-Schiff)
Se inicia con una oxidacin con cido perydico
(HlO4), que reacciona con grupos hidroxilos libres de
una hexosa o con grupos adyacentes hidroxilo y
amino de una hexosamina, convirtindolos en grupos aldehdos con rotura de la unin carbono-carbono (fig. 1-5 A). En un segundo paso, los aldehdos
reaccionan con el reactivo de Schiff y producen un
complejo estable de color rojo magenta en los sitios
donde se encuentran los azcares mencionados (fig.
1-5 B, vase tambin fig. 1-20B). En las estructuras
celulares o extracelulares, la mayor parte de esta
reaccin corresponde a glucgeno y glucoprotenas.
Como control negativo de la presencia de glucgeno se realiza una preincubacin de la preparacin con
la enzima amilasa, que digiere especficamente el
glucgeno (vase fig. 1-5 C). Para ello, puede usarse
una preparacin pura de amilasa, o simplemente saliva cuyo contenido en esta enzima es abundante. En
este caso, la reaccin de PAS ser negativa en los sitios ocupados por el glucgeno, mientras que seguir
siendo positiva en los lugares que contiene glucoprotenas. Como control negativo de la presencia de glucoprotenas se realiza una preincubacin de la preparacin con glucosidasas especficas con el fin de hidrolizar estos carbohidratos complejos. En este caso,
los sitios negativos corresponden a los sitios de las
glucoprotenas hidrolizadas y los sitios PAS positivos
correspondern a otras clases de glucoprotenas o a
glucgeno. Como control positivo se utilizan preparaciones microscpicas conocidas por poseer glucgeno (hgado, msculo) o glucoprotenas (membranas basales, glucocliz, glndulas mucosas).
16
Fig. 1-5. Reaccin de PAS. A. Fundamento, sitio de

la oxidacin con HIO4 (cabeza de flecha). B. Hgado
(PAS-hematoxilina) (mediano aumento). Ntense
los grumos de glucgeno (flecha). C. Preparacin
equivalente digerida previamente con amilasa.
Nota: Obsrvese que el reactivo de Schiff es el

mismo en la reaccin de Feulgen y en la tcnica de
PAS, pero el fundamento, los mecanismos de la
reaccin, la especificidad y los resultados en ambas
tcnicas son diferentes.
Colorantes metacromticos
Se denomina metacromasia a la tincin de algunos componentes de los tejidos de un color distinto
que el del colorante utilizado, en tanto que cuando
se tien del mismo color recibe el nombre de ortocromasia. Ciertos colorantes bsicos (catinicos)
tienen propiedades metacromticas; al colorante
metacromtico se unen los grupos sulfatos, carboxilos y fosfatos, que estn presentes en muchos proteoglucanos, cidos nucleicos y algunos lpidos.
Determinacin de una actividad

enzimtica
En este caso, se demuestran la presencia y la localizacin de un compuesto qumico mediante su actividad enzimtica. Usaremos como ejemplo la acti-
vidad de la fosfatasa cida (fig. 1-6). En una primera etapa, la preparacin microscpica se incuba en
un medio que contiene el sustrato de la enzima cuya actividad queremos demostrar (vase fig. 1-6,
glicerofosfato). En este caso, si la enzima fosfatasa
cida est contenida en las estructuras celulares en
estudio (lisosomas), acta sobre el sustrato presente en el medio de incubacin y lo hidroliza liberando las molculas de glicerol y de fosfato. Estos ltimos quedan localizados en el sitio de la enzima
donde se combina con iones plomo o calcio para
formar un producto insoluble (fosfato de plomo o
de calcio). ste es incoloro pero puede visualizarse
con el microscopio electrnico porque es denso a
los electrones. Para poder visualizar el producto de
la reaccin con el microscopio ptico es necesario
continuar la tcnica agregando sulfuro de amonio
al medio de incubacin, lo que produce un precipitado de color pardo (sulfuro de plomo) en el sitio
donde est localizada la enzima (vase fig. 1-6).
Se realiza un control negativo omitiendo el sustrato en el medio de incubacin o introduciendo un
inhibidor de la actividad enzimtica. El control positivo consiste en utilizar preparaciones que son conocidas por poseer actividad de fosfatasa cida. Por
ejemplo, lisosomas de macrfagos, de hgado, etc.
17
Fig. 1-6. Tcnica histoqumica para demostrar la actividad de fosfatasa cida.
Tcnicas inmunocitoqumicas
Los mtodos inmunocitoqumicos consisten en la
visualizacin de un componente celular (organoide,
macromolcula, etc.) mediante una reaccin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac). En este caso, el elemento en
estudio funciona como antgeno (Ag), mientras que
el anticuerpo (Ac) especfico se agrega a la preparacin donde se une con aqul. A su vez, el anticuerpo
debe estar unido a un marcador que permita su visualizacin mediante algn sistema ptico (fig. 1-7).
Sobre clulas y tejidos, los marcadores ms comunes
son colorantes fluorescentes, enzimas o partculas
electrondensas y su eleccin depende del tipo y procesamiento del material, de la finalidad del estudio y
de su observacin con microscopio ptico o con microscopio electrnico (vase fig. 1-7).
La unin entre antgeno y anticuerpo (unin eptope-paratope) se realiza mediante enlaces no covalentes relativamente dbiles. Esta caracterstica y la
gran especificidad del anticuerpo por su antgeno
hacen de este mecanismo una herramienta muy poderosa en biologa celular, ya que permite identificar y localizar molculas presentes en las clulas y
los tejidos usando los anticuerpos correspondientes
marcados adecuadamente. [Se recomienda estudiar
los conceptos inmunolgicos bsicos (vase cap. 8)
a fin de comprender mejor los fundamentos metodolgicos de estas tcnicas.]
Tcnica inmunocitoqumica directa

En este caso, el anticuerpo primario (que se une al
antgeno) est marcado y los marcadores usados se
pueden visualizar con microscopia ptica o electrnica (fig. 1-7 A). No es una tcnica muy utilizada, ya
que requiere que cada tipo de anticuerpo est unido
a un marcador en forma directa y permanente. Esta
tcnica fue reemplazada por las tcnicas indirectas,
que permiten utilizar el mismo anticuerpo secundario (marcado) para visualizar muchas clases de anticuerpos primarios, lo que tambin facilita el incremento de la marcacin (vase el siguiente apartado).
Tcnicas inmunocitoqumicas
indirectas
En este tipo de reaccin, el anticuerpo primario
no est marcado. En consecuencia, para poder
visualizar la reaccin, se utiliza un anticuerpo secundario, que es un anticuerpo antianticuerpo (antiinmunoglobulina), que est marcado y permite
visualizar el complejo Ag-Ac-Ac (vase fig. 1-7 B).
Diferencias entre tcnica directa

y tcnicas indirectas
Para que un Ac reconozca y se pegue a un Ag,
ambos deben pertenecer a especies animales diferentes. Por ejemplo, en el caso de la tcnica directa, si
queremos detectar un Ag presente en eritrocitos de
ratn, tendremos que usar un Ac de conejo, antieritrocito de ratn, marcado. En el caso de la tcnica
indirecta podremos usar el mismo sistema sin marcador (Ac de conejo, antieritrocito de ratn) y,
posteriormente, agregar un Ac secundario de cabra, antiinmunoglobulina de conejo, marcado. El
18
Fig. 1-7. Esquema de los mtodos inmunocitoqumicos directos (A) e indirectos (B y C).
uso de un Ac secundario en las tcnicas indirectas

tiene varias ventajas. Por una parte, permite utilizar
el mismo Ac secundario marcado, independientemente de la especificidad del Ac primario utilizado,
ya que la especificidad est determinada por el Ac
primario. Por otra parte, la introduccin del Ac secundario marcado aumenta la sensibilidad del mtodo, ya que pueden unirse ms molculas marcadas por cada molcula de Ag (comprense A y B de
la fig. 1-7).
En la figura 1-7 B se esquematiza el revelado del
complejo Ag-Ac primario mediante Ac secundarios
marcados con colorantes fluorescentes, radioistopos y oro coloidal. En los mtodos de revelado que
utilizan enzimas como marcadores (vase fig. 1-7 C,
peroxidasa) es necesario adicionar al medio de incubacin el sustrato de la enzima utilizada (vase fig.
1-7 C, H2O2), cuya actividad generalmente se manifiesta por la formacin de un producto coloreado
(vase fig. 1-7 C, sulfato de cobre).
Un mtodo inmunocitoqumico indirecto muy
sensible es el llamado peroxidasa-antiperoxidasa

(PAP) (vase fig. 1-8). Consiste en incubar el material
antignico con un Ac primario especfico, luego con
un Ac secundario (vase fig. 1-8, puente) y despus
con un Ac terciario marcado con el complejo PAP, seguido del revelado de la enzima. Debido a que el Ac
secundario acta como puente entre el Ac primario y
el terciario, es necesario que ambos, primario y terciario, se obtengan de la misma especie animal. Por
ejemplo, para detectar molculas de miosina (protena muscular) en msculo de ratn podremos utilizar
un Ac primario de conejo antimiosina de ratn, luego
un Ac secundario de cabra antiinmunoglobulina de
conejo y, por ltimo, un Ac terciario de conejo marcado con el complejo PAP (vase fig. 1-8).
En la aplicacin de las tcnicas de inmunomarcacin existen dos tipos principales de problemas:
1) La sobremarcacin, que consiste en una coloracin de fondo difusa (background) o de precipi-
19
Fig. 1-8. Esquema de un mtodo inmunocitoqumico indirecto y marcacin con el complejo peroxidasa-antiperoxidasa (PAP).
tado del marcador localizado fuera del sitio normal del antgeno que debemos visualizar. Este tipo de problema dificulta la interpretacin de la
inmunomarcacin y puede estar provocado por
la falta de especificidad del Ac primario o secundario, o por la movilizacin del Ag por fijacin
deficiente, o por solubilizacin del Ag, o por
reaccin cruzada con otras molculas antignicas que comparten eptopes similares.
2) La submarcacin, que es la marcacin escasa o ausente del Ag en tejidos en los cuales se conoce su
presencia. La causa, en general, es la destruccin
del Ag por un tratamiento indebido, o por fijacin
inadecuada, o utilizacin de concentraciones bajas del Ac, o tiempos de incubacin o temperatura inadecuados. Para reconocer y solucionar estos
inconvenientes deben realizarse controles adecuados y variaciones de las tcnicas, que son particulares para cada caso en estudio y cuyo detalle
excede los alcances de este libro.
La eleccin entre diferentes mtodos inmunocitoqumicos depende de muchos factores, como el ti-
po de Ag en estudio (mayor o menor labilidad frente a fijadores histolgicos, ubicacin dentro de la estructura en estudio, etc.), del equipamiento que se
ha de utilizar (microscopia ptica, de fluorescencia,
electrnica, etc.), de la disponibilidad de reactivos,
etc. Asimismo, el mtodo seleccionado ser directamente dependiente del trabajo o investigacin que
se desea realizar, por ejemplo, la determinacin de
la proliferacin celular (fig. 1-9). En el cuadro 1-3 se
sealan las ventajas y los inconvenientes de algunos mtodos de inmunomarcacin.
Por otra parte, existen mtodos de fluorescencia
que no utilizan anticuerpos marcados con fluorocromos, sino molculas que adquieren fluorescencia bajo alguna condicin biolgica, qumica o fsica. Por
ejemplo, un mtodo para evaluar la viabilidad celular se basa en la determinacin simultnea de clulas
vivas y muertas mediante marcadores que reconocen
dos parmetros de viabilidad celular: 1) la actividad
de esterasa intracelular con el reactivo calcena AM y
2) la integridad de la membrana celular con el reactivo etidio H-1. La calcena AM, que no es fluorescen-
20
Fig. 1-9. Cultivo celular con un mtodo inmunocitoqumico para evaluar la proliferacin celular. Se incuba el
cultivo con bromodesoxiuridina (BrdU), un anlogo de la
uridina que se incorpora al DNA durante la divisin celular y luego se demuestra su incorporacin mediante un
anticuerpo primario anti-BrdU y un anticuerpo secundario marcado con un fluorocromo (fluorescena = verde).
Se determina la proporcin de clulas en proliferacin
mediante la expresin clulas marcadas/total de clulas. Se observan figuras de mitosis (flechas).
te, penetra en clulas vivas y es convertida, por la actividad de la esterasa mitocondrial, en el colorante
polianinico calcena, que es retenido por las clulas
vivas y fluoresce intensamente en color verde (vase
fig. 1-10). Por su parte, el etidio H-1 no penetra la
membrana plasmtica de clulas vivas, pero penetra
Fig. 1-10. Cultivo celular con un mtodo de fluorescencia

para evaluar la viabilidad celular. Pueden observarse clulas vivas (verdes) y muertas (rojas) luego del mtodo de
calcena-etidio. Un control positivo (recuadro) muestra todas clulas muertas luego del tratamiento con un txico.
la membrana daada de las clulas muertas y aumenta 40 veces su fluorescencia al unirse con los cidos nucleicos, con una seal fluorescente de color rojo (fig. 1-10).
Microscopias
Microscopio ptico
El microscopio ptico (MO) (microscopio de luz
visible, microscopio fotnico o microscopio de
campo claro) est compuesto por un estativo o par-
Cuadro 1-3. Ventajas y desventajas de algunos mtodos de inmunomarcacin

Inmunofluorescencia
Inmunoperoxidasa
Inmunorradiografa
Sensibilidad buena
Sensibilidad buena
Sensibilidad muy buena
Se aplica usualmente en tejidos frescos o fijados y congelados
Puede aplicarse sobre tejidos

incluidos en parafina
Se aplica sobre tejidos frescos o

incluidos en parafina o resina
Buena conservacin de la morfologa
Excelente conservacin de la
morfologa
Excelente conservacin de la
morfologa
Lbil conservacin de la marcacin
Conservacin indefinida de la
marcacin
Conservacin indefinida de la
marcacin
Utiliza microscopia de fluorescencia
Utiliza microscopia ptica convencional
Utiliza microscopia ptica convencional
Buena definicin de Ag extracelulares

e intracelulares
Mala localizacin de Ag extracelulares y buena de Ag intracelulares
Buena localizacin de Ag extracelulares e intracelulares
21
Fig. 1-11. Esquema de un microscopio ptico comn.
te mecnica (fig. 1-11, lado izquierdo) y por un sistema ptico (fig. 1-11, lado derecho).
A travs del sistema ptico se refractan los rayos
luminosos provenientes del objeto en estudio para
proporcionar una imagen final de mayor tamao, invertida y virtual (fig. 1-12). Para lograr este resultado, el objeto en estudio debe ser transparente y poseer contraste para poder discriminar sus distintos
componentes. Como mencionamos en el apartado
Tcnica citohistolgica, la transparencia se logra en
parte con cortes muy delgados del material en estudio (figs. 1-3 a 1-5) o mediante el estudio de extendidos celulares o bien con cultivos de clulas aisladas (figs. 1-9, 1-10 y 1-15). El contraste adecuado se
alcanza por medio de diferentes tipos de coloraciones o mediante sistemas pticos particulares (fig. 115) (p. ej., microscopio de contraste de fase o microscopio de interferencia).
Los siguientes conceptos referidos a un sistema
ptico son muy importantes para conocer el funcionamiento y el uso correcto del microscopio.
Poder de resolucin
El poder de resolucin (PR) es la capacidad pa-
ra distinguir los ms finos detalles de las estructuras en estudio; o sea, dar imgenes distintas (separadas) de dos puntos situados muy cerca entre s
en el objeto de estudio. Esta caracterstica depende de la longitud de onda de la radiacin utilizada () y de la abertura numrica (AN) de la lente.
Esta ltima depende a su vez del ndice de refraccin del medio que atraviesa la radiacin () y del
seno del semingulo de abertura de la lente ()
(cuadro 1-4).
AN = sen
Se denomina ngulo de abertura al limitado por
los rayos ms perifricos del cono de luz que penetra en una lente.
El PR es directamente proporcional a la AN. As,
un objetivo con mayor AN tendr mayor PR que un
objetivo con menor AN.
El PR es inversamente proporcional a la longitud de onda (). Si utilizamos una fuente de
radiacin con una longitud corta (p. ej., luz ultravioleta o electrones), el PR ser mayor (vase fundamentos del microscopio electrnico, ms adelante).
22
Lmite de resolucin
Esta propiedad deriva del concepto anterior. El lmite de resolucin (LR) es la distancia mnima que
separa dos puntos para poder ser discriminados como tales (o el objeto ms pequeo que puede ser visualizado). Es la inversa del poder de resolucin y
depende principalmente de la longitud de onda ()
utilizada.
LR =
0,61
AN
El LR para:
el ojo humano = 0,1 mm
el microscopio ptico = 0,2 m
el microscopio electrnico = 2 a 10 .
En general, un tipo de luz no puede emplearse
para resolver estructuras ms pequeas que su
propia longitud de onda. As, el LR del MO est
dado por la longitud de onda de la luz visible, que
va desde 400 nm (violeta) hasta 700 nm (rojo). En
trminos prcticos, una bacteria y una mitocondria son los objetos ms pequeos que pueden ser
visualizados claramente en este tipo de microscopio (fig. 1-13).
Poder de penetracin
Es el que permite observar diferentes planos de la
preparacin en una misma posicin del enfoque. Es
inversamente proporcional a la AN y a la magnificacin de la lente.
Poder de definicin
Es la capacidad de dar imgenes claras de contornos ntidos.
Distancia focal
Es la distancia entre el centro ptico de una lente
y el foco donde se renen todos los rayos luminosos
que la atraviesan.
Distancia frontal
Es la distancia entre la preparacin microscpica y
la lente inferior del objetivo. Nota: Debe recordarse
que en los objetivos de inmersin, esta distancia es
de apenas 0,1 mm. precaucin, al hacer en enfoque
a mayor aumento! (vase fig. 1-12).
Objetivos secos
Son objetivos que se utilizan con interposicin de
aire entre la preparacin y el objetivo (3, 10, 20,
40). Precaucin! No usar aceite de inmersin!
Objetivos de inmersin
Son objetivos que se utilizan interponiendo una
delgada capa de aceite entre la preparacin y el objetivo (40, 60, 100). Tienen el propsito de lograr
un mayor aprovechamiento de los rayos luminosos
perifricos. Nota: Debe recordarse que en los objetivos de inmersin, esta distancia es de apenas 0,1
mm. Precaucin al hacer en enfoque a mayor aumento! (vase fig. 1-12).
Magnificacin o aumentos
Se calcula multiplicando los aumentos correspondientes a los sistemas pticos empleados (ocular
objetivo). Es directamente proporcional a la AN,
aunque no es necesariamente proporcional al PR
(cuadro 1-5).
Fig. 1-12. Formacin de la imagen en el microscopio y en la retina del observador.
23
Cuadro 1-4. Valores para el clculo del poder de resolucin

Valor mximo del seno de
= 0,1
Valor mximo del ndice de refraccin
= 1,6
Longitud de onda () de la radiacin:

infrarroja
roja
anaranjada
amarilla
blanca
verde
azul
ndigo
violeta
ultravioleta
rayos X
electrones
700 nm
= 700 nm
= 610 nm
= 565 nm
= 550 nm
= 515 nm
= 463 nm
= 428 nm
= 400 nm
400 nm
= 1 nm
= 0,005 nm
El MO es adecuado para estudiar clulas y tejidos

previamente fijados y coloreados. Como ya vimos,
la coloracin de las preparaciones citohistolgicas
tiene por objeto provocar la absorcin diferencial de
la luz, con el propsito de visualizar las diversas estructuras con colores distintos. Esa diferente capacidad de absorcin produce modificaciones en la amplitud (intensidad) de la onda luminosa (fig.1-14 AC). Cuanto ms absorbente sea el material en estudio, menor ser la amplitud (intensidad) de la onda
luminosa que lo atraviesa y la resultante ser la visualizacin de colores diferentes.
Por otra parte, para estudiar clulas u organismos
vivos, a los cuales no es posible colorear, es necesario recurrir a otros sistemas pticos, como el microscopio de contraste de fase o el microscopio de
interferencia. En estos casos, se aprovecha una caracterstica propia de los diferentes componentes
celulares que, aun siendo transparentes a la luz, poseen distintas densidades relativas; es decir, diferente concentracin de materia por unidad de volumen. As, los materiales que tienen distintos ndices
de refraccin permiten diferentes velocidades de las
ondas de luz que los atraviesan (vase fig. 1-14 A, B,
D-G). Cuanto mayor es la densidad de una estructura, mayor es su ndice de refraccin y menor la
velocidad de la luz que la atraviesa; es decir, las ondas de luz se retardan y cambian de fase. Con el
MO comn no es posible discriminar pequeas diferencias en los ndices de refraccin o absorcin en
las estructuras celulares no coloreadas. En cambio,
los MO de contraste de fase y de interferencia estn
diseados para utilizar las caractersticas pticas
mencionadas y traducirlas en imgenes con grados
visibles y diferenciales de contraste y brillo (fig. 115).
Fig. 1-13. Escala y tamao de objetos que pueden visualizarse con diferentes pticas.
24
ciones extremas proporciona una imagen final con

una gama de grises (distintas intensidades), que refleja las diferentes densidades e ndices de refraccin de la preparacin estudiada (vase fig. 1-15).
En sntesis, la funcin del microscopio de contraste
de fase es combinar las ondas desfasadas y convertir las diferencias de fase en diferencias de amplitud
(intensidad luminosa) a fin de poder detectar detalles en materiales no coloreados, por ejemplo, en clulas vivas, mantenidas o cultivadas in vitro.
Microscopio de contraste por

interferencia diferencial
Fig. 1-14. Esquema del paso de ondas luminosas a travs

de una clula coloreada (A, B, C) y una clula no coloreada (F, G). Se sealan ondas luminosas que atraviesan: 1)
medios homogneos (A, D, E); 2) medios con mayor ndice de refraccin y no absorbentes (= retardo de fase) (B,
F, G) y 3) medio con mayor ndice de refraccin y absorbente (= retardo de fase y disminucin de la amplitud o
intensidad) (C). Cuando colisionan ondas que estn en la
misma fase (D y E) se produce una interferencia constructiva con aumento de intensidad luminosa (D + E =
H). Por el contrario, si las ondas estn desfasadas, se produce una interferencia destructiva con disminucin de
la intensidad (F + G = I) y sta es la base del principio de
la microscopia de contraste de fase.
El microscopio de contraste por interferencia diferencial (DIC) posee un polarizador que filtra la luz
que vibra en un solo plano y un juego de prismas especiales. Uno de ellos, ubicado cerca del condensador
o sobre l, desdobla el rayo incidente en dos componentes (dos ondas) que atraviesan la muestra. Los dos
rayos luego son combinados nuevamente por un segundo prisma que los hace interferir para formar una
imagen de aspecto tridimensional. Este microscopio
fue diseado para observar relieves en superficie de
especmenes voluminosos, o difciles de manejar o
muy gruesos como para ser observados con el microscopio de contraste de fase. Con el microscopio de
interferencia tambin se pueden cuantificar los cambios de ndices de refraccin. Como la densidad ptica y el retardo de fase del haz luminoso son proporcionales a la masa de la muestra, es posible obtener
datos cuantitativos de componentes celulares mediante la comparacin de un haz luminoso de referencia con las ondas de fase retardadas. Adems, es
posible traducir los cambios de fase como cambios de
color y as se obtienen imgenes de clulas vivas y
coloreadas por medios pticos.
Microscopio de contraste de fase
Microscopio de fondo oscuro
Es un MO de luz visible que posee diafragmas

anulares en los sistemas pticos del objetivo (fig. 116 a) y del condensador (vase fig. 1-16 b) que modifican (aceleran o retardan) los rayos luminosos
perifricos con respecto a los centrales que atraviesan el objeto (vase fig. 1-16). La imagen final recibida por el ocular (vase fig. 1-16 c) depende del
efecto de interferencia entre la imagen directa dada
por los rayos centrales (no modificados) (vase fig.
1-16 A) y la imagen proporcionada por los rayos
ms perifricos (acelerados o retrasados) (vase fig.
1-16 B). Si ambos conjuntos de rayos luminosos estn en fase, se suman y el objeto aparece ms brillante que el medio que lo rodea (vase fig. 1-14 D + E
= H); pero si ambos rayos estn fuera de fase, las ondas se anulan y el objeto se ver ms oscuro (vase
fig. 1-14 F + G = I). Las variaciones entre estas situa-
Se basa en la dispersin de la luz que provocan

estructuras que pueden estar por debajo del lmite
de resolucin o en el lmite de estructuras con diferente ndice de refraccin. Esto se logra con un condensador que slo permite iluminar la preparacin
en forma muy oblicua (fig. 1-17). As, los componentes celulares se observan brillantes por la dispersin de la luz (vase fig. 1-17 B) sobre un fondo
negro, ya que la luz que no incide sobre las estructuras estudiadas no entra en el objetivo (vase fig.
1-17 A). Este microscopio, aunque no permite visualizar los detalles estructurales, permite resolver
partculas ms pequeas que las observadas con el
microscopio comn de campo claro. El efecto ptico es semejante a la visualizacin de las pequeas
partculas que flotan en el aire de una habitacin oscura donde entra un delgado rayo luminoso.
25
Cuadro 1-5. Niveles microscpicos en biologa

Unidad de medida
milmetro (mm)
Micrmetro (m)
Valor de la unidad
10-3 m
10-6 m
Mtodo de estudio
Estructura visualizada
Ojo
rganos. Tejidos
Lupa
Clulas grandes
Microscopias pticas
Tejidos. Clulas
Organoides grandes
Nanmetro (nm)
10-9 m
Microscopia electrnica
Componentes subcelulares
Microscopia de polarizacin
Virus
Macromolculas
Angstrm ()
10-10 m
Microscopia electrnica
Estructura molecular
Difraccin de rayos X
Estructura atmica
Microscopia de efecto tnel
Microscopio de polarizacin
Tambin es un microscopio ptico de luz visible,
pero se basa en el uso de luz polarizada y permite
obtener informacin acerca del ordenamiento de las
molculas del objeto estudiado. Los materiales que
poseen el mismo ndice de refraccin en todas las
direcciones se denominan isotrpicos porque no
poseen una disposicin regular u ordenada de sus
constituyentes y la luz polarizada los atraviesa a la
misma velocidad cualquiera que sea la direccin
del plano de incidencia. Por el contrario, un mate-
rial es anisotrpico o birrefringente cuando la disposicin ordenada de sus componentes en un plano

definido hace que la velocidad de la luz polarizada
difiera segn la direccin del plano de vibracin de
la onda luminosa. En este ltimo caso, las estructuras en estudio presentan diferentes ndices de refraccin que corresponden a las diferentes velocidades de transmisin de la luz que, a su vez, depende
de la disposicin molecular de sus componentes.
Para que puedan observarse estas caractersticas en
las preparaciones citohistolgicas, este tipo de microscopio posee un cristal polarizador en la zona del
Fig. 1-15. Cultivo primario de clulas neurales con microscopia de contraste de fase. Se observan clulas de diferentes
formas y tamaos que reflejan la distinta adhesividad al sustrato; algunas presentan filopodios o proyecciones perifricas que indican motilidad celular (flechas) y otras estn en proceso de divisin (cabezas de flecha).
26
Fig. 1-17. Esquema simplificado de la trayectoria de la

luz en un microscopio de fondo oscuro (vase explicacin en el texto).
Fig. 1-16. Esquema simplificado de la trayectoria de la luz
en un microscopio de contraste de fase. El anillo de fase (a)
del objetivo es fijo y el diafragma anular del condensador
(b) es mvil y se deben hacer coincidir al alinear el microscopio, tal como se muestra en la imagen del campo ptico
alineado a nivel del ocular (c). A. Rayos no modificados. B.
Rayos modificados (vase explicacin en el texto).
lo esqueltico, el huso mittico, las estructuras cristalinas, etc.) se observan ms brillantes o ms oscuras
(birrefringencia) que aquellas cuyos componentes se
disponen al azar y ms desordenados.
Microscopio de fluorescencia
condensador que se encarga de uniformar en un solo plano del espacio las vibraciones de la onda de luz
que luego atraviesa la preparacin en estudio. Tambin tiene un cristal analizador, montado sobre el
objetivo, que al ser rotado alrededor del eje ptico
permite estudiar la orientacin de los rayos luminosos provenientes de la fuente y la muestra. En una
muestra observada con este microscopio, las zonas
cuya disposicin macromolecular es regular y muy
ordenada (p. ej., las bandas transversales del mscu-
Este microscopio posee el estativo mecnico y los

componentes bsicos similares a un microscopio
ptico comn, pero en vez de luz blanca utiliza luz
ultravioleta y filtros que producen la excitacin de
la radiacin en ciertas longitudes de onda que dependen de los componentes de la muestra en estudio o de los colorantes fluorescentes utilizados.
Aunque ciertos componentes biolgicos poseen autofluorescencia (p. ej., la vitamina A), este microscopio se usa con ms frecuencia para estudiar materiales previamente marcados con colorantes como
27
Fig. 1-18. Fundamento de la microscopia TIRF.
la fluorescena (fluorescencia verde), la rodamina

(fluorescencia roja) o el colorante de Hoechst (fluorescencia azul). Como ya se mencion, la marcacin
de anticuerpos con colorantes fluorescentes es un
mtodo muy utilizado para identificar y localizar
diferentes tipos de molculas mediante las tcnicas
inmunocitoqumicas (vase fig. 1-9), aunque tambin existen mtodos que no utilizan anticuerpos
marcados con fluorocromos, sino molculas que adquieren fluorescencia en respuesta a cambios qumicos, fsicos o biolgicos (vase fig. 1-10).
Microscopio lser confocalizado

Es un tipo de microscopio ptico de fluorescencia
que incluye una fuente de emisin de luz lser. Debido a un sistema ptico particular y a las caractersticas fsicas de la radiacin lser, se pueden localizar con gran precisin estructuras subcelulares
marcadas con colorantes fluorescentes y con muy
baja o nula coloracin de fondo (background). Adems, las imgenes se integran y se analizan en un
sistema computarizado que permite realizar la reconstruccin tridimensional del objeto estudiado a
partir de los cortes pticos seriados del espcimen, as
como mltiples anlisis cualitativos y cuantitativos
de las preparaciones estudiadas.
Microscopio TIRF (total internal

reflection fluorescence)
Este microscopio fue diseado para el estudio de
clulas en un medio acuoso y en el que el portaobjetos sobre el cual se encuentran tiene un ndice de
refraccin mayor que ese medio. Si se ilumina la
muestra desde abajo con un haz de luz lser que incida con cierto ngulo, toda la luz que pasa por el
portaobjetos se refleja y no atraviesa la muestra debido a las diferencias en los ndices de refraccin.
Sin embargo, la luz que llega hasta la vecindad de
la muestra es capaz de generar un campo electro-
magntico que se propaga en ese medio de menor

ndice de refraccin. Este campo decae a medida
que se aleja de la preparacin, por lo que se denomina campo evanescente. El resultado es la excitacin del fluorocromo en una capa muy delgada,
de unos 100 nm, que corresponden a la regin ms
prxima al portaobjetos (fig. 1-18). Este microscopio
se aplica al estudio de los puntos de contacto entre
una clula y el sustrato, o a los procesos dinmicos
que ocurren entre membranas y vesculas, en clulas vivas, ya que este tipo de microscopia no funciona bien con material fijado y montado porque los
medios de montaje poseen un ndice de refraccin
similar al de los materiales de soporte.
Microscopio de dos fotones

Se basa sobre la estimulacin de un fluorocromo
de modo simultneo por dos fotones. La energa de
ambos fotones se suma y juntos son capaces de estimular del mismo modo que lo hara un solo fotn
con el doble de energa (doble de frecuencia). La
tecnologa multifotn ofrece varias ventajas para el
estudio de muestras biolgicas:
1. Excitacin de la muestra en un nico punto, ya que
slo se excita el punto donde convergen los pares de fotones en el plano focal. El resto de la
muestra, al no ser estimulada, no emite nuevos
fotones por lo que no es preciso eliminar la luz
de las zonas fuera de foco, responsable del background.
2. Posibilidad de excitar fluorocromos con un rango de
excitacin con longitud de onda menor que la
fuente de luz, por absorcin simultnea de dos o
ms fotones. Al absorberse dos fotones, la excitacin que se consigue es equivalente a la de un solo fotn con una frecuencia doble. En la prctica,
esto nos permite excitar con infrarrojo fluorocromos que slo son posibles de excitar en el ultravioleta.
3. Alta capacidad de penetracin de los fotones, lo que
28
Fig. 1-19. Esquemas comparativos de microscopios ptico (A), electrnico de transmisin (B) y electrnico de barrido (C).
es ideal para estudiar muestras gruesas como

embriones enteros vivos. A diferencia del sistema microscpico convencional, no es preciso
cortar las muestras ya que se puede estudiar un
trozo de tejido excitando slo una zona.
4. Menor dao de la muestra, dado que al estimularse
slo en el plano focal no se daa el resto de la
muestra. Uno de los principales objetivos de los
estudios de microscopa in vivo es capturar imgenes con alta penetracin y dao mnimo de la
muestra por fototoxicidad. Esto es especialmente
importante cuando el material que se estudia son
embriones que luego deben ser reimplantados.
Nota: El microscopio lser confocalizado, el microscopio TIRF (total internal reflection fluorescence),
el microscopio de dos fotones, el microscopio de
efecto tnel y otros de tecnologa muy avanzada
que brindan informacin estructural y funcional a
nivel molecular y atmico no son actualmente de
uso comn en la prctica microscpica convencio-
nal o cotidiana, ni en cualquier centro biomdico de

tipo asistencial. Sin embargo, estos y otros tipos de
microscopios se utilizan en laboratorios de investigacin biolgica en diferentes partes del mundo y
forman parte de la tecnologa que proporciona el
caudal de conocimientos que el profesional del rea
de la salud (aunque no lo practique en forma personal) no puede dejar de conocer conceptualmente.
Microscopio electrnico
de transmisin
El microscopio electrnico de transmisin (MET)
posee los componentes bsicos equivalentes al microscopio ptico (fig. 1-19 A, B), pero en lugar de una
fuente de luz utiliza un tubo de radiacin de electrones y en vez de lentes de cristal posee lentes o bobinas electromagnticas. Los electrones, que en el vaco se desplazan en lnea recta, son desviados por las
bobinas de una manera similar a la refraccin que
29
Fig. 1-20 A. Clulas epiteliales de rin (dominio basolateral) y fibroblasto de la estroma con microscopia electrnica
de transmisin. Ntense los ncleos con cromatina laxa (CL), cromatina condensada (CC) y la membrana basal (flecha). B. Membrana basal de tubos colectores, asas de Henle y capilares (flechas) se marcan con la tcnica de PAS por
su contenido en glucoprotenas.
producen las lentes pticas sobre los rayos luminosos. Luego de emitirse desde un tubo de rayos catdicos a un voltaje de 50.000 a 100.000 voltios, los electrones se concentran por accin de una bobina condensadora sobre la muestra en estudio (vase fig. 119 B), donde chocan y cambian de direccin segn la
electrodensidad de las partculas que componen la
muestra. Cuanto mayor es el nmero atmico de los
componentes de la muestra, mayor ser la dispersin de los electrones. Como la mayor parte de los
tomos que forman las estructuras biolgicas poseen
un nmero atmico bajo, se deben utilizar tomos
pesados (Os, Pb, Au, U, etc.), como colorantes electrondensos que desvan mucho los electrones y proporcionan densidad a las diferentes estructuras celulares. Luego de atravesar la muestra, los electrones
son concentrados por una bobina colectora y proyectados sobre una pantalla fluorescente o pelcula
fotogrfica, donde se forma la imagen y se efecta el
estudio (vase fig. 1-19 B). Las zonas o estructuras
que por su densidad dispersan ms a los electrones
se observan como reas oscuras en la pantalla o pelcula fotogrfica (fig. 1-20 A). Al contrario de lo que
ocurre en la microscopia ptica, los haces de electrones no son visibles directamente por el ojo, por lo
que se debe efectuar el estudio directamente sobre la
pantalla fluorescente, sobre la fotografa o sobre un
monitor.
En un trabajo de rutina de MET en biologa celular, como ejemplo indicativo, se trabaja normalmente hasta unos 30.000 a 50.000 aumentos directos sobre la pantalla. En trabajos a alta resolucin (estudio de las partculas que componen organoides, estructura de membrana, etc,) se suele trabajar con
hasta 100.000 a 200.000 aumentos directos y se puede llegar al milln de aumentos. Adems, por ampliacin fotogrfica la imagen se puede incrementar
5 veces o ms y llegar a aumentos reales del orden
de los 10 millones o ms. En este orden de aumentos se debe trabajar con una tcnica muy depurada
en la preparacin del material y contar con suficiente experiencia en la interpretacin de los datos estructurales, ya que en muchos casos resulta difcil
discriminar entre estructuras reales o artefactos de
la tcnica.
Es importante considerar que la posibilidad de lograr aumentos importantes en MET depende de la
corta longitud de onda de los electrones (vanse los
apartados Poder de resolucin y Lmite de resolucin). Como ya mencionamos, dos objetos se ven
separados cuando la distancia entre ellos es mayor
que la mitad de la longitud de onda empleada para
su estudio. Por ejemplo, la longitud de onda de la
luz blanca (de unos 550 nm), establece un lmite de
resolucin para el MO de unos 0,2 m. Como la longitud de onda de los electrones es muy pequea
(0,005 nm), el lmite de resolucin del MET se sita
entre los 2 y los 10 , lo cual es tericamente suficiente para visualizar la mayor parte de las macromolculas biolgicas cuyas dimensiones estn en el
orden de los 10 a los 100 .
de transmisin de alto voltaje
Es un MET que utiliza emisiones de electrones
acelerados a varios millones de voltios, lo que permi-
30
cundaria de rayos X, con lo cual se pueden detectar

la concentracin y la distribucin de diferentes elementos qumicos de la muestra.
BIBLIOGRAFA
Fig. 1-21. Cultivo primario de clulas neurales con microscopia electrnica de barrido. Comprese con la preparacin equivalente de la figura 1-15; se observan clulas de diferentes formas y tamaos; algunas con proyecciones perifricas que indican motilidad celular (flechas)
y otras en proceso de divisin (A, B, C).
te penetrar cortes muy gruesos y estudiar la estructura tridimensional de los componentes subcelulares dado que posee un enorme poder de resolucin
y penetracin. Con este instrumento se pueden hacer estudios sobre clulas enteras cultivadas, lo que
permite discriminar mejor las relaciones e interacciones entre los diferentes organoides que en materiales seccionados.
de barrido
El microscopio electrnico de barrido (MEB) permite observar la superficie de especmenes gruesos y de
organismos enteros que no se podran estudiar con el
MET. Para ello, el haz electrnico no atraviesa la
muestra, sino que realiza un barrido por toda la superficie del material en estudio (vase fig. 1-19 C). Este impacto de los electrones primarios sobre el espcimen produce la emisin de electrones secundarios
y, con dependencia de la geometra de la superficie
del espcimen, son captados por un detector, integrados y proyectados en la pantalla de un monitor (vase fig. 1-19 C). Es decir, construye una imagen basada sobre el grado y la direccin de la dispersin de
electrones secundarios, que vara de acuerdo con las
diferentes caractersticas geomtricas y la opacidad
electrnica de la muestra. El resultado final es una
imagen tridimensional con elevado poder de resolucin (fig. 1-21). Adems, con adaptaciones del mismo
equipo denominados detectores de sondas electrnicas es posible realizar el anlisis de la emisin se-
LECTURAS
ADICIONALES
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31
http://www.e-histologia.unileon.es/1inicio/home/tecnicas.htm
http://www.conocimientosweb.net/dcmt/ficha509.html
http://www.unich.it/offerta/perfez2005/locandina_microscopia.pdf
http://es.wikipedia.org/wiki/Microscop%C3%ADa
http://www.monografias.com/trabajos7/micro/micro.shtml
AUTOEVALUACIN
Seale la nica opcin de respuesta correcta
1. La teora celular sostiene que:
a) Las clulas son las unidades morfolgicas y fisiolgicas de todos los organismos vivientes.
b) Las clulas se originan slo de otras clulas y su
continuidad depende de su material gentico.
c) Las propiedades de un organismo depende de las
de sus clulas individuales.
d) Todo lo anterior es correcto.
2. Seale una de las opciones que caracterizan
slo a los seres vivos:
a) cidos nucleicos.
b) Compuestos de nitrgeno.
c) Compuestos de carbono.
d) Agua.
3. Es caracterstico de las clulas eucariontes:
a) Tener ncleos organizados.
b) Tener DNA circular.
c) No tener nuclolos.
d) Nada de lo anterior.
4. Los componentes basfilos de la clula son:
a) DNA y RNA.
b) RNA y mitocondrias.
c) REL.
d) Nuclolo y aparato de Golgi.
5. Seale cul de las siguientes alternativas se
debe usar para observar el DNA de clulas de
ratn:
a) Tcnica de PAS.
b) Tcnica inmunocitoqumica directa con anticuerpo
de ratn anti-RNA de conejo.
c) Tcnica de Feulgen.
d) Tcnica inmunocitoqumica con anticuerpo de cabra
antitubulina de ratn.
6. El grosor habitual de un corte para MET es:
a) Mayor que el de la membrana plasmtica y menor
que el dimetro de una clula vegetal.
b) Menor que el grosor de un corte para MO y mayor
que el dimetro de una mitocondria.
c) Aproximadamente igual al dimetro del ncleo.

d) Nada de lo anterior.
7. El lmite de resolucin de un sistema ptico es:
a) La distancia entre el objetivo y la preparacin.
b) La distancia mnima que separa dos puntos que
pueden ser discriminados como tales.
c) La capacidad de dar imgenes claras.
d) La distancia entre el centro de una lente y el punto
donde se renen todos los rayos de luz.
8. Marque la opcin correcta:
a) El ncleo celular est rodeado por una membrana
bilipdica.
b) La envoltura nuclear posee poros de 5 m de dimetro.
c) La envoltura nuclear est formada por dos membranas.
d) El ncleo celular est rodeado por una envoltura
de doble membrana que se contina con el nuclolo.
9. El poder de resolucin de un microscopio ptico es:
a) Mayor que el de un microscopio electrnico de
transmisin.
b) Menor que el de un microscopio de fluorescencia.
c) Menor que el de un microscopio electrnico de barrido.
d) Mayor que el de un microscopio de contraste de interferencia.
10. Indique el tipo de microscopio necesario para
ver un componente de la envoltura nuclear
utilizando un anticuerpo secundario conjugado
con oro coloidal:
a) Microscopio de contraste de fase.
b) Microscopio electrnico de transmisin.
c) Microscopio de fluorescencia con el filtro de excitacin / anlisis para fluorescena.
d) Microscopio de fluorescencia con el filtro de excitacin / anlisis para rodamina.
32
Indique si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas. En las falsas

subraye el(los) elemento(s) errneo(s)
1. Las clulas de un organismo pluricelular, aunque contienen el mismo DNA, pueden ser muy diferentes,
ya que utilizan la informacin gentica para dirigir
sus actividades bioqumicas segn las seales que
reciben de su medio ambiente.
V F
2. El ncleo es el organoide ms importante en la mayora de las clulas vegetales y animales, porque contiene la informacin gentica del organismo, almacenada en las molculas de RNA; los otros componentes
de las clula constituyen el citoplasma.
V F
3. Las clulas vivas estn compuestas principalmente
por un nmero limitado de elementos, cuatro de los
cuales (C, H, S, Fe) componen en conjunto el 96,5%
de su masa.
V F
4. Los organismos vivos contienen un conjunto caracterstico y restringido de pequeas molculas complejas, basadas en el carbono, que son esencialmente
iguales en todas las especies vivas; ellas son los azcares, los cidos grasos, los aminocidos y los nucletidos.
V F
5. Muchos miles de protenas en una clula eucarionte tpica son reguladas por ciclos de fosforilacin y desfosforilacin, o mediante la unin e hidrlisis de GTP
por una protena fijadora de GTP.
V F
6. Los cromosomas de clulas eucariontes consisten en
DNA estrechamente unido a una masa casi igual de
protenas especializadas, cuya funcin es plegar el
RNA en una forma laxa de modo que pueda caber en
7.
8.
9.
10.
el ncleo celular; este complejo de DNA + protena de

los cromosomas se llama carioteca.
V F
El flujo de la informacin gentica en todas la clulas
vivas es DNA > RNA > protena y la conversin de las
instrucciones genticas de DNA hacia RNA y protenas
se denomina expresin gnica.
V F
En el DNA de la clula eucarionte, la mayor parte de
los genes est constituida por pequeas regiones
(exones) intercaladas con regiones no codificantes
(intrones). Cuando un gen procarionte es transcrito
del DNA al RNA, los exones y los intrones son copiados.
V F
La traduccin de la secuencia de nucletidos del mRNA en protenas tiene lugar en el ncleo sobre grandes ribonucleoprotenas ensambladas denominadas
ribosomas. Se unen al mRNA y se desplazan paso a
paso a lo largo de la cadena de mRNA traduciendo el
mensaje a protena.
V F
La mayora de las protenas de los organoides se elaboran en el citosol y se transportan hacia el interior
del organoide donde funcionan; las seales para su
distribucin son determinadas por la secuencia de
aminocidos, que guan a las protenas hacia el organoide correspondiente, mientras que las protenas
que actan en el citosol poseen seales determinadas
por la secuencia de nucletidos y permanecen donde
se fabrican.
V F

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PARTE I

E n el estudio inicial de la clula con frecuencia nos preguntamos sobre el origen

Parte I - Un enfoque evolutivo de la clula

mos lejos de la protoclula. Para que ella pudiera

DE LOS PROCARIONTES A LOS

Parte I - Un enfoque evolutivo de la clula

diferentes componentes moleculares que cumplen

interacciones entre las clulas procariontes y las clulas eucariontes.

Parte I - Un enfoque evolutivo de la clula

Cuadro I-1. Caractersticas diferenciales entre clulas procariontes y clulas eucariontes

Protistas, hongos, plantas y animales

DNA circular no asociado con

DNA lineal asociado con protenas en

Nucleoide sin membrana

Ncleo con membrana

Poco DNA repetitivo

Fisin, gemacin, no hay mitosis

Varias formas asociadas con mitosis

Separacin de cromosomas por

Separacin de cromosomas por arrastre

Fusin de genomas gamticos asociada con

RNA sntesis/procesado en ncleo

Numerosos tipos y variedades

Absorcin, ingestin, secrecin, fotosntesis.

Compleja, principalmente multicelulares, con

Citoesqueleto y motores moleculares

Endocitosis y exocitosis ausente

Flagelos simples en ciertas

Cilios y flagelos complejos

Parte I - Un enfoque evolutivo de la clula

medios de composiciones diversas y con frecuencia

travs de una o ms membranas, lo cual determina

Cuadro I-2. Diferencias en composicin qumica y volumen entre procariontes y eucariontes

Bacteria (E. coli)

Parte I - Un enfoque evolutivo de la clula

Parte I - Un enfoque evolutivo de la clula

seco de la superficie celular (vase cap. 5, figs. 5-2,

Parte I - Un enfoque evolutivo de la clula

res y cmo stas se organizan en estructuras ms

cional si se desconoce la estructura histolgica, as

Mtodos generales para el estudio

Mtodos generales para el estudio de las clulas y los tejidos

a tcnica citohistolgica es el conjunto de procedimientos aplicados para preservar la estructura y la

de un individuo vivo (biopsia) o muerto (necropsia).

Cuadro 1-1. Etapas de la tcnica histolgica*

Pequeo tamao (2-3 mm)

Bistur, hoja de afeitar

Detiene procesos vitales, evita la autlisis

Formol 10%, 12-24 h, vol. 40/1

Facilita la penetracin de solventes

Etanol en graduacin ascendente

Favorece la penetracin de la parafina

Otorga dureza para poder realizar cortes

Parafina (45 a 60 C), estufa

Preparacin del taco

Soporte para el montaje en el micrtomo

Bloque de madera o plstico

Permite la visualizacin de estructuras

Montaje del corte sobre un Soporte para su observacin al microscoportaobjetos

Facilita la penetracin del alcohol

Permite la penetracin de colorantes

Etanol en graduacin descendente

Otorga colores diferenciales a la muestra