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PROGRAMA NACIONAL DE CONTROL DE CALIDAD

EN BACTERIOLOGIA
INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

BOLETIN INFORMATIVO Nro. 5 OCTUBRE - 2012

COMENTARIOS ENCUESTA 44

Cepa N1: Proteus mirabilis


Esta cepa corresponda a un aislamiento de P. mirabilis aislado de orina de
un

paciente

de

sexo

femenino

con

infeccin

urinaria

baja

no

complicada. P. mirabilis es uno de los agentes ms frecuentes de infecciones


urinarias de la comunidad aunque tambin se lo puede asociar a infecciones
intrahospitalarias.

Este

microorganismo

es,

dentro

la

familia

Enterobacteriaceae, uno de los ms sensibles a los antibiticos -lactmicos,


probablemente por la gran permeabilidad de su membrana externa y por una
expresin prcticamente indetectable de su -lactamasa cromosmica. Por ello,
las cepas salvajes de P. mirabilis presentan sensibilidad incluso a ampicilina. La
resistencia a los antibiticos -lactmicos es casi siempre debida a la
adquisicin de distintas enzimas plasmdicas. Para esta cepa, el Laboratorio
Nacional de Referencia (LNR) recibi la respuesta de 377 laboratorios. El 97,4 %
(n=367) de los laboratorios informaron correctamente gnero y especie. Tabla
1.a

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

Tabla 1.a. Cepa 1: Concordancia en la Identificacin bioqumica.

Nueve laboratorios (2,4%) contestaron gnero correcto y especie incorrecta,


estos

informaron P. penneri (4), P. vulgaris (4) y P. mulieris (1). Slo un

laboratorio

inform

gnero

incorrecto

(Staphylococcus

epidermidis)

probablemente debido a una contaminacin accidental, por lo que este dato fue
retirado del anlisis global de pruebas de sensibilidad.
Con respecto a la sensibilidad, la Cepa 1 posee un mecanismo de resistencia
enzimtico a -lactmicos ya que es portadora de una -lactamasas tipo
AmpC de naturaleza plasmdica, perteneciente a la familia CIT/CMY.
Las -lactamasas tipo AmpC plasmdicas (BLAP) son enzimas de clase C de
Ambler y grupo 1 de Karen Bush y tienen su origen en las -lactamasas AmpC
cromosmicas propias de Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Morganella
morganii y Hafnia Alvei. En el caso de las enzimas de la familia CIT/CMY el
origen es C. freundii. Las BLAP, al igual que sus progenitores cromosmicos,
confieren un patrn caracterstico de resistencia a los antibiticos -lactmicos
que incluye: resistencia a amino, carboxi y ureidopenicilinas; cefalosporinas de
primera y segunda generacin y, en la mayora de los casos, resistencia a
cefamicinas (cefoxitina). La actividad in vitro sobre las cefalosporinas de tercera
generacin (C3G) y el aztreonam es variable. A diferencia de las -lactamasas
de espectro extendido (BLEE) ms frecuentes en nuestro pas (CTX-M y PER), las
BLAP tienen muy dbil actividad sobre cefalosporinas de cuarta generacin
(C4G). Los inhibidores clsicos de enzimas de clase A como c. clavulnico,
sulbactam y tazobactam tienen escaso poder inhibitorio sobre las BLAP, aunque
algunas pueden ser levemente inhibidas por sulbactam y tazobactam. Los
inhibidores por excelencia de estas enzimas son los compuestos derivados del
cido bornico y oxacilina o cloxacilina (Beesley y cols. Biochem J.17:316; 1982;
Yagi y cols. JCM, 43:2551; 2005).

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

El P. mirabilis enviado presenta resistencia neta a los antibticos -lactmicos


solicitados en la encuesta (ampicilina, ampicilina/sulbactam, cefalotina) y
sensibilidad a ciprofloxacina, trimetoprima/sulfametoxazol y gentamicina. Los
rangos de halos de inhibicin obtenidos en el LNR se muestran en la Tabla 1.b.
Tabla 1.b. Cepa 1: Rangos de referencia y resultados de interpretacin de las
zonas de inhibicin del LNR.
Antimicrobiano

Rango de referencia

Interpretacin

(mm)
Ampicilina

6-6

Resistente

Ampicilina/sulbactam

6-9

Resistente

Cefalotina

6-6

Resistente

31-41

Sensible

23-30

Sensible

19-25

Sensible

Ciprofloxacina
Trimetoprima/sulfametox
azol
Gentamicina

Con el envo de esta cepa se pretenda evaluar la capacidad de los laboratorios


participantes de sospechar y detectar mecanismos de resistencia a C3G
partiendo de los datos de un

antibiograma mnimo como es el que puede

utilizarse en aislamientos de bacilo gram negativos en muestras de infeccin


urinaria no complicada de la comunidad.
A nivel general no se observaron dificultades en la interpretacin de las pruebas
de sensibilidad de esta cepa. La concordancia global en la interpretacin fue
98.8%. Solo se detectaron 1,2% de errores en la interpretacin (27/2242), de los
cuales el 55,6% fueron errores menores (15/27), 25,9% muy graves (7/27) y
18,5% graves (5/27). Todos los errores menores y muy graves estuvieron
asociados a los datos de sensibilidad de ampicilina/sulbactam. En el resto de los
antimicrobianos no se observaron dificultades de interpretacin, excepto 5
errores graves en los antibiticos no -lactmicos (Tabla 1.c). Una explicacin
posible para los errores graves podra ser que en las lecturas de los halos de
inhibicin se haya tenido en cuenta el swarming (invasin superficial de los
halos de inhibicin), tpico del gnero Proteus (debemos recordar que ste no
debe ser tenido en cuenta en la determinacin del dimetro de inhibicin).

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Tabla 1.c. Cepa 1: Concordancia en la interpretacin de las zonas de inhibicin


entre los labs. del PCC-NAC y el LNR.

Ampicilina
Ampicilina/Sulbactam
Cefalotina
Ciprofloxacina
Trimetoprima/Sulfametox
azol
Gentamicina

N
Respuest
as
373
371
375
375

N
0
7
0
374

%
0
1,9
0
99,7

N
-15
---

%
-4
---

N
373
349
375
1

%
100
94,1
100
0,3

374
374

372
372

99,5
99,5

---

---

2
2

0,5
0,5

S: sensible, I: intermedio, R: resistente

Resultado correcto
Errores menores
Errores graves
Errores muy graves

Las zonas de inhibicin informadas se encontraron, en su mayora, dentro de los


rangos establecidos por el LNR con una concordancia global de 89,2%. Hubo
ms de un 98% de concordancia para ampicilina y cefalotina, mientras que el
22,5% de los participantes obtuvieron valores de halos de inhibicin por fuera
del rango esperado para ampicilina/sulbactam. La concordancia para los
antimicrobianos no -lactmicos fue entre 83,8 y 89,4 % (Tabla 1.d).
Tabla 1.d. Cepa 1: Concordancia en las zonas de inhibicin entre los labs del
PCC-NAC y el rango calculado por el LNR.

Ampicilina
Ampicilina/Sulbactam
Cefalotina
Ciprofloxacina
Trimetoprima/Sulfametoxa
zol
Gentamicina

N
Respuest
as
355
351
355
359
358
359

Dentro del rango

Fuera del rango

N
353
272
350
301

%
99,4
77,5
98,6
83,8

N
2
79
5
58

%
0,6
22,5
1,4
16,2

320
312

89,4
86,9

38
47

10,6
13,1

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

Como ya se mencion, el aislamiento en estudio presentaba una BLAP. Un total


de 349 laboratorios respondieron sobre el mecanismo de resistencia utilizando
el campo sugerido ad hoc (Tabla 1.e). El 76,5% de los laboratorios respondi
correctamente AmpC plasmdico. 45 laboratorios (12,9%) indicaron como
mecanismo sugerido BLEE o BLEE+impermeabilidad posiblemente porque
algunos participantes detectaron una leve inhibicin (efecto huevo) entre
amoxicilina/c. clavulnico y las C3G. Si bien el inhibidor caracterstico de la
BLAP son los derivados del cido bornico, estas enzimas puede ser levemente
inhibibles por c. clavulnico, sulbactam y tazobactam, por lo que puede
observarse dicho efecto. El aislamiento presentaba otros indicios que
descartaban la presencia de BLEE como nico mecanismo, como ser:
halos de sensibilidad para cefepime similares a las cepas salvajes (30mm) y
falta

de

agrandamiento

cefotaxima/cefotaxima+ac.

5mm

clavulnico

para
y

las

combinaciones

ceftacidima/ceftacidima+ac.

clavulnico.
Tabla 1.e. Cepa 1: Mecanismo de resistencia sugerido.

Mecanismo de referencia inferido


AMPC PLASMIDICO
BLEE
HIPERPRODUCCION/DERREPRESION DE AMPC
AMPC+ IMPERMEABILIDAD
BLEE+ IMPERMEABILIDAD
CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR APB (KPC, otras)
AMPC PLASMIDICO + SENSIBILIDAD DISMIN. A FQ

N
Respuesta
s
267
42
18
5
3
2
1

%
76,5
12
5,2
1,4
0,9
0,6
0,3

1
10

0,3
2,9

BETALACTAMASA (Haemophilus spp./ Enterococcus spp. /


Moraxella spp.)

NO APLICA
Los

laboratorios

que

informaron

como

mecanismo

inferido

hiperproduccin/derrepresin de AmpC no tuvieron en cuenta que P. mirabilis no


posee

naturalmente

una

AmpC

cromosmica

por

lo

que

el

trmino

hiperproduccin/derrepresin no sera aplicable a esta especie. El aislamiento


no posea seales de impermeabilidad ni sensibilidad disminuida a las
fluorquinolonas (c. nalidxico: 24mm,

ciprofloxacina: 36mm). La cepa no

presenta ningn mecanismo que afecte la actividad de los carbapenemes. Es


importante recordar que el gnero Proteus presenta sensibilidad disminuida de
manera natural a imipenem (los otros carbapenemes como meropenem o

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ertapenem no se ven afectados). Sin embargo esta sensibilidad disminuida


difcilmente confiera valores de resistencia.
Nota: se recuerda a los participantes que la sospecha de carbapenemasa en
este

genero

requiere

de

halos

disminuidos

dos

carbapenemes

simultaneamente, a saber imipenen <=22 + meropenem <=27 mm.

Deteccin de BLAP
P. mirabilis no presenta resistencia natural a ningn antibitico -lactmico
activo sobre bacilos Gram negativos, por lo que la resistencia neta (6mm)
observada a cefalotina debera haber sido un llamado de atencin a la hora de
analizar los posibles mecanismos de resistencia involucrados. Halos de
cefalotina de 6mm son una alerta para la presencia de -lactamasas
tipo BLEE o BLAP en las enterobacterias carentes de AmpC inducible (E.
coli, Klebsiella spp, P. mirabilis, Shigella spp, Salmonella sp y C. koseri), por lo
que amerita completar el antibiograma para caracterizar el mecanismo
implicado de resistencia a los -lactmicos.
Al completar el antibiograma se pudo observar la resistencia a cefoxitina y
sensibilidad reducida a C3G. Se observaron halos de resistencia a cefotaxima
(22mm) y sensibilidad a ceftacidima (21mm), con halos de inhibicin muy
cercanos al punto de corte. Se obtuvieron los valores de CIM para C3G por
mtodo automatizado (Vitek) y por dilucin en agar. El valor de CIM para
cefotaxima fue 8 g/ml para ambos mtodos siendo interpretado como
resistente, mientras que la CIM de ceftacidima fue de 16 g/ml y 8g/ml
respectivamente siendo resistente e intermedio segn el mtodo ensayado. El
aislamiento NO present agrandamiento 5mm para las combinaciones
cefotaxima/cefotaxima+ac.
clavulnico,

caractersticos

clavulnico
de

las

BLEE

ni
y

ceftacidima/ceftacidima+ac.
se

observ

sensibilidad

cefalosporinas de cuarta generacin (cefepime: 30mm, 1g/ml). De esta


manera, se confirma la ausencia de BLEE en esta cepa.
Todos estos indicios nos conducen a sospechar de la presencia de una lactamasa tipo AmpC plasmdica. Debido a que P. mirabilis no posee una lactamasa tipo AmpC en su cromosoma, la deteccin de esta enzima implica la
adquisicin de un elemento mvil (plsmido). Para la confirmacin fenotpica se
debe realizar la bsqueda de sinergia (efecto huevo) entre cefoxitina
y/o las C3G y el cido 3-amino-fenil-bornico (APB) (300 g/disco) (como
se ve en el ejemplo de la Foto 1 disco 33= APB). El APB se desempea como
inhibidor

de

las

-lactamasas

tipo

AmpC,

independientemente

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de

su

codificacin cromosmica o plasmdica, y aunque tambin acta como inhibidor


de carbapenemasas de clase A (KPC, SME, IMI/NMC, etc), esta caracterstica no
dificulta la deteccin de BLAP en aislamientos que no presenten compromiso en
la sensibilidad a los carbapenemes.

Otro inhibidor de las -lactamasas tipo

AmpC es la cloxacilina, que inhibe especficamente a estas enzimas pero no a


las carbapenemasas de clase A. El desempeo de este inhibidor fue
recientemente evaluado en el LNR al desafiar la capacidad de deteccin de
BLAP de dos mtodos comerciales (AmpC Confirm ID Pack y ESBL+AmpC Screen
Pack, ROSCO Diagnostica) que comparan los halos de inhibicin obtenidos con
discos de C3G solas y su combinacin con cloxacilina. Ambos mtodos tuvieron
un muy buen desempeo en la deteccin de las BLAP. Las fallas de deteccin
correspondieron a mecanismos de baja prevalencia y a cepas multirresistentes
con ms de un mecanismo adquirido de resistencia a C3G (BLEE ms BLAP) (Ver
Posters adjuntos: Rapoport y col. SADEBAC 2012).
Otra prueba simple para corroborar la naturaleza enzimtica de la resistencia a
cefoxitina son los mtodos microbiolgicos (Masuda, Hodge, y modificaciones
de stos). En presencia de BLAP, estos mtodos presentan un resultado
positivo, como el caso de la cepa en estudio. Las BLAP no son el nico
mecanismo que afecta cefoxitina: la resistencia puede ser de naturaleza no
enzimtica debida a impermeabilidad de la membrana externa. Para el
aislamiento en estudio, la sinergia con APB y el mtodo de Hodge dieron
positivos por lo que se confirma la naturaleza enzimtica de la resistencia a
cefoxitina, que posteriormente fue caracterizada por PCR, dando un resultado
positivo para el gen cit/cmy

CAZ

APB

CTX

Foto 1.
Sinergia entre
discos de 3amino fenil
bornico
(APB) vs.
cefotaxima
(CTX) y
ceftacidima
(CAZ).

Informe de BLAP

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En el aislamiento en estudio se confirm la presencia de BLAP y la ausencia de


BLEE, por lo que las C3G deberan ser informadas segn los halos de inhibicin
obtenidos (Tabla 2A M100-S22). Sin embargo se observa un error minor para la
interpretacin de ceftacidima frente al mtodo de referencia (dilucin en agar)
ya que por disco debera interpretarse como sensible, mientras que por CIM se
informara intermedio. A la fecha no existe consenso sobre el reporte de las C3G
en cepas productoras de AmpC plasmdico. Del mismo modo, es escasa la
bibliografa internacional sobre la utilidad clnica de C3G en infecciones
provocadas por enterobacterias con BLAP. Sin embargo los nuevos puntos de
corte de CLSI para C3G (vigentes en el documento del CLSI desde el ao 2010 y
mantenidos en ediciones posteriores: CAZ: R17mm, S21mm, R16g/ml,
S4g/ml y CTX: R22mm, S26mm, R4g/ml, S1g/ml) mejoraron
significativamente la deteccin de BLAPs con respecto a los puntos de corte
previos (M100-S19, 2009). Teniendo en cuenta estos conceptos, a la hora de
guiar el tratamiento antimicrobiano, sera prudente evitar el uso de las C3G en
infecciones severas basado en las siguientes certezas: las resistencias
enzimticas como las BLAP elevan poblacionalmente las CIMs de los sustratos
afectados y a su vez, estos valores son plausibles de ser afectados por inculos
bacterianos de alta densidad.
Uno de los puntos crticos en este tipo de aislamientos de infecciones severas
es descartar la presencia de BLEE para poder informar correctamente la
sensibilidad de las C4G. Ante la confirmacin de ausencia de BLEE, el cefepime
debe ser informado como sensible, en el caso que presentara sensibilidad in
vitro.

Conclusiones finales. La bsqueda de este tipo de enzimas es especialmente


significativa en aquellos gneros y especies que carecen naturalmente de lactamasas tipo AmpC cromosmicas, como es el caso de P. mirabilis, Klebsiella
spp., y Salmonella y en aquellas que la producen en forma basal o en pequeas
cantidades, como Escherichia coli y Shigella spp. Se recomienda la utilizacin de
discos de APB cuando se sospecha la presencia de este mecanismo en estos
gneros bacterianos. Por el contrario, en aquellas especies productoras de
AmpC cromosmico (Enterobacter spp. C. freundii, M. morganii, P.
aeruginosa, Serratia spp., Providencia spp.) no tendra sentido probar
el disco de APB para tal fin.
En Argentina, la emergencia documentada de BLAP se remite a la descripcin
de una enzima tipo FOX-1 en un aislamiento de K. pneumoniae en el ao 1994
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(Gonzalez Leiza M. y col. AAC 1994; 38:2150). Ms recientemente, se describe


un brote de Shigella flexneri productora de CMY-2 del Hospital Materno Infantil
de Mar del Plata (Rapoport M. y col. IJAA 2008; 31:385). Desde el ao 2006, han
sido confirmados en el INEI-ANLIS Malbrn un nmero creciente de casos de
BLAP en P. mirabilis, K. pneumoniae, Salmonella y Shigella. Estos datos de
emergencia nacional establecen la necesidad de estar alertas ante la aparicin
de perfiles de resistencia compatibles con el mecanismo aqu descripto. Este
reconocimiento permitir alertar al cuerpo mdico no slo para la seguridad en
la eleccin del tratamiento del paciente, sino para el diseo de medidas de
control a fin de evitar la diseminacin vertical u horizontal de este mecanismo,
ya que cepas con estas caractersticas probaron su habilidad para ocasionar
brotes de distinta magnitud.

Cepa N 2: Aerococcus urinae


Se trataba de un Aerococcus urinae aislado de orina, cuyo desafo era la
identificacin bioqumica.
De los 377 laboratorios que contestaron la encuesta, 265 realizaron la
identificacin bacteriana; 26 laboratorios (6,9%) no reportaron dato y 86 la
informaron como no viable (22,8%).
El 84,9% de los laboratorios (225/265) inform correctamente gnero y especie,
el 3,8 % (10/265) inform gnero correcto y omiti especie y el 1,5% (4/265)
inform gnero incorrecto (Tabla 2.a). En la Tabla 2.b se detallan los errores en
la identificacin bacteriana.
Tabla 2.a. Cepa 2: Concordancia en la Identificacin bioqumica.

Concordancia
Gnero y especie correctos
Gnero correcto
Gnero correcto y especie
incorrecta
Gnero incorrecto

N
225
10

Porcentaje
(%)
84,9
3,8

4
26

1,5
9,8

Tabla 2.b. Cepa 2: Errores en la Identificacin

Gnero y especie

N
laboratorios

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Aerococcus viridans
Streptococcus viridans
Streptococcus viridans, alfa
hemolticos
Streptococcus mitis
Streptococcus sp.
Streptococcus acidominimus
Streptococcus agalactiae
Staphylococcus saprophyticus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus coagulase
negative
Staphylococcus epidermidis
Enterococcus sp.
Globicatella sp.
Leuconostoc sp.
Neisseria gonorrhoeae
Oligella urethralis
Proteus mirabilis
Aeromonas ureae

4
8
1
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

Comentarios Cepa 2 (Dr. Carlos Vay)

La familia Aerococcaceae (definida principalmente sobre la base del anlisis


filogentico de las secuencias del ARNr 16S) incluye dos grupos parafilticos:
Uno de ellos contiene nicamente al gnero Aerococcus, el otro a los gneros
Abiotrophia,

Dolosicoccus,

Eremococcus,

Facklamia,

Globicatella

Ignavigranum.
El gnero Aerococcus, y la especie Aerococcus viridans fueron propuestos en
1953 para contener a aquellos cocos gran-positivos catalasa negativos que se
diferenciaban de los estreptococos por su modo de agrupamiento. Mucho ms
tardamente, otras especies fueron incorporndose a ese gnero: Aerococcus
christensenii, Aerococcus sanguinicola, Aerococcus suis, Aerococcus urinae,
Aerococcus urinaeequi y Aerococcus urinaehominis.
Todos ellos son cocos gran-positivos, inmviles, que forman grupos, ttradas o
pares en medio lquido (la especie A. christensenii forma a menudo cadenas
cortas),

aerobios

anaerobios,

pero

preferentemente,

microaerfilos

(Aerococcus viridans crece en el primer centmetro superior del caldo


tioglicolato), catalasa negativos en su mayora, sensibles a vancomicina,

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10

capaces de crecer en caldo hipersalado (ClNa 6,5%). Acidifican la glucosa (con


excepcin de Aerococcus suis, especie de importancia en veterinaria) y no
poseen ningn antgeno de grupo de Lancefield. Las reacciones de acidificacin
de hidratos de carbono en caldo prpura de bromocresol suelen demorar
algunos das. Con excepcin de algunos aislados de A. viridans, hidrolizan el
hipurato.
Es muy importante destacar que para abordar la identificacin de los cocos
gram-positivos

catalasa

negativos

se

requiere

indefectiblemente,

de

la

observacin de la morfologa que adoptan en medio lquido (caldo tioglicolato),


pues de lo contrario sera imposible identificar correctamente a los diferentes
integrantes de este grupo.
La Tabla 2.c muestra la utilidad de tres caractersticas fenotpicas para
diferenciar a los cocos gran-positivos catalasa negativos que forman pares,
ttradas o grupos.

Tabla 2.c: Identificacin preliminar de cocos gran-positivos catalasa negativos


que forman pares, grupos o ttradas, basada en tres caractersticas fenotpicas.
Reaccin fenotpica
PYR

LAP

Microorganismo(s) posible

ClNa(6,5%)

+
+
+
Dolosigranulum pigrum,

Aerococcus sanguinicola,
Facklamia languida.

+
+
Rothia mucilaginosa.

Gemella haemolysans,

+
Helcococcus kunzii.

Aerococcus viridans,

+
+
Aerococcus christenseniia,
Tetragenococcus

Aerococcus urinae,
Pediococcus,

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Aerococcus urinaehominis

Adaptado de Ruoff K. Manual of Clinical Microbiology, 10 Edicin, 2011.


a A. christensenii puede presentar cortas cadenas.
b Tetragenococcus halophilus (Enterococcus solitarius) se diferencia de Aerococcus
urinae por las reacciones positivas de bilis-esculina y de arginina dehidrolasa(ADH) y la
incapacidad de hidrolizar hipurato. En el Manual de Microbiologa de la ASM, 10 Edicin,
2001; Ruoff informa que el gnero Tetragenococcus es PYR -, sin embargo Facklam et
al. describen a Tetragenococcus halophilus como PYR +; en este caso la reaccin
positiva de la prueba ADH y de Voges-Proskauer y la ausencia de hidrlisis del hipurato
lo diferencian de A. sanguinicola.

La Figura 2 muestra un esquema dicotmico para abordar la identificacin de


los cocos gram-positivos catalasa negativos, aerobios, que se agrupan o
forman tetradas.

Figura 2.

PYRa
+

LAP

Va(30

Hemli

ClNa
6,5%

GUR

Esculin

S
Pediococ

Helcococcus
kunzii

GUR

Aerococcus
christensenii

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Gemella
haemolysans

Aerococc
us
sanguinic

Aerococcus
viridansb

LAP

Rothia mucilaginosac

Esculin

Aerococcus
urinaehominis

Dolosigran
Facklamia
languida
a

Aerococcus urinae

Abreviaturas: PYR: Pyrrolidonil aril amidasa; LAP: Leucina aminopeptidasa, GUR: Beta-

glucuronidasa, Va (30 g): disco de vancomicina de 30 g; resistencia indica ausencia


de halo de inhibicin.
b

Helcococcus kunzii es exigente, a menudo lipoflico y crece en anaerobiosis.

Aerococcus viridans forma colonias similares a las de los enterococos con un halo
marcado de hemlisis alfa. Crece en la superficie del caldo tioglicolato, pues desarrollan
pobremente o no lo hacen en anaerobiosis.
c

Rothia mucilaginosa (Stomatococcus mucilaginosus) forma colonias grandes blanco

grisceas que suelen adherirse al medio de cultivo. Son sensibles a bacitracina (0,04UI).

Aerococcus spp. forma parte de la microbiota ambiental: se pueden hallar en el


suelo, el polvo, el agua, la vegetacin y por ende tambin en el ambiente
hospitalario. De all que a veces son contaminantes del Laboratorio de
Microbiologa, por lo que su hallazgo debe ser evaluado en contexto clnico.
Aerococcus viridans, la especie ms vieja del gnero, causa enfermedad mortal
en las langostas marinas (gafkemia) y es oportunista para el hombre.
Endocarditis, artritis sptica, bacteriemia, infeccin urinaria y espondilodiscitis
son las infecciones ocasionadas por esta especie ms descriptas.
Aerococcus urinae fue descripto por Christensen en Dinamarca en 29 pacientes
con sospecha de infecciones urinarias. Se lo denomin ALO, es decir
microorganismo similar a los aerococos. En 11 de estos pacientes fue aislado
como nico microorganismo de la orina en un recuento superior a 100.000
ufc/ml. El 50 % de los pacientes presentaban trastornos locales o sistmicos
(diabetes, neoplasias del sistema urinario o de otros sitios, litiasis urinaria). Los
pacientes con septicemia o endocarditis por estos microorganismos eran
gerontes con enfermedades subyacentes tales como diabetes, cncer de

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prstata e infarto de miocardio.

Luego varias comunicaciones han sido

publicadas en la que se demuestra definitivamente la capacidad de esta


especie de causar infecciones urinarias con o sin bacteriemia y endocarditis.
Recientemente, Senneby et al., han presentado un trabajo que muestra las
caractersticas clnicas y microbiolgicas de las bacteriemias por Aerococcus
urinae. De 16 paciente con bacteriemia 15 eran hombres de ms de 70 aos y
12 presentaban condiciones urolgicas subyacentes. El foco urinario fue
sospechado en la mayor parte de los casos, sin embargo el microorganismo fue
raramente aislado de la orina en esta serie. Nueve pacientes presentaron sepsis
y

uno

falleci.

Tres

pacientes

presentaron

endocarditis,

uno

present

espondilodiscitis como complicacin de la misma y otro paciente embolia


cerebral. En esta revisin los pacientes fueron tratados con antibiticos betalactmicos, aunque tambin fueron utilizadas quinolonas y clindamicina.
Aerococcus urinae suele ser sensible a penicilina, amoxicilina y vancomicina.
Las

fluorquinolonas

muestran

moderada

buena

actividad

algunas

cefalosporinas pobre actividad, con excepcin de cefepima. Cattoir et al.,


estudiaron la sensibilidad de 30 aislamientos de Aerococcus spp. (A. urinae 20,
A. sanguinicola 8 y A. viridans 2) y demostraron que todos ellos, fueron
sensibles a amoxicilina, vancomicina y teicoplanina y presentaron bajo nivel de
resistencia

los

aminoglucsidos(gentamicina).

En

este

trabajo

las

fluorquinolonas, la fosfomicina y el co-trimoxazol (TMS) tuvieron actividad


variable. A. urinae fue a menudo resistente a TMS y sensible a fosfomicina, en
tanto que, A. sanguinicola fue resistente a fosfomicina y sensible a TMS. Sin
embargo, Facklam describe que 10 de 15 aislados de A. sanguinicola mostraron
sensibilidad intermedia a TMS y que la totalidad fueron muy sensibles a
penicilina (CIM de 0,03 ug/ml ) y cefotaxima (CIM de 0,25 ug/ml). La
resistencia a penicilina puede observase en la especie A. viridans con relativa
frecuencia.
A. christensenii ha sido aislado de vagina humana y A. urinaehominis de sangre
y de orina respectivamente. A. sanguinicola fue aislado principalmente de
sangre y de orina.
Bibliografa:
Cattoir V, Kobal A, Legrand P. Aerococcus urinae and Aerococcus sanguinicola,
two frecuently misidentified uropathogens. Scand J infect Dis. 42:775.780, 2010.
Christensen J, Jensen I, Faerk J et al. Bacteremia/septicemia, due to Aerococcus
like organism: report of seventeen cases. Clin Infect Dis. 21:943-947, 1995.

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

14

Christensen J, Vibits H, Ursing J, et al. Aerococcus like organism, a newly


recognized urinary tract pathogen. J Clin Microbiol.29:1049-1053, 1991.
Facklam R, Lovgren M, Shewmaker P, Tyrell G. Phenotipic description and
antimicrobial susceptibilities of Aerococcus sanguinicola isolated from human
clinical samples.

J Clin Microbiol 41:2587-2592, 2003.

Ludwig W, Schleifer K, Whitman W.: Family II. Aerococcaceae fam. nov. In: De
Vos P, Garrity G, Jones D, Krieg N, Ludwig W, Rainey F, Scheleifer K, Whitman W.
(eds): Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, second edition, vol. 3, p.533.
(The Firmicutes), Springer, Dordrecht, Heidelberg, London, New York, 2009.
Ruoff K. En En Versalovic J, Carroll K, Funke G, Jorgensen J, Landry ML, Warnock
D. Manual of Clinical Microbiology. 10 Edicin. Vol 1. Captulo 22. ASM Press,
Washington DC, 2011.
Senneby E, Petersson A, Rasmussen M. Clinical and microbiology features of
bacteremia with Aerococcus urinae. Clin Microbiol Infect. 18:546-550, 2012.

Cepa N 3: Pseudomonas aeruginosa


La cepa N 3 de esta encuesta provena de hemocultivos de un paciente con
bacteriemia. Se enviaron dos aislamientos de Pseudomonas aeruginosa
productores de carbapenemasa tipo metalo-beta-lactamasa (MBL), diferentes
en cuanto al tipo de enzima involucrada en dicho mecanismo de resistencia a
los antibiticos -lactmicos y a la sensibilidad/resistencia al resto de los
antibiticos solicitados:

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

15

Cepa 3.1. P. aeruginosa MBL tipo IMP


Cepa 3.2. P. aeruginosa tipo VIM
.

La mitad de los participantes del Programa recibi la Cepa 3.1 y la otra mitad, la
cepa 3.2. En la Tabla 3 se muestra un cuadro comparativo con las
caractersticas fenotpicas y genotpicas diferenciales de las dos cepas en
cuestin: la Cepa 3.1 era resistente de alto nivel a ceftacidima y
ciprofloxacina y sensible a amicacina y la Cepa 3.2 era resistente de
alto nivel a amicacina, resistente de bajo nivel a ceftacidima y sensible
a ciprofloxacina.

Tabla 3: Caractersticas fenotpicas/genotpicas de P. aeruginosa 3.1 y


3.2

Antibitico

Cepa 3.1

Cepa 3.2

P. aeruginosa

P. aeruginosa

Zona de

MBL IMP
Interpretacin

inhibici
Imipenem
Meropenem
Ceftazidima
Piperacilina/
Tazobactam
Ciprofloxacina
Amicacina

Zona de

MBL VIM
Interpretacin

inhibicin

n (mm)/
11 18
12 20
6
20 26

Resistente
Resistente
Resistente
Intermedio/Sensi

(mm)/
6 15
6 17
9 17
13 20

Resistente
Resistente
Resistente
Resistente/Interme

6
27 33

ble
Resistente
Sensible

24 34
6

dio
Sensible
Resistente

Epidemiologa de las MBL en Pseudomonas aeruginosa: En las ltimas


dcadas se ha demostrado la emergencia y diseminacin de cepas de bacilos
gram negativos productores de carbapenemasas tipo MBL en diferentes partes
del mundo. Sin embargo, P. aeruginosa, contina siendo el husped bacteriano
ms frecuentemente asociado a MBL a nivel mundial, slo amenazado en los
ltimos

aos

por

la

dispersin

de

NDM

en

mltiples

especies

de

Enterobacterias. Los primeros hallazgos de MBL en P. aeruginosa provienen de


Japn (Wantabe, 1991) y Verona, Italia (Laurenti, 1999), para enzimas de tipo
IMP y VIM respectivamente. Posteriormente otras enzimas han sido reconocidas

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

16

como parte de la familia de MBLs en aislamientos clnicos de P. aeruginosa


como SPM, GIM, AIM y NDM. Estas enzimas poseen capacidad hidroltica sobre
penicilinas, cefalosporinas, carbapenemes y cefamicinas (cefoxitina). Slo el
monobactam aztreonam (AZT) evade la accin de estas carbapenemasas,
siempre que se encuentre como mecanismo nico. Las enzimas de la familia
MBL pertenecen a la clase molecular 3b de la clasificacin de Karen Bush. De
manera distintiva, las MBLs requieren de metales divalentes (Zn 2+) en su sitio
activo, indispensable para su capacidad hidroltica. Es por ello que en presencia
de EDTA u otros quelantes de metales divalentes, como la combinacin de
EDTA+SMA (cido etilendiaminotetraactico/mercaptoacetato de sodio), estas
enzimas presentan una inhibicin caracterstica.
P. aeruginosa: Deteccin de carbapenemasas del tipo MBL
(Grupo 3b de Karen Bush.)

EDTA/SMA
imipenem

meropenem

ceftacidima

Pip+tazob.
aztreonam

Ceftacidima +
ac clavulanico

cefepima

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

17

Las variantes ms comnmente reportadas son IMP-1, IMP-13 y VIM-2, todas


ellas microbiolgica y clnicamente similares que han alcanzado proporciones
pandmicas debido a la movilizacin de clones hiper-epidmicos.
En Argentina, los primeros hallazgos de MBL se produjeron a finales del ao
2002. En la Ciudad Autnoma de Buenos Aires se detecta por primera vez la
presencia de una nueva variante de VIM (VIM-11) en P. aeruginosa recuperada
de un paciente peditrico (Pastern, 2005). Desde entonces, se ha vigilado
activamente en Argentina la aparicin de MBL en P. aeruginosa y tambin en
otros bacilos gram negativos. En la actualidad, se ha podido identificar la
dispersin en Argentina de P. aeruginosa productoras de diversas MBLs con un
patrn regional caracterstico y nico en el pas. Independientemente de la zona
geogrfica y las variantes involucradas, se observa una tendencia sostenida y
creciente de casos reportados durante los ltimos dos aos. Ello motiv el envo
de la presente cepa a los laboratorios participantes del Programa.
Consecuencias

clnicas:

Las

consecuencias

clnicas

producto

de

la

emergencia de MBL han sido exploradas en los ltimos aos. La mortalidad


asociada a infecciones severas por P. aeruginosa productoras de MBL asciende
al 70-95% (Carmeli, 2010; Zavaschi, 2006). Segn estas publicaciones, las
nicas variables con capacidad de ser modificadas, en todo intento por reducir
la mortalidad asociada, resultan el inicio precoz del tratamiento antimicrobiano
y la apropiada seleccin de antibiticos. Es por ello que la deteccin precoz de
este tipo de resistencia es crtica y debe ser realizada con la mayor precisin
diagnstica por parte de los laboratorios de microbiologa clnica. El rgimen
antimicrobiano ideal para el tratamiento de infecciones producidas por P.
aeruginosa con MBL an no se ha determinado, pero sin lugar a dudas, el uso
clnico como monoterapia de sustratos afectados por la enzima como
penicilinas, cefalosporinas y carbapenemes, no debera ser considerado de
primera eleccin. Debido a la multiresistencia asociada a cepas productoras de
MBL, colistina resulta el antimicrobiano con mayor actividad in vitro y ha sido
utilizado para el tratamiento de estos grmenes (Sabuda, 2008). Al igual que
para enterobacterias productoras de carbapenemasa, la terapia combinada se
asocia a mayor xito clnico (Carmelli 2010). La inclusin de un carbapenem en
la combinacin no ha sido explorado, tal vez por los altos valores de CIM a
carbapenem frecuentemente asociados a P. aeruginosa con carbapenemasa, a
diferencia de las Enterobacterias que han adquirido estos mecanismos.

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

18

Deteccin fenotpica: en el Boletn Informativo N 3 -2011, en los comentarios


de la Cepa 3-Encuesta N42: P. aeruginosa KPC+ (enviado en noviembre de
2011), se incluy una actualizacin sobre la Deteccin fenotpica de
carbapenemasas en Pseudomonas aeruginosa. Este Boletn contena:
el ALGORITMO DE BSQUEDA DE CARBAPENEMASAS - PAE 2012 con
informacin vigente para el anlisis interpretado del antibiograma de
P. aeruginosa. Para ms detalles sobre la bsqueda y confirmacin de
carbapenemasas en PAE, por favor remitirse a dicho Boletn. De todas formas,
anexamos nuevamente el algoritmo para la bsqueda de carbapenemasas en P.
aeruginosa.

Con esta cepa se pretenda evaluar la capacidad de los laboratorios


para detectar carbapenemasas de trascendencia clnica y
epidemiolgica, como las MBLs.
Este punto es de suma importancia, porque la presencia de carbapenemasas
involucradas en procesos infecciosos severos, determina alta probabilidad de
falla de tratamiento a aquellas drogas incluidas en el espectro de sustratos de
estas enzimas. Mas an, estas carbapenemasas tienen una gran capacidad de
diseminacin, por lo que su hallazgo, debe acompaarse con los mayores
esfuerzos del equipo de salud a fin de contener una posible diseminacin del
microorganismo o de la carbapenemasa.

Pruebas de sensibilidad de Cepa 3.1: P. aeruginosa MBL tipo IMP


La identificacin bacteriana fue realizada por 187 laboratorios. El 98,9% de los
laboratorios (185/187) inform correctamente gnero y especie y 1,1% (2
laboratorios) informaron gnero correcto pero reportaron especie incorrecta.
(Tabla 3.1.a).

Tabla 3.1.a. Cepa 3.1: Concordancia en la Identificacin bioqumica.

Concordancia
Gnero y especie correctos
Gnero correcto
Gnero correcto y especie
incorrecta

N
185
-

Porcentaje
(%)
98,9
-

1,1

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

19

Gnero incorrecto

El aislamiento presentaba resistencia a carbapenemes, carboxi--penicilinas y


cefalosporinas por la portacin de MBL y adems a ciprofloxacina (CIM 4g/ml)
y sensibilidad a piperacilina/tazobactam (CIM 16g/ml), gentamicina (CIM
4g/ml), amicacina (CIM 2g/ml) y colistn (CIM 2g/ml). Presentaba
sensibilidad intermedia a aztreonam (CIM 16g/ml, halo 19 mm).

CIM
(g/ml
)

CAZ

FEP

TAZ

ATM

GEN

AKN

CIP

64
(R)

64
(R)

16(S)

16 (I)

4 (S)

2(S) 4 (R)

COL
2(S)

CAZ: ceftacidima, FEP: cefepime, TAZ: piperacilina/tazobactam, AZT: aztreonam,


GEN: gentamicina, AKN: amicacina, CIP: ciprofloxacina, COL: colistin

La

CIM

imipenem

meropenem

de

este

aislamiento

por

distintas

metodologas se presenta en la Tabla 3.1.c. A pesar de algunas diferencias


observadas en los valores absolutos de las CIMs a los carbapenemes, todas las
metodologas fueron capaces de detectar esta cepa como sospechosa de
carbapenemasa con las seales de alarma de cada una de las metodologas
propuestas en el algoritmo del LNR. Ver Anexo 3: Algoritmo para la bsqueda de
carbapenemasas.
Tabla 3.1.c. Cepa 3.1: CIMs de Imipenem y Meropenem por distintas
metodologas
CEPA 3.1
MEROPENEM
IMIPENEM
Sospecha
carbapenemasa
segn Algoritmo

A.dilucin
(g/ml)
4
4

Microdilucin
(g/ ml)
16
16

Vitek2C
(g/ ml)
2
8

Phoenix
(g/ ml)
4
8

Etest
(g/ ml)
3
16

Sensititre
(g/ ml)
8
16

Rango LNR
(mm)
12-20
11-18

SI

SI

SI

SI

SI

SI

SI

La presencia de MBL tambin se confirm fenotpicamente con el Mtodo de


discos combinados producidos en el Servicio de Antimicrobianos ( Pster ICAAC

2011, Pastern y cols. http://cl.ly/290u3s3d0O22):


Meropenem: 19 mm
Meropenem + APB (600ug/disco): 19 mm
Delta: 0 mm
Interpretacin: Negativo (<=3).
Meropenem + CLOXACILINA (3000ug/disco): 19 mm
Delta: 0 mm
Interpretacin: Negativo (<=2)

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

20

Meropenem + EDTA (750ug/disco): 32 mm


Delta: +13 mm
Interpretacin: Positivo (>= 8)
A nivel general no se observaron dificultades en la interpretacin de las pruebas
de sensibilidad de esta cepa. La concordancia global en la interpretacin fue
92,7 %. Se detectaron 7,2% de errores en la interpretacin (n=80), de los
cuales 46 fueron errores menores (57,5%), 9 graves (11,3%) y 25 muy graves
(31,2%).

La

mayora

de

los

errores

menores

estuvieron

asociados

piperacilina/tazobactam (36/46), los graves estuvieron asociados a amicacina


(9/9) y los muy graves se distribuyeron principalmente entre imipenem (8
errores), meropenem (8 errores) y ciprofloxacina (7 errores). Se detect que
siete laboratorios cometieron error muy grave en la interpretacin de
ciprofloxacina y error grave en amicacina, simultneamente. Esto podra
deberse a que si bien se les envi la cepa 3.1, informaron resultados
compatibles con el fenotipo de la cepa 3.2. Ms del 90% de los laboratorios
interpretaron como resistente imipenem, meropenem y ceftacidima (92,5,
94,6% y 98,4 respectivamente). (Tabla 3.1.d)
Para

piperacilina/tazobactam

el

rango

de

referencia

fue

20-26

mm

correspondindose con la categora de I o S del CLSI. De los 175 laboratorios


que reportaron zonas de inhibicin para este antibitico, 148 (84.6%)
informaron este antimicrobiano dentro del rango de referencia. 125 laboratorios
(69,8%) lo interpretaron como S, 18 (10,1%) I y 36 (20,1%) R. La cepa present
un valor de CIM de 16 ug/ml cuando se ensay por los mtodos de referencia,
correspondindose con la categora sensible del CLSI (la CIM borderline que
presenta este antibitico sera responsable del comportamiento descripto en el
mtodo de difusin). Piperacilina/tazobactam podra ser una opcin terapetica
(alta dosis) en cepas de P. aeruginosa con MBL que presenten sensibilidad a
esta droga (Zavaschi, 2006).

Tabla 3.1.d. Cepa 3.1: Concordancia en la interpretacin de las zonas de


inhibicin entre los labs. del PCC-NAC y el LNR.

Imipenem
Meropenem
Ceftacidima
Piperacilina/Tazobact

N
Respuest
as
187
186
186
179

S
N
8
8
2
125

I
%
4,3
4,3
1,1
69,8

N
6
2
1
18

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

R
%
3,2
1,1
0,5
10,1

N
173
176
183
36

%
92,5
94,6
98,4
20,1

21

am
Ciprofloxacina
Amicacina

187
186

7
177

3,8
95,2

1
-

0,5

179
9

95,7
4,8

S: sensible, I: intermedio, R: resistente

Resultado correcto
Errores menores
Errores graves
Errores muy graves
Las zonas de inhibicin informadas se encontraron, en su mayora, dentro de los
rangos establecidos por el LNR con una concordancia entre 79% y 94% para
todos los antibiticos solicitados. La concordancia global en las zonas de
inhibicin fue 85,4% (Tabla 3.1.e)
Tabla 3.1.e. Cepa 3.1: Concordancia en las zonas de inhibicin entre los labs
del PCC-NAC y el rango calculado por el LNR.

Imipenem
Meropenem
Ceftacidima
Piperacilina/
Tazobactam
Ciprofloxacina
Amicacina

N
Respuestas
177
177
176
175
176
178

Dentro del rango


N
%
146
82,5
141
79,7
165
93,8
148
164
140

Fuera del rango


N
%
31
17,5
36
20,3
11
6,2

84,6
93,2
78,7

27
12
38

15,4
6,8
21,3

Con respecto al item Mecanismo de resistencia sugerido fue respondido


por 180/187 laboratorios (96,3%). Se consideraron como respuestas
correctas el informe de carbapenemasa inhibible por EDTA (MBL) o
carbapenemasa.

147

laboratorios

(87,1%)

informaron

correctamente

alguna de estas opciones. La cepa no posea BLEE como mecanismo adicional.


Tabla 3.1.f. Cepa 3.1: Mecanismo de resistencia sugerido.

Mecanismo de referencia inferido


CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR EDTA (MBL)
CARBAPENEMASA
CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR EDTA (MBL) + BLEE
CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR APB (KPC, otras)
BLEE+ IMPERMEABILIDAD
MLSb INDUCIBLE + RESISTENCIA A FQ
SENSIBILIDAD DISMINUIDA A FLUORQUINOLONAS

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

N
Respuesta
s
139
8
27
2
1
1
1

%
77,2
4,5
15,0
1,1
0,5
0,5
0,5

22

NO APLICA

0,5

Llama la atencin la alta proporcin de laboratorios (n=27) que report la


coexistencia de BLEE en esta cepa. La caracterizacin molecular permiti
demostrar que la cepa 3.1 present slo una beta-lactamasa adquirida, la
carbapenemasa tipo IMP. La disociacin de la sensibilidad a PIPERACILINA
(dentro de la categora S) contrastando con la resistencia a ceftacidima que
present la cepa 3.1, tambin es una caracterstica frecuentemente asociada a
MBL del tipo IMP. Recordamos a los participantes que la deteccin de BLEE en
cepas con MBL requiere de mtodos fenotpicos muchas veces no disponibles
en la rutina como el agregado de EDTA al medio de cultivo y posterior repeticin
del antibiograma estratgico.

Los intentos de inhibir la MBL con el disco de

EDTA como reemplazo al medio suplementado para posterior examinacin de


los discos de IMP-CAZ bajo el gradiente de EDTA, son poco reproducibles y en
extremo subjetivos.

Cepa 3.2: P. aeruginosa MBL tipo VIM


La identificacin bacteriana fue realizada por 189 laboratorios. El 98,4% de los
laboratorios (186/189) inform correctamente gnero y especie, el 1,1% (2
laboratorios) inform gnero correcto pero omiti especie. Un laboratorio
inform gnero incorrecto. (Tabla 3.2.a).

Tabla 3.2.a. Cepa 3.2: Concordancia en la Identificacin bioqumica.

Concordancia

Gnero y especie correctos


Gnero correcto
Gnero correcto y especie
incorrecta
Gnero incorrecto

Porcentaje
(%)

186
2

98,4
1,1

0,5

El aislamiento presentaba resistencia a carbapenemes, carboxi-, ureidopenicilinas y cefalosporinas por la portacin de MBL y adems a amicacina (CIM
64 g/ml), gentamicina (CIM 16 g/ml) y sensibilidad a aztreonam (CIM 8
g/ml), ciprofloxacina (CIM 1 g/ml) y colistn (CIM 2 g/ml).

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23

CIM
(g/ml
)

CAZ

FEP

TAZ

ATM

GEN

AKN

CIP

COL

64
(R)

64
(R)

64(I)

8 (S)

16 (R)

64 (R)

1 (S)

2(S)

CAZ: ceftacidima, FEP: cefepime, TAZ: piperacilina/tazobactam, AZT: aztreonam,


GEN: gentamicina, AKN: amicacina, CIP: ciprofloxacina, COL: colistin

La

CIM

imipenem

meropenem

de

este

aislamiento

por

distintas

metodologas se presenta en la Tabla 3.2.c. Al igual que en la cepa 3.1, todas las
metodologas

detectaron

este

aislamiento

como

sospechoso

de

carbapenemasa a pesar de las diferencias en los valores absolutos de las CIMs


a carbapenemes

Tabla 3.2.c. Cepa 3. 2: CIMs de Imipenem y Meropenem por distintas


metodologas

ND: no determinado
La presencia de MBL tambin se confirm en este aislamiento con el mtodo de
discos combinados producidos en el Servicio de Antimicrobianos ( Pster ICAAC

2011, Pastern y cols. http://cl.ly/290u3s3d0O22):


Meropenem: 15 mm
Meropenem + APB (600ug/disco): 15 mm
Delta: 0 mm
Interpretacin: Negativo (<=3).
Meropenem + CLOXACILINA (3000ug/disco): 17 mm
Delta: +2 mm
Interpretacin: Negativo (<=2)
Meropenem + EDTA (750ug/disco): 34 mm
Delta: +19 mm
Interpretacin: Positivo (>=8)

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

24

A nivel general no se observaron dificultades en la interpretacin de las pruebas


de sensibilidad de esta cepa. La concordancia global fue 91,8%. Se detect 8,2
% de errores en la interpretacin (n=91), de los cuales 65 fueron errores
menores (71,4%), 5 graves (5,5%) y 21 muy graves (23,1%). La mayora de los
errores menores estuvieron asociados a piperacilina/tazobactam (48/65), los
graves estuvieron asociados a ciprofloxacina (5/5) y los muy graves se
distribuyeron de manera uniforme entre imipenem (7 errores), meropenem (4
errores), ceftacidima (5) y amicacina (5 errores). Ms del 92 % de los
laboratorios interpretaron como resistente imipenem, meropenem y ceftacidima
(94,6%, 97.3% y 92,4 respectivamente). (Tabla 3.2.d.) Se detect que los cinco
laboratorios cometieron error muy grave en la interpretacin de amicacina y
error grave en ciprofloxacina, simultneamente. Esto podra deberse a que si
bien se les envi la cepa 3.2, informaron resultados compatibles con el fenotipo
de la cepa 3.1. Para piperacilina/tazobactam el rango de referencia fue 13 - 20
mm correspondindose con la categora de I o R del CLSI. De los 184
laboratorios que reportaron zonas de inhibicin para este antibitico, 135
(75.8%) informaron este antimicrobiano dentro del rango de referencia. 48
laboratorios (26,1%) lo interpretaron como S, 36 (19,6%) I y 100 (54,3%) R. La
cepa present un valor de CIM de 64 ug/ml cuando se ensay por los mtodos
de referencia, correspondindose con la categora intermedio del CLSI (la CIM
borderline que

presenta piperacilina/tazobactam

sera

responsable

del

comportamiento descripto en el mtodo de difusin).


Tabla 3.2.d. Cepa 3.2: Concordancia en la interpretacin de las zonas de
inhibicin entre los labs. del PCC-NAC y el LNR.

Imipenem
Meropenem
Ceftacidima
Piperacilina/Tazobact
am
Ciprofloxacina
Amicacina

N
Respuest
as
184

184
185
184
184
183

N
7
4
5

%
3,8
2,2
2,7

N
3
1
9

%
1,6
0,5
4,9

N
174
179
171

%
94,6
97,3
92,4

48
175
5

26,1
95,1
2,7

36
4
-

19,6
2,2

100
5
178

54,3
2,7
97,3

S: sensible, I: intermedio, R: resistente

Resultado correcto
Errores menores
Errores graves
Errores muy graves

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25

Las zonas de inhibicin informadas se encontraron, en su mayora, dentro de los


rangos establecidos por el LNR con una concordancia entre 80 y 92% para
ciprofloxacina, imipenem, amicacina y meropenem y entre 76% y 78% para
piperacilina/ tazobactam y

ceftacidima. La concordancia global fue 83,2%

(Tabla 3.2.d).
Tabla 3.2.e. Cepa 3.2: Concordancia en las zonas de inhibicin entre los labs
del PCC-NAC y el rango calculado por el LNR

Imipenem
Meropenem
Ceftacidima
Piperacilina/
Tazobactam
Ciprofloxacina
Amicacina

N
Respuestas
176
176
176
178
177
173

Dentro del rango


N
%
149
84,7
162
92,0
138
78,4
135
143
151

Fuera del rango


N
%
27
15.3
14
8.0
38
21.6

75,8
80,8
87,3

43
34
22

24.1
19.2
12.7

Con respecto al item Mecanismo de resistencia sugerido fue respondido


por 184/190 laboratorios (96.8%). Se consideraron como respuestas
correctas el informe de carbapenemasa inhibible por EDTA (MBL) y
carbapenemasa.

159

laboratorios

(86.4%)

informaron

correctamente

alguna de estas opciones.


Tabla 3.2.f. Cepa 3.2: Mecanismo de resistencia sugerido.

Mecanismo de referencia inferido


CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR EDTA (MBL)
CARBAPENEMASA
CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR EDTA (MBL) + BLEE
CARBAPENEMASA INHIBIBLE POR APB (KPC, otras)
BLEE+ IMPERMEABILIDAD
BLEE
MLSb INDUCIBLE
MLSb CONSTITUTIVO
RESISTENCIA NO ENZIMATICA A CARBAPENEMES
NO APLICA

N
Respuesta
s
154
5
15
2
1
1
2
1
1
2

%
83.7
2.7
8.2
1.1
0.5
0.5
1.1
0.5
0.5
1.2

Llama nuevamente la atencin la alta proporcin de laboratorios (n=15) que


report la coexistencia de BLEE en esta cepa. La cepa 3.2 por PCR present
solamente una beta-lactamasa adquirida, la carbapenemasa tipo VIM. Adems
en esta cepa no se observ disociacin entre PIPERACILINA y ceftacidima
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26

(ambas dentro de la categora R) que frecuentemente se asocia con BLEE en P.


aeruginosa, pero como vimos en la cepa anterior, tambin con MBL tipo IMP.
Recordamos a los participantes que la deteccin de BLEE en cepas con MBL
requiere de mtodos fenotpicos muchas veces no disponibles en la rutina
(agregado de EDTA al medio de cultivo y posterior repeticin del antibiograma
estratgico).

Conclusiones finales
Debido a la persistente diseminacin de MBL en Argentina y el elevado impacto
en la morbi/mortalidad de las infecciones asociadas a estos grmenes,
alentamos a los laboratorios a realizar un esfuerzo y confirmar fenotpicamente
los mecanismos de resistencia en aquellos aislamientos sospechosos de
carbapenemasa segn los puntos de corte epidemiolgicos propuestos en el
algoritmo (o remitir a Centros Centinela en caso de no poder efectuar estos
pasos confirmatorios). La dinmica de diseminacin de los mecanismos
descriptos y la emergencia de nuevos, hacen imprescindible la confirmacin
molecular por parte del Centro Nacional de Referencia frente a todo hallazgo
confirmado fenotpicamente de carbapenemasa en P. aeruginosa.

Anexo 3
Algoritmo para la bsqueda de carbapenemasas. Actualizacin 2012.

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27

Pregunta N 21
Marque

el

microorganismo

ms

probable

que

presenta

las

siguientes

caractersticas fenotpicas: No invade, no fermenta lactosa, TSI A/A (SH2


negativo), LIA desaminada, ureasa +, citrato+, fenilalanina +, Indol+, ODC-,

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28

fermentacin manosa-, presenta resistencia a: cefalotina, ampicilina, colistina y


nitrofurantona.
a- Providencia stuartii
b- Providencia rettgeri
c- Proteus vulgaris
d- Proteus penneri
Recibimos 375 respuestas. 221 (58,9%) laboratorios informaron la opcin
correcta: c) Proteus vulgaris, 110 (29,3%) optaron por la Rta b, 37 (9,9%)
laboratorios respondieron a y 7 (1,9%) respondieron d. Dos laboratorios no
enviaron respuesta a la pregunta.

221
(58,9%)

N de
Laboratorios

110
(29,3%)
37
(9,9%)

7
(1,9%)

S/D: sin dato

Rta

Proteus vulgaris es una de las 5 especies que poseen nombre, que integran el
gnero Proteus (P. mirabilis, P. vulgaris, P. penneri, P. hauseri y P. myxofaciens),
puesto que existen adems, tres especies genticas que an no han sido
nomencladas (Proteus genoespecies 4, 5 y 6). Es la segunda especie en
frecuencia de aislamiento, de las 4 que pueden infectar al hombre (la especie P.
myxofaciens no ha sido an reconocida en especmenes clnicos humanos).
Dado que no existen diferencias fenotpicas entre P. vulgaris sensu stricto, y
las especies genticas 4, 5 y 6 se considera que las 4 especies forman el
Complejo Proteus vulgaris. Asimismo, desde un punto de vista prctico a este
complejo podra incluirse la especie P. hauseri pues sus caractersticas
fenotpicas son idnticas a las del Complejo P. vulgaris.
Junto con Providencia y Morganella, el gnero Proteus, conforma la conocida
tribu Proteae.

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29

Este grupo (Tribu Proteae) de la familia Enterobacteriaceae presenta las


siguientes caractersticas diferenciales con el resto de los integrantes de esta
familia:
Mviles (la mayor parte de los aislamientos)
Ausencia de fermentacin de lactosa
ONPG ( galactosidasa): Ausente
Decarboxilacin de lisina e hidrlisis de L-arginina: Ausente
Deasaminacin de fenil- alanina o triptfano
Para aquellos laboratorios que utilizan el medio Agar Hierro Lisina (Agar LIA) la
desaminacin de este aminocido slo se presenta en los gneros Proteus y
Providencia y est ausente en el gnero Morganella.
Cabe mencionar que unas pocas Enterobacteriacea que infectan con mucha
menor frecuencia al hombre que las pertenecientes a la tribu Proteae pueden
desaminar la fenilalanina. A continuacin, la Tabla 1, enumera las pruebas de
primera lnea utilizadas en la identificacin fenotpica en los laboratorios de
microbiologa clnica, que excluyen a estas Enterobacteriacea infrecuente, de la
Tribu Proteae:
Especie / fenilalanina deaminasa(%)a
diferencial b
Rahnella aquatilis (95%)
malonato+, urea-, Glu +,

Prueba
lactosa +, ONPG+,
inmvil a 35C

Butiaxella noackiae (100%)


malonato+

ONPG+, urea ,

Complejo Enterobacter agglomerans(20%)


urea (20%)

ONPG +, Pig amarillo (75%),

Cronobacter(Enterobacter)sakasakii (50%)
ADH+, Pig amarillo+

lactosa+,ONPG+, ODC+,

Pragia fontium (20%)c

urea

Tatumella ptyseos (90%)

urea -, inmvil a 35C

Adaptado de Farmer JJ III, Wright K, Janda M. Enterobacteriaceae. Manual of Clinical


Microbiology. 2007.
b
+: indica ms del 90 % de los aislados producen la reaccin positiva; -: indica menos
del 10% de los aislados producen la reaccin positiva. Pig: pigmento, ONPG: o-nitro fenil

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30

- galactosidasa, ODC: ornitina decarboxilasa, ADH: arginina dehidrolasa, Glu: glucosidasa.


c
No se ha encontrado en muestras de origen humano.

Como corolario se puede resumir que las especies raras de Enterobacteriaceae


que desaminan fenilalanina a diferencia de la tribu Proteae producen ONPG con
excepcin de Pragia y Tatumella. Estas ltimas no desaminan lisina.
Los

aislamientos

pertenecientes

al

gnero

Proteus

se

identifican

presuntivamente por su olor tpico desagradable, la invasin en medios no


selectivos y la produccin de sulfuro de hidrgeno en agar TSI. Sin embargo, el
olor desagradable tambin est presente en los cultivos de Morganella y
Providencia; el fenmeno de la invasin puede estar ausente en los aislados
clnicos y la produccin de gas sulfdrico tambin. Si bien en las tablas del
manual de la ASM se consigna con un porcentaje de positividad del 98, 95 y
30% a la prueba de SH2 en agar TSI para P. mirabilis, P. vulgaris y P. penneri,
respectivamente, estos porcentajes suelen diferir de los observados por otros
microbiolgos. De hecho en la ltima edicin de Manual de Microbiologa de
ASM (Versalovic J. et al., 10 edicin, 2011) en la tablas de diferenciacin de
Proteus, Providencia y Morganella y sus respectivas especies, la prueba de SH2
en P. vulgaris se consigna como V (11-89% de positividad para la prueba). Al
parecer, el porcentaje del 98% para las produccin de SH2 en P. mirabilis es
excesivamente alto, pues en nuestro medio es bastante habitual encontrar la
ausencia de tal caracterstica en esta especie. De hecho, Castro et al.
describieron sobre un total de 87 P. mirabilis aislados de muestras clnicas que
la produccin de SH2 fue detectada en el 67%. Algo similar sucedi con P.
vulgaris puesto que de 103 aislados la produccin de SH2 fue del 76%. La Tabla
2 muestra las principales caractersticas fenotpicas diferenciales entre los
gneros que integran la tribu Protege
Tabla 2. Caractersticas fenotpicas diferenciales de los gneros que integran la
Tribu Proteae.
Prueba
Providencia

Proteus

Morganella

Ureasa
Va

SH2 (TSI)
-

-b

Invasin( 35C)
-

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31

Citrato(Simmons)
+c
Des lis(LIA)
-

+d

ODC
-

Manosa/xilosa
+/-

+f

-/+

Gelatinasa
-

+/-

+g

Manitol,arabitol, inostol,adonitol
+ (al menos uno de

ellos segn especie)

Providencia rettgeri +, Providencia stuartii V, Providencia alcalifaciens


Algunos biotipos pueden producir una pequea cantidad de SH 2 en agar TSI
c
Algunos aislamientos pueden ser negativos
d
Des Lis: Lisina deaminasa. P penneri puede no desaminar la lisina o producir la
reaccin despus de las 24 hs incubacin.
e
P mirabilis +, P. vulgaris P. hauseri y P penneri-. P mirabilis puede producir la reaccin
negativa.
f
Algunos aislados puede producir la reaccin negativa.
g
Uno de cada dos P. penneri producen la reaccin positiva. Si se utiliza el mtodo de
Frazier slo es vlido para las cepas que no producen invasin.
b

La Tabla 3 muestra las caractersticas diferenciales de las especies del gnero


Proteus
Tabla 3: Caractersticas diferenciales de las especies del gnero Proteus que
infectan humanos.
Caracterstica
P. penneri

P. mirabilis

Complejo P. vulgaris
(Incluye P.

hauseri)

TSI
cido/cido
SH2 (TSI)
Vc
Citrato(Simmons)
-

alcalino/cido

V
V

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

cido/cido
V
V

32

ODC
-

Indol
-

Sacarosa
+

Maltosa
+

TSI: agar hierro tres azcares, ODC: ornitina decarboxilsa. Sacarosa y maltosa:
fermentacin de, preferentemente en medio base de Andrade.
b
Slo un pequeo porcentaje de P. mirabilis puede fermentar sacarosa y producir un TSI
cido/cido.
c
La mayora de los aislados no generan SH2 en TSI.
d
Algunos aislados no decarboxilan la ornitina. En el esquema de identificacin la
diferenciacin se puede hacer a travs de las reacciones obtenidas en agar TSI. La
prueba confirmatoria es la fermentacin de la maltosa.
e
Un pequeo porcentaje fermenta sacarosa.

Para tener en cuenta:


Existen aislamientos de P. vulgaris que no invaden y no producen SH2. Estos
aislamientos presentan muchas similitudes fenotpicas con los aislamientos de
Providencia spp ureasa+ (P. rettgeri o P. stuartii). La Tabla 4 muestra las
similitudes y las diferencias fentipicas entre ambos.

Tabla 4: Caractersticas diferenciales y similitudes entre P. vulgaris SH2- y


no invasivo y Providencia spp ureasa+.
Prueba
Providencia spp

Proteus vulgaris
(SH2-, No invasivo)

(ureasa +)

Agar TSI
alclino/cido

cido/ cido
a

Citrato(Simmons)b
+
LIA c
desaminada

V
desaminada

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33

Indol
+
ODC
-

Manosa
+
Xilosa

Gelatinasa

Maltosa

Es posible que aislamientos que fermentan la sacarosa (ms frecuentemente se


observan en P. stuartii) produzcan un TSI cido/ cido, es decir idntico al que produce
P. vulgaris.
b
Citrato + 20%, en Farmer JJ et al. Manual of Clinical Microbiology, 2007. Aislados de
Providencia spp pueden no crecer en citrato.
c
Caractersticas fenotpicas idnticas entre Providencia spp y P. vulgaris
d
Caractersticas diferenciales de gnero.

Con referencia al perfil de sensibilidad P vulgaris es portador de una


lactamasa de clase A de Ambler (grupo 2e de Karen Bush), tipo cefuroximasa,
que se inhibe con cido clavulnico. Esta -lactamasa confiere a los aislados
salvajes resistencia a las aminopenicilinas, a las cefalosporinas de primera
generacin, como la cefalotina, pero no a la combinacin de aminopenicilinas
con ihnibidores de -lactamasas (como ampicilina con sulbactama y amoxicilina
con cido clavulnico).
En

cambio,

Providencia

rettgeri

P.

stuartii

son

portadoras

de

una

cefalosporinasa de clase C de Ambler (grupo 1 de Karen Bush), de tipo AmpC.


De ello se deduce que posee resistencia a las cefalosporinas de primera
generacin y de acuerdo a la capacidad de induccin a las aminopenicilinas y a
la combinacin de las mismas con inhibidores de lactamasa. No obstante,
Cornaglia et al. han descripto aislados de Providencia de origen urinario,
sensibles a amoxicilina-cido clavulnico. Providencia stuartii (tambin lo puede
ser P. rettgeri) es resistente a gentamicina.

Bibliografa:

PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

34

Abbot S. Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Plesiomonas, and other


Enterobacteriaceae. En Versalovic J, Carroll K, Funke G, Jorgensen J, Landry ML,
Warnock D. Manual of Clinical Microbiology. 10 Edicin. Vol 1. Captulo 37. ASM
Press, Washington DC, 2011.
Farmer JJ III, Wright K, Janda M. Enterobacteriaceae. En Murray P, Baron H,
Jorgensen J, Landry ML, Pfller M. Manual of Clinical Microbiology. 9 Edicin. Vol
1. Captulo 42. ASM Press, Washington DC, 2007.
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PCC-Nac. Servicio Antimicrobianos. INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

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