ADN RECOMBINANTE

El trmino ADN recombinante hace referencia a la creacin de nuevas

combinaciones de segmentos o de molculas de ADN que no se encuentran
juntas de manera natural. Es decir, al que se ha formado al intercalar un
segmento de ADN extrao en un ADN receptor.
La tcnica del ADN recombinante se utiliza en estudios sobre la regulacin de
la expresin gnica, en la regulacin de la produccin comercial de sntesis de
protenas como la Insulina o la hormona del crecimiento, en el desarrollo de
organismos transgnicos y en la amplificacin del ADN, es decir, en obtener un
gran nmero de copias de un gen determinado. En este ltimo caso, existe una
tcnica mejor, denominada con las siglas PCR.
La tcnica consiste en introducir el gen seleccionado en el interior de un vector
y ste, a su vez, dentro de una clula, denominada clula anfitriona.
Aprovechando la maquinaria celular, el gen se expresa, sintetizndose as la
protena codificada en el gen. Adems, al dividirse la clula, las nuevas clulas
formadas contienen ese gen que tambin sintetizan esa protena. Se genera un
grupo celular que contiene un genoma distinto.
Las etapas en la produccin de ADN recombinante son las siguientes:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Preparacin de la secuencia del ADN para su clonacin

Preparacin de un vector de clonacin
Formacin del ADN recombinante
Introduccin del ADN recombinante en una clula anfitriona
Propagacin del cultivo
Deteccin y seleccin de los clones recombinantes

1. Preparacin de la secuencia del ADN para su clonacin

Es la parte esencial del proceso, ya que el ADN debe separarse y
concentrarse.

Partimos de clulas con ncleo, que deben ser lisadas (rotas).

Las protenas estructurales, enzimas, ARN y restos moleculares
deben separarse del ADN.
El ADN obtenido se concentra y se fragmenta por accin de
las enzimas de restriccin.
Se asla el ADN que se desea clonar, por ejemplo, mediante
cromatografa lquida o por centrifugacin.
Si el ADN debe expresarse hay que aadir los segmentos reguladores
de la expresin gnica.

2. Preparacin de un vector de clonacin

El vector es el portador de la secuencia de ADN que se desea clonar. Un

vector debe presentar las siguientes caractersticas:

Una pequea secuencia de ADN fcil de aislar, como, por ejemplo,

un plsmido.
Contener distintos puntos de ataque a enzimas de restriccin y que
sean conocidos.
Poder ser incluido en la clula anfitriona con facilidad.
Replicarse de forma independiente al ADN de la clula anfitriona.
Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse y
seleccionar las clulas clonadas. Un ejemplo de marcador puede ser
la resistencia a un antibitico.

Las etapas del proceso consisten en:

Cortar el vector con enzimas de restriccin, las mismas enzimas que

se utilizaron para cortar el ADN que se quiere insertar.
Unir el vector y el ADN que se va a clonar mediante los
llamados extremos cohesivos, o pegajosos, o escalonados.

Una vez que el ADN ha sido introducido en el vector se denomina ADN

inserto, o simplemente, inserto.
Los tipos de vectores que se utilizan suelen ser plsmidos, virus como el
fago l, cromosomas creados de forma artificial y quimeras.

3. Formacin del ADN recombinante

En esta etapa se produce la unin covalente del vector y el ADN inserto
mediante una ligasa. As se realiza el sellado de la llamada Mella,
Muesca o Nick.
4. Introduccin del ADN recombinante en la clula anfitriona
Para la clonacin (replicacin del ADN recombinante) se necesita la
maquinaria celular. Por ello, hay que introducir el ADN recombinante en
una clula anfitriona.
Los tipos de clulas anfitrionas son:

Clulas bacterianas: son las ms utilizadas, ya que tienen una alta

velocidad de replicacin, un bajo coste de mantenimiento de las colonias
y son fcilmente manipulables.

Clulas eucariotas: aunque las clulas eucariotas son, en general,

difciles de mantener se usan levaduras y clulas tumorales:
Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigacin
de la expresin y la regulacin gnica y la sntesis de protenas
eucariotas.

 Clulas tumorales: apropiadas en procesos de clonacin, ya que la

velocidad de replicacin es muy alta y se mantienen los caracteres
sin producirse cambios, pues son muy estables.
Los mtodos para la introduccin del ADN recombinante facilitan la entrada
de grandes fragmentos de ADN, puesto que la membrana celular es
selectiva y no permitira la penetracin de grandes molculas.

5. Propagacin del cultivo

Se induce la divisin de clulas anfitrionas, de forma que se producen
tambin copias de ADN recombinante y, por ello, la clonacin. Primero se
efecta una siembra en placas Petri con agar como medio de cultivo. Se
dejan crecer las colonias. Cada una de ellas ser seleccionada y transferida
a distintos medios lquidos, donde seguir aumentando el nmero de
individuos de la colonia.

6. Deteccin y seleccin de los clones recombinantes

En los procesos de clonacin se utiliza un gran nmero de clulas. Al final
del proceso se hace necesario separar las clulas que contienen ADN
recombinante de las que no lo contienen.
La deteccin y la seleccin de colonias se realiza en los medios de cultivo.
En los procesos de clonacin se obtienen clulas anfitrionas que no han
incluido el vector, clulas recombinantes, es decir, que han incluido el vector
con el ADN para recombinar, y clulas anfitrionas con vector que no lleva el
ADN inserto.
Los mtodos para detectar y seleccionar son:

Mtodo de hibridacin: se utiliza una sonda marcada que hibrida

con el ADN recombinante o con el ARN mensajero que se transcribe
a partir de l.

Mtodo inmunolgico: se detecta la protena codificada en el ADN

recombinante mediante anticuerpos especficos.

Mtodos genticos: que, a su vez, pueden ser:

Insercin del vector y el ADN recombinante en un gen de la clula
anfitriona que queda desactivado. Por ejemplo, si la colonia no
produce enzima lactasa, es que el ADN recombinante se
encuentra dentro del ADN bacteriano en ese gen.
Vector con genes de resistencia a un antibitico: en el medio se
agrega el antibitico y slo crecer aquella colonia que sea
resistente a l, por tanto, que porte el ADN.

 Colonias con defectos nutricionales: se utilizan clulas anfitrionas

mutantes que no puedan sintetizar, por ejemplo, un aminocido.
Para que la colonia sobreviva, el aminocido debe ser aadido al
medio de cultivo. Empleando un vector que lleve el gen correcto
para la sntesis de dicho aminocido, haciendo crecer las colonias
celulares en medios carentes de l slo crecern las bacterias
que lleven el ADN inserto.