-;k

Principios y tcnicas
de microscopa
T

I-os biloeos celularesa menudo necesitanexaminar Ia estructura de'las clulasy de sus componentes.El microscopio es una herramienta indispensablepara ello ya que la
mayora de las estructurascelularesson demasiadopequeas para ser observadasa simple vista. De hecho, los comienzos de la biologa celular se pueden seguir hastaIa invencin del microscopio ptico, que posibilit por primera
vez a Ios cientficosla observacinde imgenesaumentadas
de las clulas.El primer microscopio ptico fue desarrollado en 1590por Z. |ansseny su sobrino H. jansenn.Durante el siguiente siglo se describieron muchas observaciones
microscpicasimportantes, entre las que destacanlas realizadaspor Robert Hooke, que observlas primeras clulas
y por Antonie van Leeuwenhoek,cuyos microscopios mejorados nos hicieron vislumbrar por primera vez la estructura interna de las clulas.Desde entonces,el microscopio
ptico ha experimentado numerosasmejoras y modificaciones hastala actualidad.
De igual forma que la invencin del microscopio ptico permiti una oleada de logros cientficos al posibilitar
por primera vez la observacinlas clulas,el desarrollo del
microscopio electrnico en la dcadade 1930revolucion
nuestracapacidadde explorar la estructuray Ia funcin celular. En microscopio electrniconos hizo pasara una nueva era en biologa celular debido a que es al menos 100 veces ms eficaz que el microscopio ptico para visualizar
objetos,abriendo nuestros ojos a la exquisita arquitectura
subcelular,nunca observadaanteriormente, y cambiando
para siempre nuestra forma de pensar sobre las clulas.
Sin embargo,a pesarde su poder de resolucin inferior,
el microscopio ptico no ha cado en desuso.Por el contrario la microscopa ptica ha experimentado un renacimiento en los ltimos aos por el desarrollo de nuevastc-

que han permitido a los investigadores

nicas especializadas
explorar aspectosde la estructuray del comportamiento celular que no pueden ser estudiadosmediante la microscopa electrnica.Estosavanceshan sido posiblespor la combinacin de tecnologasprocedentesde Ia fsica,ingeniera,
qumica y biologa molecular,y han ampliado en gran medida nuestra capacidadpara estudiar clulasempleando la
microscopa ptica.
En este apndice,exploraremos los principios fundamentalestanto de microscopaptica como de microscopa
electrnica,haciendo nfasisen las diversastcnicasespecializadasque se emplean para adaptar estos dos tipos de
microscopapara una gran diversidadde objetivos especializados.

Principios pticos de la microscopa

Aunque los microscopiospticos y electrnicosdifieren en
muchos aspectos,ambos hacenuso de principios pticos semejantes parala formacin de imgenes.Por lo tanto, comenzamos nuestra discusin sobre microscopa examinando estosprincipios comunes,y haciendoespecialnfasis
en los factoresque determinan el tamao mnimo de los objetos que pueden observarse.
.:
Le loNcrruD DE oNDA DE LA rLUMrNAcrN
ESTABLECEUN LMITE EN EL TAMAO OB LOS OBIETOS
QUE PUEDENSEROBSERVADOS
Independientementedel tipo de microscopio que se emplee, se necesitansiempre tres elementospara formar una
imagen: wa fuente de iluminacin, una muestra para ser
examinada y un sistemadelentesqlueenfocan la iluminacin
sobrela muestra y que forma la imagen.La Figura A.1 ilusPrincipios
pticos
dela mlcroscopa 873

Fuentede luz
Luzvisible

+
kvl
5o-1oo

Haz de electrones

Lentescondensadoras

Anodo

Muestras
Lentesobjetivo

Lenteselectromagnticas

Lentesde vidrio

Lentesintermedias

Lenteocular
Lentede proyeccin

Ojo humano,pelcula

Pantalla
fluorescente

l+ar4fia

n nolinr rl taar

^ dt^t^r

FiguraA.1 Sistemaspticos de los

microscopiosptico y electrnico. El
microscopio ptico utiliza luz visible
y lentes de vidrio paraformar a
partir de la muestra una imagen que
puede ser observadaa simple vista,
enfocadaen una pelcula fotogrfica
o recibida por un detector
electrnico como una cmara de
vdeo. (b) El microscopio electrnico
utiliza un haz de electronesemitido
por un filamento de tungsteno y
enfocado por lentes
electromagnticaspara formar una
imagen de la muestra en una
pantalla fluorescente,un detector
digital o una pelcula fotogrfica.
(Estosdiagramassehan dibujado
para enfatrzarlas semejanzasen el
diseogeneralentre los dos tipos de
microscopio.En realidad,el
microscopioptico estdiseado
con la fuentede luz en la parte
inferior y el ocular en la parte
superio como semuestraen la
Figura 5b.)

Afio

(cmarade vdeo)
electrnico
(a) Microscopio
ptico

(b) Microscopio
electrnico

Si dos personassujetan los dos extremos opuestos de

tra estascaractersticasen un microscopio ptico y en un micuerda y la hacen ondular mediante un movimiento rtuna
la
fuente
croscopio electrnico. En un microscopio ptico,
_
hacia arriba y hacia abajo,generarnun largo patrn
mico
lentes
consiste
de iluminacin es luz visible,y el sistema de
de movimiento en la cuerda denominado movipuede
vista
o
regular
ser
en una serie de lentes de vidrio. La imagen
puede
miento
ondulatorio (Figura A.2a).La distancia desde la
enbien directamentea travsde un ocular o bien se
de
cresta una onda a la crestade la siguientese denomina
focar sobreun detectorcomo una pelculafotogrficao una
longitud de onda. Si alguien localizado en un lado de Ia
cmaraelectrnica. En un microscopio electrnico, la fuencuerda arroja hacia la cuerda un objeto grande como una
te de iluminacin es un haz de electronesemitido por un fipelota de playa,stapuede interferir con el movimiento de
lamento de tungsteno calentado,y el sistemade lentesconla cuerda y perturbarlo (Figura A.2b). Sin embargo, si se
sisteen seriesde electroimanes.El haz de electronesseenfoca
arroja hacia la cuerda un pequeo objeto como una pelota
en una pantalla fluorescente,en una pelcula fotogrfica o es
de bisbol, el movimiento de la cuerda probablemente no
visualizada digitalmente empleando un detector.
se ver afectado (Figura A.2c). Si las personasque sujetan
A pesar de estasdiferenciasen la fuente de iluminacin
la cuerda la mueven ms rpidamente, su movimiento toy en el diseo de los instrumentos)los dos tipos de microsdava serondulatorio, pero la longitud de onda serprocopios dependen de los mismos principios pticos, y forbablementems corta (FiguraA.2d). En bstecaso,si searroman imgenes de una manera similar. Cuando se coloca
ja contra Ia cuerda una pelota de bisbol, es bastante
una muestra en el recorrido de un baz de luz o de electroprobable que el movimiento de la cuerda se perturbe (Fines, las caractersticasfsicasdel haz cambian de forma que
gura A.2e).
se crea una imagen que puede ser interpretada por el ojo
Esta analoga sencilla ilustra un principio importante: la
humano o puede ser registradapor un detector fotogrficapacidad de un objeto de perturbar un movimiento onco. Paracomprender estainteraccin entre la fuente de iludulatorio depende crticamente del tamao del objeto con
minacin yla muestra, necesitamosentender el concepto de
relacin a la longitud de onda del movimiento. Esteprincilongitud de onda que se ilustra en la Figura A.2 empleanpio es de gran importancia en microscopa, ya que significa
do la siguiente analoga sencilla.

874

y tcnicas
de microscopa
ApndicePrincipios

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)
FiguraA,2 Movimientoondulatolio,longitudde onday
pertuaciones. El movimiento ondulatorio de una cuerda sujeta
por dos personasesanilogoal movimiento ondulatorio de los
fotonesy electrones,y sepuede utilizar para ilustrar el efectodel
tamao de un objeto en su capacidadde perturbar el movimiento
ondulatorio. (a) EI movimiento rtmico del extremo de una cuerda
hacia arriba y hacia abajo generarun movimiento ondulatorio con
una longitud de onda caracterstica.(b) Cuando searroja contra la
cuerdauna pelota de playau otro objeto con un dimetro
comparablea la longitud de onda de la cuerda,seperturba el
movimiento de la cuerda.(c) Una bola de bisbol u otro objeto con
un dimetro significativamentemenor que la longitud de onda de la
cuerda producir perturbacionesmuy pequeaso no Perturbar el
movimiento de la cuerda.(d) Si la cuerdasemuevems rpidamente,
Ia longitud de onda sereducesustancialmente.(e) Ahora, una pelota
de bisbol puede perturbar el movimiento de la cuerdaporque su
metro escomparablea la longitud de onda de la cuerda.

que la longitud de onda de la fuente de iluminacin estableceel lmite del tamaomnimo de un objetoparapoder
serobservado.Paracomprenderestarelacin,necesitamos
reconocerque el movimiento de la cuerdade la FiguraA.2
es anlogoal rayo de luz (fotones)o de electronesque se
empleacomo fuentede iluminacin en el microscopiop-en otraspalabras,tantico o electrnicorespectivamente
secomportancomoondas-.
to la luz comolos electrones
Cuandoun haz de luz o de electronesincide sobreuna
fsicasdelhaz
muestra,la muestraalteralas caractersticas
de iluminacin de igual forma que la pelota de playao de
bisbolalterael movimiento de la cuerda.Debido a que un
objetoslosepuededetectarpor su efectosobrela onda,la
longitud de onda debetenerun tamaocomparableal del
objeto que debeserdetectado.
Unavezque entendemosestarelacinentrela longitud
de onday el tamaodel objeto,podemoscomprenderahora por qu los objetosmuy pequeosslo sepuedenobla longitud de onda
servarcon el microscopioelectrnico:
esmuchomscortaquela de los fotones.
de los electrones
As,algunosobjetoscomovirus y ribosomassondemasiaparaperturbaruna ondadefotonesperopuedo pequeos
den interaccionarcon una onda de electrones.Al tiempo
quedescribimoslos distintostiposdemicroscopiosy detcnicasde preparacinde muestraspuedesertil que sepregunte cmo interaccionanla fuentede iluminacin y la
de ambas
muestra,y cmo semodifican las caractersticas
paraproduciruna imagen.
Le nrsoluclN INDtcA LA cAPActDAD
ADYACENTES
PARADISTINGUIROBJETOS
SEPARADOS
COMOOBJETOS
Cuandoun haz de luz o de electronespasaa travsde una
lente y se enfocaen un punto, la imagenque se forma es
de una propiedadde lasondasdenominada
consecuencia
interferencia-proceso por el cual dos o ms ondasse
produciendouna
combinan para reforzarseo cancelarse,
onda igual a la suma de las dos ondasiniciales-. As, la
imagenque ustedve cuandoobservauna muestraa travs
de una seriede lentesesrealmenteun patrn de interaccionesaditivasy destructivasde las ondasque atravesaron
laslentes,un fenmenoconocidocomo difraccin.
En un microscopioptico seempleanlentesde vidrio
para dirigir la direccin de los fotones,mientras que un
comolentes
microscopioelectrnicoempleaelectroimanes
Aun as,los dos
paradirigir la direccinde los electrones.
fundatipos de lentestienen en comr'dos propiedades
y
La
distancia
fofocal
apertura
angular.
distancia
mentales:
y
punpunto
medio
de
la
lente
el
entre
el
cal esla distancia
to focalen el queconvergenlos rayosqueatraviesanla lente
(FiguraA.3). La apertura angular esla mitad del nguloa
del cono de luz que entra en el objetivo del microscopioa
partir dela muestra(FiguraA.4).La aperturaangularespor
lo tanto una medidade la cantidadde iluminacin que sale
de la muestray pasatravsde la lente.Esto determinala
dela microscopa 875
Principios
pticos

Lneamedia
de la lente

Rayos
parareros

medio que rodea a la muestra. (El ndice de refraccin es

una medida de la variacin de la velocidad de la luz al atravesar de un medio a otro.) El efecto de estastres variables
sobre la resolucin se describe cuantitativamente mediante la siguienteecuacinconocida como la ecuacindeAbb:

r:

Distancia
focal,
FigulaA.3 Distancia
focalde unalente. La distanciafocalesla
distanciadesdela lneamediade unalenteal punto en el que
convergen
en un focolosrayosparalelosquepasana travsdeIa
1ente.

agtdeza del patrn de interferenciay,por 1o tanto, la capacidad de la lente para trasladarinformacin de la muestra.
En los mejores microscopios pticos la apertura angular es
alrededor de 70o.
La apertura angular de una lente es uno de los factores
que determina la resolucin de un microscopio, que sedefine como la distancia mnima que existe entre dos puntos
que todava se pueden identificar como puntos separados
cuando se observancon un microscopio.
La resolucin estdeterminada por tres factores:la longitud de onda de la luz que se emplea para iluminar la
muestra, la apertura angular y el ndice de refraccin del

- 0,6u"
nsena

(A.l)

en la que res la resolucin ,t esla longitud de onda de la luz

empleada como iluminacin, n esel ndice de refraccin del
medio entre la muestra y la lente objetivo del microscopio,
y d esaapertura angular ya descrita.La constante0,61 representael grado en el que pueden solaparselos puntos de
la imagen y todava ser reconocidos como puntos separados
por un observador.
En la ecuacin anterior, la cantidad r seno de a se denomina apertura numrica de la lente objetivo y se abrevia como NA. Por lo tanto, una expresin alternativa para
la resolucin sera:

(4.2)

EN le pRcrICA, EL LMrrE DERESoLUcTN

PTICO
ESDE2OONM PARAEL MICROSCOPIO
ELECTRNICO
Y 2 NM PARAEL MICROSCOPIO
Maximizarla resolucinesuna tareaimportantetanto en
microscopapticacomo electrnica.
Yaque r esuna medida de cmode cercapuedenestardospuntosy sertodava distinguidos,la resolucinmejora al tiempo que r se
hacemspequeo.As,parauna mejor resolucin,el numeradordela EcuacinA.2 deberaserlo mspequeoposibley el denominadorlo msgrandeposible.
preguntndonoscmo maximizarla
Comenzaremos
Lenteobletvo
resolucinde una lente de vidrio usandoluz como fuente
hacerel nude iluminacin.En primer lugar,necesitamos
pequeo
posible.
La
longitud
de ondapara
meradorlo ms
la luz visibleoscilaen el rangode 400-700nm, por lo que
vendrdeterminadopor la longitud
el valormnimo para,2,
de onda ms corta, dentro de esterango,que seaprctica
como fuentede iluminacin lo que resultaserluz azulde
alrededorde 450nm. Paramaximizarel denominadordela
lmagen
rmagen EcuacinA.2,recuerdequela aperturanumricaesel producto del ndicede refracciny el senode la aperturaangular.Estosdosvaloresdebenpor lo tanto sermaximizados
para alcanzaruna resolucinptima. Ya que la apertura
angularparalos mejoresobjetivosesalrededorde 60o,el va(b) Lentede aperturaalta
(a) Lentede aperturabaja
lor mximoparasenode a esalrededorde 0,94.El ndice
de refraccinparael aireesde aproximadamente
1,0,por
Figun 4.4 Apertutaangulatde una lente. La aperturaangulares
la mitad del ngulo a del cono de luz que entra en la lente objetivo
parausarseen seco,la aperlo queparauna lentediseada
del microscopio a partir de la muestra. (a) Lente de poca apertura
tura numricamximaesde alrededorde 0.94.
(a espequeo).(b) Lentede aperturagrande (a esgrande).A
As,parauna lentecon aperturaangularde 70",la resomayor apertura numrica ms informacin puede transmitir la
parauna muestrailuminada en secocon luz azulde
lucin
lente. Las mejores lentes de vidrio pueden tener una apertura
450nm sepuedecalcularde la manerasiguiente:
angular de alrededor de 70'.
876

y tcnicas
ApndicePrincipios
demicroscopa

0.61
I -

NA
- (o'61)J450)
:292nm
0.94

(A.3)

Por tanto, como regla bsica,el lmite de resolucin para

una lente de vidrio en seco es aproximadamente 300 nm.
Con objeto de incrementar la apertura numrica, algunas lentes de microscopio estn diseadasparaufrlizar aceite de inmersin entrela lente en la muestra. El aceitede inmersin tiene un ndice de refraccin mayor que eI aire
por tanto, permite que la lente reciba mayor cantidad de luz
transmitida a travs de la muestra. Debido a que el ndice
de refraccin del aceitede inmersin es alrededor de 1,5,la
apertura numrica mxima para una lente de aceitede inmersin esalrededorde 1,5 X 0,94 : 1,4.Por lo tanto, Ia resolucin de una lente para aceitede inmersin es de alrededor de 200 nm.

0,614
NA

(0 ,6 r)(4 so )
:

1,4

Iyb nm

(A.4)

As,el lmite deresolucin(la mejor resolucinposible)

paraun microscopioqueemplealuz visibleesaproximadamente300nm en secoy de 200nm conlentesparaaceitede
inmersin.La resolucinpuedeseroptimizadahastavaloresde 100nm empleandoluz ultravioletacomo fuentede
iluminacin,debidoa la longitudde ondamscorta(200300nm) deesetipo deluz.Sinembargo,laimagendebeser
entoncesregistradaen una pelculafotogrftcao mediante
algnotro medio de deteccinya que la luz ultravioletano
esvisibleparael ojo humano.Adems,elvidrio corrientees
por lo quesedebenemplearlenopacoa la luz ultravioleta,
tesde cuarzomuy caras.En cualquiercaso,Iosvaloresque
hemoscalculadosonlos lmitestericosde resolucin.En
laprctca,esraro alcanzarestoslmites debido a las abetcnicos)de laslentes.
rraciones(defectos
Debidoa queel lmite de resolucindeterminalacapacidaddeuna lenteparadistinguirentredosobjetosqueesel lmite superiorde
tn muy prximos,tambin establece
posibles
concualquierlente.En la prclosaumentostiles
tica,Iosmayoresaumentostilesquesepuedenconseguir
conun microscopiopticosonde alrededorde 1.000veces
Yaquela aperla aperturanumricade la lenteempleada.
tura numricavaraentre 1,0y 1,4,estosignificaque los
aumentostilesde un microscopiopticoestnlimitados
aproximadamente
a 1.000Xen secoy a 1.400x con aceite
de inmersin.Losaumentospor encimade estoslmitesse
vacos>
ya queno proporcionanindenominan<aumentos
formacin adicional acercadel objeto que seestudia.
La forma ms efectivade alcanzarms aumentoses
cambiarla fuentede iluminacin deluz visiblea electrones.

Debidoa quela longitudde ondade un electrnesalredevecesmspequeaquela deun fotn deluz

dor de 100.000
visible,el lmite terico de resolucinde un microscopio
electrnico(0,002nm) es algunosrdenesde magnitud
menor que el del microscopioptico (200 nm). Sin embargo,algunosproblemasprcticosen el diseode laslenparaenfocarlos electrones
empleadas
teselectromagnticas
evitan que el microscopioelectrnicoalcanceestevalor
proterico.EI principalproblemaesqueloselectroimanes
cuandola aperturanuducendistorsionesconsiderables
mricaesmayor de algunasdcimasde grado.Estengulo
diminuto esvariosrdenesde magnitudmspequeoque
el de una lente de vidrio de buenacalidad(alrededorde
70'), lo que confiereal microscopioelectrnicouna apermspequeaquela del
tura numricaconsiderablemente
microscopioptico.El lmite de resolucinpara el mejor
microscopioelectrnicoespor lo tanto nicamentede alrededorde 0,2 nm, lejos del lmite terico de 0,002nm.
Adems,cuandose observanmuestrasbiolgicas,existen
problemascon la preparacinde la muestray con el contraste,que hacenque el lmite prcticode resolucinseaa
menudoentorno a2 nm.Enla prctica,la resolucindeun
100vecesmejor
microscopioelectrnicoesgeneralmente
que la de un microscopioptico.Como resultado,los aumentostilesde un microscopioelectrnicosonalrededor
de 100vecesios de un microscopioptico,esdecir,alrededor de 100.000x.

El microscopioptico
El microscopio ptico abri inicialmente nuestrosojos a la
existenciade las clulas.Un nombre pionero en la historia
de Ia microscopa ptica esel de Antonie van Leeuwenhoek,
el comercianteholandsreconocido generalmentecomo el
padre de la microscopaptica. Laslentesde Leeuwenhoek,
que l mismo fabric durante los ltimos aos del siglo xvtt, tenan una calidad sorprendentementealta para
aquellapocay eran capacesde aumentar 300 veces,lo que
supone una mejora de 10 vecescon respectoa los instrumentos previos. Este incremento en la capacidadde aumentar
hizo visible por primera vez el interior de las clulasy las observacionesde Leeuwenhoekdurante ms de 25 aos condujeron al descubrimiento de las clulasen varios tipos de
muestrasbiolgicasy establecieronel escenariopara la formulacin de la teora celular.

Los utcRoscoproscoMpuEsTosEMpLEAN
COMBINACIONES DE VARIAS LENTES
Se han hecho avances considerables en la construccin y la

aplicacinde microscopiospticosen los 300aosposteEn la actualidad,

rioresal trabajopionerode Leeuwenhoek.
el instrumentode eleccinen microscopaptica utiliza
lentesy sedenominapor Io tande diversas
combinaciones
to microscopiocompuesto(FiguraA.5).En la FiguraA.5se
ilustrael recorridode la luz en un microscopiocompuesto
Elmicroscopio
ptico

877

Ocular (pieza ocular)

Aumenta
la imagen
formada por el objetivo
Lenteocular

Tubodel cuerpo
Transmite
la imagen
al ocular
delobjetivo

Lneade visin
de la luz

Brazo

4s4

AfTM
Tubo del
cuerpo

LentesobjetvoPrincipales
lentesqueaumentan
la muestra

hiotirrne
v v l v L '

v v

Platina Mantiene
la posicinde la

preparacron
mrcroscoprca
lvluestra

CondensadorEntoca
la luza travsde la
muestra

Lentes
conoensaooras

Diafragma ControlaIa cantidad

de luz oue entraen el condensador

Tornillode enfoquerpido
Iluminador
Fuentede luz
.. r".*,r$rti

Base

Basecon
la fuente
de iluminacin

ts,

Tornillode enfoquefino

(a) Partesy funcionesprlncipales

(b) Recorridode la luz (de abajo a arriba)

FiguraA.5 Microscopioptico compuesto. (a) Un microscopio ptico compuesto. (b) Recorrido de la luz a ttavs del microscopio
comPuesto.

que comienzacon la fuentede iluminacin, normalmente

una fuentedeluz localizadaen la basedel instrumento.Los
rayosde luz procedentesde estafuente pasana travsde
lentescondensadorasque dirigen la luz haciala muestra
montadaen un portaobjetosde vidrio dispuestoen la platina del microscopio.La lente objetivo, localizadainmedela formacin
diatamentesobrela muestra,esresponsable
dela imagenprimaria.La mayorade microscopioscompuestostienen diversosobjetivosde distintosaumentos
montadossobreun revlverrotatorio.
aumentadapor
La imagenprimaria esposteriormente
la lente ocular, o pieza ocular. En algunosmicroscopios
entre el objetivo y el ocular se posicionauna lente intermediaparaconseguiran msaumentos.Losaumentostotalesde la imagense puedencalcularmultiplicandolos
aumentosdel objetivo,del oculary dela lenteintermedia(si
As,un microscopioconun objetivode l0 x,
estpresente).
una lenteintermediade2,5X,y un ocularde 10X,aumenta250 vecesla muestra.
Los elementosdel microscopiodescritoshastaahora
constituyenla forma bsicade microscopaptica denominada microscopade campo claro. En microscopiode
esbaracampoclaro,comparadocon otrosmicroscopios,
to y fcilde usary alinear.Sinembargo,Iasnicasmuestras
878

y tcnicas
ApndicePrincipios
de microscopa

mediantemicroscoque sepuedenobservardirectamente
pa de campoclaroson aquellasque tienencolor o tienen
algunaotra propiedadque afectaa la luz que la atraviesa.
Muchasmuestrasbiolgicascarecende esascaractersticas
o examinay por lo tanto debenserteidascon colorantes
Estos
microscode
microscopios.
dascon tipos especiales
que
para
los
adecuan
piosespecficos
tienenvariasventajas
visualizardistintostipos de muestras.Entre ellosseincluyen Ia microscopade contrastede fase,la microscopade
contrastede interferenciadiferencial,la microscopade
y la microscopaconfocal.En las siguientes
fluorescencia
stasy otrastcnicasimportantes.
estudiaremos
secciones
DETEcTA
Le urcRoscopA DE coNTRAsrE DEFASES
DIFERENCIASEN EL NOIC DE REFRACCIN
Y EN EL GROSOR
Como describiremos ms adelante con mayor detalle, antes de poder examinar las clulas mediante microscopa de
campo claro, stas habitualmente se matan, se cortan en
seccionesfinas y setien. Aunque estosprocedimientos son
tiles para visualizar los detalles de la arquitectura celular
interna, el estudio de clulas que se han fijado, seccionado
y teido proporciona poca informacin acercade los aspectos dinmicos del comportamiento celular. Por lo tan-

to, sehan desarrolladouna ampliavariedaddetcnicaspara

el uso de microscopaptica en la observacinde clulas
que estnintactasy en muchoscasostodavavivas.Una de
estastcnicas,la microscopade contrastede fases,incrementa contrastesin necesidadde cortar ni teir, haciendo
uso de lasdiferenciasde grosory de ndicede refraccintle
variasregionesde las clulasque seexaminan.Paraentender lasbasesdela microscopade contrastedefasedebemos
primero saberque un haz de luz estcompuestopor multitud de rayosindividualesde luz. A medida que los rayos
pasandesdela fuente delaz a travsde la muestra,suvelocidadpuedeverseafectadapor laspropiedadesftsicasde la
muestra.Habitualmente,la velocidadde los rayosseve disminuida de maneravariable por distintas regionesde la
muestra,lo que produceun cambio de fasecon relacina
el objeto(sediceque
lasondasdeluz queno han atravesado
en lasondasde luz viajan enfaseunndo coincidenlascrestasy los vallesde lasondas).
Aunque el ojo humano no puededetectardirectamendecontrastedefase
te estoscambiosdefase,Ia microscopa
solucionaesteproblematransformandolas diferenciasde
faseen alteracionesdel brillo. Estaconversinseconsigue
usandovna placadefase(FiguraA.6) que es un compo- Planode la imagen

Placa
de fase

Luz difractada
(fasealterada
por la muestra)
Lenteobjetivo

nenteptico dispuestoen el recorrido de la luzpor encima

del objetivoparaponer en faselos rayosdirectosno difractadoscon aquellosquehan sido difractadospor la muestra.
El patrn resultantede longitudesde onda intensificala
imagen,produciendouna imagencon alto contrasteentre
zonasclarasy oscurassobreun fondo iluminado homoglasestructuras
inneamente(FiguraA.7).Comoresultado,
ternasen lasclulassevisualizana menudomejor mediante microscopade contrastede fasequecon pticadecampo
claro.
Estamodalidaden microscopaptica es particularmentetil para examinarmuestrasvivasy sin teir ya que
los materialesbiolgicosproducendifraccin de la luz de
de contrastede fase
maneracasiinevitable.La microscopa
seempleageneralmenteen microbiologay en Ia investigacin con cultivoscelularespara detectarbacterias,orgnulos celularesy otras pequeaspartculaspresentesen las
muestrasvivas.
Le urcnoscopA DE coNTRASTEDE TNTERFERENcIA
(OTC)UTU-ZA UN DISOCIADOR
DELIj.AZ
DIFERENCIAL
DE FASE
DIFERENCIAS
DELUZ PARADETECTAR
La microscopla de contrastede interferencia diferencial
(DIC) en principioseasemeja
de contrasa Ia microscopa
ya queempleaun prismaeste defase,peroesmssensible
(Fipecialparasepararel hazdeluz en dosrayosseparados
guraA.8). Cuandolos doshacesserecombinan,cualquier
cambiode faseen algunode ellosproducidoal pasara travsde la muestragenerauna interferenciacon el segundo
haz.Debidoa quelos principalescambiosde fasenormalmenteseproducenen losbordesde lasclulas(el ndicede
refraccinesmsconstantedentrode la clula),la perifeuna sealintensa.La
ria de la clulaproducegeneralmente
imagentiene aparienciatridimensionalcomo resultadode
una ilusindefusinde sombrasqueseproduceya quelas

Luz directa
(fase inalterada
por la muestra)

Lentecondensadora

G?lxl'#'"
Fuentede luz

FiguraA.6 0ptica del mictoscopiode conttaste de fase.

Configuracin de los elementospticos y de los recorridos de los
rayos de luz a travs del microscopio de contrastede fase.Las lneas
rosasrepresentanla luz difractada por la muestra y las lneasnegras
representanla luz directa.

so;m-

de conttastedefase. Micrografade
FiguraA.7 Mictoscopia
Lasclulasfueronobservadas
contrastede fasede clulasepiteliales.
sin procesary sin teir,lo queesunaventajaprincipalde la
de contrastede fase.
microscopa

Elmicroscopio
ptico

879

-------Plano

de laimaoen

Analizador
(rotado90" con respectoal polarizadr)
Prismade Wollaston

\i
Lenteobjetivo

2 hacesde luz polarizada

separadospor el prismainferior
Lentescondensadoras

Prismade Wollaston
Polarizador

Q-ruente

oetuz

-E-

Figura
A.8 Optica
delmicroscopio
decontlaste
deinteilerencia
(DlG). Configuracin
diferencial
deloselementos
pticos
y delos
recorridos
delosrayosdeluzatravs
delmicroscopio
DIC.
diferenciasde fasesonpositivasen un lado dela cebray negativasen el ladoopuesto(FiguraA.9).
Los componentes
pticosnecesarios
parala microscopa DIC incluyenan polarizador,unanalizadorywpar de
prismasdeWollaston
(FiguraA.8).El polarizadory el primer
prisma de Wollanstonseparanel rayo de luz, creandodos
hacesseparadospor una pequeadistanciaen una direccin. Despusde atravesarla muestra,los hacesserecombinan por el segundoprisma de Wollanston.Si no existe
muestra,loshacesserecombinanparaformar un rayoidntico al que entr inicialmenteen el polarizadory en el primer prismadeWollanston.En presenciadeuna muestra,los
doshacesno serecombinandela mismaforma (interfieren
entreellos),ylapolarizacin de los hacesrota ligeramente
en compracincon el original. El efectoneto esun marcadoincrementode la resolucin,que haceque estatcnica seaespecialmente
til para estudiarmuestrasvivasy sin
teir. Como veremosen breve,la combinacinesatcnica
con la videomicroscopaes una aproximacinespecialmenteefectivapara estudiarlos procesosdinmicosde las
clulasen tiempo real.
880

y tcnicas
ApndicePrincipios
de microscopa

Torrm'
Figura
4.9 Microscopa
DlC. Micrografa
DICdeun grupode
neuronas hipocampalesde rata creciendo en cultivo. Obsrveseel
efecto de grabado de sombra que haceque estasclulasaparezcan
oscurasen la parte superior y clarasen la parte inferior.

Losbilogoscelulares
empleanotrosmtodosdemejora de contraste.LamodulacindecontrastedeHoffman,desarrolladapor Robert Hoffman, incrementael contraste
detectandogradientespticos a travsde una muestra
transparente,utilizando filtros especiales
y un polarizador
que rota. La modulacin de contrastede Hoffrnan produceun efectode fusinde sombrasparecidoal de la microscopaDIC.
pERMrrE
Le urcRoscopA DEFLUoREScENcIA
DETECTAR
LA PRESENCIA
DEMOLCULAS
O IONES
ESPECFICOS DENTRO DE LAS CLULAS

Aunque las tcnicasmicroscpicas

descritashastaahora
sonbastanteefectivasparavisualizarlasestructurascelulares,proveenrelativamente
pocainformacinacercadela localizacinde molculasespecficas.
Una forma de obtener
estainformacin esmedianteel uso de la microscopade
fluorescencia,que permite la Tocalizacinde molculas
fluorescentes
dentrodelasclulas.Paraentendercmo funcionala microscopa
primero
de fluorescencia
esnecesario
comprenderel fenmenode la fluorescencia.
Naturaleza
de la fluorescencia.El trmino fluorescencia
hacereferenciaal procesoquecomienzaconla absorcinde
luz por una molculay termina con su emisin.La aproximacin a esteprocesose optimizaconsiderandoel comportamiento de un cuanto de luz en contraposicina su
comportamientoondulatorio.La FiguraA.l0 esun diagrama de los diversosnivelesde energade un tomo simple.
Cuandoun tomo absorbeun fotn (o cuanto)de luz de
una determinadaenerga,uno de suselectronessaltade su

de una molcula fluorescentetpica. Cada molcula fluorescentetiene su propio espectrode absorciny de emisin
caracterstico.

c
.o

b
c)
c)
-o

El microscopiode fluorescencia. La microscopa de fluorescencia es un tipo especializadode microscopa ptica que

emplea luz para excitar fluorescencia en la muestra. Un microscopio de fluorescencia tiene un filtro de excitacin entre la fuente deluzy el condensador, que transmite nicamente luz de una longitud de onda particular (FiguraA.l l).
El condensadorenfoca la luz sobre la muestra, produciendo que los compuestosfluorescentesde la muestra emitan
luz de una longitud de onda ms larga. Thnto la luz de excitacin del iluminador como Ia luz emitida, generadapor
los compuestosfluorescentesde la muestra, pasan a travs
del objetivo. A medida que la luz pasaa travsdel tubo del

!
,g

9)
c)
c

LIl

Estadobasal
(a) Diagramade energa

N
f,

-c)

Planode la imagen

'11

p
E
(
O

Luz
400

500

600

700

I
i

VlSlDle

Filtrn herrare

Longitudde onda (nm)

(b) Espectrosde absorciny de emisin
FiguraA.10 Principiosde la fluorescencia. (a) Diagramade
energade la fluorescenciade un tomo simple.La luz de una
determinadaenergaesabsorbida(lneaazul).El electrnsaltade
su estadobasala un estadoexcitado.Vuelveal estadobasal
emitiendo un fotn de menor energay por lo tanto de mayor
longitud de onda (por ejemplo,Iuz roja). (b) Espectrosde
absorcin y de emisin de una molcula fluorescentetpica. La
curva azul representaIa cantidad de energaabsorbida en funcin
de la longitud de onda, y la curva arroja muestra la cantidad de luz
emitida como funcin de la loneitud de onda.

/hlnn,roa

la transmisin
de toda
la luz ultravioleta,

normitiondn

al nrcn

nicamente
de luz visible)
Lenteob.letivo

lvluestra

Luz
ultravioleta
Lentecondensadora

estado basal un estado excitado o de mayor energa. Este

electrn a menudo pierde parte de su energa y desciende a
su estado basal original, emitiendo un fotn al hacerlo. El
fotn emitido tiene siempre menor energa (mayor longi-

tud de onda) que el fotn original que fue absorbido.As,

por ejemplo, la iluminacin con luz azrtlde un tomo puede producir Ia emisin de luz roja (la energade un fotn
esinversamenteproporcional a su longitud de onda; por lo
tanto, la luz roja, al tener una longitud de onda mayor que
lahlz az,il' tiene menor energa).
Las molculas fluorescentes en realidad tienen diagramas de energams complicados que los que se muestran
en la Figura A.10a. El nmero de nivelesposiblesde energa en las molculas reales es mucho mayor y por lo tanto,
los diferentes tipos de energa que se puedan absorber y
emitir son consecuentementems numerosos.En Ia Figura A.10b se muestran los espectrosde absorcin y emisin

Filtrode excitacin(fillra
la luz y transmitenicamente
rayosultravioleta)

\ -ruenre oe ruz
EI
+

FiguraA,11 pticadel microscopiode fluorescencia.

Configuracinde los elementospticosy de Ios recorridosde la luz
a travs del microscopio de fluorescencia.Laluz procedentede la
fuente de iluminacin pasaa travs de un filtro de excitacin que
transmite nicamente luz de excitacin (lneasnegrascontinuas).
La iluminacin de Ia muestra con estaluz produce que sus
molculasfluorescentesemitan luz de una longitud de onda mayor
(lneasazules).Posteriormente,el filtro barrera elimina la luz de
excitacin y permite el paso de Ia luz emitida. Por lo tanto, Ia
imagen se forma exclusivamentea partir de luz emitida por las
molculasfluorescentesde Ia muestra.

Elmicroscopio
ptico

881

microscopio por encima del objetivo, atraviesaun filtro barrera que elimina especficamentela longitud de onda de la
luz de excitacin. Esto deja nicamente las longitudes de
onda de la luz emitida por la muestra parala formacin de
la imagen fluorescentefinal que, por lo tanto, parecebrillante frente a un fondo oscuro.
Anticuetposfluotescentes, Para emplear la microscopa de
fluorescenciaen la localizacinde molculaso iones especficos dentro de las clulas,los investigadoresdeben emplear
indicadores especialesde las molculas denominados sondas
lluorescentes.Una sonda fluorescente esuna molcula capaz
de emitir luz fluorescentey que puede emplearsepara indicar la presenciade una molcula o un ion especfico.
Una de las aplicacionesms frecuentes de las sondas
fluorescentesesla inmunotincin, una tcnicabasadaen la
capacidadde los anticuerposde reconocery unirse a molculas especficas(las molculas a las que se unen los anticuerpossedenominan antgenos).Los anticuerposson protenasproducidas de manera natural por e1sistemainmune
en respuestaa la presenciade microorganismosinvasores,
pero se pueden generartambin en el laboratorio inyectando una protena extraau otra macromolculaa un animal como un conejo o un ratn. De estaforma, es posible
a virproducir anticuerposque se unirn selectivamente
tualmente cualquier protena que un cientfico quisieseestudiar. Los anticuerposno son visiblesdirectamenteusando microscopa ptica, sin embargo, se suelen unir a
colorantes fluorescentescomo Ia fluorescena,que emite
fluorescenciaverde,o \a rodamina,que emite fluorescencia
roja. Ms recientemente los anticuerpos se han unido a
<quantum dots>>
que son cristalesdiminutos que emiten luz
y que son ms establesqumicamente que los colorantes
tradicio nales.Para identifi car la lo calzacin subcelularde
una protena especficalas clulassetien simplementecon
un anticuerpo fluorescentedirigido contra Ia protena y la
localizacin de la fluorescenciase detectamediante el examen de Ia clula con luz de la longitud de onda apropiada.
Se pueden aplicar tcnicasmicroscpicasde inmunofluorescenciausando anticuerpos marcados directamente
con marcadoresfluorescentes(FiguraA.l2a). Sin embargo,
la microscopa de inmunofluorescenciase emplea ms comnmente utilizando tcnicasde inmunofluorescencia indirecta (Figura A.12b). En la inmunofluorescenciaindirecta se trata un tejido o una clula con un anticuerpo sin
marcar. Este anticuerpo, llamado anticuerpoprimario, se
une a los sitios antignicosespecficosdentro del tejido o de
la clula.Entoncesse aadeun segundotipo de anticuerpo
llamado anticuerpo secundario.El anticuerpo secundario
estmarcado con una partcula fluorescentey se une al anticuerpo primario. Debido a que se pueden unir ms de
una molcula de anticuerpo primario al antgeno,y ms de
una molcula de anticuerpo secundario al anticuerpo primario, seconcentrauna mayor cantidad de molculasfluorescentescercade la molcula que queremos detectar.Como

882

y tcnicas
demicroscopa
Apndice Principios

Anticuerposmarcados
con un colorante
fluorescente

A n t i c u . e r p o sV, , , Y
.,
otflgtooscl /
especrlrcos

Se permiteque los
anticuerpos
se unan

;;;;;;;;,r1s"r;-4
1
\A v

r1'

(a) Inmunofluorescencia
Anticuerpos
especficos
frenteal antgeno
primario)
(anticuerpo

\/\
-

f'(

I
-t

a losanticuerpos
Sepermite
unirseal antgeno

v -

Se aadenanticuerpos
marcadosque se unen
a los anticuerposprimarios
("anticuerposecundario')
(b) Inmunofluorescencia
indirecta
empleando
anticuerposfluotescentes.
FigwaA.t2 Inmunotincin
sebasaen el uso de
La microscopade inmunofluorescencia
anticuerposmarcadoscon fluorescenctaparadetectarcomponentes
(antgenos)dentro de una muestrade
molecularesespecficos
directaun anticuerpoque se
tejido. (a) En la inmunofluorescencia
une a un componentemolecularen la muestrade tejido semarca
El anticuerpomarcadoentoncesse
con un colorantefluorescente.
aadea la muestrade tejido unindosea algunaslocalizaciones
El patrn de fluorescenciaque seorigina sevisualiza
especficas.
empleandomicroscopade fluorescenciao confocal.(b) En ia
inmunofluorescenciaindirecta,seaadeun anticuerpoprimario al
tejido.A continuacinseaadeun anticuerposecundarioque lleva
El anticuerposecundarioseune al
el marcajefluorescente.
anticuerpoprimario. Debido a que sepuedeunir ms de un
anticuerposecundariofluorescentea cadamolculade anticuerpo
primario, la inmunofluorescenciaindirectaamplificade manera
haciendoque seams sensibleque la
efectiva1asea1fluorescente,
inmunofl uorescenciadirecta.

resultado, la inmunofluorescencia

indirecta produce una

amplificacin de la sealy esmucho ms sensibleque la utilizacn de un nico anticuerpo primario. El mtodo es

<indirecto>ya que no detectadirectamentednde se unen
los anticuerpos a los antgenos;tcnicamente,la fluorescencia refleja el sitio al que se ha unido el anticuerpo secundario. Por supuesto,esto refleja el lugar donde se localizala molcula originaria de inters.

Ottassondasfluotescentes,En microscopade fluorescencia seempleantambinprotenasnaturalesque son unidas

Por
a componentescelularesespecficos.
selectivamente
ejemplo,la FiguraA.l3muestraunaimagendefluorescencia de clulasepitelialesteidas confaloidina, una toxina
que se
procedentede una seta,marcadacon fluorescena,
a los microfilamentosde actina.Otra
une especficamente
utiliza la protenaverde
tcnicapotentede fluorescencia
fluorescente(GFP),una protenafluorescentede origen
naturalproducidapor la medusaAequoriavictoria.Usanlos cientficospueden
do tcnicasde DNA recombinante,
unir el DNA que codificapara GFP a un gen que codifica

--

1orm-----]

de
defluotescencia.Clulasepiteliales
FiguraA.13 Micloscopa
phalloidina,
rin de perroteidasconel colorantefluorescente
queseunea losmicrofilamentos
de actina.

(a)00:00

(b) 03:a0

una protenacelularen particular.Et DNA recombinante

resultantesepuedeintroducir dentro de las clulas,en las
queseexpresarparaproducir
unaversinfluorescente
de
la protenacelularnormal.En muchoscasos,la fusin de
GFP al final de una protenano interfierecon su funcin,
lo que permite el uso de la microscopade fluorescencia
paravisualizarprotenasfusionadasa GFPmientrasstas
desempeansus funcionesen una clulaviva (Figuhan producidoformas
ra A.14).Losbilogosmoleculares
que
y
emiten
luz de diversas
absorben
mutantesde GFP
longitudesdeonda.Adems,sehan identificadootrasproroja del
tenasde origennatural,la protenafluorescente
coral.Estasherramientashan expandidoel repertoriode
queestna disposicindelosbimolculasfluorescentes
Iogoscelulares.
sepuedeutilizar para
La microscopade fluorescencia
monitorizarla distribucinsubcelulardevariosionesadecomoprotenas.Para
msde paradetectarmacromolculas
conseguirlo,los qumicoshan sintetizadomolculascuyas
sonsensibles
a lasconcentrapropiedades
de fluorescencia
Na*,
Zn'*
y Mg2+,as
Ca2+,
H+,
de
iones
como
ciones
plasa
travs
de
la
membrana
comoa potencialeselctricos
seinyectanen cmtica.Cuandoestassondasfluorescentes
al citosolo a un
lulasde forma que sequedanrestringidas
produceninformacin
componenteintracelularespecfico,
importanteacercade las condicionesinicasdentro de la
clula.Por ejemplo,una sondafluorescentellamadafura-2
paraestudiarlasconcentraciones
seempleahabitualmente
de Ca2* dentro de clulasvivas,ya que fura-2 emite fluobajas
rescenciaamarillaen presenciade concentraciones
de Ca2+y fluorescenciaverdeo azul en presenciade conms altasde esteion. Por lo
centracionesprogresivamente
en ctanto,la monitorizacindelcolordela fluorescencia
permite
con
esta
sonda
a
los
cientficos
lulas vivasteidas
intracelularesde
observarcambiosen las concentraciones
Ca2*amedidaque stasseproducen.

(c) 05:08

-iotm-

de unaclulade un embrinde
vetdepatavisualizalptoteinas. Seriede imgenes
de la protenafluorescente
FiguraA.14 Utilizacin
protena
fluorescente
verde(GFP).El tiemporespecto
que
unida
a
la
est
mitosis.El embrinexpresa
nematodoexperimentando
B-tubulina
a Ia primerasemuestraen minutos:segundos.

Elmicroscopio
ptico

883

Le utcnoscope coNrocAl MINMTzAEL ASpEcro

BoRRoSoMEDIANTELA EXcLUSINoT LALUz zuERA
DE FOCODE LA IMAGEN
Cuando se visualizanclulasintactas,la resolucinde la
microscopade fluorescenciaestlimitada por el hechode
que aunqueseemite fluorescenciaa travsde toda la profundidad de la muestra,el observadornicamentepuede
enfocarel objetivoen un determinadomomento a un nico plano.Como resultado,la luz emitida desderegionesde
la muestrapor encimay por debajodel planofocalhaceque
la imagenseaborrosa(FiguraA.15a).Parasolucionareste
problema,los bilogoscelularesa menudo empleanel microscopioconfocal-un tipo especializado
demicroscopio
ptico que empleaun haz dehtz lserpara producir una
imagende un nico plano de la muestraen un momento
determinado(FiguraA. I 5b)-. Estaaproximacinmejora
la resolucina lo largo del ejeptico del microscopio-as
se pueden distinguir las estructuraslocalizadasen el que
centro de la clulade las que estnen la superficieo de la
parteinferior-. De igualforma,sepuededistinguiruna clula en el centro de una piezade tejido de las clulasque
estnpor encimao por debajode ella.
Paraentenderestetipo de microscopaesnecesarioprimero considerarlos recorridosde la luz que atraviesauna
lente simple.La FiguraA.16 ilustra cmo una lente forma
una imagende una fuentepuntual de luz. Paraentenderlo
que verasu ojo imagineque colocaun trozo de una pelcula fotogrficaen el plano de foco (plano de la imagen).

(a) Microscopade fluorescenciatradicional

Ahora pregntesecmo contribuyena la imagenoriginal

lasimgenesprocedentes
de otrospuntosdeluz localizados
mscercao mslejosde la lente(FiguraA.16b).Como se
puedededucir,existeuna relacinprecisaentrela distancia
entre el objeto y la lente (o), la distanciaentrela lente y la
imagenenfocadadel objeto (i) yladistanciafocalde la lente (fl.La siguienteecuacinexpresaestarelacin:
111

j:;-

(A.s)

Como muestrala FiguraA.l6b, la luz que seoriginaa

partir de los puntos que no estnen foco cubreuna superficie mayor de la pelculaya que los rayosconvergeno divergen.As, la imagen en la pelcula estformada por la
fuentepuntual original, que esten foco,y un halo de luz
superpuestoprocedentede los objetosfuera de foco.
Si nicamenteestuvisemos
interesadosen ver la fuente puntual original, podramos eliminar la ltz ajenaa
estepunto disponiendo una apertura u orificio puntual
(pinhole),en el mismo plano de la pelcula.El microscopio
confocalempleaesteprincipio para discriminar los rayos
fueradefoco.Porsupuesto,en una muestrarealno tenemos
nicamenteuna fuentepuntual de luz extraaa cadalado
del objeto que deseamosobservar,sino un continuo de
puntos.Paraentendercmo afectaestoa nuestraimagen,
imagineque en lugar de tres puntos de luz nuestramuesa estuviese
formadapor un tubo deluz fino ylargo, como
muestra
se
la FiguraA.16c.Considereahoracmo seob-

(b) Microscopade fluorescenciaconfocal

FigutaA.15 Comparacinde la microscopade fluorescenciaconfucalcon la microscopiade fluorescenciatladicional. Estasmicrograflas de

fluorescenciamuestran clulasde gla marcadascon fluorescencia(rojo) y clulasnerviosas(verde) marcadascon dos marcadorei
fluorescentesdiferentes.(a) En la microscopa de fluorescenciatradicional se ilumina la muestra completa de forma que el material
fluorescentepor encima y por debajo del plano de foco tiende a hacer borrosa la imagen. (b) En la microscopa confoial de fluorescencia,la
luz incidente se enfocaen un nico plano, y se excluyela fluorescenciafuera de foco de la muestra. La imagen resultanteespor lo tanto
mucho ms ntida. (Imagen cortesade Karl Garsha,especialistaen microscopla ptica digital, grupo de tecnologa de imagin, Instituto
Beckman de Ciencia y Tecnologa,Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Urbana,IL wwi.tig.uiux.edu.l

884

y tcnicas
ApndicePrincipios
demicroscopa

Visindel plano
de Ia imagen
Lente

Planode la imagen

(a) Formacinde una imagenpor una lentea partirde un nico

puntode luz

Visindel plano
da

Lente

la

imnan

Planode la magen
imagen

(b) Formacinen la magende un puntode |uz en presencia

aia ^trc

2 nr rninc

Visindel plano
lo l imnon
I

Lente

Planode la imagen

(c) Formacinde una imagende una seccinde un tubo

de luz uniforme

t.
1
.l

I
I

Lente

Visindel plano
de la imagen

Planode la imagen

(d) Formacinen una imagende una secciniluminada

d e u n t u b od e | u z

FiguraA.16 Reconidosde la luz a travs de una lente. (a) Imagen

de un punto nico de luz formada por una lente. (b) Recorridos de
laluz a partir de tres puntos de luz situados a diferentesdistancias
de Ia lente. En el plano de la imagen, la imagen enfocadadel punto
central sesuperpone con los rayos desenfocadosprocedentesde los
otros puntos. Sepuede usar una apertura alrededor del punto
central para discriminar los rayos desenfocadosy maximizar la
contribucin del punto central. (c) Recorridos de la luz originada a
partir de un continuo de puntos, representadocomo un tubo de
luz. Esto es semejantea una muestra iluminada uniformemente. En
el plano de la imagen, las contribuciones procedentesde una
pequea seccinenfocadaarbitraria, dx, estncompletamente
enmascaradaspor los otros rayos fuera de foco; en estecasoun
pinhole o pequeo orificio no ayuda. (d) Mediante la iluminacin
intensa de una nica seccindel tubo y la iluminacin dbil del
resto,podemos recuperar Ia informacin en el plano de imagen de
la seccin dx. Ahora un orificio localizado alrededor del punto
rcchazalos rayos fuera de foco. Debido a que los rayos del centro
proceden casitodos de dx, tenemos una forma de discriminar
frente a los puntos ms dbilesfuera de foco.

tieneuna imagena partir de una pequeaseccinarbitraria, dx. Si el tubo envala misma cantidadde luz por unidad de longitud,entoncesinclusocon un pinhole,la imagendeintersestarenmascarada
por loshalosprocedentes
de otras partesdel tubo. Estosucedeporquela pequea
contribucinde cadauna de lassecciones
fuerade foco,y
todaslaspequeas
producenconjuntamente
secciones
un
fondo intensosobrela seccinde inters.
Estasituacinesmuy semejante
a la que encontramos
en muestrasbiolgicasrealesque se han teido con una
sondafluorescente.
En general,la distribucinde la sonda
estridimensionaly cuandodeseamos
mirar en detalleun
nico objeto(comoun microtbulo)usandomicroscopa
defluorescencia
convencional,
la imagenesta menudoestropeadapor el halode luz de fondo queseoriginaprincipalmentepor los microtbuloslocalizadospor encimay
por debajodel plano de inters.Paraevitaresto,podemos
iluminar preferentemente
el plano de intersdesequilibrando as las distintascontribucionesen el plano de Ia
imagen,de formaqueprocedanprincipalmentede un nico plano (FiguraA.16d).As,la esenciade Ia microscopa
confocalconsisteen enfocaren un nico planoel hazdeiluminacin queexcitala fluorescencia,
y usarun orificio para
asegurarque la luz que llegaal plano de la imagenseorigina principalmentea partir del planoenfocado.
La FiguraA.17ilustracmofuncionanestosprincipios
enun microscopiolserconfocal,queiluminalasmuestras
empleandowhazde luz lserenfocdoa travsde una lente objetivohaciaun punto limitado de difraccin.La posicin del punto se controlamedianteespejosde barrido,
que permiten que el haz deluz recorrala superficiede la
muestrade formaprecisa.
A medidaqueel hazhaceun barrido sobrela muestraseforma una imagena partir de la
mismade la siguienteforma.En primer lugar,la luz fluorescente
emitidapor la muestraescaptadapor la lenteobjetivo y conducidapor el mismo recorrido de la luz inciElmicroscopio
ptico

88s

Lser
Espejos
de barrido

Haciael
oroenaoor
Espejodicroico
Detector
| t ^hiii\/^
(tubofotomultiplicador)
L v , , r v

v v J v ! , v v

Muestra
(b)
FiguraA.1? Microscopiode banidolserconfocal. (a) Fotografiay
(b) esquemade un microscopio de barrido lserconfocal.Seemplea
un lserpara iluminar un punto de la muestra en un determinado
momento (lneasazules).Los espejosde barrido mueven el punto en
un determinado plano de foco siguiendoun patrn preciso.La luz
fluorescenteemitida por la muestra (lneasrojas) esreflejadapor los
mismos espejosde barrido y retorna por el mismo recorrido original
del haz incidente.La luz emitida no urelve al lser por el contrario,
estransmitida a travsde un espejodicrico (que en esteejemplo
refleja la luz azul y transmite lafuzroja). Un orificio o pinhole en el
plano de la imagen bloquea los rayosextraosque estnfuera de
foco. La luz esdetectadapor un tubo fotomultiplicador, cuya seales
digitalizaday almacenadaen un ordenador.

dente. El recorrido de la luz fluorescente se separa entonces

de la luz lserutilizando un espejodicroico,que reflejaluz

de un color y transmitela de otro. Debido a quela luz fluorescentetieneuna longitud de onda mslargaquela luz de
hacia
esdesplazado
excitacin,el color dela luz fluorescente
el roio. La luz fluorescenteatraviesael orificio localizadoen
886

y tcnicas
demicroscopa
ApndicePrincipios

un plano de la imagen,frentea un tubo fotomultiplicador,

que actacomo detector.La sealdel tubo fotomultiplicador esentoncesdigitalizaday mostradaen un ordenador.
Paraver el incrementode resolucinque seobtienecon la
microscopaconfocal,vuelva a mirar la Figura A.15, que
muestraimgenesde la misma clulavisualizadamediante microscopade fluorescenciaconvencionaly mediante
microscopade lserconfocal.
Como alternativaa la microscopalserconfocal,el miconfocaldediscogiratorioempleadiscosque giran
croscopio
rpidamentey que contieneun conjunto de pequeaslende pinholes.Aunque no
tes y una seriecorrespondiente
puedeproducir seccionespticastan finas como los milserconfocal,puedegenerarimgenesconfocroscopios
calesque sepuedenadquirir rpidamenteusandocmaras
digitales.Estavelocidadestil paravisualizarprocesosrpidosqueseproducenen lasclulas.
En microscopaconfocal,seempleaun pinholeparaeliminar la luz fuerade foco.El resultadoesuna imagenntida, aunquelas molculaspor encimay por debajodel plapor Ia luz
no focaldela lenteobjetivoestnsiendoexcitadas
rpido
de
incidente.Estopuedeproducir el blanqueamiento
en algunoscasos,especiallas molculasde fluorescencia;
mentecuandoseobservanclulasvivasque contienenmoesteblanqueamientolibera radicales
lculasfl uorescentes,
txicosque puedencausarla muerte de la clula.Parareducir esta<fototoxicidad>serladeseableque nicamente
muy prximas
fuesenexcitadaslasmolculasfluorescentes
al plano focalque seestexaminando.Estoesposibleutilizandolamicroscoplade excitacinmultifotn. En la microscopade excitacinmultifotn, seempleaun lserque
emitepulsosde luz de muy altaenergay muy rpidamente
parairradiar Ia muestra.Paraqueseproduzcafluorescencia,
debeabsorberuna rpidasucesin
la molculafluorescente
dedos(o enalgunoscasostreso ms)fotones(FiguraA.l8).
Laprobabilidaddequeestoseproduzcaesmuy baja,excepto
nicercadel plano focaldel objetivo.Como consecuencia,
camentelas molculasfluorescentesque estnenfocadas
El resultadoesmuy similar en nitidez
emitenfluorescencia.
a la microscopaconfocal,perono esnecesarioel pinholeya
queno hayqueeliminarluz fueradefoco.Thmbinsereduce
la fototoxicidad.Como ejemplo,seemconsiderablemente
ple microscopade excitacinmultifotn para generarla
imagende la FiguraA.14 de un embrin vivo.
Sepuedeemplearuna terceratcnica,la microscopladigital de deconvolucin,para producir imgenesmuy ntidas.La deconvolucindigital sebasae un principio completamentediferente.En estecaso,seempleamicroscopa
de fluorescenciaconvencionalpara adquirir seriesde ima lo largo del espesorde la muestra.
genesfluorescentes
emplea
un ordenadorpafa procesardigitalEntoncesse
cadaplano focal para eliminar
mente, o deconvolucionar,
la contribucin debida alalaz fuera de
matemticamente
foco.En muchoscasos,la deconvolucindigital puedeproducir imgenescomparablesa las obtenidasmediantemi-

FiguraA.18 Microscopade
excitacinmultifotn. (a) En un
microscopio confocal estndarse
produce fluorescenciaen un
recorrido con forma de reloj de
arena a travs de la muestra. Debido
a que una zona amplia emite
fluorescenciaesmucho ms
probableque seproduzca
fototoxicidad que en la microscopa
de excitacin multifotn. (b) En un
microscopio de excitacin
multifotn la fluorescenciaest
limitada al punto de foco de los
pulsosdel lserinfrarrojo, lo que
producemucho menosdao.La
iluminacin infrarroja tambin
penetrams profundamenteen la
muestraaue la luz visible.

(a) Microscopa
confocal

(a) Microscopa
multifotn

croscopaconfocal (Figura A.l9). Una ventaja de la deconvolucin es que microscopano estrestringida a las longitudes de onda especficasque se emplean comnmente en
los lseresde los microscopios confocales.
LR vtool,ncRoscopA
DIcITAL pUEDE REGIsTRAR
IMGENESCONSECUTIVASOPTIMIZADAS
El advenimiento de detectoresde luz de estadoslido ha hecho posible en muchos casosreemplazar la pelcula foto-

(a)

grflcacon un equivalenteelectrnico-por ejemplo, con

una cmarade vdeo o una cmarade imagen digital-. Estas mejoras han dado lugar a la tcnica de videomicroscopa digital, en la que se registrany se almacenanelectrnicamenteimgenesmicroscpicasponiendo una cmarade
vdeo en el plano de la imagen producido por la lente ocular. Esta aproximacin se aprovechadel hecho de que las
cmaras de vdeo pueden detectar pequeas diferencias
de contraste con mayor sensibilidad que el ojo humano.

(b)

4"n---:,

FiguraA'19 Microscopiade deconvolucin

digital. Fisin de una clulade levadurasteida con un coloranteespecficopara el DNA (rojo)
y un colorante especficode membrana (verde). La imagen de la izquierda esuna seccinptica sin procesara travs del centro de la clula.
La imagen de la derechaesuna proyeccin de todas las seccionesdespusdel procesamientotridimensional de la imagen. El anillo del
tabique central en desarrollo (rojo) se estformando entre los dos ncleos (rojo) que surgieron por divisin nuclear durante Ia mitosis
previa.

Elmicroscopio
ptico

887

1.1

Adems,lascmarasdevdeogeneranimgenesen un formato digital que pueden seroptimizadasmedianteel procesamientodigital. En el procesode optimizacin,primero sealmacenala sealdela cmaracomo un conjunto de
nmerosen dosdimensionescuyosvalorescorrespondena
la claridadu oscuridadde una localizacinparticular en la
imagen.Losdatosseprocesanentoncesparaincrementarel
del fondo que
contrastey paraeliminar las caractersticas
la imagende inters(FiguraA.20).
enmascaran
Lasmejorasproducidaspermitenla visualizacinde estructurasque son un orden de magnitud mspequeasde
las que se pueden observarmediantemicroscopaptica
convencional.Como hemosvisto, Ia microscopaptica
convencionales generalmenteincapazde resolverobjetos
mspequeosde 200 nm de dimetro.Por el contrario,la
videomicroscoplacomputerizadapermite la visualizacin
de microtrlbulos individuales que miden nicamente25
nm de dimetro.Lastcnicasdigitalesde vdeo sepueden
aplicar a la microscopaconvencionalde campo claro,as
como a la microscopaDIC y confocal,creandoasun conjunto poderosode aproximaciones
paraincrementarla efiptica.
caciade la microscopa
Una ventajaadicionalde la videomicroscopladigital es
el quela muestrano necesitaestarfijada,comoesel casoen
la microscopaelectrnica,de forma que sepuedenmonitorizarprocesosdinmicosa medidaquestosseproducen.
Adems,se han desarrolladocmarasde vdeo especialmentesensiblesque puedendetectarimgenesextremadamentedbilesfacilitandoaslla capacidadde registraruna
de los procesosceluserierpidade imgenesconsecutivas
laresa medidasque stosseproducen.Por ejemplo,utilizandouna pelculafotogrficaconvencional,podra llevar
ms de minuto registraruna imagendel marcajefluorescente,lo quesignificaqueuna seriede fotografiasconsecutivaspodrla slomostraruna foto de una clulapor minuto. Sin embargo,si una cmarade vdeooptimizadapuede

(a)

(b)

registraruna imagen de la misma clula30 vecespor segundo,estopermite monitorizar cambiosrpidosen el aspectoy el comportamientode componentessubcelulares.
Estoha permitido a los cientficosobtenerinformacin de
los cambiosen la concentfaciny en la distribucin subcelular de componentescitoslicoscomo segundosmensajeros durantela sealizacincelular,y estudiarel papelde las
estructurasde citoesqueletoen los movimientosintracelulares.As, la videomicroscopadigital ha ampliado enormementenuestracapacidadpara monitorizar procesosal
tiempo que seproducenen las clulasvivas.
La microscopadigital no essolamentetil paraexaminar procesosen un plano focal.En una variantede estatcnica seempleaun ordenadorpara controlar el foco motorizadodeun microscopio.De estaforma,secaptanimgenes
a lo largo del espesorde la muestra.Cuandoestasseriesde
este
imgenessecaptana intervalosde tiempo especlficos,
en cuatroditipo de microscopasedenominamicroscopa
(expresinacuadaa partir de la ftsica;las cuamensiones
tro dimensionessonlastresdimensionesdel espaciomsla
dimensinadicionaldeltiempo).El anlisisdelos datosen
cuatro dimensionesrequiereaplicacionesinformticasesque puedennavegarentrelos planosfocalesa
pecializadas
lo largo del tiempo para mostrar imgenesespecficas.
MToDosprtcos
S pusoN EMPLEAR
Y LASPROPIEDADES
PARAMEDIRLOSMOVIMIENTOS
Y OTRASMACROMOLCUTS
DELASPROTENAS
La microscopapticapuedeayudarnosa visualizardnde
selocalizanlas molculasdentro de lasclulasy para estudelas
diar la dinmicadelos momientosy laspropiedades
brevemente
estas
Consideraremos
molculasbiolgicas.
en
esta
seccin.
tcnicasmodernas
y fotoactlvacln,Cuandolasmolculas
Fotoblanqueamiento
son irradiadascon luz de la longitud de onda
fluorescentes

(c)

(d)

ffi

digital computeilzada. Esta serie de micrografas muestra cmo sepueden emplear los ordenadorespara
FiguraA.20 Videomicroscopa
mejorar las imgenesobtenidas mediante microscopa ptica. En esteejemplo, la imagen de numerosos microtbulos, que son demasiado
pequeospara ser observadosmediante microscopa ptica convencional,seprocesanpara hacerlosvisibles en detalle. (a) Imagen resultante
del incremento electrnico del contrastede la imagen original (que pareceestarvaca). (b) Fondo de Ia imagen procesadaen (a) que es
sustrado (c) de la imagen (a) dejando como resultado nicamente los microtbulos. (d) Imagen final detalladaque resulta del promedio
electrnico de las imgenesindiduales procesadasque semuestran en a-c.

y tcnicas
de microscopa
ApndicePrincipios

de excitacin apropiada durante largos periodos de tiempo,

sufren un fotoblanqueamiento (la irradiacin induce que
las molculas dejen de emitir fluorescencia).Si solamente
una pequea regin de Ia clula es expuesta a la luz intensa, el blanqueamiento produce una disminucin caractersticade la fluorescenciaen estazona (FiguraA.2la).A medida que las molculas no blanqueadas se mueven hacia la
zona blanqueada, se recobra gradualmente los niveles de
fluorescencia.La recuperacinde la fluorescenciadespusdel
fotoblanqueamiento(FRAP) es una medida til de la velo-

:F*QF--QF
(a) Fotoblanqueamiento

(b) Fotoactivacin

Agua
(bajondice
de refraccin)
aa
o

ol

evanescente
a
T
.lo
1 0 0n m
la

a
a

a
a-

a
oa

aa
a

Monmero
de G actina

a a
o O
a
a
o Vidrio

(altondice
de refraccin)

Aceitede
inmersin
l^^+^

objetivo

(c)
FiguraA,21 Tcnicasde estudiode los movimientos
dinmicosde
las molculasdentrode las clulas. (a) Fotoblanqueamiento
de
molculas fluorescentes.Un reabien definida de una clula es
irradiada, lo que produce el blanqueamiento de las molculas
fluorescentes.Gradualmente,nuevasmolculassin blancuear
invaden la zona blanqueada.(b) Fotoactivacin de protenas
fluorescentes.La fotoactivacin de una regin seleccionada,como
el ncleo (indicadoen rojo), produceun incrementode 1a
fluorescencia.El movimiento posterior de molculasfluorescentes
sepuede monitorizar. (c) Microscopa de fluorescenciade reflen
total interna (TIRF). El ejemplomostradoimplica monmeros
fluorescentes
de G actina (vaseCapitulol5). Cuando un haz
paralelo de luz en un medio con un alto ndice de refraccin (como
el vidrio) incide sobre su interfasecon un medio de menor ndice
de refraccin (como una clula o el agua) con un ngulo que
supera el ngulo crtico, sufre una reflexin total interna. La
reflexin total interna produce un (campo evanescente)en el
medio de menor ndice de refraccin, que decaerpidamente con la
distancia.Esto permite la observacinnicamente de un nmero
pequeo de molculasfluorescentes.

cidad a la que las molculasdifunden o son transportadas

(vaselaFigura7.ll paraun ejemploclsico
directamente
de la utilizacin de FRAP).
En otroscasos,lasmolculasfluorescentes
sonmodificadas qumicamentepara no emitir fluorescenciahastaque
son irradiadascon luz de una longitud de onda especfica,
normalmenteluz ultravioleta.La luz ultravioletainducela liberacindel modificadorqumico,permitiendoque la molculade intersemitafluorescencia.
Sehan producidotanto colorantesmodificadosqumicamentecomo formas de
GFPque secomportande estaforma. Estoscompuestosse
denominanconfrecuenciacompuestos
enjaulados,ya
queson
nicamente<liberados>
por la escisininducidapor la luz.
La liberacin,o fotoactivacin,producela situacincontraria al fotoblanqueamiento:
la liberacinlocal de una molproduceun punto luminosodefluorescenculafluorescente
ciaquesepuedeseguira medidaquelasmolculassiguensu
caminoa Io largode la clula(FiguraA.2lb). La liberacin
por fotoactivacinsepuedeempleartambinparatransformar otro tipo de molculasinertesa su estadoactivo.Por
ejemplo,el ncalcioenjaulado>
consisteenun quelantedecalcio que estunido a los ionescalcio.Cuandoel compuesto
enjauladoesirradiado,liberael calcioque llevaunido, produciendouna elevacinlocal de calciodentro de la clula.
Microscopa
defluorescencia
dereflexin
totalintema. La microscopade florescencia
de reflexintotal interna(TRIF)
suponeun mtodoinclusoms precisopara observarlas
molculasfluorescentes.
TRIFsebasaenunapropiedadtil
dela luz: cuandola luz semuevedesdeun mediocon un alto
ndicederefraccin(comoel vidrio) a un medioconun ndicede refraccinmenor (comoel aguao una clula),si el
ngulodeincidenciadela luz superaun ciertovalor (denominadongulocrtico),Laluz
esreflejada.
Ustedpuedeestar
familiarizadocon los cablesde fibra ptica,que sebasanen
el mismo principiofsico.La curvaturade Ia fibra produce
que casitoda la luz que entra en el cableseareflejadainternamente,permitiendoa estasfibrasservircomo<tuberas
de
luz>.Losmicroscopistas
puedentambinusarlentesespecialespara haceruso de la reflexintotal interna.Cuando
una clulaemiteluz brillantefluorescente
de forma quetoda
la luz superael ngulocrtico,seproducirla reflexintotal
interna.Porqu estil la TRIF si sereflejatoda la luz?Una
capade luz muy pequea,llamadael <campoevanescente)
seextiendehaciael aguao la clula(FiguraA.21c).
Estacapa
esmuyfina,dealrededorde 100nm, haciendoqueTRIFsea
10vecesmejor que un microscopioconfocalpararesolver
objetospequeosmuy prximos a la superficiedel cubreobjetos.Estohaceque TRIF seaespecialmente
til para estudiar la liberacinde vesculasde secrecino para la observacinde la polimerizacinde actina.
pol resonancia
Tlansferencia
de energa
de fluorescencia,
La
microscopade fluorescenciaes til no solamentepara
la observacinde movimientode lasprotenas,sino tamElmicroscopio
ptico

889

bin para medir las interaccionesffsicasentre ellas.Cuancuyaspropiedadesde fluodo dosmolculasfluorescentes

y muy prximasentre s, es
rescenciaestnemparejadas
posibleque sufrantransferenciade energapor resonrncia de fluorescencia(FRET).En FRET la iluminacin de
una clulaa la longitud de onda de excitacindel primer
energaal sefluorforo(donante)producela transferencia
gundo fluorforo (aceptor).Esatransferenciaenergano
implica un fotn de luz, pero una vezque ocurre,induceIa
emisinde luz por el aceptoren su longitud de onda caen FRETseempleaun par de
racterstica.Frecuentemente
molculasfluorescentesderivadasde GFP:una brilla con
proazul(cian) (sedenominafrecuentemente
fluorescencia
cian o CFP);la otra seexcitaconluz azul
tenafluorescente
y brilla con un color amarillento (y sedenominaprotena
amarilla oYFP).Sepuedemedir FRETentredos
fluorescente
protenasseparadas(FRETintermolecular;FiguraA.22b).
La FRETsloactaen un rangomuy pequeoy comoconla FRETintermolecularproporcionauna lectusecuencia,
dentrodela clulaen el quedosprotenasfluolugar
ra del
seestntocando.
esencialmente
rescentes
FRET intramolecularse empleaen diversostipos de
Vimos un ejemplode un bio<biosensores
moleculares>.
los <camacuando
consideramos
sensoren el Captulo14,
para
poner en
de
forma
leones>.Estasprotenascambian
y
nicaamarillas
contactoprotenasfluorescentesazules
La
FRET
de
calcio.
mente cuando se elevanlos niveles

CFP

ao

vv

resultantesepuedeusarcomo una medidade los niveles

similares
Iocalesde calcio.Seestnempleandobiosensores
para medir la activacinlocal de pequeasprotenasG,
como Ras,un reguladorclaveen la sealizacindel receptor tirosina quinasa(vaseCaptulo 14). Estossensores
sufren un cambio de forma que permite la FRET nicamenteen regionesde la clulaen las que seactivaRas(FiguraA.22c).
uPinzas
pticas'. La ltima aplicacinde la microscopa
comopropuedeserconsiderada
pticaque discutiremos
formas
bien
establepero
basa
en
se
pia de cienciaficcin,
pequeos.
los
objetos
cidasde interaccinde la luz con
proCuandolos fotonesimpactancon objetospequeos,
ducen<presinlumnica>sobreellos.Cuandoun objetopequeotieneuna grancurvaturacomoesel casoen una peproducidas
queaesferadeplstico,Iasfuerzasdiferenciales
por un haz de luz lsercompactoy canalzadoa travsdel
microscopio,tiendena mantenerla gota en el centrodel
haz,atrapndolamediantepresin lumnica.Estas<pinzas
pticas>sepuedenusarpara moverobjetos,o sepueden
sobreesusarparaproducirfuerzassumamentepequeas
Por
ferasque estnunidasa protenaso a otrasmolculas.
ejemplo,midiendolas fuerzasejercidassobreesferasacode mepladasa la miosinalos cientficoshan sidocapaces
dir las fuerzasproducidaspor el golpe de fuerzade una
nicamolculade miosina(Figura4.23)

n
rnA,,a
y,vvvvv

FRET:la luz
incidente
es absorbida
por CFP;YFP
emiteluz amarilla

de protenas
Interaccin
YFP

'+
Procesode
celular
sealizacin

Se produce
FRET

Activdad
Ras:
alta
I

baja
(c)
FigutaA.22 Transferenciade ener$a pol resonanciade fluorescencia(FRET). (a) FRET intermolecular. Cuando dos protenas unidas a dos
cadenaslateralesfluorescentes(como la protena fluorescentecian, o CFP,y la protena fluorescenteamarilla o YFP), estnmuy prximas, al
excitar CFP,stapuede transferir energadirectamente a YFP.EntoncesYFP emite fluorescencia,y stasepuede medir. (b) FRET
intramolecular. En estecaso,CFP yYFP estnunidas a la misma molcula, pero nicamente pueden interaccionar cuando la protena sufre
un cambio conformacional. Estasprotenas sepueden usar como <biosensores,celulares.(c) Deteccin de la activacin de Rasen una clula
viva. Una clula COS-I que expresauna protena que sufre una FRET intramolecular en las regionesen las que Rases activa,muestra un
incremento de FRET despus" .*potr.i lu clula al factor de crecimiento epidrmico (EGF), el cual activa a Ras.(Reproducido con
permiso de Nature Publishing Group.)

890

y tcnicas
demicroscopa
ApndicePrincipios

animal antes de extraer los rganos.Esta tcnica, llamada

perfusin,puede ayudar a reducir los artefactos,que son representacionesfalsaso inexactasde la muestra,que seproEsferade plstico
ducen por el tratamiento qumico o por la manipulacin de
Iasclulasy los tejidos.
En la mayora de los casos,el paso siguienteconsisteen
cortar la muestra en seccionesque seanlo suficientemente
finas para transmitir la luz. De otra forma, la muestra sera
opacabajo el microscopio y no seranvisibleslas estructuras discernibles.Parapreparar estassecciones
finas,lamuestra se incluye en un medio (como plstico o parafina) que
puede mantener su posicin mientras se obtienen las secciones.Debido a que la parafina esinsoluble en agua,cualquier resto de aguasedebeextraerpreviamentede la muesFigura4.23 "Pinzaspticas., lJna pequeaesferade plstico se
puede mantener en un determinado lugar por un haz de luz lser
tra (habitualmente mediante deshidratacinen alcoholes)
enfocado a travs de la lente obietivo de un microscopio. Cuando la
y debe ser reemplazadopor un solventeorgnico, como el
esferaestunida a una molcula como la miosina, la fuerza
xileno, en el que es soluble la parafina. El tejido procesado
producida cuando la miosina tira de un filamento de actina unido a
se coloca entoncesen un medio calientede parafina lquiportaobjetos
un
de un microscopiosepuedemedir con precisin.
da que posteriormente se deja endurecer.La deshidratacin es menos crtica si la muestra se incluye en un medio
soluble en agua en lugar de en parafina. Las muestras se
Tcnicas de preparacinde muestras
pueden incluir tambin en resinasplsticasepoxi o el tejipara microscopaptica
do sepuede simplemente congelarde manera rpida como
Una de lascaractersticas
msatractivasde la microscopa medio alternativo de soporte.
pticaesla facilidadcon la que sepuedenprepararla maDespusde la inclusin o la congelacinrpida,la muesyorade lasmuestrasparasu examen.En algunoscasos,la
tra se corta en seccionesfinas de pocos micrmetros de
preparacindelasmuestrasno implicamsqueel montar
grosor empleando un microtomo, un instrumento que fununa pequeapiezade un espcimen
en un lquidoadecua- ciona de forma parecida a un seccionadorde embutidos (Fido sobreun portaobjetosde vidrio y cubrirla con un
gura A.24). La muestra se monta simplemente en el brazo
cubreobjetos
de vidrio. La preparacinsecolocaentonces de un micrtomo, que la hace avanzaen incrementos peen la platinadel microscopioy seexaminaa travsdel ocuqueos hacia una cuchilla metlica o de vidrio que cort; el
lar o con una cmara.
tejido en seccionesfinas.A medida que se cortan secciones
Sinembargo,paraaprovecharal mximo el poderde resucesivas,habitualmente se pegan unas a otras formando
solucindela microscopa
ptica,lasmuestrassepreparan una tira de seccionesfinas. Las seccionesse montan entonhabitualmentede una forma queincrementaeI contraste,
es
cesen un portaobjetos y se procede a su tincin con cualdecir,diferencias
en la opacidado en el color delasestruc- quiera de los colorantesque sehan adaptadopara esteproturasque seexaminan.lJna forma habitualparaincremen- psito. Algunas veces el tejido se trata con un nico
tar el contrasteesla aplicacinde colorantesespecficos
que
colorante, pero ms frecuentementese emplean seriesde
dan color o que alterarlaspropiedades
de transmisinde
colorantes cada uno de los cuales tiene afinidad por un
la luz delos constituyentes
celulares.
La preparacinde ccomponente celular diferente.Una vez teida,la muestra se
lulas para su tincin generalmenteimplica los procedi- cubre con un cubreobjetosde vidrio para su proteccin.
mientosespeciales
quedescribiremos
a continuacin.
La autorradiografa microscpicaes una aproximacin
con importancia histrica paralalocalizacin de compoLe pnrpeRecrN DELASMUESTRAS
nentes especficosdentro de las clulas; es una tcnica que
FRECUENTEMENTE IMPLICA SU FIJACIN,
emplea una emulsin fotogrfica para determinar en qu
SECCIONAMIENTO Y TINCIN
lugar selocaliza un compuesto radioactivo especficodentro
En lospreparativos
parala tincin declulas,
lostejidosdede Ia clula en el momento en el que stasefija y secorta para
ben sertratadospreviamentecon fijadores que matan las
microscopa.En eseprocedimiento, los compuestosreactivos
clulas,al tiempo que preservansu aparienciaestructural. seincuban con seccionesde tejidos o seadministran a las cLosfijadoresmsampliamenteempleados
sonlos cidosy
lulas o a organismos intactos. Despus de que haya pasado
aldehdoscomo el cidoactico,el cidopcrico,el formalun periodo de tiempo suficiente para que el compuesto radehdoy el glutaraldehdo.
Una forma de fijacindelostediactivo seaincorporado en las molculas y estructuras injidos essencillamente
sumergirlosen la solucinfijadora. tracelularesde nueva formacin, selava la radiactividad resUna aproximacinalternativaparatejidosanimalesconsiste tante no incorporada, se seccionala muestra de manera
en la inyeccindel fijador en el torrente circulatorio del
convencional y se monta en una preparacin microscpica.
Rayolser("pinzaspticas")

paramicroscopa
Tcnicas
depreparacin
demuestras
ptica

891

Le urcnoscopA ELEcTRNIcADE TRANSMISIN

Muestraincluida
vr I vdrdilr

ro

o resinaplstica
Brazodel
micrtomo

Cuchillade metal
o devidrio
Tirade secciones
finas

Tirade secciones
montadasen un
portaobjetos
de vidrio,
teidasy cubiertas
con un cubreobjetos
FigwaA.24 0btencinde seccionescon un micrtomo. La
muestra fijada se incluye en parafina o resina plsticay semonta en
el brazo de un micrtomo. A medida que el brazo semuevehacia
arriba y hacia abajo siguiendo un arco circular, la cuchilla corta
formando
Lasseccionesseadhierenentre e1las,
seccionessucesivas.
finas que sepuedemontar en un portaobjetos
una tira de secciones
de vidrio, teir y protegersecon un cubreobjetos.

La preparacin se cubre entonces con una capa delgada

de emulsin fotogrfica y se coloca en una caja sellada du-

rante el periodo de tiempo deseado,que frecuentementees

de varios daso incluso semanas.Cuando la emulsin serevela posteriormente y la muestra se examina con un microscopio aparecen granos de plata directamente sobre la
muestra, en los puntos en los que la radiacin ha estimulado la emulsin.Lalocalizacin de estosgranos de plata, que
son visiblestanto con el microscopio ptico como electrnico, puede servirnos para apuntar la regin de la clula que
contiene Ia radiactividad.

El microscopioelectrnico
El impacto de la microscopa electrnicaen nuestro conocimiento de las clulas sepuede describir nicamente como
revolucionario.Aun as,igual que la microscopaptica, la
microscopa electrnica tiene tanto ventajas como debilidades.En microscopa electrnicala resolucin es mucho
mejor, pero la preparacin de la muestra y el manejo del instrumento son a menudo ms difciles. Los microscopios
electrnicostienen dos diseosbsicos:el microscopioelectrnico de transmisiny el microscopioelectrnicode barrido. Ambos son similares, ya que cada uno utiliza un haz de
electronespara producir la imagen. Sin embargo, Ios dos
instrumentos emplean mecanismosdiferentespara formar
la imasen final como veremos a continuacin.

892

y tcnicas
demicroscopa
ApndicePrincipios

FORMALA IMAGEN A PARTIRDE LOS ELECTRONES

QUE ATRAVIESANLA MUESTRA
El tipo de microscopio electrnico que se emplea ms comnmente se llama microscopio electrnico de transmisin (TEM) ya que forma una imagen a partir de los electrones que se trqnsmiten a travs de la muestra que est
siendo examinada.Como se muestra en la Figura A.25,la
mayoria de los componentes del TEM tienen nombres y
funciones semejantesa sus equivalentesen el microscopio
ptico, aunque su orientacin fisica estinvertida. Examinaremosbrevementecadauna de las caractersticasprincipales.
Sistemade vaco y cande electrones. Debido a que los
electronesno pueden viajar muy lejos a travs del aire, se
debe mantener un intenso vaco a lo largo de todo el recorrido del haz de electrones.Para crear estevaco dos tipos
de bombas de vaco funcionan de manera conjunta. En algunos TEMs seincorpora un dispositivo llamado trampa de
vaco como parte del sistemade vaco para ardar a establecer un nivel de vaco elevado.La trampa fra es un metal introducido en la columna del microscopio que seenfra
con nitrgeno lquido. La trampa de fro atrapagasesy molculascontaminantesque sesolidifican en la superficiedel
metal fro.
Los electronesen un TEM son generadospor un can
de electrones, un conjunto compuesto por diversoscomponentes.El ctodo,un filamento de tungsteno semejante
al filamento de una bombilla, libera electronesde su superficie cuando es calentado.La punta del ctodo estcerca de una apertura circular en un cilindro de metal. Un voltaje negativo en este cilindro alrada a controlar la emisin
de electronesy a dar forma alhaz. En el otro extremo del
cilindro se encuentra eI nodo.El nodo se mantiene a 0 V
mientras que el ctodo se mantiene a 50-100 kV. Esta diferencia de voltaje haceque los electronesse acelerenal pasar
a travs del cilindro y por lo tanto se denomina potencial
de aceleracin.
y formacinde la imagen. La forLenteselectromagnticas
macin de una imagen en un microscopio electrnico depende tanto de la longitud de onda como de las propiedades particuladas de los electrones. Debido a que los
electronesson partculas cargadasnegativamente,su movimiento puede ser alterado por fuerzasmagnticas.Esto
significa que la trayectoria de un haz de electronesse puede controlar usando electroimanes,de la misma forma que
las lentesde vidrio pueden desviarlos rayos de luz que pasan a travs de ellas.
A1 tiempo que l haz abandona el can de electrones,
entra en una serie de lentes electromagnticas(Figura
A.25b). Cada lente es simplemente un espaciobajo la influencia de un campo electromagntico.La distanciafocal
de cadalente sepuede incrementar o disminuir variando la

- Cande
Ctodo (filamento I electrones
de tungsteno)
[> (en
\ ' - el interior
.-:-+

Anooo

I de un cilindro

Hnmera
lant6

Muestra

I OUenOSe

J muestra)
I
|
I

condensadoraI Sistema
I de lentes
segunoa
I condensadoras
renre
I
conoensaooraJ

Soportede
la muestra

Lenteobjetivo

Lenteintermeda

Lentede proyeccin

Detector

(b)
FigutaA.25 Mictoscopioelectfnicode transmisin. (a) Fotograffay (b) diagrama esquemticode un TEM.

cantidad de corriente elctrica aplicada a la espiral. As,

cuando se disponen variasventasjuntas, staspueden controlar la iluminacin, el foco y los aumentos.
La lente condensadora esla primera en afectar alhaz de
electrones. Funciona de la misma forma que su equivalente en el microscopio ptico para enfocar el haz sobre la
muestra. Lamayoria de microscopioselectrnicosusan un
sistemade lentescondensadorascon dos lentespara enfocar mejor el haz de electrones.El siguientecomponente, la
lente objetivo, esla parte ms importante del sistemade lentes del microscopio electrnico. La lente objetivo, junto
con Ia lente intermedia, y la lente de proyeccin, producen
una imagen final en una pantalla que emite fluorescencia
cuando recibe impactos de los electroneso en un detector
que genera directamente la imagen.
Cmo se forma la imagen a partir de la accin de estas
lentes electromagnticas sobre un haz de electrones? Recuerde que el haz de electronesgenerado por el ctodo pasa
a travs de un sistema de lentes condensadorasy afecta a la
muestra. Cuando impactan sobre la muestra, algunos electrones son dispersadospor la muestra, mientras que otros
continan su recorrido relativamente sin desviacin. Esta
desviacin de electrones es el resultado de las propiedades
creadasen la muestra mediante los protocolos de preparacin que describiremos a continuacin. La preparacin de
la muestra, en otras palabras,confiere a la muestra densidad

selectivaa los electrones,'

es decir, algunaszonasse hacen
ms opacasa los electronesque otras.Las zonaselectrodensasde la muestraaparecernoscuras,ya que son atrapor pocoselectrones,mientrasqueotrasreasapavesadas
recernms claras,ya que permiten el pasode una mayor
cantidadde electrones.
El contrasteentrelaszonasclaras,oscurase intermedias
de la muestraforman la imagenfinal. El hecho de que la
imagenestformadapor diferentesgradosde transmisin
de electronesa travsde la muestraquedareflejadoen el
de transmisin.
hombre de microscopio
electrnico
Sistemade captutade imagen. Debido a que los electrones
no son visiblespara el ojo humano,la imagenfinal esdetectadaen el microscopioelectrnicodetransmisinal permitir a los electronestransmitidosimpactarsobreuna pantalla fluorescenteo una pelculafotogrfica.La utilizacin
de pelculapermite crear impresionesfotogrficasque se
denominanmicrograffas electrnicas,y que setransforman en un registrofotogrficopermanentede la muestra
(Figura A.26a).En muchos microscopiosmodernos una
cmaradigital registrala pantallao un detectordigital detectadirectamentelos electronesincidentes.
Voltaje. Elhaz de electronesesdemasiadodbil para penetrar en las muestrasbiolgicas,de forma que las muesElmicroscopio
electrnico 893

(a) lMicrografa
electrnica
de transmisin

'

0,5rm

(b) Micrografa
electrnica
de barrido

tilm'

FigutaA.26 Gomparacinde micloglafiaselectlnicasde tlansmisiny de barido, (a) La micrografia electrnica de transmisin muestra las
membranas del retculo endoplsmico rugoso en el citoplasma de una clula pancreticade rata. La apariencia (rugosa) de las membranas
de estamuestra estcausadapor la presenciade numerosos ribosomas unidos a Ia membrana. (b) Una muestra similar visualizadacon un
microscopio electrnico de barrido revelaIa aparienciatridimensional del retculo endoplsmico rugoso, aunque no sepueden distinguir los
ribosomas individuales.

trasqueseexaminanmediantemicroscopa
electrnicade
transmisinconvencional
finas
debenserextremadamente
(normalmenteno msde 100nm de grosor).De lo contrano serancapaces
rio, loselectrones
de atravesar
la muestra
y la imagenseracompletamente
opaca.La observacin
de
msgruesas
requiereun microscopioelectrnisecciones
co especialde alto voltaje (HVEM), que es similar a un
microscopioelectrnicodetransmisinperoutiliza un volmuchomsalto-alrededor de200-1.000
taiedeaceleracin
kV en comparacincon los 50-100kV de un TEM-. Debido a queel poderdepenetracindelhazde electrones
resultanteesaproximadamente10vecesmayor que el de los
microscopioselectrnicos
convencionales,
sepuedenexarelativamente
gruesascon una buenareminar secciones
solucin.Como resultado,la estructuracelularse puede
estudiaren secciones
dehasta1 prmde grosor)lo quesupone 10vecesel grosorposiblecon un TEM ordinario.
Le urcRoscopA ELEcTRNrcADE BARRIDoREvELA
LA ARQUITECTURA DE LA SUPERFICIEDE CLULAS
Y ORGNULOS
La microscopa electrnica de barrido es un tipo funda-

mentalmentediferentede microscopaelectrnicaqueproduceimgenesa partir delos electronesreflejadospor la superficie externade la muestra (en lugar de los electrones
transmitidosa travsde la misma).Esuna tcnicaespecialmente espectacular
debido a la sensacinde profundidad
queconfierea lasestructurasbiolgicas,permitiendopor lo
tanto estudiarla topograffade superficie(FiguraA.26b).
Como su nombre implica,un microscopioelectrnicode
barrido (SEM) generauna imagenmedianteel barrido de
la superficiede la muestracon un hazde electrones.
894

y tcnicas
ApndicePrincipios
demicroscopa

En Ia FiguraA.27semuestraun SEMy susistemaptico.El sistemadevacoy la fuentede electrones

sonsimilaresa los del TEM, aunqueel voltajede aceleracin
esms
(alrededor
principal
kV).
La
bajo
de 5-30
diferenciaentre
losdostiposdeinstrumentosconsiste
enla formaen Ia que
segeneraIa imagen.En un SEM el sistemade lenteselectromagnticas
enfocaintensamente
elhazde electrones
en
un punto que semuevesobrela superficiede la muestra
medianteplacascargadasdenominadasdeflectores
del haz,
y la muestra.Losdelocalizadosentrela lentecondensadora
flectoresatraeno repelenel hazde acuerdocon lasseales
enviadasdesdeun circuito deflector(FiguraA.27b).
Mientrasel hazdeelectrones
barrerpidamentela muestra, lasmolculasde la muestraseexcitana nivelesaltosde
secundarios.
Estoselectrones
energay emitenelectrones
emitidos son captadospor un detectorlocalizadoinmediatamentepor encimay en un lado de la muestra,generando
una imagende susuperficie.El componenteesencialdel deque emite fotonesde luz
tector es un detectorde centelleo,
cuandoesexcitadopor electronesque incidensobre1.Los
fotonesseempleanparageneraruna sealelectrnicasobre
una pantallade vdeo.La imagensegeneraentoncespunto
por punto,lneapor lneaen la pantallaal tiempo queel haz
primario de electronesva barriendola rhuestra.

Tcnicas de preparacinde muestras

para microscopaelectrnica
Las muestras para ser examinadas mediante microscopa
electrnica se pueden preparar de diversas formas dependiendo del tipo de microscopio y del tipo de informacin
que pretenda obtener el microscopista.En cada caso,sin

(a)

Cande
electrones
Lente
conoensaoora

Haz de
electrones
Deflectorde
electrones Circuitodeflector
(generadorde barrldo)
Pantalla
de vdeo

Electrones
secundaflos

Muestra

Detector
de centelleo

Deflector
de pantalla

(b)
FiguraA,27 Mictoscopioelectrnicode barido. (a) Fotografay
(b) diagrama esquemticode un SEM. La imagen es generadapor
Ios electronessecundarios(lneasnaranjascortas) emitidos por la
muestra al enfocar y desplazarrpidamente el haz de electrones
primarios (lneasnaranjaslargas) sobre ella. La sealhacia la
oantalla de vdeo estsincronizadacon el movimiento del haz de
ilectrones primarios sobre la muestra por el circuito deflector del
generadorde barrido.

embargo,el mtodo escomplicado,requieremucho tiempo y esmscostosoen comparacincon los mtodosque

seempleanen microscopiaptica.Adems,no sepueden
examinarclulasvivas debido al vaco al que hay que sometera lasmuestrasen el microscopioelectrnico.
Le osrNcIN DE sEccIoNESULTRAFINAS
Y LA TINCIN SON TCNICAS PREPARATIVAS COMUNES
EN MICROSCOPA ELECTRNICA DE TRANSMISIN
La forma ms comn de preparar muestras para microscopa electrnica de transmisin implica el seccionamiento de

ultrafinas,deno msde 50-100

tejidosy clulasen secciones
nm de grosor(menosde la dcimapartedel grosorde las
queseempleannormalmenteen microscopapsecciones
muestras
debenserpreviamentefijadasqumicatica). Las
y
El procesode fijacin mataa las cmente estabilizadas.
pero
mantiene
los
componentescelularesen gran
lulas
y
en
medidatal comoeran lasclulasvivas.Losfijadoresque
se empleanson habitualmentesolucionesde aldehdosy
muy comnmenteglutaraldehdo.Despusde la fijacin,la
muestrasetie habitualmentecon una solucinall-2o/ode
tetraxidode osmiotamponado(OsOn),que seune a varios componentesde las clulas,hacindolosmsdensosa
los electrones.
Los fijadoresqumicosson muy eficacesen la estabilizacindemuchasestructurasdentrodelasclulas,perotieEn primer lugar,sonlentos;la difusindel
nen dosefectos.
requiereuna
fijadorenla muestraparafijarsusestructuras
mnima cantidadde tiempo.En segundolugar,losfijadocelulares(a
resqumicosa menudoextraencomponentes
menudo sepierdendurantela fijacin algunasestructuras
pequeasdentro de lasclulas).La criofijacin, que generalmente consisteen una congelacinrpda (20 ms) de
una muestrabajo condicionesde alta presin,evitaestos
a alta presines necesaria,ya
problemas.Estacongelacin
que sin ellaseforman cristalesde hielo dentro de la muesEn la mayora
tra lo queproducedaosen susestructuras.
a altapresinesseguida
de los protocolos,la congelacin
Duranteestasustitucin,el aguade
por una criosustitucin.
muy lentamentepor un solvenla muestraesreemplazada
te orgnico,comola acetona,duranteun periodode das.
La muestraresultantesepuedeprocesarparasu inclusin
y cortadode la mismaforma en queseprocesanlasmuestras fijadasqumicamente.
sepasaa travsde una seriede
El tejidoposteriormente
y posteriormende alcoholque1odeshidratan,
soluciones
te sesumergeen una solucinde un disolventecomoacetona u xido depropilenoparapreparcrloparasuinclusin
de que
en una resinalquidaplsticadetipo epoxi.Despus
la
muestra,
sta
se
coloca
en
plstico
infiltrado
en
seha
el
para
plsendurecer
el
y
en
una
estufa
un molde secalienta
la muestraincluida es cortadapara
tico. Posteriormente
ultrafinasutilizandoun instrumentollaobtenersecciones
mado ultramicotomo (FiguraA.28a).La muestrasecoloca firmementeen el brazo del ultramicotomo,el cual la
ayanzaen incrementospequeoshaciauna cuchillade vidrio o de diamante(FiguraA.28).Cuandoel bloquealcandela superficie
zala cuchilla,secortansecciones'ltrafinas
flotan enla superficiedel aguadesdelbloque.Lassecciones
de donde sepuedanmontar sobrerejillascircularesde cobre. Lasrejillasestnformadaspor un entramadode hilos
de cobremuy finos, que sujetanla muestraal tiempo que
a travsdelos
seforman aberturasentreloshilos adyacentes
cualessepuedeobservarla muestra.
IJnavez que sedisponenen la rejilla, normalmentelas
se tien de nuevo,estavez con solucionesque
secciones
paramicroscopa
electrnica 895
demuestras
Tcnicas
de preparacin

(a) Ultramicrtomo

pica para localizar molculas radiactivas dentro de las clulas. La autorradiografia sepuede tambin aplicar a la microscopaelectrnicade transmisin con algunaspequeas
diferencias.Para el TEM, la muestra que contiene componentes marcados radiactivamente se examina simplemente
en seccionesultrafinas sobre rejillas de cobre en lugar de en
seccionesfinas montadas en portaobjetos de vidrio.
Tambin describimos cmo se pueden emplear anticuerpos marcados con fluorescencia en microscopa ptica
paralocalizar componentes celularesespecficos.De la misma manera,sepueden usar anticuerposen la tcnicade microscopaelectrnicallamada inmunomicroscopa electrnica (inmuno EM). La fluorescenciano sepuede visualizar
en el microscopio electrnico y para visualizar los anticuerpos stosdeben estar unidos a sustanciasdensasa los
electronesy por lo tanto visiblescomo puntos opacos.lJna
de las aproximacionesms comuneses acoplarlas molculas anticuerpo con partculas de oro coloidal. Cuando las
seccionesultrafinasde tejidos setien con anticuerposmarcados con oro dirigidos contra diversasprotenas, la microscopaelectrnicapuede desvelar la localizacin subcelular de estasprotenas con gran precisin (Figura A.29).
Ss puo EMpLEARLA MlcRoscopA coRRELATIVA
PARA CUBRIR EL ESPACIOENTRELAS MICROSCOPAS
prrce Y ELEcTRNrcA
La inmunotincin de muestrasfijadasylas tcnicasde imagen de clulasvivas que expresanprotenas marcadascon
GFP son herramientas poderosasen el arsenalde los bilogos celulares,ya que proporcionan informacin importante sobre lalocalizacin de los componentes celulares.Sin
embargo,debido a que la longitud de onda de la luz visible
esgrande,la microscopaptica tiene lmites inherentes.En
contraposicin la microscopa electrnica de transmisin
proporciona visiones increblemente detalladasde las c-

(b) Brazodelultramicrtomo
(a)Fotografa
FigutaA.28 Ultramicrtomo.
deun
(b) Visincercana
ultramicrtomo.
delbrazodeun
ultramicrtomo
quemuestraunapiezahistolgica
enun bloquede
plsticomontadoen el extremodelbrazo.A medidaqueel brazo
delultramicrtomosemuevehaciaarribay haciaabajo,el bloque
avanza
en incrementos
pequeos
y secortansecciones
ultrafinasde
Ia superficie
delbloqueconunacuchilladediamante.
contienen plomo y uranio. Este paso incrementa el contraste de la muestra ya que el plomo y el uranio confieren
an una densidad electrnicamayor a regionesespecficas
de la clula.Despusde estatincin, la muestra estpreparcdapara ser observadao fotografiada en un TEM.
SB puoBx LocALrzAR MoLcuLAS EN MrcRocRAFAS
ELECTRNICASCON RADIOISTOPOSO ANTICUERPOS
En nuestra exposicin sobre microscopa ptica describimos cmo se puede emplear la autorradiografamicrosc-

896

y tcnicas
ApndicePrincipios
de microscopa

{^.
Figura
4.29 Utilizacin
deanticuerpos
marcados
conoroen
mictoscopa
electrnica,Clulas
dela bacteria
E. collquefueron
teidasconanticuerpos
marcados
conoro,dirigidoscntrauna
protenadela membrana
plasmtica.
Lospequeos
granososcuros,
distribuidosalrededordela periferiadela clula,sonlasmolculas
de anticuerpomarcadas
conoro.

lulas,pero estasclulasdebenestarfijadasqumicamenteo
congeladasrpidamenteantesde su procesamientopara
TEM. Uug aproximacinpbderosaque unifica estasdos
formas de examinarlas estructurascelularesesla microscopa correlativa. En la microscopacorrelativasecaptan
imgenesdinmicasde una clulaempleandomicroscopa
ptica,a menudousandoanticuerposy/o GFP.La misma
clulaseprocesaposteriormentey sevisualizaempleando
EM. GeneralmenteseempleainmunoEM paradeterminar
la localizacinde la protenacon una alta resolucin(Figura A.30). La microscopacorrelativaestableceas un

puenteentrelasimgenesdinmicasde microscopaptica y las imgenesdetalladasque solamentese pueden

adquirirmedianteEM.
Le TrNcTNNEGATIVAPUEDERESALTAR
PEQUEoS
EN RELTEVE
EN CONTRASTE
oBJETOS
CONUN FONDO
TEIDO
Aunque el cortado de tejidos en seccionesultrafinas en la
forma mscomnde prepararmuestrasparamicroscopa
electrnicade transmisin,se disponede otras tcnicas
parafinesparticulares.
Por ejemplo,la forma y la apariencia de la superficiede objetosmuy pequeos,comovirus
u orgnulosaislados,
sepuedenexaminarsin seccionarla
muestra.En la tcnicade tincin negativa,que esuna de
las tcnicasms simplesen microscopaelectrnicade
transmisin,las muestrasintactasse visualizansimplemente en relieveen contrastecon un medio teido intensamente.
Pararealizarunatincin negativala rejilla de cobredebe
serinicialmentecubiertacon una pelculade plsticomuy
fina.Entoncessesuspende
la muestraen una pequeagota
de lquido que seaplicasobrela superficiede plsticoy se
dejasecaral aire.Unavez quela muestraseha secadoen la
rejilla se aplicaa la superficiede la pelculauna gotade colorante como acetatode uranilo o cidofosfotngsico.Los
bordesde la rejilla se hacencontactaren diversospuntos
con papel de filtro para absorberel excesode colorante.
Estodejaal colorantepor debajoy alrededordela muestra
y de suscaractersticas
ultraestructurales.
Cuandosevisualiza en un TEM seobservala muestraen contrastenegativo
ya que el fondo es oscuroy muy teido, mientras que la
muestraestmenosteida(FiguraA.3l).

TF'
FiguraA.30 Mictoscopade conelacin, (Izquierda)Seccinfina de
la faringe (estructuramuscular para la alimentacin) de un C.
elegansadulto (un nematodo) visualizadomediante microscopla
confocal.La sealverde esuna protena unida a la protena
fluorescenteverde (GFP) que sexpresaen las uniones entre las
clulasepitelialesde la faringe.El rojo semuestra una imagen
coloreadade la luz reflejadade la seccin. (Derecha)La misma sesin
despusde procesarsepara inmunoEM, usando un anticuerpo que
reconoceGFP.Las partculasde oro selocalizan en las mismas
regionesque emiten la sealfluorescente.Vista a mayoresaumentos
(recuadro) que muestra dnde selocalizanlas partlculas de oro en
relacin con las uniones entre las clulas(TEM).

2;;
FiguraA.31 Tincinnegativa. Micrografla electrnica de un
bacteriofagovisto en una preparacin con tincin negativa.Esta
muestra simplemente sesumergi en un colorante electrodensolo
que permite su visualizacin en relieve en contrastecon el medio
intensamentemarcado (TEM).

Tcnicas
de oreoaracin
demuestras
oaramicroscooa
electrnica 897

Les rcNrcAS DE SoMBREADoEMpLEAN vApoR

DE METAL VAPORIZADO SOBRELA SUPERFICIE
DE LA MUESTRA
La tcnica de sombreado consisteen vaporizar una capafina
de un metal electrodenso, como oro o platino, con un cietto ngulo sobrela superficiede la muestra biolgica,y permite visualizar partculas aisladas como macromolculas
(Figura A.32).La Figura A.33a ilustra la tcnica de sombreado. La muestra se extiende primero sobre una superficie limpia de mica y sedeja secarlpaso e). Entoncessecoloca en un evaporador devaco, un recipiente en forma de
campana en el que secrea un vaco mediante un sistemaparecido al del microscopio electrnico (Figura A.33b). Dentro del evaporador hay tambin dos electrodos,uno de ellos
consiste en un bastn de carbono localizado directamente
sobre la muestra y el otro en un cable metlico localizado
con un ngulo de alrededor de 10o-45ocon respecto a la
muestra,
Despus de crearse el vaco en el evaporador, se aplica
corriente al electrodo metlico, produciendo la evaporacin del metal pesadoel cual se depositasobrela superficie
de la muestra (Figura A.33,@). Debido a que el electrodo
que emite metal est posicionado con un ngulo con respecto a la muestra, el metal se deposita solamente sobre un
Muestra
\

b ,r '
FigutaA.32 Sombreado. Micrograffa electrnica de partculas del
virus mosaico del tabacovisualizadascon la tcnica del sombreado.
En esatcnica, sevaporiza metal pesadocon un ngulo sobre la
muestra, lo que produce una acumulacin de metal en un lado de
cadapartlcula viral, y una regin de sombra que carecede metal en
el otro lado (TEM).
Electrodode metal

de mrca
,Superficie

Electrodo
oe carDono

tomosde metal
vaporlzadosdesde
el electrodolateral
Rplicade metal

lvluestra

Atomosde metalvaoorizados
desdeel electrodosuperior

+tt+

Haciael sistemade vaco

(b) Evaporadoral vaco

ad'rrcaoemelal

,zRplica de metal

____
-H

-"

Re.jilla
de cobre
(a) Tcnicade sombreado

898

y tcnicas
ApndicePrincipios
demicroscopa

FigutaA.33 Tcnicadel sombleado, (a) Procedimiento del sombreado paso a

paso.@ La muestra seextiende en una superficie de mica y se deja secar.@ La
muestra se sombrearecubrindola con tomos de un metal pesado(platino u
oro, mostrado en azul) que sevaporiza a partir de un filamento calentado,
localizado en un lado de la muestra en un evaporador al vaco. Esto generauna
rplica de metal (naranja) cuyo grosor refleja el contorno de la superficie de la
muestra. @ A continuacin, Ia muestra esrecubierta con tomos de carbono
evaporadopor el electrodo superior para estirar y estabihzarla rplica de metal.
@ Esta rplica entoncessehaceflotar en la superficie de un bao cido que
disuelvela muestra dejando limpia la rplica de metal. @ La rplica selava y se
recogeen una rejilla de cobre para su posterior visualizacin en un TEM.
(b) Evaporador de vaco en el que serealiza el sombreado.El electrodo de
carbono estlocalizado directamente sobre la muestra, mientras que el electrodo
de metal pesadoestdesplazadolateralmente.

_I

lado de la muestragenerandouna rplicade la superficie.

La caraopuestade la muestrapermanecesin teir; estaregin sifteRir creael efecto-de<sombreado>.
Entoncesseusaun electrodoque liberacarbnpararccubrir la muestracon carbonovaporizado,loque proporcionaestabilidady soportea lasrplicasde metal @. A continuacin, el soportede mica que contienela muestrase
extraedelevaporadordevacoy sesumergesuavemente
bajo
la superficiedel aguahaciendoque la rplicaflote y sedesprendade la superficiede mica.La rplicasetransfierea un
bao cido,quedisuelvelos restosde la muestra,y dejauna
rplicalimpia de metaldela muestra@. La rplicasetransfiere entoncesa una rejilla de cobreestirdar@ para su visualizacincon el microscopioelectrnicode transmisin.
ParavisualizarmolculaspurificadascomodeDNA o de
RNA comnmenteseempleaun procedimientorelacionado. En estatcnica,se extiendeuna solucinde DNA yio
RNA en una interfaseaire-agua,creandouna monocapamolecularque serecogecomo una fina pelculaque esvisualizadad, depositaruniformementemetal pesadosobreella.
Le cRrorn,cruRA y EL cRABADopoR coNGELActN
SONTILESPARAEL ESTUDIODELINTERIOR
DE LASMEMBRANAS
La criofractura esun procedimientode preparacinde la
muestracompletamentediferentedelos mtodosdescritos

Muestra
rinnrntanir'le

-,E

-;iZ

/--

Soporte
de la muestra

hastaahora.En lugar de cortar seccionesuniformesa travsde la muestrade teiido (o de teir materialsin seccionar),lasmuestrassecongelanrpidamente
a ia temperatura del nitrgeno lquido o de helio lquido, se sometenal
vaco,y segolpeancon el borde de una cuchillaafilada.Las
muestrascongeladasa temperaturastan bajasson demasiadoduraspara ser seccionadas.
Por el contrario, sefracturan a travsde laslneasde debilidadnatural-en la mayor parte de los casosel interior hidrofbico de las
membranas-. Entoncesseempleael sombreadocon platino/carbono pafa$ear una rplicade la superficiefracturada.
En la FiguraA.34 seilustrala criofractura.Tienelugar
en un evaporadordevaclomodificadocon una cuchillainternade micrtomoqueseempleaparafracturar
la muestra congelada.
La temperaturadel soportede la muestra,
del brazo del micrtomo y de Ia cuchillase controlade
maneraprecisa.Lasmuestrasestngeneralmente
fijadas
antesde la criofractura, aunque algunostejidos vivos se
puedencongelarlo suficientemente
rpido para mantenerlosen condicionesprcticamente
igualesa cuandoestabanvivos.Debido a que las clulastienen gran cantidad
de agua,las muestrassetratan habitualmentecon un anticongelante,como el glicerol,que confierecrioproteccin,
estoes,reducela formacin de cristalesde hielo durantela
congelacin.

^"v/

ru

Cuchillafra
del micrtomo

(-100.c)

Cuchilla

Muestra

Soportede la muestra

o
Rplicade metal

tu

o
FiguraA.34 Tcnicade cliofiactula. @ Una muestra crioprotegida semonta en un soporte metlico. @ La muestra montada se sumergeen
fren lquido enfriado con nitrgeno llquido. @ La muestra congeladasetransfiere a un evaporador al vaco y se ajusta a una temperatura
de - 100 oC.@ La muestra se fractura con un golpe de la cuchilla de microtomo. El plano de fractura pasaa travs del interior de Ias bicapas
lipdicas cuando esto esposible, ya que staesla llnea de menor resistenciaa travs de la muestra congelada.@ La muestra fracturada se
sombreacon platino y cartrono,como en Ia Figura A.33, para hacer una rplica de metal de la muestra.@ Larplica de metal se examina en
un TEM.

paramicroscopa
Tcnicas
de preparacin
de muestras
electrnicar 899

La muestracrioprotegidasemonta en una mordaza(Fien frenenguraA.34,pasoO) y sesumergerpidamente

friado con nitrogenolquido @. Esteprocedimientoreducetambinla formacin de cristalesde hielo en lasclulas.
Cuandosedisponela muestrasobrela mordazaen el evaporador de vaco@ seestablece
un alto vacioy seajustala
temperaturade la mordaza akededorde - 100 oC,y la
muestracongeladasefracturacon un golpedela cuchillade
micrtomo@. Entoncessehaceuna rplicade la muestra
fracturadamediantesombreadodeplatinoy carbonocomo
seha descritoen la seccinanterior @ y la rplicaestlisen el TEM @.
taparaobservarse
Lasmembranascriofracturadasaparecencomo superficies lisas salpicadascon partculas intremembranosas
(IMPs) que sedistribuyenen la membranao bien alazaro
seorganizanen complejosordenados.Estaspartculasson
protenasintegralesde membranaquehan permanecidoen
una u otra monocapaal pasarel planode fracturapor el interior de la membrana.
La micrograffaelectrnicade la FiguraA.35 muestran
por
las dos carasde la membranaplasmticaobservadas
criofractura.La caraP esla carainterior dela monocapainterna;sedenominacaraP porqueesten el lado protoplsmicodelamembrana.La caraE esla carainterior de la monocapaexterna;se llama cara E porque esten el lado
exteriorde la membrana.Observecmo la cara P tienen
quela caraE.En
muchasmspartculasintramembranosas
general,la mayor parte de las partculasde Ia membrana
permanecenen Ia monocapainterna cuandoel plano de
fracturapasapor el centrode una membrana.
caaa cara,en Ia FiguParaquelascarasP y E aparezcan
ra A.35,el planode fracturadebepasara travsde dosclulasvecinas,deforma queuna clulapierdasucitoplasmay la
paraexponer
monocapainternadesumembranaplasmtica
la caraE, mientrasquela otra cluladebeperderla monocapa externade su membranaplasmticay el espaciointercelular asociadoparaexponerla caraP.De acuerdoconesto,las
carasE estnsiempreseparadas
de lascarasP de las clulas
(indicadocon flechasen la Fipor un <escaln>
adyacentes
guraA.35) que representael grosordel espaciointercelular.
Existeuna tcnicamuy relacionadallamada grabado
por congelacin,que aadeun pasoadicionalrespectoa la
criofracturay permite aportar ms informacin.A continuacin de la fractura de la muestra,pero antesdel sombreado,sedisponeelbrazodel micrtomo directamentesobre la muestraduranteun periodocorto de tiempo (desde
unos pocossegundosa algunosminutos).Estamaniobra
producela evaporacin(sublimacin)deuna pequeacantidad de aguade la superficiede la muestrasobrela superficie de la cuchilla,y estasublimacinproduceun efectode
grabadoque consisteen la acentuacinde los detallesde la
superficie.EI grabadobrevemejorala visualizacindela superficiede la membranaexterna,que de otra forma estara
cubiertacon hielo y esdifcil de visualizaren una muestra
tpica de criofractura.
900

y tcnicas
ApndicePrincipios
de microscopa

6ffi
FiguraA.35 Criofiacturade la membtanaplasmtica. Esta
micrografia electrnica muestra las carasexpuestasde las
membranas plasmticasde dos clulasendocrinas adyacentesdel
pncreasde una rata tal y como se observanmediante criofractura.
La caraP esla superficie interna de la monocapa lipldica en el lado
protoplsmico de la membrana plasmtica.La cara E esla
superficie interna de la monocapa lipdica en el Iado externo de la
membrana plasmtica.La caraP esmucho ms rica en partculas
intramembranosasque la cara E. Las flechasindican el <escaln>
por el que pas el plano de fractura del interior de la membrana
plasmticade una clula al interior de la membrana plasmticade
ia clula vecina. Por lo tanto, esteescalnrepresenta1grosor del
espaciointracelular(TEM).

Mediantela utilizacin de tcnicasde congelacinultrarrpidaparaminimizar la formacinde cristalesdehielo

durantela congelacin,y mediantela inclusinde un crioprotector voltil como el metano lquido, que se sublima
muy rpidamentehacia una superficiefria, el periodo de
grabadosepuedeprolongary sepuedeeliminaruna capa
de hielo ms profunda, exponiendode estaforma las estructuraslocalizadasa mayorprofundidaddentro del interior celular.Estamodificacinllamadagrabadoprofundo
proporcionauna visin fascinantede la estructuracelular.
til en la exEl grabadoprofundo ha sido especialmente
ploracindel citoesqueleto
y en el examnde susconexionescon otras estructurasde la clula.
Le rsrBnroMrcRoscopA ELECTRNrcApERMrrE
DEMUESTRAS
EN TRES
LA VISUALIZACIN
DIMENSIONES

quierenvielectrnicosfrecuentemente
Losmicroscopistas
sualizarlasmuestrasen tres dimensiones.El sombreado.la
criofracturay la microscopaelectrnicade barrido son

tcnicastiles para estefin, as como otra tcnica especiaIizada Ilamada estereomicroscopa electrnica. En la estereomicroscopa electrnica se obtiene informacin tridimensional fotografiando la misma muestra desde dos
ngulos ligeramente diferentes. Esto se consigue usando
una mordaza especialque puede ser inclinada con respecto a las de electrones.La muestra seinclina inicialmente en
una direccin y se fotografa,y despusse inclina la misma
magnitud en la direccin opuesta y se fotografa de nuevo.
Las dos micrografas se montan caa a caracomo un estreopar. Cuando se observa un estreopar a travs de un
visor estereoscpico,
el cerebroemplea dos imgenesindependientes para construir una visin tridimensional que
ofrece una sensacinintensa de profundidad de la estructura que se estinvestigando.La Figura A..36es un estreo
par del cromosoma politnico de Drosophila,obtenido mediante microscopa electrnica de alto voltaje. Usando un
visor estereoscpicoo permitiendo que susojos fundan las
dos imgenesvisualmente se crea una visin tridimensional del cromosoma.

pARAMrcRoscopA
Le pRpeRecrN DEMUESTRAS
ELECTRNICADE BARRIDO REQUIERELA FUACIN
PERONO EL SECCIONAMIENTO
Cuando se prepara una muestra para microscopa electrnica de barrido el objetivo es preservar las caractersticas
estructurales de la superficie celular y tratar al tejido de
forma que se minimice el dao causadopor el haz de electrones. El procedimiento es similar a la preparacin de seccionesultrafinas en la microscopaelectrnicade transmisin, pero sin el paso de cortado. El tejido est fijado en
aldehdos,postfijado en tetraxido de osmio y deshidratado mediante el procesamientoa travsde seriesde soluciones de alcoholes.El tejido entoncesse sumergeen un fluido como dixido de carbono lquido en un recipiente de
metal pesadollamado secador de punto crtico, que seemplea para secarla muestra en condicionesde presin y temperatura controladas.Esto aluda a mantener la estructura
de las superficiesdel tejido en casi las mismas condiciones
que tenan antesde la deshidratacin.
La muestra secase pega entonces sobre una mordaza
metlicacon una pastametlica.La muestramontada esrecubierta con una capa de oro o una mezclade oro y paladio utilizando una forma de evaporacin al vaco -oaincada llamada recubrimiento por bombardeo (sputter
coating). Una vez que la muestra se ha montado y recubierto estpreparadapara ser examinadaen un SEM.

Otros mtodos de imagen

,a.{

.qd

" ,1,*

:1
.i:,

{'lt

,,a"lt

,'*1{
,

nt'

tt

.
r

'"ti

r*

,n

!r ..r

a'.

*",{

- qstmFiguraA.36 Estereomicroscopia
electrnica. El cromosoma
politnico que se observaen estamicrografa electrnicade alto
voltajesemuestracomo un estreopar de fotos que sepueden
fundir pticamente para generar una imagen tridimensional. Las
dos fotografassetomaron inclinando el soporte de Ia muestra
primero 5oa la derechay despus5" a la izquierda respectoal haz
de electrones.Para una vista tridimensional sepuede examinar el
estreopar con un visor estereoscpico,
fusionndolas dos
micrografias en una imagen simple (HVEM).

Las microscopasptica y electrnicason tcnicasde imagen directa,en las que los fotoneso los electronesproducen
imgenesde una muestra. Sin embargo, otras tcnicasde
imagen son indirectas.Para comprender lo que queremos
decir por imagen indirecta suponga que le dan un objeto
para manipular con los ojos cerrados.Usted puede sentir
seissuperficiesplanas,12 bordes y ocho esquinasy si usted
despuspuede dibujar lo que ha percibido, el objeto resultante seruna caja.Esto esun ejemplo de un procedimiento indirecto de imagen.
Los dos mtodos indirectos de imagen que describimos
sonla microscopade barrido de sonday la difraccin de rayos
X. Ambas aproximaciones tienen el potencial de mostrar las
estructuras molecularescon una resolucin casi atmica, l0
vecesmejor que el mejor microscopio electrnico.Tienen algunos defectosque limitan su utilidad para muestras biolgicas,pero cuando estastcnicasseaplican con xito,las imgenes resultantes proporcionan na informacin nica
acercade la estructura molecular que no se puede obtener
empleando tcnicasconvencionalesde microscopa.
Le urcnoscopA DE BARRIDo DE soNDA REVELA
LAS CARACTERSTICASDE LA SUPERFICIE
DE MOLCULASINDIVIDUALES
Aunque el <barrido> se produce tanto en la microscopa
electrnica de barrido como en la microscopa de barrido

Otrosmtodos
deimagen

901

El primer
de sonda,los dos mtodosson muy diferentes.
ejemplode microscopade barrido de sondadenominado
microscopiode efectotnel (STM) fue desarrolladoal principio de los aos80 con el fin de explorarla estructurasuperficial de muestrasa nivel atmico.El STM utiliza una
sondamuy pequeaque no emite un haz de electrones,
sinoquepor el contrarioposeeunapuntahechade un materialconductorcomoel platino-iridio.La puntadela sonda estextremadamenteafiladaestandocompuestaidealmentepor un nico tomo.Medianteel control precisode
un circuitoelectrnicoestapunta sepuedemoverentresdix e ybaLasdimensiones
mensiones
sobreuna superficie.
que
la
mientras
la
dimensin
z
controla
la
superficie,
rren
(Figura
punta
A.37).
la
superficie
sobre
distanciade la
A medidaque la punta del STM semuevea lo largo de
la superficiede una muestra,seaplicanvoltajesque oscilan
entre unos pocosmilivoltios y algunosvoltios. Si Ia punta
estlo suficientementecercade la superficie,y la superficie
es conductoraelctricamente,empezarna fluir o a desplazarseelectronesa travsdel espacioo la brechaexisten-

lmagenconstruida
poroarnqos
sucesrvos-

enladireccin
,f
Movimiento
ffi

Superficieestudiada
FiguraA.37 Microscopaelectrnicade efectotnel, El
microscopio de efecto tnel (STM) emplea mtodos electrnicos
para mover una punta metlica a lo largo de la superficie de una
muestra. En esailustracin la punta no estdibujada a escala;Ia
punta estcompuestade manera ideal nicamente por uno o unos
pocos tomos, mostrados aqu como esferas.Seestableceun voltaje
elctrico entre la punta y la superficie de la muestra.A medida que
la punta hace un barrido de la muestra en las direccionesx e ft
ocurre un efectotnel de los electronesa un ritmo dependientede
la distancia entre la punta y la primera capa de tomos de la
superficie.El instrumento estdiseadopara mover la punta en la
direccin z con objeto de mantener un flujo constantede corriente.
El movimiento espor lo tanto una funcin de Ia corriente de
electronesy se representaen una pantalla de vdeo. Los barridos
sucesivosconstruyen de estaforma una imagen de la superficie a
resolucin atmica.

902

y tcnicas
Apndice Principios
de microscopa

te entrela sondaenla muestra.El flujo dependeen granmedida dela distancia,de forma queinclusolaspequeasirregularidadesen el rango del tamao de tomossencillos
afectarna la velocidaddel flujo de electrones.A medida
quela sondabarrela muestra,la puntadela sondasemueve hacia arribay haciaabajoautomticamentepara mantenerun flujo constantede electronesa travsde la brecha.
Un ordenadormide estemovimiento y usala informacin
para generarun mapa de la superficiede la muestraque
puedeverseen un monitor de vdeo.
Peseal enormepoder del STM,tienedoslimitaciones:
y la tcnicanila muestradebeserun conductorelctrico,
camenteproporcionainformacinde los electronesasociadoscon la superficiede la muestra.Los investigadores
han comenzadopor lo tanto a desarrollarotrostipos de microscopiosdebarrido de sondaquehacenun barrido como
en el STM pero quemiden distintostiposde interacciones
entrela puntay la superficiedela muestra.Porejemplo,en
defuerzaatmica(AFM),la punta del escel microscopio
ner seempujacontrala superficiede la muestra.A medida
quesebarrela muestra,semuevehaciaarribay haciaabajo comosi sedesplazase
sobrecolinasy vallesmicroscpien la superficiede
cosformadospor los tomospresentes
la muestra.Sehan diseadodiversosmicroscopiosde bacomola friccin,
rrido de sondaparadetectarpropiedades
el calory el sonido.
potencialmente
msimportanUna de lasaplicaciones
tesde la microscopade barrido de sondaesla medidade
los cambiosdinmicosen la conformacindelasbiomolpor ejemploIo impreConsider
culasen funcionamiento.
sionanteque podraser<visualizar>el cambiode forma de
una nica molculade una enzimaa medidaque hidroliza
transportarioAIP paraproducirla energlanecesariapara
nesa travsde membranas.Esta<visualizacinmolecular>
en la esferareal.Esinesahorauna posibilidadenteramente
clusoposibleusaruna forma modificadadela microscopa
de fierza atmicapara estirar directamentebiomolculas
mecnicas.
grandesparamedir suspropiedades
Le ornccrN or RAYosX pnrr,rtrr
DE LA ESTRUCTURA
LA DETERMINACIN
DELASMACROMOLCULAS
TRIDIMENSIONAL
Aunquela difraccin de rayosX no incluyeningunaforma
de microscopa,
esun mtodotan importanteparainvestigar la estructuratridimensionalde las molculasindividualesquela incluimosaqu.Estemtodoreconstruyeimgenesa partir de los patronesde difraccinde rayosX que
pasana travsde una muestracristalinao fibrosa,revelando la estructuramolecularcon una resolucinde nivel
atmico.
Una buenaforma de entenderla difraccinde rayosX
una analogacon la luz visible.Como discutiesestablecer
mos anteriormentela luz tiene algunaspropiedadesque se
describende forma ptima comouna onda.Cuandoocurren fenmenosondulatoriosen la naturalezase pueden

a
producirinteracciones
entrelasondas.Si lasondasprocedentesde dos orgenesentran en fase,su amplitud total es
aditiva (interferenciaconstructiva);
si estnfuerade fase,su
amplitud sereduce(interferenciadestructiva).
Esteefectose
puedever cuandola luz pasaa travsde dosorificiosen una
piezadematerialopacoy entoncesincidesobreuna superficieblanca.Seproduceun patrndeinterferencias,
conregionesoscurasen lasregionesenlasquelas
""*:_0"^tli.:^
tn fuera de fasey regionesclarasdonde
estnen fase
(FiguraA.38).Si la longitudde ondade la luz (,1)esconocida,uno puedemedir el ngulo d entre el rayo original y
el primer pico de difracciny entoncescalcularla distancia
d entrelos dos orificios mediantela frmula:

)_

| tv
;)

(A.6)

u-

sen

patrones

FiguraA.38 Comprensin
de los
de difiaccin, Cualquier
Sepuedeusarestamismaaproximacinparacalcularla
energacon forma ondulatoia producir patrones de interferencia
distanciaentretomosen cristaleso fibrasde protenaso
si las ondas producidas a partir de dos o ms fuentesse superponen
cidosnucleicos.En lugarde unahoja depapelcon dosaguen el espacio.Uno de los patrones ms simples que sepuede
jeros,imaginequetenemosmltiplescapasde tomosorobservar cuando la luz monocromtica pasaa travs de dos
orificios vecinos e incide sobre una pantalla. Cuando la luz
ganizadosen un cristalo una fibra. En lugar de luz visible,
atraviesalos dos orificios, stosactan como fuentesde luz,
que tiene una longitud de onda demasiadograndepara
irradiando ondas que inciden sobre una superficieblanca. En los
interaccionarcon los tomos,emplearemos
un hazestrecho puntos en los que las ondas estnen la misma fase,apareceuna
de rayosX, con longitud de onda en el rango de lasdistansuperficie brillante (interferencia constructiva), pero cuando las
ciasinteratmicas.
A medidaquelos rayosX pasana travs ondas estnfuera de fasese neutralizan entre ellasintroducen zonas
de la muestra,reflejanplanosde tomos,y los hacesrefle- oscuras(interferencia destructiva).
jadossufreninterferencias
y destructivas.
constructivas
Los
rayosreflejadosinciden sobreplacasfotogrficasdetrsde
para deducirla estructuratridimensionalde la molcula
la muestragenerandopatronesdistintivosde difraccin. original.La FiguraA.39 ilustrala utilizacinde estatcniEstospatronesson entoncesanalizados
matemticamente caparareducirla estructurade doblehlicedel DNA.
FigutaA.39 Difiaccinde tayos X. Sepuede utilizar la difraccin de rayos Xpara analizarla
estructura molecular con una resolucin casiatmica. O Los rayosX son difractados por los
tomosde cristaleso fibrasde la misma forma que las ondasde luz son difractadaspor los
orificios.En Ia mayorade los casos,las muestrasde interspara los bilogosson protenaso
cidos nucleicos.El ejemplo especficoilustrado en estafigura es una fibra de DNA. @ Los
patrones de difraccin resultantesson registradosfotogrficamentey se pueden analizar
matemticamentePara deducir la estructura molecular. Estafotografla muestra el patrn de
difraccin de rayosX empleado por famesWatson y Francis Crick para deducir la estructura
molecular de la doble hlice del DNA. @ Modelo srfico de ordenador de la estructura en doble
hlice del DNA.

Fibrade DNA

Haz de rayosX

Patrnde difraccin
sobre una placa fotogrfica

por la fibra
lo. rayosX difractados
de DNA producenun patrn
de difraccinen una placafotogrfica

ft patrOn
de difraccln
resultante
se analiza
matemtcamente.

t" deducela estructura

tridimensional
de la molcula,

0trosmtodos
de imagen

903

a-La tcnicade difraccinde rayosX fue desarrolladaen

l9l2 por Sir William Bragg,que la emple paraestablecer
la estructurade cristalesmineralesrelativamente
simples.40
aosdespus,
Max Perutzy |ohn Kendrewencontraronformasde aplicarla difraccinde rayosX a cristalesde hemoglobinay mioglobina,proporcionandonuestraprimeravisindela estructuradelasprotenas.Desdeentonces,
sehan
cristalizadoy analizadopor difraccinde rayosX numerosasprotenasy otrasmolculasbiolgicas.Aunquelasprotenasde membranason mucho msdiffcilesde cristalizar
quelasprotenasanalizadas
generalmente
por difraccinde
rayosX, Hatmut Michel y Iohann Deisenhofersolucionaron esteobstculoen 1985al cristalizarlas protenasdel
centroreaccinfotosintticodelasbacterias.Enroncescontinuaron paradescribirla organizacinmoleculardel centro reaccina una resolucinde 0,3 nm, un logro que les
hizo merecedores
del PremioNobel.
Le cmoEM ESTABLEcE
uN PUENTE
ENTRELA CRISTALOGRAFA
DE RAYOS
X
Y LA MICROSCOPA
ELECTRNTCA
La cristalografia
de rayosX ha proporcionadounasvisionessin precedentes
de lasmolculasbiolgicasa nivelatmico. Sin embargo,la cristalografarequieregrandescantidadesde molculaspurificadas.
Adems,la cristalografta
de rayosX no esthastael momentobien adaptadapara
analizaragregadosmacromolecularesgrandescomo por
ejemplolosribosomas(vaseFigura
20.1).Unatcnicaque
a:gtdaa rellenarestevaco esla crioEM. En la crioEM, se
congelanrpidamentemediantecriofijacin molculaso
agregados
macromoleculares
purificados.La congelacin
rpidaevitala formacinde cristalesde hielo.Por el conquedanembebidas
trario,lasmolculas
enhielovtreo,agua
congelada
no cristalinaquepreservamejor lasestructuras

de lasmolculasembebidas.La muestraesentoncesvisualizadaen un microscopioelectrnicoa muy baja temperatura ( - 170"C). A menudo,lasmuestrassonrotadasy visualizadasdesdenumerosasorientacionesdiferentes,las

visionesrotadasresultantessereconstruyenpara proporcionarinformacintridimensionalacercadela muestra,un
procesoconocido como tomografaelectrnica.Para ver
cmo funciona la crioEM junto a la cristalografade rayos
X considerela FiguraA.40,en la que seha combinadouna
imagende crioEM de las subunidades
ribosomales30Sy
50Sy de un factorconocidocomoRF2conla estructuradetalladade RF2obtenidaa partir de datosde rayosX. Utilizando estasdos tcnicasde manera conjunta, es posible
ver cmo la estructurade la protenaposibilita que encaje
en la estructurageneraldel ribosomaparadesempear
su
funcin.

(a)

(b)

FiguraA.40 Utilizacinde la ciloEM y la cristalogtafriade rayosX

para establecerun puenteentre los nivelesatmico y molecular,
(Izquierda) Reconstruccintridimensional de las subunidades30S
(amarillo) y 50S (azul) del ribosoma unidas al factor de liberacin
(RF2, en rosa) obtenida mediante crioEM. La cristalografade rayos
X proporciona una visin ms detallada deRF2 (derecha).
(Reproducido con el permiso de Nature Publishing Group.)

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