Introduction

The abuse of prescription drugs that act on the central nervous system
is one of the most serious social problems in the world. Among those drugs,
benzodiazepines (BZPs) have largely replaced barbiturates as an xiolytic and
hypnotic drugs [1]. As the number of people who misuse those drugs for
recreational purposes has increased in recent years, there is an urgent need
to develop a highly reliable analytical method that can be used in forensic
science and emergency medicine. However, as various impurities are present
in biological specimens, a pretreatment method that can efficiently extract,
concentrate, and purify an extremely small amount of the target compound
is critical for analyzing biological specimens. Several approaches, such as
solid phase extraction (SPE) [2,3], solid-phase micro

extraction, [4,5], stir

bar sorptive extraction [6,7], and liquid phase micro extraction [8,9], have
been used so far. Dispersive solid phase extraction (DSPE) was used for the
clean upof crude extracts from different sample matrices [10]. However, the
extracts still contained some matrix contaminants, because DSPE could not
selectively purify the target compound. Furthermore, DSPE could not be used
for sample concentration. Dispersive liquid micro extraction (DLLME) [11]
features a high pre concentration capability, a short extraction time, and low
cost, but lacks selectivity for different analytes. In addition, a dispersion may
not form during the analysis of biological specimens [12].We have developed
a novel extraction method called the solid phase dispersive extraction (SPDE)
method [13], in which micro particles (solid phase) are dispersed in a liquid
sample, and have used it for the determination of van comycin in serum
samples [14]. After the dispersion of the micro particles (solid phase) in a
liquid sample (liquid phase), equilibrium between the two phases is
immediately reached. In addition, various micro particles can be used in
SPDE, similar to SPE; thus, SPDE has high selectivity, in contrast with DLLME
and DSPE. In this study, we evaluated the extraction efficiency of SPDE when
used in combination with liquid chromatography/time of flight mass

spectrometry (LC/TOF-MS) for the analysis of BZPs in serum and urine

samples. Our findings suggest the benefits of SPDE for the rapeutic drug
monitoring in emergency medicine as well as for the appraisal of abused
drugs in forensic science.

2. Experimental
2.1. Materials and reagents
Bromazepam,

nitrazepam,

lorazepam,

alprazolam,

triazolam,

flunitrazepam, etizolam, and diazepam standards were purchased from Wako

Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan). Erimin tablet (5 mg), which
was used as the nimetazepam standard, was obtained from Dainippon
Sumitomo Pharma Co., Ltd. (Osaka, Japan). Desalkyl flu razepam, which was
used as the surrogate for TOF-MS measurements, was purchased from
Cerilliant Corporation (Round Rock, TX, USA). Escherichia coli glucuronidase
for decon jugation was purchased from Sigma Aldrich Corp. (St. Louis,
MO,USA). Reversed phase (RP) polymeric Oasis HLB solid phase gel (30 m
O.D.) was obtained by removing the gel from the corresponding Oasis HLB
series SPE cartridges (Waters Corporation, Milford, MA, USA). Before use, the
solid phase gel was first conditioned with methanol and purified water. Then,
a turbid aqueous solution of the solid phase gel was prepared at the
concentration of 5 mg/ 50

L. The centrifugal filter prototype was custom

made by Frontier Science Co. (Hokkaido, Japan). The filter paper used was
No. 5B of Japanese Industrial Standards P3801.
2.2 Serum and urine samples
The lyophilized serum product, Consera (Nissui Pharmaceutical Co.,
Ltd., Tokyo, Japan), was used as a blank for the serum tests.Urine sample

from a healthy non dosed volunteer was used as ablank for the urine tests.
Blood and urine samples were collected from a patient receiving clinical
doses of etizolam. This study was per formed in accordance with the ethical
standards of the Declaration of Helsinki. The sample donors were recruited
on a voluntary basis and informed about the study objectives. The samples
were kept at 20C until analysis.
2.3. Basic SPDE method
An aqueous suspension (50 L) of Oasis HLB gel was introduced into
a 2 mL micro test tube. Then, 500 L of BZP standard solution (500 ng/ mL)
and 500 L of 10 mM aqueous ammonium for mate were added sequentially.
Subsequently, a centrifugal filter and a new micro test tube for receiving the
filtrate were attached (Fig. 1). After the solid phase was homogeneously
dispersed by light vortexing for a few seconds, the whole device was
inverted and then centrifuged at 3000 g for 10 s (Fig. 1). The micro test
tube containing the filtrate was removed, and a new micro test tube
containing a washing solution (1 mL of 5% aqueous methanol solution) was
attached. The whole centrifugal filter device was again inverted (i.e.,
returned to the original position), and then centrifuged at 3000 g for 10 s
to introduce the washing solution into the opposite micro test tube
containing the Oasis HLB gel. The solid-phase gel was then dispersed and
centrifuged as described above. Again, the micro test tube containing the
filtrate was removed, and a new micro test tube containing an eluting
solution (500 L of methanol) was attached to introduce the eluting solution
into the opposite micro test tube containing the solid phase gel. The solid
phase gel was dispersed by light vortex ing followed by ultrasonic cation for
10 s, and the solution was centrifuged as described above. The filtrate was
analyzed by LC/TOF-MS.
2.4. Pretreatment of serum and urine samples

Five hundred micro liters of serum was spiked with 10 L of de salkyl flu
razepam (10 g/mL) as the surrogate, and mixed well with 500 _L of ace to
nitrile to precipitate proteins. Then, the mixture was filtered through the
centrifugal filter (3000 g, 10 min). The filtrate was purged under nitrogen
at 40C to near dryness. Next, 500 L of 1 M ammonium acetate aqueous
solution and 10 L of glucuronidase (10,000 units/mL ) were added to the
residue, and the mixture was incubated at 37C for 1 h to achieve de
conjugation. The de conjugation was performed in accordance with the
information provided by the reagent manufacturer. Then, the whole solution
was subjected to SPDE. As for the urine sample,10 L of de salkyl flu razepam
(10 g/mL), 100 L of 1 M ammonium acetate aqueous solution, and 10 L of
glucuronidase Fig (10,000 units/mL) were added to 1 mL of urine sample, and
thewhole mixture was incubated at 37C for 1 h to achieve de conjugation.
Then, the whole solution was subjected to SPDE.
2.5. Apparatus
An Alliance HT 2795 system equipped with an LCT Premier XE TOF-MS
(Waters Corporation, Milford, MA, USA) was used. LC separation was
performed with a Porshell 120 EC-C18 column(100 mm 4.6 mm I.D., 2.7
_m; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA). Column temperature
was maintained at 40C.The mobile phase was a mixture of ammonium for
mate (pH 3.0,10 mM) ace to nitrile (70:30, v/v), and was delivered at the flow
rate of 0.5 mL/min. A 5

_L aliquot of the sample was injected into the

system. The optimum working parameters for TOF-MS were as follows

:ionization mode, electro spray ionization positive; capillary volt-age, 2000 V;
and cone voltage, 50 V. The proton adduct of each compound was used as
the monitoring ion (Fig. 2). Mass accuracy was maintained using Lock Spray
with leucine enkephalin [M+H]+ion, m/z = 556.2771 as lock mass.
Resolution was at least 10,000 as calculated by using the full width at half
maximum method.

3. Results and discussion

3.1. Optimization of SPDE
Method The centrifugal filter was composed of a double lap filter paper
and two types of polypropylene units, such that the filter paper was
sandwiched between the polypropylene units (Fig. 1).The optimum solidphase gel volume for the recovery of BZP by SPDE was investigated. Because
relatively high recoveries of over 80% were obtained when 5 mg of solidphase gel was used, that amount was considered optimum for mixing with a
sample. We also analyzed the filtrate and the washing solution after one
SPDE. As no BZP was detected, we assumed that almost all the BZPs in the
liquid phase were extracted by the solid-phase gel after one SPDE. The
extraction yield of each BZP was determined by calculating the recovery of
the drug in the standard solution, and was in the range of 81.389.2% (RSD:
1.86.9%). This result indicates that adsorption to and desorption from the
solid-phase gel occurred almost instantaneously. As micro particles in a
suspension can move around freely and have a large surface area, they have
a greater chance of coming into contact with the target compound in the
liquid solution, and this was thought to result in the enhanced extraction. The
enrichment factors of BZPs in the serum and urine samples were 100 and
200, respectively. As the SPDE method is performed in a closed system with
high

sealing

property

compared

to

previously

reported

system

[14],exposure to infectious microbes or hazardous chemicals is minimized.

3.2. Method validation of SPDE-LC/TOF-MS for serum analysis
The limit of detection (S/N = 3) and the limit of quantification (LOQ; S/N
> 10) of nine BZPs were in the range of 110 and550 ng/ mL, respectively.
Each calibration curve showed good linearity (r > 0.998) over the range of
LOQ (520 ng/mL) to 100 times those concentrations (5002000 ng/mL). Fig.
2 shows the typical chromatograms for 200 ng/mL BZPs in serum, as
measured by SPDE-LC/TOF-MS.

For serum samples, the average recoveries of BZPs spiked at50 ng/mL
and 500 ng/mL were 89.6105.0% (RSD: 2.16.8%) and93.6110.4% (RSD:
2.14.2%), respectively (Table 1). For urine samples, the average recoveries
of BZPs spiked at the same concentrations were 88.7105.5% (RSD: 2.9
6.4%) and 91.5101.1% (RSD:3.65.5%), respectively. Table 2 shows intraday and inter-day as say data for BZPs in serum and urine samples spiked at
100 ng/mL. Statistical analyses were performed using one-way analysis of
variance. The repeatability values ranged from 1.6% to 7.0% (serum),
and2.8% to 7.4% (urine), and the intermediate precision values were from
2.4% to 8.0% (serum), and 3.4% to 7.0% (urine). These data suggested that
SPDE-LC/TOF-MS has sufficient sensitivity and precision for monitoring
residual BZPs in biological samples.
3.3. Analysis of serum and urine samples from patient receiving clinical
doses of Etizolam
Serum and urine samples from a patient receiving clinical doses of
etizolam (De pas ) were analyzed. The major metabolites of etizolam are 8hydroxy etizolam and hydroxy etizolam, and their glucuronide conjugates, all
of which are excreted in urine [15]. The serum and urine samples were
subjected to de conjugation with glucuronidase. Blood and urine of the
patient receiving clinical doses of De pas (2 mg) were periodically sampled
(3, 6, and 9 hafter oral administration) and subjected to SPDE-LC/TOF-MS
analysis. The typical chromatograms of the serum and urine samples
obtained 3 h after oral administration exhibited an etizolam peak(Fig. 3(A)
and (B)). The accurate mass (359.0733 20 m Da) of the proton adducts of
expected etizolam metabolites in the total ion chromatogram of urine sample
was determined and drawn as amass chromatogram. Peaks (a) and (b) were
observed (Fig. 3(C))at the retention times of 4 min and 10 min,
respectively. The chemical formula C17H15ClN4SO for both etizolam
metabolites is consistent with the molecular ion peaks from mass
spectrometry, and isotopic peaks indicate the presence of chlorine (Fig.

3(D)), as expected. Thus, we attributed peaks (a) and (b) to the etizolam
metabolites. However, because 8-hydroxy etizolam and hydroxyl.
3.4. Drug monitoring in blood and urine
Fig. 4 shows time course of the concentrations of etizolam and its two
metabolites in serum and urine samples following oral administration. For the
urine sample, the drug concentration was corrected by creatinine values. The
maximum concentration of etizolam in blood was reached 3 h after oral
administration, consistent with previously reported data [16]. Accordingly,
the metabolites and the parent compound should be monitored when urine is
analyzed to identify the causative agent when drug poisoning or abuseis
suspected. In conclusion, SPDE-LC/TOF-MS is useful for therapeutic drug
monitoring in emergency medicine and forensic science.
Acknowledgement
This study was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research from
the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan
(Grant No. 20590043).

TERJEMAHAN B. INDONESIA
pengantar
Penyalahgunaan obat resep yang bekerja pada sistem saraf pusat
adalah salah satu masalah sosial yang paling serius di dunia. Di antara obat

tersebut, benzodiazepin (BZPs) telah digantikan tarif barbi tu sebagai xiolytic

dan obat hipnotik [1]. Karena jumlah orang yang menyalahgunakan obat
tersebut untuk tujuan rekreasi telah meningkat dalam beberapa tahun
terakhir, ada kebutuhan mendesak untuk mengembangkan metode analisis
yang sangat handal yang dapat digunakan dalam ilmu forensik dan obatobatan darurat. Namun, karena berbagai kotoran yang hadir dalam spesimen
biologi,

metode

pengobatan

pra

yang

efisien

dapat

mengekstrak,

berkonsentrasi, dan memurnikan jumlah yang sangat kecil dari senyawa

target penting untuk menganalisis spesimen biologi. Beberapa pendekatan,
seperti ekstraksi fase padat (SPE) [2,3], fase padat mikro ekstraksi, [4,5],
batang sorptive ekstraksi [6,7], dan fase cair mikro ekstraksi [8,9], telah
digunakan sejauh ini. Tebar ekstraksi fase padat (DSPE) digunakan untuk
bersih upof ekstrak mentah dari matriks sampel yang berbeda [10]. Namun,
ekstrak masih terdapat beberapa kontaminan matriks, karena DSPE tidak
bisa selektif memurnikan senyawa target. Selanjutnya, DSPE tidak dapat
digunakan untuk konsentrasi sampel. Tebar cair ekstraksi mikro (DLLME) [11]
memiliki kemampuan yang tinggi pra konsentrasi, waktu ekstraksi singkat,
dan biaya rendah, tetapi tidak memiliki selektivitas untuk analit yang
berbeda. Selain itu, dispersi mungkin tidak terbentuk selama analisis
spesimen biologi [12] Kami telah mengembangkan metode ekstraksi baru
yang disebut fase padat tebar ekstraksi metode (SPDE) [13], di mana partikel
mikro (fase padat) yang tersebar di sampel cair, dan telah digunakan untuk
penentuan van comycin dalam sampel serum [14]. Setelah dispersi dari
partikel mikro (fase padat) dalam sampel cair (fasa cair), keseimbangan
antara kedua fase segera tercapai. Selain itu, berbagai partikel mikro dapat
digunakan di SPDE, mirip dengan SPE; dengan demikian, SPDE memiliki
selektivitas yang tinggi, berbeda dengan DLLME dan DSPE. Dalam studi ini,
kami mengevaluasi efisiensi ekstraksi SPDE bila digunakan dalam kombinasi
dengan kromatografi cair / waktu spektrometri massa penerbangan (LC /
TOF-MS) untuk analisis BZPs dalam serum dan urin sampel. Temuan kami
menunjukkan manfaat SPDE untuk pemantauan obat rapeutic dalam

pengobatan darurat serta untuk penilaian obat disalahgunakan dalam ilmu

forensik.

2. Percobaan
2.1. Bahan dan reagen
BROMAZEPAM,

nitrazepam,

lorazepam,

alprazolam,

triazolam,

flunitrazepam, etizolam, dan standar diazepam dibeli dari Wako Pure

Chemical Industries, Ltd (Osaka, Jepang). tablet Erimin (5 mg), yang
digunakan

sebagai

standar

nimetazepam,

diperoleh

dari

Dainippon

Sumitomo Pharma Co, Ltd (Osaka, Jepang). Desalkyl razepam flu, yang
digunakan sebagai pengganti untuk pengukuran TOF-MS, dibeli dari Cerilliant
Corporation (Round Rock, TX, USA). Escherichia coli glucuronidase untuk de
konjugasi dibeli dari Sigma Aldrich Corp (St. Louis, MO, USA). fase terbalik
(RP) polimer Oasis HLB fase padat gel (30 m O.D.) diperoleh dengan
menghapus gel dari kartrid seri SPE sesuai Oasis HLB (Waters Corporation,
Milford, MA, USA). Sebelum digunakan, gel fase padat pertama kali AC
dengan metanol dan air murni. Kemudian, larutan keruh dari fase gel padat
disiapkan pada konsentrasi 5 mg / 50 L. Filter prototipe sentrifugal dibuat
khusus oleh Frontier Ilmu Co (Hokkaido, Jepang). kertas filter yang digunakan
adalah Nomor 5B dari Jepang Standar Industri P3801.
2.2 Serum dan urine sampel
Produk terliofilisasi serum, Consera (Nissui Pharmaceutical Co, Ltd,
Tokyo, Jepang), digunakan sebagai kosong untuk sampel serum tests.Urine
dari relawan non tertutup sehat digunakan sebagai kosong untuk tes urine.
Sampel darah dan urin dikumpulkan dari pasien yang menerima dosis klinis
etizolam. Penelitian ini per dibentuk sesuai dengan standar etika Deklarasi
Helsinki. Para donor sampel direkrut atas dasar sukarela dan informasi
tentang tujuan studi. Sampel disimpan di 20C sampai analisis.

2.3. Metode SPDE dasar

Larutan suspensi (50 L) dari Oasis HLB gel diperkenalkan ke dalam
tabung reaksi mikro 2 mL. Kemudian, 500 L dari BZP larutan standar (500
ng / mL) dan 500 L dari 10 mM amonium berair jodoh ditambahkan secara
berurutan. Selanjutnya, filter sentrifugal dan tes tabung mikro baru untuk
menerima filtrat yang melekat (Gbr. 1). Setelah fase padat homogen
dibubarkan oleh korteks cahaya selama beberapa detik, seluruh perangkat
itu terbalik dan kemudian disentrifugasi pada 3000 g selama 10 s
(Gambar. 1). Tabung reaksi mikro yang mengandung filtrat telah dihapus,
dan tabung reaksi mikro baru yang berisi larutan pencuci (1 mL dari 5%
larutan metanol berair) telah terpasang. Seluruh perangkat penyaring
sentrifugal itu lagi terbalik (yaitu, kembali ke posisi semula), dan kemudian
disentrifugasi pada 3000 g selama 10 s untuk memperkenalkan solusi cuci
ke dalam tabung reaksi mikro berlawanan yang berisi gel Oasis HLB. Gel
fase padat kemudian tersebar dan disentrifugasi seperti dijelaskan di atas.
Sekali lagi, tabung reaksi mikro yang mengandung filtrat telah dihapus, dan
tabung reaksi mikro baru yang berisi solusi eluting (500 L metanol) melekat
untuk memperkenalkan solusi eluting ke dalam tabung uji mikro berlawanan
mengandung gel fase padat. Gel fase padat dibubarkan oleh korteks cahaya
diikuti oleh kation ultrasonik selama 10 s, dan larutan disentrifugasi seperti
dijelaskan di atas. filtrat dianalisis dengan LC / TOF-MS.
2.4. pra pengobatan serum dan urin sampel
Lima ratus mikroliter serum dibubuhi 10 L dari razepam flu salkyl de
(10 g / mL) sebagai pengganti, dan dicampur dengan baik dengan 500 _L
asetonitril untuk mengendapkan protein. Kemudian, campuran disaring
melalui filter sentrifugal (3000 g, 10 menit). Filtrat dibersihkan dalam
nitrogen pada 40C mendekati kekeringan. Selanjutnya, 500 L dari 1 M
amonium larutan asetat dan 10 L dari glucuronidase (10.000 unit / mL)
ditambahkan ke residu, dan campuran diinkubasi pada 37C selama 1 jam

untuk mencapai konjugasi. konjugasi dilakukan sesuai dengan informasi

yang diberikan oleh produsen reagen. Kemudian, seluruh solusi menjadi
sasaran SPDE. Adapun sampel urine, 10 L dari razepam flu salkyl (10 g / mL),
100 L dari 1 M amonium larutan asetat, dan 10 L dari glucuronidase Gambar
(10.000 unit / mL) ditambahkan ke 1 mL sampel urin, dan seluruh campuran
diinkubasi pada 37C selama 1 jam untuk mencapai konjugasi. Kemudian,
seluruh solusi menjadi sasaran SPDE.
2.5. Aparat
Sebuah Aliansi HT 2795 sistem dilengkapi dengan LCT Premier XE TOFMS (Waters Corporation, Milford, MA, USA) digunakan. pemisahan LC
dilakukan dengan Porshell 120 EC-C18 kolom (100 mm x 4,6 mm nomor
pembayar, 2,7 _M, sebuah Teknologi gilent, Inc., Santa Clara, CA, USA). Suhu
kolom dipertahankan pada 40C. fase gerak adalah campuran dari amonium
untuk pasangan (pH 3.0,10 mM) ace ke nitril (70:30, v / v), dan disampaikan
pada laju alir 0,5 mL / menit. Sebuah alikuot 5 _L dari sampel disuntikkan ke
dalam sistem. Parameter kerja optimum untuk TOF-MS adalah sebagai
berikut: modus ionisasi, elektro semprot ionisasi positif; kapiler volt usia,
2000 V; dan tegangan kerucut, 50 V. proton adisi dari masing-masing
senyawa yang digunakan sebagai ion monitoring (Gambar. 2). akurasi massa
dipertahankan menggunakan kunci Semprot dengan leucine enkephalin [M +
H] + ion, m / z = 556,2771 massa sebagai kunci. Resolusi setidaknya 10.000
yang dihitung dengan menggunakan lebar penuh pada metode setengah
maksimum.
3. Hasil dan Pembahasan
3.1. Optimasi SPDE
Metode Filter sentrifugal terdiri dari kertas lap saringan ganda dan dua
jenis unit polypropylene, sehingga kertas saring terjepit di antara unit
polypropylene (Gambar. 1) .suatu Volume gel fase padat optimal untuk

pemulihan BZP oleh SPDE diselidiki. Karena pemulihan yang relatif tinggi
lebih dari 80% diperoleh ketika 5 mg fase padat gel digunakan, jumlah yang
dianggap

optimal

untuk

pencampuran

dengan

sampel.

Kami

juga

menganalisis filtrat dan solusi mencuci setelah satu SPDE. Karena tidak ada
BZP terdeteksi, kita mengasumsikan bahwa hampir semua BZPs dalam fase
cair diekstraksi dengan fase gel padat setelah satu SPDE. Hasil ekstraksi dari
setiap BZP ditentukan dengan menghitung pemulihan obat dalam larutan
standar, dan berada di kisaran 81,3-89,2% (RSD: 1,8-6,9%). Hasil ini
menunjukkan bahwa adsorpsi ke dan desorpsi dari gel padat-fase terjadi
hampir seketika. Sebagai partikel mikro dalam suspensi dapat bergerak
bebas

dan

memiliki

luas

permukaan

yang

besar,

mereka

memiliki

kesempatan lebih besar untuk datang ke dalam kontak dengan senyawa

target dalam larutan cair, dan ini dianggap menghasilkan ekstraksi
ditingkatkan. Faktor-faktor pengayaan BZPs dalam serum dan urin sampel
100 dan 200, masing-masing. Sebagai metode SPDE dilakukan dalam sistem
tertutup dengan properti penyegelan tinggi dibandingkan dengan sistem
dilaporkan sebelumnya [14], paparan mikroba menular atau bahan kimia
berbahaya diminimalkan.
3.2. Metode validasi SPDE LC / TOF MS untuk analisis serum
Batas deteksi (S / N = 3) dan batas kuantifikasi (LOQ; S / N> 10) dari
sembilan BZPs berada di kisaran 1-10 and5-50 ng / mL, masing-masing.
Setiap kurva kalibrasi menunjukkan jalur baik yang ritas (r> 0,998) selama
rentang LOQ (5-20 ng / mL) untuk 100 kali mereka konsentrasi (500-2000
ng / mL). Gambar 2 menunjukkan kromatogram khas untuk 200 ng / mL BZPs
dalam serum, yang diukur dengan SPDE-LC / TOF-MS.
Untuk sampel serum, yang pemulihan rata-rata BZPs berduri pada 50
ng / mL dan 500 ng / mL adalah 89,6-105,0% (RSD: 2,1-6,8%) dan 93,6110,4% (RSD: 2,1-4,2%), masing-masing (Tabel 1). Untuk sampel urin,
pemulihan rata-rata BZPs berduri pada konsentrasi yang sama adalah 88,7-

105,5% (RSD: 2,9-6,4%) dan 91,5-101,1% (RSD: 3,6-5,5%), masing-masing

tabel 2 menunjukkan intraday hari lain sebagai mengatakan data untuk BZPs
dalam serum dan urin sampel berduri di 100 ng / mL. Analisis statistik
dilakukan menggunakan analisis satu arah varians. Nilai-nilai pengulangan
berkisar dari 1,6% menjadi 7,0% (serum), and2.8% menjadi 7,4% (urine),
dan nilai-nilai presisi menengah berasal dari 2,4% menjadi 8,0% (serum),
dan 3,4% menjadi 7,0% (urine) . Data ini menunjukkan bahwa SPDE-LC /
TOF-MS memiliki sensitivitas yang cukup dan presisi untuk memantau BZPs
sisa dalam sampel biologis.
3.3. Analisis serum dan urin sampel dari pasien yang menerima dosis
klinis Etizolam
Serum dan urine sampel dari pasien yang menerima dosis klinis
etizolam (De pas ) dianalisis. Metabolit utama etizolam 8 etizolam hidroksi
dan etizolam hidroksi, dan konjugat glukuronida mereka, semua yang
diekskresikan dalam urin [15]. Serum dan urin sampel mengalami de
konjugasi dengan glucuronidase. Darah dan urin dari pasien yang menerima
dosis klinis depas (2 mg) secara berkala sampel (3, 6, dan 9 oral hafter)
dan dikenakan SPDE-LC / analisis TOF-MS. Kromatogram khas dari serum dan
urin sampel diperoleh 3 jam setelah pemberian oral dipamerkan etizolam
puncak (Gambar. 3 (A) dan (B)). Massa akurat (359.0733 20 m Da) dari
adisi proton metabolit etizolam diharapkan total kromatogram ion dari
sampel urine ditentukan dan ditarik sebagai kromatogram kumpulkan.
Puncak (a) dan (b) yang diamati (Gambar. 3 (C)) pada waktu retensi ~4 min
dan ~ 10 menit, masing-masing. Rumus kimia C17H15ClN4SO untuk kedua
metabolit etizolam konsisten dengan puncak ion molekul dari spektrometri
massa, dan puncak isotop menunjukkan adanya klorin (Gambar. 3 (D)),
seperti yang diharapkan. Dengan demikian, kita dikaitkan puncak (a) dan (b)
untuk metabolit etizolam. Namun, karena etizolam 8-hidroksi dan hidroksil.
3.4. pemantauan obat dalam darah dan urine

Gambar 4 menunjukkan perjalanan waktu konsentrasi etizolam dan

dua metabolitnya dalam serum dan sampel urin setelah pemberian oral.
Untuk sampel urine, konsentrasi obat dikoreksi oleh nilai-nilai kreatinin.
Konsentrasi maksimum etizolam di darah mencapai 3 jam setelah pemberian
oral, konsisten dengan data yang dilaporkan sebelumnya [16]. Dengan
demikian, metabolit dan senyawa induk harus dipantau saat urin dianalisis
untuk mengidentifikasi agen penyebab ketika keracunan obat atau abuseis
dicurigai. Kesimpulannya, SPDE-LC / TOF-MS berguna untuk pemantauan
obat terapeutik dalam pengobatan darurat dan ilmu forensik.
Pengakuan
Penelitian ini didukung oleh grantin iklan untuk Riset Ilmiah dari
Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Olahraga, Sains dan Teknologi Jepang
(Grant No. 20590043).