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Director
BERNADETTE KLOTZ
Biloga
ROSA ERLIDE PRIETO
Qumica
UNIVERSIDAD DE LA SABANA
FACULTAD DE INGENIERIA DE PRODUCCION AGROINDUSTRIAL
BOGOTA, D.C.
2001
Nota de aceptacin
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
Presidente del Jurado
________________________________
Jurado
________________________________
Jurado
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a:
La Doctora Bernadette Klotz y la Doctora Erlide Prieto, directoras del presente proyecto,
por su valiosa colaboracin y orientacin para el desarrollo del mismo.
CONTENIDO
Pg
Contenido
VI
Contenido
VII
Contenido
VIII
3.3.5.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 51
3.3.5.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 51
4. PRESENTACIN DE RESULTADOS ---------------------------------------- 53
4.1 GUIA DE MANEJO DEL SISTEMA DE BOMBAS
PERISTLTICAS ---------------------------------------------------------------------- 53
4.1.1 Configuracin de sistema de bombas peristlticas para control de pH -------- 55
4.2 RESULTADOS DE FERMENTACIONES PRELIMINARES ------------- 56
4.2.1 Porcentajes de variacin de pH para los medios semisinttico y natural ------ 57
4.3 RESULTADOS DE PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO ---- 57
4.3.1 Determinacin de velocidad de agitacin para una fermentacin alcohlica-- 57
4.3.2 Determinacin de la concentracin de cido y base --------------------------------- 58
4.3.3 Fermentacin preliminar en el Bioflo ----------------------------------------------------- 58
4.4 ESTANDARIZACION DE METODOLOGIAS ----------------------------------- 58
4.4.1 Calibracin de mtodo de determinacin de nitrgeno total ----------------------- 59
4.4.1.1 Curva de calibracin del mtodo Kjeldahl con urea ------------------------------- 59
4.4.1.2 Curva de calibracin para etapa de destilacin y titulacin---------------------- 60
4.4.2 Calibracin del mtodo de determinacin de azcares reductores
por titulacin de Lane y Enyon --------------------------------------------------------------------- 62
4.5 RESULTADOS DE LAS FERMENTACIONES ALCOHOLICAS
EN EL BIOFLO -------------------------------------------------------------------------------------- 63
4.5.1 Datos de crecimiento de microorganismos --------------------------------------------- 63
4.5.2 Datos de contenido de nitrgeno total en la biomasa-------------------------------- 65
4.5.3 Datos de slidos solubles totales y porcentaje de sacarosa----------------------- 66
4.5.4 Datos de azcares reductores residuales y contenido de etanol ----------------- 66
4.5.5 Volmenes consumidos de cido y base por el sistema de regulacin
de pH ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 67
4.5.6 Variacin de pH en las fermentaciones sin control de pH -------------------------- 68
5. DISCUSION DE RESULTADOS ------------------------------------------------------- 69
Contenido
IX
LISTA DE TABLAS
Pg
Tabla 2.1 Requerimientos de nutrientes ---------------------------------------------------------23
Tabla 2.2 Composicin del extracto de levadura producido mediante autlisis------- 24
Tabla 2.3 Parmetros medidos o controlados en biorreactores -------------------------- 29
Tabla 3.1 Normas y mtodos utilizados--------------------------------------------------------- 35
Tabla 3.2 Medio de cultivo semisintticos ------------------------------------------------------ 37
Tabla 3.3 Medio de cultivo naturales------------------------------------------------------------- 38
Tabla 4.1 Ciclo de funcionamiento de bombas peristlticas------------------------------- 54
Tabla 4.2 Caudales de bombas peristlticas para flujos de entrada y salida
empleando tubo de silicona de 1/8--------------------------------------------------------------- 55
Tabla 4.3 Resultados para medio semisinttico ----------------------------------------------- 56
Tabla 4.4 Resultados para medio natural ------------------------------------------------------ 56
Tabla 4.5 Porcentajes de variacin de pH------------------------------------------------------ 57
Tabla 4.6 Resultados de volmenes consumidos de cido y base, y
tiempo de operacin a diferentes velocidades de agitacin -------------------------------- 57
Tabla 4.7 Resultados de volmenes consumidos de cido y base, y
tiempo de operacin a diferentes concentraciones ------------------------------------------- 58
Tabla 4.8 Resultados de calibracin para mtodo total de Kjeldahl--------------------- 59
Tabla 4.9 Resultados para etapa de destilacin y titulacin del mtodo
Kjeldahl --------------------------------------------------------------------------------------------------- 61
Tabla 4.10 Resultados de calibracin para mtodo de determinacin de
azcares reductores----------------------------------------------------------------------------------- 62
Tabla 4.11 Resultados de crecimiento de microorganismos ------------------------------ 64
Tabla 4.12 Resultados de contenido de nitrgenos celular por mililitro ---------------- 65
Tabla 4.13 Resultados de toma de Brix a 20 C--------------------------------------------- 66
Tabla 4.14 Resultados de determinacin de azcares reductores residuales-------- 67
X
Lista de Tablas
XI
LISTA DE FIGURAS
Pg
Figura 2.1 Secuencia de la gluclisis ------------------------------------------------------------ 19
Figura 2.2 Va anaerobia de la gluclisis ------------------------------------------------------- 20
Figura 2.3 Va aerbica de la gluclisis --------------------------------------------------------- 20
Figura 2.4 Relacin de concentracin de substrato y velocidad
especfica de crecimiento de un microorganismo --------------------------------------------- 21
Figura 2.5 Curva de crecimiento tpica de una poblacin celular ------------------------ 22
Figura 2.6 Componentes del retroalimentador ------------------------------------------------ 30
Figura 2.7 Efectos de la tasa de dilucin y concentracin de substrato
en un quimiostato -------------------------------------------------------------------------------------- 31
XII
LISTA DE ANEXOS
Pg
Anexo A Datos de fermentaciones preliminares----------------------------------------------- 88
Anexo B Datos de fermentaciones en el Bioflo ------------------------------------------------ 90
Anexo C Datos del seguimiento de una fermentacin con flujos de
entrada y de salida ------------------------------------------------------------------------------------ 94
Anexo D Sistema de bombas peristlticas del Bioflo 3000 M1227 --------------------- 100
XIII
RESUMEN
Abstract: The purpose of this project was to establish the effect of a regulated pH on an
ethanolic fermentation at 25C. Also, through this study it was want to complete
instruction manual of the biorreactor Bioflo. Following parameters were determined
during the growth of Saccharomyces cerevisiae in a system with controlled and non
controlled pH: total nitrogen content, growth of microorganism, consumption of total
soluble solids, sucrose content, ethanol content and residual sugars content. In
addition, initial steps for the establishment of a continuos culture realized.
XIV
INTRODUCCION
CAPITULO 1
OBJETIVOS
16
CAPITULO 2
REVISION BIBLIOGRAFICA
Gluclisis
2 Etanol + 2 CO2
Fase de retraso: En esta fase las clulas se ajustan a las nuevas condiciones.
Si un cultivo que crece exponencialmente es inoculado al mismo medio bajo
las mismas condiciones de crecimiento, no se observa fase de retraso y el
crecimiento exponencial continua a la misma velocidad.
NUTRIENTE
CARBONO
NITROGENO
FOSFORO
Na2HPO4, KH2PO4
AZUFRE
Na2SO4, H2S
POTASIO
KCL, K2HPO4
MAGNESIO
MGSO4, MgCL2
SODIO
NaCl
HIERRO
MICRONUTRIENTES
2.1.2.2
Muchos procesos a gran escala utilizan amonio, sales, urea o amonio gaseoso
como fuente de nitrgeno. Una fuente de nitrgeno que es metabolizada
eficientemente es el lquido de maceracin del maz, que se forma durante la
formacin de almidn a partir de maz. Los extractos de levadura son excelentes
substratos para muchos microorganismos. El extracto de levadura contiene
aminocidos, pptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos. Las peptonas
pueden ser utilizadas por muchos microorganismos pero son relativamente caras
para la aplicacin industrial. Las fuentes de peptonas incluyen la carne, la
caseina, la gelatina, la queratina, las semillas de man, la harina de soya, las
semillas de algodn y las semillas de girasol.
El extracto de levadura es medio complejo y su composicin se presenta a
continuacin.
Tabla 2.2 Composicin del extracto de levadura producido mediante autlisis
COMPOSICIN (%)
MATERIA SECA
70
NITROGENO TOTAL
8.8
PROTEINA (N * 6.25)
55
AMINOACIDOS
38.4
CONTENIDO EN VITAMINAS (ppm)
TIAMINA
20-30
RIVOFLAVINA
50-70
PIRIDOXINA
25-35
ACIDO PANTOTENICO
200
NIACINAMINDA
600
2.2
VARIABLES
ALCOHOLICA
QUE
AFECTAN
LA
FERMENTACION
Adicin de cido tartrico o de cido ctrico: Los dos nicos cidos que se
pueden usar tanto tecnolgicamente como legalmente, son el cido tartrico y
el ctrico.
11
Desacidificacin:
Los desacidificantes utilizables tcnicamente en las
fermentaciones son: el carbonato de calcio, el bicarbonato de potasio y el
tartrato neutro de potasio.
2.2.2.2 Buffers
En los medios de cultivo es deseable mantener un pH constante (rango 3.0 3.5)
durante el proceso fermentativo y esto se logra mediante el empleo de
amortiguadores o buffers. Tambin sucede que el pH en un medio de cultivo se
ajusta adicionando un compuesto alcalino, por ejemplo hidrxido de sodio si el pH
es demasiado cido; o un compuesto cido, por ejemplo el cido clorhdrico, si el
pH es demasiado alcalino. Como los microorganismos suelen provocar cambios
en el pH de sus ambientes al desarrollarse, lo mejor es adicionar al medio de
cultivo un amortiguador de pH, actuando dentro de los lmites mximos de pH; por
lo tanto, se deben seleccionar amortiguadores para diferentes regiones de pH.
Para lmites prximos a la neutralidad (pH 6.0 a 7.5) el fosfato constituye un
amortiguador apropiado (Brock, 1993, 349). Generalmente los sistemas proteicos
de un medio de cultivo permiten un efecto buffer en el mismo.
2.2.3 Aireacin
La velocidad de fermentacin al inicio del proceso fermentativo, depende
estrechamente de las condiciones de aireacin,
desarrollndose dicha
fermentacin ms rpidamente cuando las levaduras estn mejor aireadas. Por lo
tanto, es conveniente airear el medio hasta el mximo, mximo que coincidir con
l limite de solubilidad de un gas (oxgeno) en un liquido y que es muy bajo. Por
mucho que se airee al principio, se tender a alcanzar muy pronto la saturacin
del mosto en oxgeno.
La utilizacin del oxgeno por levaduras slo tiene lugar al comienzo de la
fermentacin. Una vez arrancada sta, no necesita oxigenacin o de lo contrario
se desviara el proceso alcohlico, y comenzara entonces la metabolizacin de
los azcares por va respiratoria, produciendo mayor cantidad de clulas.
La fermentacin con agitacin es ligeramente ms rpida que la fermentacin sin
agitacin. A pesar de ello, los niveles finales de etanol y azcar obtenidos son
similares en ambas condiciones de operacin, observndose un ligero aumento en
el grado alcohlico y el azcar residual en la fermentacin sin agitacin (Lpez,
Marzo de 1995, 55).
2.3 BIORREACTORES
Son dispositivos para el cultivo de microorganismos que permiten el control tanto
de la densidad de la poblacin, como de la velocidad de crecimiento. Su
aplicacin incluye la preparacin de bebidas alcohlicas, como una amplia gama
en la industria biotecnolgica.
Se pueden adaptar para realizar cultivos
12
Produccin de biomasa.
Las medidas que son realizadas en lnea generalmente son: temperatura, presin,
pH, oxgeno disuelto, velocidad de flujo, velocidad de agitacin, consumo de
energa, nivel de espuma.
13
QUIMICOS
BIOLOGICOS
CONCENTRACION DE
BIOMASA, CONCENTRACION
DE ENZIMAS, COMPOSICION
DE BIOMASA(ADN, ARN,
PROTEINA,
ATP/ADP/AMP/NAD),
MORFOLOGIA.
15
16
17
D = max x se / Ks + se
Donde se es la concentracin del substrato residual en el estado de equilibrio.
Despejando se de la ecuacin anterior resulta:
se = Ks x D / max D
Esta ecuacin predice que la concentracin de substrato en el quimiostato viene
determinada por la velocidad de dilucin. En efecto, esto se debe a que el
crecimiento est consumiendo el substrato hasta una concentracin que permite
que la velocidad de crecimiento iguale a la velocidad de dilucin.
La concentracin de clulas en el quimiostato en el estado de equilibrio viene
definida por la ecuacin:
xe = Y ( SR ( Ks x D / max D ) )
donde:
Y es factor de rendimiento para el substrato limitante (g biomasa/ g substrato
consumido).
SR es la concentracin original del substrato en el medio.
La velocidad especfica mxima de crecimiento en los procesos industriales se
escoge de forma que se obtenga el rendimiento ms alto en el volumen ms
pequeo del fermentador y en el tiempo ms corto.
El modelo de Monod no es generalmente aplicable a la fermentacin continua a
velocidades muy bajas o muy altas de dilucin. A velocidades medias de dilucin
la relacin molar entre la biomasa producida y el CO2 que se desprende es
constante. A bajas velocidades de dilucin la proporcin de CO2 se hace ms
grande. Esto se debe a que se utiliza ms fuente de energa para el
mantenimiento de la estructura celular, para la regulacin osmtica o para la
motilidad de la clula. Por otra parte, a velocidades altas de flujo una parte del
carbono aadido es oxidado incompletamente (a productos como piruvato, acetato
o cidos tricarboxlicos) y de esta forma se reduce la productividad. A bajas
velocidades de flujo, con nitrgeno como substrato limitante, se forman materiales
de reserva, como polisacridos, lo que resulta en un aumento en el tamao de la
clula y por tanto de la biomas
18
CAPITULO 3
MATERIALES Y METODOS
3.1
PROCEDIMIENTO
NORMA/METODOS
Nitrgeno
Etanol
Azcares reductores
Slidos solubles totales y % Sacarosa
Conteo de microorganismos
FUENTE: Autores
Elaboracin de curvas de calibracin para los mtodos de determinacin de
nitrgeno y azcares reductores, utilizando muestras de concentracin
conocida, para los mtodos empleados.
3.2
DISEO EXPERIMENTAL
Determinacin de parmetros en
funcin del tiempo: nmero de
microorganismos, slidos solubles
totales, %sacarosa, pH
Pruebas en el Bioflo
Fermentacin alcohlica en el
biorreactor, preparacin de medio de
cultivo a 10 litros bajo condiciones
constantes de temperatura 25 C y pH
de 4.5, paralelo a una fermentacin
sin funcionamiento del sistema de
regulacin de pH a 25C.
Determinacin de parmetros en
funcin del tiempo: nmero de
microorganismos, slidos solubles
totales y %sacarosa, nitrgeno total.
Se emplea el medio s2 a un
volumen de 10 litros, tomando
muestra diaria para determinar
crecimiento
de
microorganismos, contenido
MEDIO S1
MEDIO S2
MEDIO S3
Extracto de levadura
(g/l)
8.00
8.00
8.00
Sacarosa (g/l)
100.00
100.00
100.00
Metabisulfito de
Sodio (g/l)
0.05
0.05
0.05
Solucin Madre de
Complejo vitamnico
(ml/l de medio)
0.11
0.11
0.11
Sulfato de Amonio
(NH4)2SO4 (g/l)
0.25
Fosfato de Amonio
(NH4)2HPO4(g/l)
0.25
Fuente: Autores
MEDIO N1
MEDIO N2
MEDIO N3
Pia (Ananas
comosus) (g/l)
1000.00
1000.00
1000.00
Metabisulfito de
Sodio (g/l)
0.05
0.05
0.05
Solucin Madre de
Complejo vitamnico
(ml/l de medio)
0.11
0.11
0.11
Sulfato de Amonio
(NH4)2SO4 (g/l)
Fosfato de Amonio
(NH4)2HPO4(g/l)
0.25
0.25
Fuente : Autores
Cada medio se elabor por triplicado. Posteriormente se debe llegar a 20Brix con
ms adicin de sacarosa.
3.2.3 Esterilizacin de los erlenmeyer y adecuacin de los medios de cultivo
Para la esterilizacin de los 18 erlenmeyer se utiliz una estufa WTB-BINDER,
para ello se procedi a cerrarlos con papel aluminio, con el fin de que
permanecieran estriles hasta el tiempo en el que fueran utilizados. La
esterilizacin se llev a cabo a 200oC durante dos horas. Se procedi a la
introduccin del medio en los erlenmeyer, este proceso se realiz dentro de una
cmara de flujo laminar CAE ET (30"x36"x6"), para evitar la contaminacin de los
medios de cultivo. Luego se aument la temperatura de los medios a 25oC, al
colocarlos en una estufa Binder adecuada a esta temperatura. En la preparacin
del medio de cultivo se agreg el metabisulfito de sodio con el fin de realizar una
inhibicin bacteriana qumica, y de esta forma, evitar el crecimiento de la flora
bacteriana que podra contaminar el medio, formada principalmente por bacterias
fermentativas tolerantes a medios cidos.
pH
Para medir el pH, se tom una muestra diaria de cada medio durante la
fermentacin, agitando previamente de manera suave durante 30 segundos el
medio de cultivo. El pH fue medido mediante un potencimetro debidamente
calibrado.
3.2.5.2
Nmero de microorganismos
Temperatura de 25 C
Temperatura de 25 C
3.2.11.2
Tcnicas utilizadas
Digestin
2 NH3 + 2H3BO3
Para calcular un volumen terico de HCl con una normalidad dada se tiene de la
estequiometra de la reaccin:
ml de HCl x Normalidad = Xg N [(132g (NH4)2 SO4 x 34g NH3 x121g H2BO3 x 73 g
HCl x 1 equiv. HCl x 1000ml) / (28g N x 132g (NH4)2 SO4 x 34g NH3 x121g H2BO3
x 36.5 g HCl)]
Donde se obtiene:
ml de HCl x Normalidad HCl = Xg Nitrgeno x 71.43
3.3.1.3 Materiales
Sistema de digestin de KJELDAHL BUCHI B-316
Unidad de destilacin BUCHI B-316
Centrfuga HERMLE Z320
Tubos de vidrio para digestin BUCHI
Vaso de precipitado de 1000 ml (plsticos)
Bureta de 10 ml ( + 0.05 ml)
Pipetas de 5 y 10 ml (+ 0.045 - 0.05 ml) respectivamente
Erlenmeyer de 250 ml
Placa de calefaccin y agitacin
Tubos para centrfuga
Balanza analtica
3.3.1.4 Reactivos
Acido sulfrico concentrado r.a
Pastillas catalizadoras de Kjeldahl sin selenio
Indicador de Taschiro
Acido brico al 2%
Solucin de hidrxido de sodio al 32%
Acido clorhdrico 1 N
Agua destilada
Carbonato de sodio
3.3.1.5 Procedimiento
!
Digestin
en
de
de
en
10
Destilacin:
11
Clarificacin
12
Solucin A (1 litro)
Solucin B (1 litro)
Titulacin
Azul de metileno
3.3.2.4 Procedimiento
13
14
15
Destilacin
16
17
3.3.5.4
Procedimiento
Porcentaje de sacarosa
18
CAPITULO 4
PRESENTACION DE RESULTADOS
4.1
GUIA DE MANEJO
PERISTALTICAS
DEL
SISTEMA
DE
BOMBAS
Modos LVL1, LVL2, LVL3: Estos modos se utilizan cuando los sensores de
control de niveles en el Bioflo estn presentes en el sistema. Generalmente
estos modos se utilizan para fermentaciones en continuo. Cada uno de los
modos de nivel pueden a la vez seleccionarse para manejo del sistema
continuo. Los modos de funcin del LVL1, 2 y 3 son Off, Add y Harvest. Esto
indica que cada sensor de nivel puede ser utilizado para alimentar de medio de
cultivo o para cosechar respectivamente, teniendo en cuento que cada sensor
de nivel se le asigna una bomba.
En general, para el sistema de bombas peristlticas se emplean como entrada o
salida de flujos del Biorreactor, las cuales deben instalarse apropiadamente para
su correcto funcionamiento (Ver Anexo D). La configuracin de las bombas
depende de su uso y se instalan en el sistema as:
Para flujos de entrada al Biorreactor: se adapta el tubo de silicona de 1/8 de
pulgada al puerto necesario. El tubo va desde el puerto hasta la parte baja de
la bomba seleccionada y debe dar vuelta a la bomba, para esto se coloca la
bomba en modo ON, hasta que se adapta totalmente el tubo. El tubo de
silicona termina por acoplarse al recipiente contenedor. La bomba se configura
en los modos mencionados.
Para flujos de salida del Biorreactor: se adapta el tubo de silicona de 1/8 de
pulgada al puerto necesario. El tubo va desde el puerto designado hasta la
parte alta de la bomba seleccionada y debe dar vuelta a la bomba para
terminar acoplado en el recipiente contenedor.
Las bombas en su funcionamiento tienen unos ciclos variables de velocidad con
los cuales determinan caudales de entrada y de salida del Biorreactor. Los ciclos
variables se enuncian a continuacin.
Tabla 4.1 Ciclos de funcionamiento de bombas peristlticas
D
%
V E L O C
I D
5
1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
5
0
0
0
0
0
0
0
0
1 0 0
A T O S
F U N C
A D
D E
I O N
C I C L O S
D
A M I E N T O
T I E M P O
M U E R T O
( s e g )
1 5 . 0
1 3 . 5
1 3 . 0
1 2 . 8
1 1 . 5
1 0 . 9
8 . 9
7 . 8
6 . 8
5 . 5
5 . 2
3 . 0
C I C L O
D E
T R A B A J O
( # G I R O )
1 / 8
1 / 4
3 / 8
5 / 8
7 / 8
1
1 / 8
1
3 / 8
1
3 / 4
2
2
1 / 4
2
1 / 2
2
3 / 4
Fuente: Autores
CAUDAL DE
ALIMENTACION
(m l/m in)
0.175
0.475
0.630
0.785
0.940
1.095
1.250
1.565
3.125
CAUDAL DE
COSECHA
(m l/m in)
0.200
0.575
0.780
0.985
1.190
1.395
1.600
2.004
4.031
% DIFERENCIA ENTRE
CAUDAL DE ALIMENTACION
Y COSECHA
12.50
17.39
19.23
20.30
21.01
21.51
21.88
21.91
22.48
Fuente: Autores
4.1.1 Configuracin de sistema de bombas peristlticas para control de pH
Para la utilizacin del sistema de regulacin de pH, en el Bioflo se deben
seleccionar dos bombas peristlticas para la adicin de cido y de base de
acuerdo a la accin de control. Los pasos a seguir son:
Seleccionar el cido y la base a utilizar para la regulacin de pH. En ste caso
se utiliz cido ctrico e hidrxido de potasio respectivamente.
Adaptar dos tubos de silicona a las bombas seleccionadas. El tubo se instala
de la siguiente manera: desde el puerto de adicin que se encuentra en la
tapa del vaso del Bioflo, hasta la parte de abajo de la bomba peristltica,
dndole la vuelta alrededor de ella hasta el recipiente donde se encuentra el
cido y la base respectivamente. Los recipientes a utilizar son erlenmeyer de
500 ml con tapn de caucho por donde se inserta el tubo de silicona. Cada
bomba debe configurarse en el modo cido o base correspondiente.
Despus de adaptar los tubos de silicona de 1/8 de pulgada a las bombas se
deben conectar a los puertos de adicin de cido y base que se encuentran en
la tapa del Bioflo, segn la figura incluida en el Anexo D.
Para seleccionar el modo de funcionamiento de la bomba, en la pantalla del
Bioflo, se coloca el cursor en la columna FEED1 y FEED2 respectivamente,
con la tecla ALTER se pasa al modo base y cido respectivamente. La
bomba se mueve en sentido horario, por lo cual el fluido se mover en dicha
4.2
DIA
pH
Brix
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
S2
N m .o/m l
pH
Brix
Rango + Rango -
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
S3
N m .o/m l
pH
Brix
N m .o/m l
Rango + Rango -
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
Rango + Rango -
6.35
6.32
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
6.76
6.72
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
6.36
6.34
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
4.69
4.62
20.1
19.5
3.4E+07
2.8E+07
4.82
4.76
20.1
19.7
4.4E+07
3.1E+07
4.60
4.58
20.1
19.3
3.7E+07
2.6E+07
3.93
3.65
9.3
8.9
6.1E+07
5.8E+07
3.77
3.60
9.4
8.2
6.6E+07
4.4E+07
3.73
3.67
8.5
8.1
8.8E+07
4.4E+07
3.94
3.66
8.7
7.8
1.1E+08
8.6E+07
3.78
3.62
8.3
7.3
9.6E+07
6.4E+07
3.75
3.70
7.8
6.8
1.5E+08
8.2E+07
3.94
3.65
8.2
7.1
1.5E+08
1.1E+08
3.80
3.64
7.5
6.6
1.1E+08
6.6E+07
3.77
3.72
6.9
6.2
1.1E+08
9.2E+07
3.98
3.68
6.5
6.0
7.5E+07
5.6E+07
3.83
3.67
6.8
6.2
6.9E+07
5.4E+07
3.80
3.76
6.6
6.0
7.9E+07
6.6E+07
11
3.96
3.72
6.1
5.8
6.3E+07
4.0E+07
3.86
3.71
6.5
6.0
5.7E+07
4.0E+07
3.84
3.80
6.3
5.5
6.5E+07
6.0E+07
Fuente: Autores
Tabla 4.4 Resultados para medio natural
N1
DIA
pH
Brix
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
N2
N m .o/m l
pH
Brix
Rango + Rango -
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
N3
N m .o/m l
pH
Brix
N m .o/m l
Rango + Rango -
Rango +
Rango -
Rango +
Rango -
Rango + Rango -
3.56
3.53
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
3.61
3.58
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
3.54
3.52
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
3.68
3.66
17.3
12.0
2.7E+07
2.3E+07
3.71
3.69
19.9
17.5
3.1E+07
2.6E+07
3.67
3.66
19.5
17.5
2.5E+07
2.4E+07
3.82
3.80
6.7
6.6
4.5E+07
3.0E+07
3.72
3.70
7.0
6.9
4.8E+07
4.0E+07
3.73
3.72
6.6
6.5
5.1E+07
3.6E+07
3.94
3.90
6.6
6.4
1.1E+08
8.1E+07
3.90
3.86
6.6
6.4
1.0E+08
6.5E+07
3.88
3.85
6.6
6.4
1.2E+08
9.0E+07
3.95
3.94
6.9
6.7
1.1E+08
8.3E+07
3.88
3.86
7.0
6.9
9.8E+07
8.7E+07
3.87
3.85
7.0
6.7
1.3E+08
9.2E+07
3.96
3.95
6.7
6.2
1.0E+08
9.2E+07
3.89
3.88
6.9
6.5
1.3E+08
8.1E+07
3.89
3.88
6.8
6.6
9.4E+07
8.9E+07
11
3.98
3.96
6.6
6.0
1.2E+08
9.7E+07
3.91
3.89
6.7
6.3
1.5E+08
8.2E+07
3.89
3.88
6.7
6.5
1.1E+08
7.5E+07
Fuente: Autores
El porcentaje de sacarosa medido para todos los medios en el da 11 de la
fermentacin fue del 0 %.
% DE
VARIACION
MEDIO NATURAL
S1
S2
S3
N1
N2
N3
PH INICIAL
PH FINAL
39.3
43.7
39.8
11.8
8.3
10.2
PH MAYOR
PH MENOR
40.1
45.4
41.7
10.6
7.7
9.2
Fuente: Autores
4.3
pH Inicial
pH Final
Tiempo de
operacin (min.)
50
22.20
50
32.11
75
21.00
75
25.09
100
18.08
100
24.00
Fuente: Autores
A velocidad de agitacin de 125 r.p.m. se presenta turbulencia y formacin de
espuma, lo cual no es deseable que se presente en el proceso de fermentacin.
4.3.2 Determinacin de la concentracin de cido y base
Utilizando el medio de cultivo que present mayor variacin de pH en las
fermentaciones preliminares (Ver Tabla 4.5) se trabaj a diferentes
concentraciones de cido y base con funcionamiento del sistema de regulacin de
pH.
Tabla 4.7 Resultados de volmenes consumidos de cido y base, y tiempo de
operacin a diferentes concentraciones
Volumen consumido (ml)
CONCENTRACION
1N
5N
pH inicial
pH final
Acido
Base
694
Tiempo de
operacin
(min.)
115
870
435
195
75
600
142
Fuente: Autores
4.3.3 Fermentacin preliminar en el Bioflo
Los resultados de sta fermentacin respecto al uso del sistema de regulacin de
pH se presentan a continuacin. Unicamente de manera preliminar se observ los
consumos de cido y base empleando el sistema de regulacin de pH del Bioflo.
El consumo total durante los 10 das de fermentacin de cido y base fueron
respectivamente de: 600 ml de cido ctrico 5 N y 1750 ml de carbonato de calcio
5N.
Se observ que al transcurso de la fermentacin se form un precipitado debido a
la baja solubilidad del Carbonato de calcio en el medio, presentando problemas
para realizar conteo de microorganismos. Para solucionar dicho problema se
implemento el uso de KOH.
El comportamiento del crecimiento de
microorganismos bajo el efecto del KOH 5 N como base fue positivo, presentando
valores de crecimiento de 2.7 x107 m.o/ml hasta 3.9 x107 m.o/ml en los dos
primeros das de fermentacin y permite el uso de dicha base en las
fermentaciones propuestas para el proyecto con fines de anlisis.
N IT R O G E N O
N IT R O G E N O
T E O R IC O (g)
R E C U P E R A D O (g)
0.002354
0.002318
0.003730
0.003643
0.004678
0.004638
0.007273
0.007067
0.009417
0.009329
0.011733
0.011480
0.023434
0.022960
0.035058
0.034230
0.046900
0.045710
0.069914
0.067580
0.093364
0.091210
0.116643
0.113300
0.140140
0.135500
0.163310
0.157300
0.186760
0.179900
0.233333
0.225900
P R O M E D IO % E R R O R M E T O D O =
P R O M E D IO % R E C U P E R AC IO N =
C O R R E L AC IO N T O D O S L O S D AT O S =
% ERRO R
% R E C U P E R A C I N
1.54
2.32
0.85
2.83
0.94
2.15
2.02
2.36
2.54
3.34
2.31
2.87
3.31
3.68
3.67
3.19
98.46
97.68
99.15
97.17
99.06
97.85
97.98
97.64
97.46
96.66
97.69
97.13
96.69
96.32
96.33
96.81
2.49
97.51
0.99999
Fuente: Autores
0.200000
NITROGENO(g)
0.150000
0.100000
0.050000
0.000000
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
UREA(g)
Nitrgeno terico (g)
Fuente: Autores
4.4.1.2
0.6
NITROGENO
TEORICO(g)
NITROGENO
RECUPERADO(g)
%ERROR
%RECUPERACION
0.005000
0.010000
0.020000
0.030000
0.040000
0.060000
0.090000
0.100000
0.110000
0.120000
0.140000
0.160000
0.180000
0.004858
0.009938
0.019870
0.029810
0.039750
0.059400
0.089220
0.098940
0.108800
0.117600
0.136800
0.156100
0.174900
2.84
0.62
0.65
0.63
0.63
1.00
0.87
1.06
1.09
2.00
2.29
2.44
2.83
97.16
99.38
99.35
99.37
99.38
99.00
99.13
98.94
98.91
98.00
97.71
97.56
97.17
1.46
98.54
0.999939
Fuente: Autores
Grfica 4.2 Curva de calibracin para destilacin y titulacin en mtodo Kjeldahl
C U R V A D E C A L IB R A C IO N P A R A D E S T IL A C IO N T IT U L A C IO N
0 .2
0 .1 8
0 .1 6
0 .1 4
NITROGENO (g)
0 .1 2
0 .1
0 .0 8
0 .0 6
0 .0 4
0 .0 2
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
S U L F A T O ( m l)
N it r g e n o t e r ic o ( g )
N it r g e n o r e c u p e r a d o ( g )
Fuente: Autores
10
El error del mtodo total (digestin, destilacin y titulacin) es del 2.49%, el error
para destilacin y titulacin es de 1.46%, por lo tanto el error para la etapa de
digestin es de 1.03%.
4.4.2
% ERROR
1.3
1.0
0.3
0.2
0.2
11
0 .0 0 3 5
0 .0 0 3 0
0 .0 0 2 5
0 .0 0 2 0
0 .0 0 1 5
0 .0 0 1 0
0 .0 0 0 5
0 .0 0 0 0
0
10
20
30
40
50
60
V O L U M E N D E S O L U C IO N D E A Z U C A R IN V E R T ID O (m ililitr o s )
V O L U M E N T E O R IC O (m l)
V O L U M E N R E A L (m l )
Fuente: Autores
4.5
Para las cuatro fermentaciones, dos con regulacin de pH y dos sin regulacin del
mismo, se presentan los datos de crecimiento determinados por el conteo cmara
Neubauer Improved con los rangos de error de precisin respectivos. Se calcul
de acuerdo a la formula enunciada en el procedimiento para conteo de
microorganismos.
Los triplicados realizados para el conteo de microorganismos en cada
fermentacin se presentan en el Anexo B.
12
NM.O/ml FERM. 2
DIA
0
1
2
3
4
7
8
9
10
RANGO
MENOR
RANGO
MAYOR
RANGO
MENOR
RANGO
MAYOR
RANGO
MENOR
RANGO
MAYOR
RANGO
MENOR
RANGO
MAYOR
2.1E+07
9.8E+07
1.1E+08
1.4E+08
1.4E+08
1.2E+08
7.2E+07
6.8E+07
6.2E+07
2.4E+07
1.0E+08
1.2E+08
1.4E+08
1.4E+08
1.2E+08
7.7E+07
7.1E+07
6.5E+07
2.2E+07
1.0E+08
1.2E+08
1.4E+08
1.5E+08
1.1E+08
6.6E+07
6.3E+07
5.7E+07
2.5E+07
1.1E+08
1.3E+08
1.4E+08
1.5E+08
1.1E+08
7.0E+07
6.5E+07
5.8E+07
2.4E+07
7.1E+07
8.3E+07
9.4E+07
2.5E+07
7.4E+07
8.5E+07
9.7E+07
2.3E+07
7.5E+07
8.7E+07
9.9E+07
2.4E+07
7.8E+07
9.1E+07
1.0E+08
7.1E+07
6.6E+07
6.1E+07
5.2E+07
7.6E+07
6.9E+07
6.3E+07
5.5E+07
7.4E+07
6.8E+07
6.4E+07
5.5E+07
7.8E+07
7.0E+07
6.8E+07
5.8E+07
Fuente: Autores
Las grficas de crecimiento para cada fermentacin se presentan a continuacin
con el fin comparativo de las mismas.
Grfica 4.4 Curvas de crecimiento de microorganismos para fermentaciones con
control y sin control de pH.
C U R V A S D E C R E C IM IE N T O D E M IC R O O R G A N IS M O S
1 .0 E + 0 9
1 .0 E + 0 8
1 .0 E + 0 7
0
10
11
T IE M P O (D A S )
N M .O /M L F E R M . 1
N M .O /M L F E R M . 1 S IN C O N T R O L
N M .O /M L F E R M . 2
N M .O /M L F E R M . 2 S IN C O N T R O L
Fuente: Autores
13
4.5.2
FERM. 2 mg N / ml
DIA
RANGO
INFERIOR
RANGO
SUPERIOR
RANGO
INFERIOR
RANGO
SUPERIOR
RANGO
INFERIOR
RANGO
SUPERIOR
RANGO
INFERIOR
RANGO
SUPERIOR
0.0644
0.0676
0.0965
0.1015
0.0644
0.0676
0.0644
0.0676
0.2257
0.2373
0.2257
0.2373
0.1936
0.2034
0.2257
0.2373
0.2584
0.2716
0.2584
0.2716
0.2257
0.2373
0.2584
0.2716
0.2906
0.3054
0.3228
0.3392
0.2584
0.2716
0.2906
0.3054
0.3549
0.3731
0.3876
0.4074
0.2906
0.3054
0.2906
0.3054
0.1936
0.2034
0.2257
0.2373
0.2584
0.2716
0.2257
0.2373
0.1936
0.2034
0.1936
0.2034
0.2257
0.2373
0.1936
0.2034
0.1614
0.1696
0.1614
0.1696
10
0.1936
0.2034
0.1614
0.1696
0.1614
0.1696
0.1614
0.1696
Fuente: Autores
Utilizando el rango para todos los das de las fermentaciones, se realizo la grfica
de contenido de nitrgeno celular por mililitro.
Grfica 4.5 Curva de nitrgeno celular por mililitro para fermentaciones con control
y sin control de pH
C O N T E N ID O
D E
N IT R O G E N O
C E L U L A R
0 .4 6
0 .4 1
MILIGRAMOS DE NITROGENO/MILILITRO
0 .3 6
0 .3 1
0 .2 6
0 .2 1
0 .1 6
0 .1 1
0 .0 6
0 .0 1
0
1 0
1 1
T IE M P O (D IA S )
F E R M . 2 m g N / m l
F E R M . 1 S IN C O N T R O L D E
P H
m g N
/ m l
F E R M . 1 m g N / m l
F E R M . 2 S IN C O N T R O L D E
P H
m g N
/ m l
Fuente: Autores
14
4.5.3
F E R M .1 C O N
R E G U L A C IO N
FERM . 2 CO N
R E G U L A C IO N
F E R M . 1 S IN
R E G U L A C IO N
F E R M . 2 S IN
R E G U L A C IO N
0
1
2
3
4
7
8
9
10
2 0 .0
1 7 .9
1 4 .1
1 0 .7
8 .2
7 .4
7 .0
6 .5
6 .2
2 0 .0
1 7 .5
1 4 .0
1 0 .1
8 .0
7 .2
6 .8
6 .4
6 .0
2 0 .0
1 8 .0
1 4 .7
1 1 .8
2 0 .0
1 7 .3
1 4 .1
1 0 .5
7 .7
7 .1
6 .8
6 .4
7 .3
6 .8
6 .4
6 .0
Fuente: Autores
Grfica 4.6 Curva de Brix para fermentaciones con control y sin control de pH
Brix a 20 C
B rix
2 0 .0
1 8 .0
1 6 .0
1 4 .0
1 2 .0
1 0 .0
8 .0
6 .0
4 .0
2 .0
0 .0
0
10
12
T ie m p o (d a s )
F E R M .1 C O N R E G U LA C IO N
F E R M . 1 S IN R E G U L A C IO N
F E R M . 2 C O N R E G U LA C IO N
F E R M . 2 S IN R E G U L A C IO N
Fuente: Autores
El porcentaje de sacarosa medido en el da 10 de cada fermentacin fue de 0 %
de sacarosa.
4.5.4
15
FERMENTACION 1 FERMENTACION 2
FERMENTACION 1 FERMENTACION 2
CON
CON
SIN REGULACION SIN REGULACION
REGULACION DE REGULACION DE
DE PH
DE PH
PH
PH
0.00133
0.00141
0.00157
0.00151
Fuente: Autores
Para el contenido de etanol, la temperatura de trabajo fue de 15C debido a la
calibracin del alcoholmetro. Para el da final de la fermentacin se tiene que la
para las fermentaciones con regulacin de pH el contenido de alcohol es de 10
G.L y para las fermentaciones sin regulacin de pH el contenido de alcohol es de
8 G.L. La toma de contenido de etanol no presento error de precisin ni error de
exactitud en el mtodo.
Tabla 4.15 Resultados de contenido de etanol
CONTENIDO DE ETANOL EN G.L
DIA
10
FERMENTACION 1 FERMENTACION 2
FERMENTACION 1 FERMENTACION 2
CON
CON
SIN REGULACION SIN REGULACION
REGULACION DE REGULACION DE
DE PH
DE PH
PH
PH
10
10
Fuente: Autores
4.5.5
16
7.4 x 10-7) en relacin con el KOH, lo que ocasiona un mayor consumo de cido
respecto a la base.
4.5.6
I A
0
1
2
3
7
8
9
1 0
F E R
N
6
4
3
3
4
4
4
4
.
.
.
.
.
.
.
.
T
8
2
9
9
0
0
0
1
A
5
1
6
0
3
5
8
0
I O
F E R
N
6
4
4
3
4
4
4
4
.
.
.
.
.
.
.
.
T
7
3
0
9
0
0
0
0
A
8
3
2
4
1
3
6
9
I O
Fuente: Autores
17
CAPITULO 5
DISCUSION DE RESULTADOS
En ste captulo se analizan los resultados obtenidos del presente trabajo. Como parte
importante, se encuentra el anlisis del crecimiento de microorganismos, contenido de
nitrgeno, slidos solubles totales, sacarosa, azcares reductores totales y contenido
de etanol entre una fermentacin alcohlica con funcionamiento del sistema de
regulacin de pH en el Bioflo y otra fermentacin a las mismas condiciones sin
regulacin de pH. Tambin se discute la reproducibilidad de estas fermentaciones de
acuerdo a las variables medidas en una fermentacin alcohlica.
5.1
69
Discusin de resultados
70
5.3
Discusin de resultados
71
ALBA, D Y
SIERRA, R.
(EQUIPO
KJElDAHL
NACIONAL)
BONILLA, H Y
MARTINEZ, V.
(EQUIPO
KJElDAHL NACIONAL)
MERCHAN, C Y
CASTILLO, A.
(EQUIPO
KJElDAHL NACIONAL)
RAMIREZ, G Y
PEDROZA, J. (EQUIPO
BUCHI)
PORCENTAJE ERROR
METODO TOTAL
6.26 %
7.45 %
8.00 %
2.49 %
PORCENTAJE ERROR
ETAPA DESTILACION Y
TITULACION
2.75 %
4.50 %
6.00 %
1.46 %
PORCENTAJE DE ERROR
ETAPA DE DIGESTION
3.51 %
2.95 %
2.00 %
1.03 %
RANGO PARA
DETERMINACION DE
NITROGENO (g)
0.002 0.05
0.004 0.025
0.004 0.025
0.002 0.23
ESTANDARIZACION
Discusin de resultados
5.4
72
1 CON REGULACION
DE PH
2 CON REGULACION
DE PH
1 SIN REGULACION
DE PH
2 SIN REGULACION
DE PH
NUMERO DE
MICROORGANISMOS
/ MILILITRO
1.4 E+08
1.5 E+08
9.5 E+07
1.0 E+08
DESVIACION
ESTANDAR
2.5 E+06
1.0 E+06
1.6 E+06
1.6 E+06
Fuente: Autores
Observando las grficas de crecimiento se tiene que las fermentaciones realizadas con
regulacin de pH a valor de 4.5, temperatura de 25C y agitacin a 100 r.p.m. presentan
un mayor crecimiento de microorganismos respecto a las fermentaciones sin regulacin
de pH. El crecimiento en las fermentaciones con regulacin de pH es 47.15% - 50.20%
mayor respecto a las que no regulan el pH, debido a que al no regular el pH, hay una
tendencia a la produccin de metabolitos secundarios (cido ctrico, cido mlico y
otros), los cuales acidifican el medio impidiendo una mayor produccin de biomasa y
etanol, pero con un consumo de slidos solubles similar para ambas fermentaciones,
comportamiento observado en la variacin de pH que presentan las fermentaciones sin
utilizar la regulacin de pH (Ver Tabla 4.16); al inicio de la fermentacin se tiene un pH
de 6.85 y al da 1 el pH disminuye a un valor de 4.21 y para las fermentaciones que
utilizan el sistema de regulacin, el pH permanece constante a un valor de 4.5, fijado
desde el inicio del proceso.
Para fermentaciones alcohlicas desarrolladas en el biorreactor por los anteriores
trabajos de la lnea de investigacin, controlando nicamente la variable temperatura, el
mayor crecimiento microbiano a 25 C fue de 1.4E+08 y a 30 C fue de 7.6E+07. Al
desarrollar una fermentacin regulando el pH a 4.5 se obtiene un crecimiento 6.60%
mayor respecto a una fermentacin a temperatura constante de 25 C, pero significativa
respecto a una temperatura constante de 30 C al ser un 97.50% mayor el crecimiento
en la fermentacin a 25 C y pH de 4.5. El comportamiento que se observa en la
comparacin de este parmetro, indica que a 25 C el crecimiento de microorganismos
se favorece ya que es la temperatura ptima para el desarrollo de una levadura.
Tambin se observa que al regular el pH esta tendencia de mayor crecimiento se
Discusin de resultados
73
beneficia levemente ya que el pH fijado a 4.5 difiere del pH ptimo para el desarrollo de
la levadura en una fermentacin, el cual es de 3.5 y fue ajustado al inicio de las
fermentaciones que no controlan el pH a lo largo del proceso (Aleixandre, Noviembre de
1998). Otro factor que favorece el crecimiento de microorganismos es el medio de
cultivo, ya que el extracto de levadura es el medio que ms provee de requerimientos
nutricionales a la levadura, respecto al preparado a base de peptona utilizado por
fermentaciones realizadas en el Bioflo. Las fermentaciones desarrolladas en el
presente trabajo mantuvieron una agitacin constante mientras que los antecedentes
presentados solo realizan agitacin antes de tomar la muestra.
Grfica 5.1 Comparacin del mayor crecimiento de microorganismos para distintas
fermentaciones en el Bioflo.
2.0E+08
1.5E+08
1.4E+08
1.5E+08
TEMPERATURA 25C
TEMPERATURA 30C
5.0E+07
0.0E+00
CRECIMIENTO
Fuente: Autores
5.4.2 Contenido de nitrgeno en la biomasa
Los datos de contenido de nitrgeno que se presenta en la siguiente tabla corresponden
a los das en que se obtuvo el mayor crecimiento de microorganismos en las
fermentaciones en el Bioflo bajo las condiciones ya establecidas.
Tabla 5.3 Mayor contenido de nitrgeno en fermentaciones en el Bioflo
FERMENTACIONES
FERM. 1 CON
REGULACION DE PH
FERM. 2 CON
REGULACION DE PH
FERM. 1 SIN
REGULACION DE PH
FERM. 2 SIN
REGULACION DE PH
RANGOS DE
NITROGENO
MILIGRAMOS DE
NITROGENO /
MILILITRO
0.3549 0.3731
0.3876 0.4074
0.2584 0.2716
0.2906 0.3054
Fuente: Autores
De acuerdo a los rangos de contenido de nitrgeno, para las fermentaciones con
regulacin de pH la diferencia es de un 3.7% y para las de sin regulacin la diferencia
es del 6.5%, diferencias calculadas tomando los datos ms cercanos de cada rango.
Los parmetros determinados en las fermentaciones realizadas presentan
reproducibilidad debido a la similitud en sus datos y sus porcentajes de diferencia son
bajos, teniendo en cuenta que se trata de un sistema biolgico.
Se observa una tendencia de un menor contenido de nitrgeno en las fermentaciones
que no regulan el pH. El contenido de nitrgeno para las fermentaciones con regulacin
de pH es entre 33.37% - 37.34% mayor que el contenido de nitrgeno para las
fermentaciones sin regulacin de pH.
Discusin de resultados
74
FERM. 2
F E R M . 1 S IN C O N T R O L
DE PH
F E R M . 2 S IN C O N T R O L
DE PH
RANGOS
RANGOS
RANGOS
RANGOS
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
10
2 .8 E -0 9
2 .2 E -0 9
2 .0 E -0 9
2 .2 E -0 9
2 .4 E -0 9
2 .5 E -0 9
2 .9 E -0 9
3 .3 E -0 9
3 .1 E -0 9
Fuente: Autores
3 .0 E -0 9
2 .3 E -0 9
2 .1 E -0 9
2 .3 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .6 E -0 9
3 .0 E -0 9
3 .4 E -0 9
3 .2 E -0 9
4 .1 E -0 9
2 .1 E -0 9
2 .0 E -0 9
2 .4 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .8 E -0 9
3 .0 E -0 9
2 .8 E -0 9
4 .3 E -0 9
2 .2 E -0 9
2 .1 E -0 9
2 .5 E -0 9
2 .7 E -0 9
2 .7 E -0 9
3 .0 E -0 9
3 .2 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .8 E -0 9
2 .6 E -0 9
2 .8 E -0 9
2 .7 E -0 9
3 .0 E -0 9
2 .8 E -0 9
2 .7 E -0 9
3 .0 E -0 9
3 .1 E -0 9
2 .8 E -0 9
2 .9 E -0 9
3 .1 E -0 9
3 .2 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .7 E -0 9
2 .8 E -0 9
2 .7 E -0 9
3 .0 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .8 E -0 9
3 .2 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .9 E -0 9
2 .5 E -0 9
2 .9 E -0 9
3 .1 E -0 9
3 .0 E -0 9
2 .7 E -0 9
3 .0 E -0 9
Discusin de resultados
75
Se observa una tendencia a un menor contenido de nitrgeno por clula durante los
primeros das de las fermentaciones que regulan pH, ya que el pH interactua con el
estado fisiolgico de la levadura, comportamiento reflejado en el conteo de
microorganismos. Durante la fase estacionaria de crecimiento no se observan
fluctuaciones del contenido de nitrgeno por clula para cada una de las
fermentaciones. De acuerdo a los valores de contenido de nitrgeno por clula para los
das donde se tiene el mayor crecimiento de microorganismos (da 4 para fermentacin
con regulacin de pH y da 3 para fermentacin sin regulacin de pH), el contenido de
nitrgeno por clula es mayor en 8.14 % en una fermentacin sin regulacin de pH
respecto a una fermentacin con pH regulado. De manera concreta, una levadura que
se desarrolla en una fermentacin sin regulacin de pH tiende a una mayor cantidad de
nitrgeno que una que se desarrolla en una fermentacin a pH regulado. En la
siguiente tabla se presenta los rangos de porcentaje peso a peso de nitrgeno por
clula en cada una de las fermentaciones desarrolladas.
Tabla 5.5 Rangos de porcentaje peso a peso de nitrgeno por clula
% P /P N IT R O G E N O / C E L U L A
F E R M .1
FERM. 2
F E R M . 1 S IN C O N T R O L
DE PH
F E R M . 2 S IN C O N T R O L
DE PH
RANGOS
RANGOS
RANGOS
RANGOS
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
10
P R O M E D IO S
1 1 .1 6
8 .5 2
8 .0 1
8 .7 3
9 .5 6
9 .6 5
1 1 .3 3
1 2 .7 6
1 1 .9 8
1 0 .1 9
1 1 .7 3
8 .9 5
8 .4 2
9 .1 7
1 0 .0 5
1 0 .1 4
1 1 .9 1
1 3 .4 1
1 2 .5 9
1 0 .7 1
1 6 .0 9
8 .0 4
7 .7 6
9 .2 4
1 0 .0 6
1 0 .0 8
1 1 .0 4
1 1 .8 5
1 0 .9 6
9 .8 8
1 6 .9 2
8 .4 5
8 .1 6
9 .7 1
1 0 .5 7
1 0 .6 0
1 1 .6 0
1 2 .4 5
1 1 .5 2
1 0 .3 8
1 0 .2 9
1 0 .1 8
1 1 .0 1
1 0 .2 5
1 0 .8 2
1 0 .7 0
1 1 .5 7
1 0 .7 7
1 0 .7 3
1 1 .5 6
1 2 .0 5
1 0 .9 7
1 1 .2 8
1 2 .1 5
1 2 .6 6
1 1 .5 3
1 0 .6 6
1 0 .8 3
1 0 .5 3
1 1 .8 2
1 0 .7 0
1 1 .2 1
1 1 .3 9
1 1 .0 6
1 2 .4 2
1 1 .2 4
1 1 .4 0
1 1 .3 5
9 .9 4
1 1 .1 9
1 1 .1 5
1 1 .9 8
1 1 .9 3
1 0 .4 5
1 1 .7 6
1 1 .7 2
Fuente: Autores
De acuerdo a los promedios obtenidos de toda la marcha fermentativa, se observa que
el porcentaje de nitrgeno por clula es mayor en un rango del 8.15 % - 8.18 % de una
fermentacin sin regulacin de pH respecto a la fermentacin con regulacin de pH a
4.5.
Estos porcentajes de diferencia que se observan en la anterior comparacin, se deben
a la directa incidencia de la variable pH en cuanto a su comportamiento en la
fermentacin sin regulacin de pH durante el proceso fermentativo, ya que los valores
de pH en las fase de crecimiento presentan un valor cercano al pH ptimo (3.05 3.50)
para el desarrollo de la levadura (Aleixandre, Noviembre de 1998). La variacin de pH
en el desarrollo de una fermentacin sin regulacin de pH se observa en la Tabla 4.16.
El porcentaje de nitrgeno por clula tiende a ser ms estable a lo largo de la
fermentacin sin regulacin de pH debido a que la levadura como sistema biolgico,
maneja de manera natural el pH, lo que no sucede al regular el pH debido a que el valor
fijado de 4.5 desde el inicio de la fermentacin esta alejado del rango ptimo de pH para
el desarrollo de la levadura en una fermentacin alcohlica y no es un manejo natural
del pH.
Discusin de resultados
76
Discusin de resultados
77
consumo de azcares por las levaduras en una fermentacin con pH regulado para la
produccin de etanol, y en produccin de biomasa.
Respecto al contenido de etanol al final de cada fermentacin, se obtiene mayor grado
alcohlico en una fermentacin con regulacin de pH, un 25 % mayor que una
fermentacin sin regulacin de pH, de acuerdo a los resultados presentados en el
numeral 4.5.4. La menor produccin de alcohol en una fermentacin sin regulacin de
pH se debe a que en la fase inicial del proceso existe una mayor demanda energtica
por parte de la levadura para la produccin de metabolitos secundarios que disminuyen
el pH de un valor de 6.8 hasta valores aproximados de 4.0, lo que causa una
disminucin en el grado alcohlico. En si la levadura tuvo la necesidad de acidificar el
medio disminuyendo la produccin de metabolitos primarios (etanol) y con tendencia a
la produccin de metabolitos secundarios (cidos orgnicos).
Al regular el pH a lo largo de una fermentacin la levadura se adapt a las condiciones
dadas para producir mayor cantidad de alcohol y a su vez consumir los azcares
proporcionados obteniendo menor cantidad de azcares reductores residuales al final
de la fermentacin. La levadura en su metabolismo se adapta mejor al mantener
constantes las variables en el proceso tales como pH y temperatura, a pesar de no
manejar un pH ptimo. Esto se confirma de acuerdo a los antecedentes presentados
en fermentaciones realizadas en el Bioflo sin regulacin de pH, donde la fermentacin
desarrollada a 30 C el porcentaje de azcares reductores finales fue del 10.60 % y el
contenido alcohlico fue de 6.2 G.L y para una fermentacin a 25 C el porcentaje de
azcares reductores finales fue de 6.30 % y el contenido alcohlico fue del 7.0 G.L.
De acuerdo al contenido de alcohol, al utilizar el medio semisinttico con extracto de
levadura, dicho contenido fue mayor respecto a las fermentaciones que utilizaron el
medio a base de peptona debido a que el medio con extracto de levadura provee a las
clulas los nutrientes necesarios y adecuados para su crecimiento y produccin de
metabolitos (Alba y Sierra, 1999, 120).
El balance de consumo de azcares expresa de mejor manera las diferencias
presentadas entre una fermentacin con regulacin de pH y sin regulacin.
5.4.4.1
Discusin de resultados
78
x 0.45 =
Gramos de carbono final = 1.19 x 10-11 g de Carbono / levadura x 1.41 x 1012 levadura
= 16.77 g Carbono
Discusin de resultados
79
FERMENTACION 1
CON REGULACION
DE PH
FERMENTACION 2
CON REGULACION
DE PH
FERMENTACION 1
SIN REGULACION
DE PH
FERMENTACION 2
SIN REGULACION
DE PH
Cantidad de
azcar en
gramos
%azcar
Consumido
Cantidad de
azcar en
gramos
%azcar
Consumido
Cantidad de
azcar en
gramos
%azcar
Consumido
Cantidad de
azcar en
gramos
%azcar
Consumido
AZUCAR CONSUMIDO
EN FERMENTACION
1551
70.16
1551
70.16
1241
56.14
1241
56.14
AZUCAR
TRANSFORMADO EN
BIOMASA
35.17
1.59
35.14
1.58
19.48
0.88
22.03
0.99
AZUCAR RESIDUAL
13.30
0.60
14.10
0.63
15.70
0.71
15.10
0.68
AZUCAR CONSUMIDO
EN RESPIRACION Y
PRODUCTOS
SECUNDARIOS
611.03
27.65
610.26
27.63
934.32
42.26
932.37
42.17
CONSUMO
AZUCARES
AZUCAR ADICIONADO
2210.50
2210.50
2210.50
2210.50
Fuente : Autores
De acuerdo a los porcentajes de azcar consumido en fermentacin, no se alcanzo el
rendimiento reportado en la bibliografa del 95% debido a que la levadura tuvo una
tendencia a consumir azcares para el proceso de respiracin y la produccin de
metabolitos secundarios. El rendimiento se acerca ms al terico al regular el pH y es
menor al no regular el pH debido a la acidificacin que se presenta en el proceso.
Tambin este rendimiento no fue el mximo debido a que se manejo un medio
semisinttico en las fermentaciones y dicho rendimiento se basa en requerimientos
nutricionales ptimos para la levadura provedos por medios naturales como lo es un
mosto de uva.
Discusin de resultados
80
FERMENTACION A 30 C
FERMENTACION A 25 C
% DE AZUCAR CONSUMIDO EN
FERMENTACION
42.54
54.12
% AZUCAR TRANFORMADO EN
BIOMASA
0.86
1.23
% AZUCAR CONSUMIDO EN
RESPIRACION Y PRODUCTOS
SECUNDARIOS
16.59
15.00
% AZUCAR RESIDUAL
40.00
29.50
Discusin de resultados
81
Porcentajes de consumo de
azcares
Fuente: Autores
Fermentacin a 30 C
% Azcar residual
Discusin de resultados
82
5.5
Discusin de resultados
83
Discusin de resultados
84
max = 0.062 h
-1
-1
max = 0.5 h
-1
-1
max = 0.5 h
-1
-1
D = 0.011 h
D = 0.011h
D = 0.4 h
se (g / ml)
5.4E-6
5.6E-7
1.0E-4
xe (g / ml)
2.9E-3
2.9E-3
2.9E-3
Fuente: Autores
De acuerdo a la tabla anterior la concentracin de microorganismos permanece
constante variando la tasa de dilucin en un amplio rango, pero la concentracin de
substrato residual en el equilibrio se aumenta 177 veces al aumentar notablemente la
tasa de dilucin, desde 0.011 h-1 hasta 0.4 h-1 y un valor ideal de max = 0.5 h-1. En el
rango presentado de tasas de dilucin la concentracin de microorganismos permanece
constante y la concentracin de substrato conserva un valor muy bajo, aumentando a
medida que se aumenta la tasa de dilucin.
CONCLUSIONES
Conclusiones
86
de azcares reductores por titulacin de Lane y Enyon, el cual present un error del
0.62% para un rango de determinacin de azcares entre 0.109% - 0.363% (%p/v).
RECOMENDACIONES
Adaptar un sistema de esterilizacin para el vaso del Bioflo dentro del laboratorio de
Operaciones Unitarias con el fin de evitar posibles accidentes y mayor eficiencia de
la esterilizacin.
87
ANEXO A
DATOS DE FERMENTACIONES PRELIMINARES
S1
B
S2
B
S3
B
N1
B
N2
B
N3
B
6.33
6.35
6.32
6.72
6.76
6.74
6.34
6.36
6.35
3.53
3.55
3.56
3.58
3.60
3.61
3.52
3.54
3.54
4.62
4.68
4.67
4.76
4.81
4.80
4.58
4.60
4.59
3.66
3.68
3.68
3.70
3.71
3.69
3.66
3.67
3.67
3.74
3.95
3.68
3.75
3.71
3.59
3.69
3.67
3.73
3.80
3.81
3.82
3.70
3.72
3.72
3.73
3.72
3.73
3.75
3.96
3.69
3.76
3.74
3.61
3.73
3.70
3.75
3.91
3.94
3.90
3.88
3.86
3.90
3.85
3.88
3.86
3.73
3.96
3.69
3.78
3.76
3.63
3.75
3.72
3.77
3.94
3.95
3.95
3.86
3.87
3.88
3.85
3.85
3.87
3.76
4.00
3.73
3.81
3.79
3.66
3.79
3.76
3.80
3.95
3.96
3.96
3.88
3.89
3.89
3.89
3.88
3.89
11
3.80
3.97
3.75
3.83
3.83
3.70
3.83
3.80
3.83
3.98
3.96
3.97
3.89
3.90
3.91
3.89
3.89
3.88
N3
B
N1
B
N2
B
S1
B
S2
B
S3
B
13.0
11.0
13.0
18.0
13.0
14.0
11.0
15.0
12.0
9.8
9.4
11.0
11.6
12.1
10.4
9.6
10.1
9.5
24.0
23.0
24.0
20.0
27.0
19.0
36.0
24.0
19.0
18.0
15.1
11.9
18.3
15.7
18.5
14.4
20.5
17.4
40.0
34.0
43.0
25.0
33.0
38.0
52.0
55.0
31.0
35.8
34.1
45.8
29.8
42.8
29.0
35.1
46.8
44.4
49.0
62.0
48.0
25.0
40.0
39.0
37.0
43.0
39.0
34.0
37.4
45.1
36.3
35.2
39.6
35.8
47.5
48.1
22.0
28.0
29.0
22.0
28.0
24.0
27.0
28.0
32.0
38.5
36.7
40.3
52.2
35.1
37.4
35.9
36.4
37.9
11
18.0
18.0
26.0
16.0 23.0
-1
19.0
25.0
24.0
26.0
49.1
39.8
42.1
60.4
46.2
33.2
42.6
35.6
30.4
Factor de Dilucin 10
A
0 20.0
1 20.0
4 8.9
5 8.8
6 8.3
8 6.0
11 5.8
MEDIO SEMISINTETICO
MEDIO NATURAL
S1
S2
S3
N1
N2
N3
B
C
A
B
C
A
B
C
A
B
C
A
B
C
A
B
C
20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0
19.5 19.9 20.0 20.0 19.7 19.8 20.0 19.3 12.2 14.3 17.5 20.1 18.0 18.1 17.5 19.5 18.6
9.1 9.3 9.3 8.1 9.0 8.2 8.5 8.1 6.6 6.7 6.7 6.9 7.0 7.0 6.5 6.6 6.6
8.0 8.0 8.1 7.2 8.0 7.0 7.1 7.9 6.6 6.4 6.4 6.6 6.4 6.5 6.5 6.4 6.6
7.3 7.3 7.4 6.5 7.2 6.4 6.3 7.0 6.7 6.8 6.9 6.9 6.9 7.0 6.8 6.7 7.0
6.2 6.5 6.4 6.3 6.8 6.2 6.0 6.6 6.2 6.6 6.6 6.5 6.7 6.9 6.6 6.6 6.8
6.0 6.1 6.1 6.1 6.5 5.5 5.8 6.3 6.0 6.5 6.4 6.3 6.5 6.7 6.5 6.5 6.7
88
INTERVALO
DE DIAS
MEDIO SEMISINTETICO
MEDIO NATURAL
S1
26.30
18.60
0.26
0.26
1.05
0.26
46.73
S2
28.90
23.10
0.54
0.54
0.80
1.06
54.94
S3
27.70
19.30
0.81
0.54
0.80
1.05
50.20
N1
3.38
3.81
2.88
0.76
0.25
0.25
11.33
N2
2.77
0.27
4.58
0.25
0.51
0.25
8.63
N3
3.96
1.63
3.48
0.00
0.77
0.00
9.84
MEDIOS
S1
S2
S3
N1
N2
N3
PENDIENTE
0.555
0.673
0.578
0.066
0.042
0.053
CORRELACION
0.895
0.905
0.893
0.983
0.861
0.935
0_1
1_4
4_5
5_6
6_8
8_11
SUMATORIA DE %
preliminares
89
ANEXO B
T IC
IA
0
1
2
3
4
7
8
9
1 0
P A R
D
T IC
F E R M E N T A C IO N
1 C O N
R E G U L A C IO N
U L A S
C O N T A D A S
E N
C A M A R A
N E U B A U E R
T R IP L IC A D O
P R
1
2
3
8 .5
9 .2
9 .5
4 0 .2
3 9 .5
4 1 .1
4 4 .5
4 2 .3
4 5 .3
5 4 .7
5 5 .8
5 4 .5
5 6 .3
5 7 .9
5 6 .1
4 8 .5
4 6 .2
4 7 .3
2 8 .8 5
2 9 .3
3 0 .8
2 7 .2
2 7 .5
2 8 .5
2 5 .4
2 4 .8
2 5 .8
F E R M E N T A C
U L A S
C O N T A D A S
T R
IA
0
1
2
3
4
7
8
9
4
4
5
5
4
2
2
2
1 0
P A R
D
T IC
U L A S
T IC
U L A S
IA
0
1
2
3
7
8
9
1 0
P A R
D
IA
0
1
2
3
7
8
9
1 0
1
9
2
6
6
8
5
7
6
3
.
.
.
.
.
.
.
.
3
3
2
9
2
1
1
4
IO N
E N
2 C O N
R E G U L A C IO N
C A M A R A
N E U B A U E R
IP L IC
2
9 .
4 3
4 5
5 5
5 9
4 4
2 7
2 5
2 3
5
.5
.8
.8
.3
.3
.8
.3
.1
A D
D E
P H
IM P R O
O
4
4
5
5
4
2
2
2
9 .
0
4
5
6
7
9
7
5
E D
V E D
A
2 0 C
D E S V IA C IO
N
E S T A N D A R
0 .5 1
0 .8 0
1 .5 5
0 .7 0
0 .9 9
1 .1 5
1 .0 2
0 .6 8
0 .5 0
IO
0 7
.2 7
.0 3
.0 0
.7 7
.3 3
.6 5
.7 3
.3 3
D E
P H
IM P R O
V E D
2 0 C
P R
3
9 .
4 2
4 7
5 7
5 8
4 4
2 6
2 5
2 2
8
.8
.1
.3
.5
.1
.2
.5
.8
4
4
5
5
4
2
2
2
9 .
2
6
6
8
4
7
5
3
E D
4 3
.8 7
.4 0
.4 3
.9 0
.5 3
.0 3
.6 3
.1 0
IO
E S V IA C IO
N
E S T A N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.
.
.
.
.
.
.
.
.
4
6
6
7
4
5
8
4
3
0
0
6
8
0
9
0
2
0
F E R M E N T A C IO N
1 S IN
R E G U L A C IO N
D E
P H
C O N T A D A S
E N
C A M A R A
N E U B A U E R
IM P R O V E D
A
2 0 C
D E S V IA C IO
T R IP L IC A D O
P R O M E D IO
N
1
2
3
E S T A N D A R
9 .5
9 .8
1 0 .2
9 .8 3
0 .3 5
2 8 .8
2 8 .6
2 9 .5
2 8 .9 7
0 .4 7
3 3 .5
3 4 .2
3 3 .1
3 3 .6 0
0 .5 6
3 8 .2
3 7 .5
3 8 .8
3 8 .1 7
0 .6 5
2 8 .2
3 0 .1
2 9 .5
2 9 .2 7
0 .9 7
2 6 .8
2 6 .2
2 7 .4
2 6 .8 0
0 .6 0
2 5 .1
2 4 .8
2 4 .2
2 4 .7 0
0 .4 6
2 1 .3
2 0 .8
2 2 .1
2 1 .4 0
0 .6 6
F E R M E N T A C IO N
2 S IN
R E G U L A C IO N
D E
P H
C O N T A D A S
E N
C A M A R A
N E U B A U E R
IM P R O V E D
A
2 0 C
D E S V IA C IO
T R IP L IC A D O
P R O M E D IO
N
1
2
3
E S T A N D A R
9 .2
9 .4
9 .7
9 .4 3
0 .2 5
3 0 .1
3 0 .5
3 1 .2
3 0 .6 0
0 .5 6
3 5 .5
3 4 .8
3 6 .3
3 5 .5 3
0 .7 5
3 9 .8
4 0 .5
4 1 .1
4 0 .4 7
0 .6 5
3 0 .2
2 9 .7
3 1 .5
3 0 .4 7
0 .9 3
2 8 .1
2 7 .5
2 7 .3
2 7 .6 3
0 .4 2
2 6 .5
2 7 .1
2 5 .8
2 6 .4 7
0 .6 5
2 2 .8
2 3 .1
2 1 .9
2 2 .6 0
0 .6 2
90
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
10
F E R M E N T A C IO N 1 C O N R E G U L A C IO N D E P H
B R IX A 2 0 C
T R IP L IC A D O
P R O M E D IO
1
2
3
20
20
20
2 0 .0
1 8 .2
1 7 .8
1 7 .9
1 8 .0
1 4 .3
14
1 4 .2
1 4 .2
1 0 .6
1 0 .8
1 0 .6
1 0 .7
8
8 .2
8 .4
8 .2
7 .4
7 .4
7 .5
7 .4
7
7
7
7 .0
6 .5
6 .6
6 .5
6 .5
6 .1
6 .2
6 .2
6 .2
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.2
.1
.1
.2
.0
.0
.0
.0
0
1
5
2
0
6
0
6
6
F E R M E N T A C IO N 2 C O N R E G U L A C IO N D E P H
B R IX A 2 0 C
T R IP L IC A D O
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
10
D IA
0
1
2
3
7
8
9
10
D IA
0
1
2
3
7
8
9
10
P R O M E D IO
20
1 7 .5
1 4 .1
1 0 .1
7 .8
7 .2
6 .8
6 .4
6
20
1 7 .4
1 4 .2
1 0 .1
8 .2
7 .3
6 .9
6 .3
5 .9
20
1 7 .6
1 3 .9
1 0 .2
8 .1
7 .2
6 .8
6 .4
6
2 0 .0
1 7 .5
1 4 .1
1 0 .1
8 .0
7 .2
6 .8
6 .4
6 .0
F E R M E N T A C IO N 1 S IN R E G U L A C IO N D E P H
B R IX A 2 0 C
T R IP L IC A D O
P R O M E D IO
1
2
3
20
18
1 4 .6
1 1 .5
7 .4
7 .2
6 .7
6 .4
20
18
1 4 .6
1 2 .2
7 .8
7
6 .8
6 .3
20
18
1 4 .8
1 1 .8
7 .9
7 .2
6 .8
6 .4
2 0 .0
1 8 .0
1 4 .7
1 1 .8
7 .7
7 .1
6 .8
6 .4
F E R M E N T A C IO N 2 S IN R E G U L A C IO N D E P H
B R IX A 2 0 C
T R IP L IC A D O
P R O M E D IO
1
2
3
20
20
20
2 0 .0
1 7 .2
1 7 .4
1 7 .3
1 7 .3
1 4 .2
1 4 .2
14
1 4 .1
1 0 .5
1 0 .1
1 0 .8
1 0 .5
7 .2
7 .2
7 .4
7 .3
6 .8
6 .9
6 .8
6 .8
6 .4
6 .4
6 .5
6 .4
6
6 .1
6
6 .0
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.1
.1
.0
.2
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.0
.0
.0
0
0
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1
6
6
6
6
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.0
.1
.3
.2
.1
.0
.0
0
0
2
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2
6
6
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.1
.1
.3
.1
.0
.0
.0
0
0
2
5
2
6
6
6
91
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
1 0
1
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .5 5
0 .4 5
0 .4
0 .3 5
0 .3
D E T IT U L A C IO N H C L 0 . 9 4 6 5 6 N
T R IP L IC A D O ( m l )
2
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .5 5
0 .4 5
0 .4
0 .3 5
0 .3
P R O M E D IO
3
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .5 5
0 .4 5
0 .4
0 .3 5
0 .3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.1
.3
.4
.4
.5
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0
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5
5
0
5
0
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
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0
0
0
0
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.0
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0
0
0
0
0
F E R M E N T A C IO N 2 C O N R E G U L A C IO N D E P H
D E T E R M IN A C I N D E N IT R O G E N O C E L U L A R
V O L U M E N
D IA
0
1
2
3
4
7
8
9
1 0
D E T IT U L A C IO N H C L 0 . 9 4 6 5 6 N
T R IP L IC A D O ( m l )
0 .1 5
0 .3 5
0 .4
0 .5
0 .6
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0 .3 5
0 .3
0 .2 5
0 .1 5
0 .3 5
0 .4
0 .5
0 .6
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
0 .1 5
0 .3 5
0 .4
0 .5
0 .6
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
P R O M E D IO
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.1
.3
.4
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.2
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0
0
5
5
0
5
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.0
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.0
.0
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0
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0
0
0
0
0
0
F E R M E N T A C IO N 1 S IN R E G U L A C IO N D E P H
D E T E R M IN A C I N D E N IT R O G E N O C E L U L A R
V O L U M E N
D IA
0
1
2
3
7
8
9
1 0
D E T IT U L A C IO N H C L 0 . 9 4 6 5 6 N
T R IP L IC A D O ( m l )
0 .1
0 .3
0 .3 5
0 .4
0 .3
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
0 .1
0 .3
0 .3 5
0 .4
0 .3
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
0 .1
0 .3
0 .3 5
0 .4
0 .3
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
P R O M E D IO
0
0
0
0
0
0
0
0
.1
.3
.3
.4
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.3
.2
.2
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0
0
0
5
5
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
0
0
0
0
0
0
0
0
F E R M E N T A C IO N 2 S IN R E G U L A C IO N D E P H
D E T E R M IN A C I N D E N IT R O G E N O C E L U L A R
V O L U M E N
D IA
0
1
2
3
7
8
9
1 0
1
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
D E T IT U L A C IO N H C L 0 . 9 4 6 5 6 N
T R IP L IC A D O ( m l )
2
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
3
0 .1
0 .3 5
0 .4
0 .4 5
0 .3 5
0 .3
0 .2 5
0 .2 5
P R O M E D IO
0
0
0
0
0
0
0
0
.1
.3
.4
.4
.3
.3
.2
.2
0
5
0
5
5
0
5
5
D E S V IA C IO N
E S TA N D A R
0
0
0
0
0
0
0
0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
.0
0
0
0
0
0
0
0
0
FERMENTACION 1
ACIDO
KOH 5 N
CITRICO 5 N
(ml)
(ml)
88
65
25
34
25
16
31
18
89
50
25
14
31
19
35
18
DIA
1
2
3
4
7
8
9
10
FERMENTACION 2
ACIDO
KOH 5 N
CITRICO 5 N
(ml)
(ml)
91
72
28
38
26
15
32
18
98
62
21
15
30
19
26
20
FERMENTACION
1
FERMENTACION
2
10
41.0
38.2
FERMENTACION
1 SIN CONTROL
DE PH
FERMENTACION
2 SIN CONTROL
DE PH
40.8
40.5
38.5
39.2
35.0
34.5
34.7
N de Generaciones
FERMENTACION 1
TASA DE
MULTIPLICACION
N de Generaciones
FERMENTACION 2
TASA DE
MULTIPLICACION
0-24
0-48
0-72
0-96
2.1
2.5
2.6
2.6
0.09
0.05
0.04
0.03
2.2
2.5
2.6
2.6
0.09
0.05
0.04
0.03
N de Generaciones
FERMENTACION 1
SIN CONTROL
TASA DE
MULTIPLICACION
N de Generaciones
FERMENTACION 2
SIN CONTROL
TASA DE
MULTIPLICACION
1.6
1.8
2.0
0.07
0.04
0.03
1.7
1.9
2.1
0.07
0.04
0.03
93
ANEXO C
El presente anexo presenta los resultados del estudio preliminar para el montaje
de un cultivo continuo en el biorreactor.
RESULTADOS
DE
LA
EVALUACION
DE
PERISTALTICAS DEL BIOFLO Y SEGUIMIENTO
FERMENTACION EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO
BOMBAS
DE UNA
IN T E R V A LO
DE HORAS
TASA DE
C R EC IM IE N T O
FER M . 1 C O N
R E G U LA C IO N D E
P H (h -1 )
0-24
24-48
48-72
72-96
Fuente: Autores
0.062
0.011
0.003
0.001
TASA DE
TASA DE
TASA DE
C R EC IM IE N T O
C R EC IM IE N T O
C R EC IM IE N T O
FER M . 2 SIN
FER M . 1 SIN
FER M . 2 C O N
R E G U LA C IO N C O N T R O L D E P H (h - C O N T R O L D E P H (h 1
1
D E P H (h -1 )
)
)
0.063
0.011
0.002
0.001
0.045
0.006
0.005
0.049
0.006
0.005
D IA
0
1
2
5
6
7
8
12
13
N M .O /m l
R a n g o s u p e rio r
2 .6 E + 0 7
6 .4 E + 0 7
7 .5 E + 0 7
1 .0 E + 0 8
8 .5 E + 0 7
7 .3 E + 0 7
7 .1 E + 0 7
5 .6 E + 0 7
5 .8 E + 0 7
R a n g o in fe rio r
1 .9 E + 0 7
4 .8 E + 0 7
6 .4 E + 0 7
7 .2 E + 0 7
6 .2 E + 0 7
5 .7 E + 0 7
3 .8 E + 0 7
5 .2 E + 0 7
4 .7 E + 0 7
C O N T E N ID O D E N IT R O G E N O /M L
m g N IT R O G E N O /m l.
0 .0 6 6 0
0 .1 9 8 5
0 .2 6 5 0
0 .3 3 1 0
0 .2 6 5 0
0 .2 4 8 0
0 .1 9 8 5
0 .1 9 8 5
0 .1 9 8 5
S O L ID O S
SOLUBLES
T OT ALES
B R IX A 2 0 C
2 0 .0
1 8 .8
1 5 .8
9 .0
8 .5
8 .6
9 .0
8 .9
1 0 .0
Fuente: Autores
De acuerdo al conteo de microorganismos se calcul la tasa de crecimiento que
define la tasa de dilucin necesaria para establecer los flujos de entrada y salida
en el Biorreactor.
Tabla C.3 Tasas de dilucin y flujos en la fermentacin con flujo de entrada y flujo
de salida
INTERVALO DE
HORAS
TASA DE
CRECIMIENTO (hr-1)
0-24
0-48
0-120
0-144
0-168
0-192
0-288
0-312
0.040
0.023
0.011
0.008
0.006
0.005
0.003
0.003
FLUJO(ML/MIN)
% VELOCIDAD DE
BOMBAS
PERISTALTICAS
FLUJO BIOFLO
COSECHA(ML/MIN)
3.88
1.79
1.24
0.92
0.75
0.42
0.37
40%
5%
15%
15%
15%
5%
15%
1.60
0.20
0.58
0.58
0.58
0.20
0.58
FLUJO BIOFLO
TASA DE DILUCIN
ALIMENTACIONML/
COSECHA (hr-1)
MIN)
0.010
0.001
0.004
0.004
0.004
0.002
0.005
1.25
0.18
0.48
0.48
0.48
0.18
0.48
TASA DE DILUCIN
ALIMENTACION (hr-1)
0.008
0.001
0.003
0.003
0.004
0.002
0.004
Fuente: Autores
Para el da final de fermentacin, se determin el contenido alcohlico y
concentracin de azcares reductores dando como resultado 10 G.L y 0.0218 g
azcar reductor/ mililitro.
El conteo de microorganismos se realiz tomando muestra directamente del vaso
del biorreactor y se observ que hasta el quinto da se asemeja a un crecimiento
exponencial similar a de un cultivo discontinuo(Ver Tabla C.2), notando que la tasa
de dilucin para el cultivo continuo se fij a partir del segundo da de fermentacin.
Entre el intervalo del quinto hasta el octavo da de fermentacin se not un
descenso desde 8.5E7 m.o/ml hasta 5.4E7 m.o/ml. Esto se debe a la diferencia
ya expresada para los caudales de entrada y salida de flujo del biorreactor, lo que
implica una diferente tasa de dilucin para la cosecha y alimentacin (Ver Tabla
C.3). Del da 8 hasta el da 13 donde se finalizo la fermentacin no existen
variaciones en el crecimiento de microorganismos ni variacin en el contenido de
nitrgeno. La grfica de nitrgeno por clula present un comportamiento
constante a lo largo de la fermentacin, lo que indica que el conteo realizado es
equivalente al contenido de nitrgeno durante la fermentacin. Para la curva de
grados Brix se observa que desde el da quinto hay una estabilizacin de los
mismos hasta finalizar la fermentacin en valores aproximados a 9 Brix. Esto
indica que solo hubo consumo de slidos solubles durante los primeros 5 das de
fermentacin en continuo. En los siguientes das es probable que la concentracin
de slidos solubles se mantuviera constante debido a la tasa de dilucin, que
alimenta de slidos al cultivo pero tambin los desaloja del biorreactor.
De acuerdo a los valores de tasas de dilucin para cosecha y para alimentacin,
se tiene que la tasa de dilucin fue menor que la tasa de crecimiento hasta el da
12 de fermentacin. El da 13 la tasa de dilucin tiene un valor mayor, tanto para
la alimentacin como para la cosecha, respecto a la tasa de crecimiento para el
intervalo de das de fermentacin. Los fines de semana la tasa de dilucin debi
8.60
26.10
28.00
39.40
28.10
23.00
15.50
22.30
20.50
T R IP L IC AD O S
10.60
20.90
25.50
28.40
25.60
29.30
21.40
20.85
18.90
7.90
20.40
29.75
35.10
34.60
25.60
28.70
21.20
23.48
P R O M E D IO
9.03
22.47
27.75
34.30
29.43
25.97
21.87
21.45
20.96
DESV. ST D
1.40
3.16
2.14
5.54
4.65
3.17
6.61
0.76
2.32
0
1
2
5
6
7
8
12
13
P R O M E D IO
T R IP L IC A D O S
2 0 .0
1 8 .6
1 5 .8
9 .0
8 .4
8 .7
9 .0
8 .8
1 0 .0
2 0 .0
1 9 .0
1 5 .8
9 .0
8 .5
8 .6
9 .0
8 .9
9 .9
2 0 .0
1 8 .7
1 5 .8
8 .9
8 .6
8 .6
8 .9
9 .0
1 0 .0
2 0 .0
1 8 .8
1 5 .8
9 .0
8 .5
8 .6
9 .0
8 .9
1 0 .0
0
1
2
5
6
7
8
12
13
T R IP L IC A D O S V O L U M E N H C L 0 .9 4 6 5 6 N ( m l)
0 .1 0
0 .3 0
0 .4 0
0 .5 0
0 .4 0
0 .3 5
0 .3 0
0 .3 0
0 .3 0
0 .1 0
0 .3 0
0 .4 0
0 .5 0
0 .4 0
0 .3 5
0 .3 0
0 .3 0
0 .3 0
0 .1 0
0 .3 0
0 .4 0
0 .5 0
0 .4 0
0 .3 5
0 .3 0
0 .3 0
0 .3 0
P R O M E D IO
0 .1 0
0 .3 0
0 .4 0
0 .5 0
0 .4 0
0 .3 5
0 .3 0
0 .3 0
0 .3 0
C R E C IM IE N T O D E M IC R O O R G A N IS M O S
N M.O/ml.
1 .0 0 E + 0 8
Fuente: Autores
1 .0 0 E + 0 7
10
11
12
13
14
T IE M P O ( D IA S )
N m e ro d e m ic ro o rg a n is m o s / m l
Fuente: Autores
Grfica C.2 Curva de contenido de nitrgeno
C O N T E N ID O D E N IT R O G E N O E N M IL IG R A M O S D E N /M L
0 .4 0 0 0 0
0 .3 5 0 0 0
mg NITROGENO/MILILITRO
0 .3 0 0 0 0
0 .2 5 0 0 0
0 .2 0 0 0 0
0 .1 5 0 0 0
0 .1 0 0 0 0
0 .0 5 0 0 0
0
T IE M P O ( D IA S )
C O N T E N ID O D E N IT R O G E N O /M L
Fuente: Autores
10
11
12
13
14
25
20
BRIX
15
10
0
0
10
11
12
13
14
13
14
T IE M P O (D IAS )
Fuente: Autores
1 .0 0 E -0 8
1
N(mg)/n microorganismos
1 .0 0 E -0 9
T IE M P O ( D IA S )
N /C E L U L A
Fuente : Autores
10
11
12
ANEXO D
SISTEMA DE BOMBAS PERISTALTICAS DEL
BIOFLO 3000 M1227
BIBLIOGRAFIA
Biologa.
Quinta edicin,
Bibliografa
106
Control en un proceso de