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FIJACIN
La fijacin tiene por objeto matar las clulas y conservarlas, hasta donde sea posible,
en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un mtodo
histolgico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura
morfolgica y qumica de las clulas y tejidos al estado vivo y que permite realizar,
posteriormente, los procedimientos de coloracin o de identificacin que facilitan el
completo conocimiento de su constitucin ntima.
Fijacin de la muestra.
Se llaman fijadores a las sustancias qumicas o a los agentes fsicos que se utilizan
para tal fin.
Cualidades que debe tener un fijador:
1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las clulas antes de que aparezcan los
fenmenos agnicos o post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.).
2. Poseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta en las
capas profundas de la pieza a fijar.
3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.
4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observacin
ulterior (ejecucin de cortes, coloracin, etc.).
5. Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante la fijacin o despus de
ella.
6. No provocar o impedir la produccin de estructuras artificiales.
7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.
Manera de actuar de los fijadores
Vara con la composicin o naturaleza de los mismos: coagulando las protenas sin
combinarse con ellas (alcohol, cido pcrico, yodo, calor), formando combinaciones
qumicas con las sustancias orgnicas (cido crmico y sus sales), o reducindose en
contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (cido
smico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).
La mayor parte de los fijadores actan como oxidantes, favoreciendo as la coloracin
ulterior de los tejidos (recurdese que stos, en su mayora, son reductores que
muchos colorantes se transforman en leucobases incoloras al combinar una molcula
de hidrgeno con su cromforo).
Fijadores qumicos
Son los ms utilizados; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola
sustancia qumica, y fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias
sustancias intervienen en su constitucin.
FIJADORES SIMPLES:
a) Formol al 10%, es el ms usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en
que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar
rganos o tejidos para estudios histolgicos topogrficos.
b) Alcohol etlico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microqumica.
c) Alcohol metlico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre,
mdula sea, ganglio, bazo, lquidos de puncin, etc.).
d) cido smico al 1 2%, es poco penetrante pero enrgico, conserva muy bien
estructuras celulares.
e) Bicromato de potasio al 3-5%.
FIJADORES COMPUESTOS:
En su composicin intervienen un nmero variable de fijadores simples racionalmente
elegidos con el fin de completar la accin de cada uno de ellos o atenuar sus defectos.
a) Lquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-actica.
b) Lquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-actica.
c) Lquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
d) Lquido de Bouin, mezcla picro-formos-actica.
e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohlico.
FIJADORES FSICOS:
1. Desecacin.
2. Calor seco.
3. Calor hmedo.
4. Fro.
5. Congelacin y desecacin.
DESHIDRATACIN E INCLUSIN EN PARAFINA
Deshidratacin
Las piezas al ser retiradas del fijador, o despus de haberlas lavado, estn embebidas
en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar,
debemos deshidratar los tejidos sumergindolos en lquidos anhidros, vidos de agua.
Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratacin brusca, se aconseja
proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etlico de graduacin
creciente.
Penetracin de la parafina
Se sumergen las piezas en parafina (56-58 de punto de fusin), mantenida lquida en
la estufa a no ms de 62C. Despus de 1 a 2 horas se renueva la parafina.
Barras de Leuckart
A los 15-30 minutos la parafina se habr solidificado completamente, recortamos los
bloques en forma de pirmide cuadrangular truncada, lo adherimos a un taquito de
madera mediante una esptula calentada con la llama de un mechero y ya podemos
realizar los cortes con el micrtomo.
OBTENCIN DE CORTES
COLORACIN
Luego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloracin.
Colorantes: reciben esta denominacin las sustancias que pueden conferir color a otros
cuerpos.
Coloracin: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teido por una sustancia
colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la
solucin colorante.
A continuacin veremos cuales son los tistintos ripos de tinsiones que existen en la
histologa.
Tipos de tinciones
Existen mltiples mtodos de tincin histolgica, unos generales y otros especficos,
que permiten poner de manifiesto tanto la topografa tisular, como tipos celulares
concretos, determinados orgnulos o estructuras intracelulares.
Las tinciones histolgicas propiamente dichas utilizan colorantes, la mayor parte de
ellos derivados de la industria textil, que se eligen en funcin de su capacidad de
interaccionar con los diferentes constituyentes de los tejidos. Tcnicas de tincin ms
complejas como las histoenzimticas o inmunocitoqumicas se basan en el empleo de
sustratos, lectinas, anticuerpos, etc.
Que es un colorante?
Un colorante es una molcula que tiene la capacidad de absorber radiaciones
electromagnticas dentro de la regin del espectro visible es decir entre 400 y 650 nm.
Los colorantes que absorben todas las radiaciones entre estos mrgenes, no
transmiten ningn tipo de luz y se ven por lo tanto de color negro. Aquellos colorantes
que absorben una franja ms estrecha, transmiten un color determinado. Por ejemplo el
cido pcrico absorbe predominantemente la luz azul-violeta del final del espectro
visible, dando como resultado una luz transmitida de color amarillo.
Cundo se habla de un buen mtodo de tincin?
conviene realizar determinado tipo de tinciones "en flotacin". Para ello los cortes de
tejido se mantienen sumergidos (en flotacin) en el interior de la solucin colorante lo
cual permite la accesibilidad del colorante por ambas superficies. Este tipo de tcnica
es poco comn cuando se utilizan colorantes pero es habitual cuando se realizan
tcnicas de tincin histoenzimticas o inmunocitoqumicas.
Qu es una tincin en placa?
Es aquella que se realiza utilizando placas de cultivo celulares. Es decir, la tincin se
realiza sobre clulas que se han mantenido vivas en condiciones in vitro.
En qu consiste una tincin "en bloque"?
En ocasiones, en algunos tipos de impregnaciones metlicas, tcnicas de Golgi, etc...
Conviene realizar la tincin no sobre cortes histolgicos sino sobre la pieza o bloque de
tejido. Para ello el bloque de tejido se sumerge en la solucin colorante durante un
tiempo determinado. Los resultados finales no se pueden valorar, sin embargo, hasta
que no se han confeccionado los cortes y se realiza la observacin microscpica.
Qu es una tincin para microscopa electrnica?
Para la observacin de los cortes ultra finos con el microscopio electrnico de
transmisin, es preciso "contrastar" los cortes con objeto de incrementar las diferencias
de densidad electrnica de las diferentes partes de la muestra. Para ello se recurre al
empleo de sales de metales pesados como uranio, wolframio o plomo.
anticuerpos pueden estar marcados con una sustancia fluorescente y en este caso se
trata de una tincin de inmunofluorescencia.
Hematoxilina-eosina
La hematoxilina es un colorante catinico mientras que la eosina es un colorante
aninico perteneciente a los xantenos. Se teirn los ncleos de azul, citoplasmas en
rosa, msculo en tonos rojizos a rosados fucsia, glbulos rojos en naranja o rojo y la
fibrina en rosa intenso.
1-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
5- Lavar en H2O-2min.
2- Hidratacin.
Alcohol absoluto-5min.
Alcohol 96-5min.
Alcohol 70-5min.
6-Eosina alcohlica-1min.
7-Deshidratar.
Alcohol de 70
Alcohol de 96.
Alcohol absoluto.
Xilol.
4- Hematoxilina-5min.
8- Montaje.
Giemsa
La tcnica radica en la disociacin controlada de las sales de eosinato que ocurre al
insolubilizar la mezcla del giemsa por disolucin en H2O destilada; la eosina as
liberada colorea el componente extracelular y determinadas extructuras acidfilas; y los
2- Hidratacin.
Alcohol absoluto-5min.
Alcohol 96 -5min.
Alcohol 70 -5min.
10- Xilol.
11- Montar.
Gram
Permite la observacin de bacterias, pero no su identificacin especfica. Permite
observar su morfologa, e incluso si una vez teidos son gram + gram - cido
alcohol resistentes. Tie los organismos Gram+ de azul negruzco, Gram- de rojo y el
fondo rosa.
SOLUCIONES:
1.- Solucin Cristal Violeta:
-Cristal violeta-------------------------------------------2 gr.
- Alcohol96 -------------------------------------------20 ml
- Agua destilada --------------------------------------78 ml
TCNICA:
Tricromico de Masson
Es una tcnica para la coloracin de fibras colgenas y elsticas. Se observan tres
colores distintos; tejido conjuntivo de verde, tejido muscular de verde pardo, eritrocitos
de rojizo, ncleos azul negro y citoplasma y fibras musculares rosa.
1-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2- Hidratacin.
Alcohol absoluto-5min.
Alcohol 96-5min.
Alcohol 70-5min.
10-Deshidratar.
Alcohol de 70
Alcohol de 96.
Xilol.
11- Montaje.
1-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2- Hidratacin.
Alcohol absoluto-5min.
Alcohol 96-5min.
Alcohol 70-5min.
3- Lavar en H2O destilada.
19-Deshidratar.
Alcohol de 70
9- Lavar con agua destilada -1-2 pases. Alcohol de 96.
Alcohol absoluto.
Xilol.
10- Reactivo de Wilder - 2 min.
20- Montaje.
RESULTADOS:
Reticulina: negro.
Ncleos: grisceo.
Colgena: prpura grisceo.
PAS
Se usa como tcnica de rutina para observar las membranas basales que separan el
tejido epitelial del corin. Tie los ncleos de color azul, el glucgeno de color prpura y
el material PAS + (polisacridos simples, mucopolisacridos neutros, mucoprotenas,
glucoprotenas y glucolpidos) rojo rosa.
SOLUCIONES:
- Metabisulfito sdico al 10 %
------------------6 ml.
- Fucsina bsica
-----------------------------------1 gr.
- cido hidroclrico 1N al 10 %
----------------5 ml
- Agua destilada
--------------------------------100 ml
TCNICA:
9.- Deshidratar.
SOLUCIONES:
1.- Hematoxilina de Verhoeff:
- Hematoxilina alcohlica:
- Fucsina cida al 1 %
----------------------------1.3 ml
Hematoxilina ------------------------------------10
gr.
- cido pcrico a saturacin
---------------------- 9.7 ml
Alcohol96 -------------------------------------100
ml
-Cloruro frrico al 10 %:
Cloruro frrico ----------------------------------10
gr.
Agua destilada
----------------------------------100 ml
- Yoduro potsico al 10 %:
Yoduro potsico --------------------------------10
gr.
Agua destilada
----------------------------------100 ml
- Alcohol 50
TCNICA:
7.- Deshidratar
9.- Montar
Azul Alcian
SOLUCIN:
TCNICA
1-. Desparafinar.
Estufa durante 30 min. a 60C
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2- Hidratacin.
Alcohol absoluto-5min.
Alcohol 96-5min.
Alcohol 70-5min.
7-Deshidratar.
Alcohol de 70
Alcohol de 96.
Alcohol absoluto.
Xilol.
8- Montaje.
Grocott
Para la tincin de hongos (candida, aspergillus).
1-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2- Hidratacin.
Alcohol absoluto-5min.
Alcohol 96-5min.
Alcohol 70-5min.
3- Lavar en H2O destilada
16-Deshidratar.
Alcohol de 96.
Alcohol absoluto.
Xilol.
17- Montaje.
Hierro coloidal
1-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
7- Mezcla ferrocianuro-clorhdrico 20
min.
2- Hidratacin.
Alcohol absoluto-5min.
Alcohol 96-5min.
Alcohol 70-5min.
11-Deshidratar.
Alcohol de 70
Alcohol de 96.
Alcohol absoluto.
Xilol.
12- Montaje.
Mucicarmin de Mayer
Las mucinas o mucoprotenas son protenas con H.C. en una proporcin superior al 4
%. La tcnica del mucicarmn de Mayer sirve para identificar globalmente las mucinas,
pero no reconoce su naturaleza bioqumica.
1-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2- Hidratacin.
Alcohol absoluto-5min.
Alcohol 96-5min.
Alcohol 70-5min.
8-Deshidratar.
Alcohol de 70
Alcohol de 96.
Alcohol absoluto.
Xilol.
Hemalumbre de Mayer
1-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2- Hidratacin.
Alcohol absoluto-5min.
Alcohol 96-5min.
Alcohol 70-5min.
7-Deshidratar.
Alcohol de 70
Alcohol de 96.
Alcohol absoluto.
Xilol.
Orceina
ORCEINA (fibras elsticas, virus, hepatitis, cobre)
1-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2- Hidratacin.
Alcohol absoluto-5min.
Alcohol 96-5min.
Alcohol 70-5min.
11- Xilol
12- Montar
Perls
1-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2- Hidratacin.
Alcohol absoluto-5min.
Alcohol 96-5min.
Alcohol 70-5min.
8- Eosina 1 pase.
9-Deshidratar.
Alcohol de 70
Alcohol de 96.
Alcohol absoluto.
Xilol.
10- Montaje.
RESULTADOS:
Hierro: azul.
Rojo congo
1-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2- Hidratacin.
Alcohol absoluto-5min.
Alcohol 96-5min.
Alcohol 70-5min.
10-Deshidratar.
Alcohol de 70
4- Hematoxilina de Carazzi o de Weigert
Alcohol de 96.
10 min.
Alcohol absoluto.
Xilol.
5- Lavar en agua corriente - 10 min.
11- Montaje.
2- Hidratacin.
Alcohol absoluto-5min.
Alcohol 96-5min.
Alcohol 70-5min.
5- Solucin de Ag-Metenamina:
. En estufa - 60 min.
(controlar la tincin hasta que alcance un
color tabaco y comprobar al microscopio
que se han teido los glomrulos)
14-Deshidratar.
Alcohol de 70
Alcohol de 96.
Alcohol absoluto.
Xilol.
15- Montaje.
Sudan III
1-Desparafinado.
Estufa durante 30 min. a 60.
Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.
2- Hidratacin.
Alcohol absoluto-5min.
Alcohol 96-5min.
Alcohol 70-5min.
RESULTADO:
Las grasas neutras se tien.
Violeta de Cresilo
1- Desparafinado.
Estufa durante 30 min.a 60.
Sumergimos en xilol durante 10-15 min.
2-Deshidratacin.
Alcohol absoluto durante 5 min.
Alcohol 96 5 min.
Alcohol 70 5 min.
Tincin de Semifinos
Contraste de Ultrafinos
Mucicarmin
Ziehl
Fucsina Bsica
Decolorante
Azul de Metileno
Mtodo tradicional para la deteccin del bacilo tuberculoso. Para empleo con
esputo, concentrado o por extensin directa, lquido cefalorraqudeo u otros
fluidos corporales, incluyendo orina cateterizada y material homogeneizado de
tejidos.
Coloracin de Papanicolaou
Se trata de una tcnica citolgica compuesta por 3 soluciones:
Hematoxilina Biopur
Colorante nuclear. Las caractersticas y recomendaciones para el uso de
Hematoxilina Biopur fueron expuestas en la seccin anterior. Rogamos referirse
a la misma para informacin adicional.
OG Biopur
Se trata de una solucin alcohlica de cido fosfotngstico y Orange G. El cido
fosfotngstico acidifica la solucin y aumenta la unin del Orange G a zonas
citoplasmticas densas.
EA Biopur
Se trata de una solucin alcohlica, fotoestable que elimina los problemas
causados por las tradicionales e inestables frmulas numeradas EA-36/50/65/etc.
No requiere filtracin. Listo para usar.
Tie selectivamente el citoplasma de clulas que tuvieron actividad metablica
poco antes de la recoleccin de la muestra. Tie de rosa a rojo las clulas
escamosas superficiales, cilios, nucleolo y eritrocitos.
Feulgen
Tincion Fluorescente
REFERENCIAS
Horobin RW, Kiernan JA (2002) Conn's Biological Stains. A Handbook of Dyes Stains
and Fluorochromes for Use in Biology and Medicine. 10th ed. Oxford: BIOS. ISBN 185996-099-5
http://elprofedebiolo.blogspot.mx/2010/01/tecnicas-de-tincion.html
http://es.scribd.com/doc/15606061/Tarea-4-tincion
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n
http://html.rincondelvago.com/histoquimica.html
http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/5-histoquimica.php
http://www.bu.edu/histology/m/append02.htm
http://www.uam.es/departamentos/medicina/patologia/Tecnicas.htm
http://www.uv.es/histomed/practicas/04-adip/04-adip.htm
Penney DP, Powers JM, Frank M, Churukian C (2002) analysis and testing of Biological
Stains - the Biological Stain Commission Procedures. Biotechnic & Histochemistry 77:
237-275.