BIOTECNOLOGIA

Actualizacin Profesional en Manejo de Recursos
Naturales, Agricultura Sostenible y Pobreza Rural
Introduccin a la
Biotecnologa Vegetal
William M. Roca, Ph.D.
Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT)
Hernando Ramrez, M.Sc.
Universidad Nacional de Colombia
Centro para el Desarrollo Agropecuario y Forestal, Inc.

CEDAF
Octubre, 2000
Introduccin a la Biotecnologa
CEDAF
Centro para el Desarrollo Agropecuario y Forestal, Inc. (CEDAF), Santo Domingo, Repblica Dominicana. Octubre del 2000.
Derechos exclusivos de edicin en castellano reservados para todo el mundo: CEDAF. Calle Jos Amado Soler No. 50, Ensanche
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Hecho el depsito que prev la ley 418. Impreso en la Repblica Dominicana.
Cita correcta:
William M. Roca, Hernando Ramrez. 2000. Introduccin a la Biotecnologa Vegetal. Coordinador de la Produccin de
Documentos Originales: Vicente Zapata S., Ed. D., Cali , Colombia. 174p.
Palabras Claves:
1. Biotecnologa 2.Cultivo de Tejido 3. Marcadores Moleculares 4. Gentica de Plantas 5. Perspectivas Futuras.
ISBN: 99934-821-4-5
Octubre del 2000

Santo Domingo, Repblica Dominicana
William M. Roca / Hernando Ramrez
CEDAF
Tabla de Contenido
Presentacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i
Agradecimiento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ii
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii
Autoevaluacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Autoevaluacin - Informacin de retorno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vi
Objetivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii
Estructura General. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii
Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix
Seccin 1 Una Introduccin a la Biotecnologa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Estructura de la Seccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Preguntas Orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1 Qu es la Biotecnologa? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2 Breve Historia de la Biotecnologa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3 La Nueva Biotecnologa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.4 Ejercicio 1.1 Introduccin a la Biotecnologa Vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Originales para Transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Seccin 2 Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

Estructura de la Seccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Preguntas Orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.1 Fundamentos del Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2 Aplicaciones del Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3 Ejercicio 2.1El Cultivo De Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
CEDAF
Seccin 3 Tecnologa del DNA Recombinante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.1 Qu es la Ingeniera Gentica? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.2 Aspectos Fundamentales y Tecnolgicos de la Ingeniera Gentica . . . . . . . . . . . . . 47
3.3 Aislamiento de genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.4 Secuenciacin del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.5 Ejercicio 3.1 Tecnologa del DNA recombinante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Seccin 4 Marcadores Moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.1 El genoma y la variabilidad gentica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.2 Los marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.3 Breve resea de algunos marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.4 Ejercicio 4.1 Marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
CEDAF
Seccin 5 Transformacin Gentica de Plantas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.1 Porqu transformar plantas? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.2 Un vector natural para introducir genes forneos a las plantas . . . . . . . . . . . . . . . . 95
5.3 Transformacin gentica de plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens . . . . . . . . 98
5.4 Transformacin por introduccin directa de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
5.5 Logros de la ingeniera gentica de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
5.6 Ejercicio 5.1 Transformacin gentica de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
Seccin 6 Perspectivas Futuras de la Biotecnologa Vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

Estructura de la Seccin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Preguntas orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
6.1 Relaciones institucionales y la biotecnologa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
6.2 Costo - beneficio de la biotecnologa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
6.3 Propiedad intelectual y comercializacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
6.4 Produccin de alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
6.5 Ejercicio 6.1 Perspectivas futuras de la Biotecnologa Vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . 125
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
Originales para trasparencias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
CEDAF
Anexos
Anexo 1. Evaluacin final de conocimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
Anexo 2. Evaluacin final de conocimientos - Informacin de retorno . . . . . . . . . . . . . 138
Anexo 3. Evaluacin del evento de capacitacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
Anexo 4. Evaluacin del desempeo del instructor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
Anexo 5. Evaluacin de los materiales de capacitacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
Anexo 6. La Biotecnologa Vegetal en la Repblica Dominicana. . . . . . . . . . . . . . . . . 146
Anexo 7. Glosario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149
CEDAF
Pr e s ent aci n
Numerosos diagnsticos aseveran un grave deterioro de la base de recursos naturales de la Repblica Dominicana. Estos estudios indican que la cobertura forestal, de cuestionable calidad y uniformidad, no pasa
del 12 por ciento y que una parte importante de los 2.8 millones de hectreas con aptitud forestal en el pas
han sido y estn siendo utilizadas inadecuadamente. Al igual que en la mayora de los pases tropicales, el
mal manejo de los suelos y de los sistemas de cultivo ha resultado en una acentuada perdida de su fertilidad, estructura y materia orgnica; as como en erosin y contaminacin. El resultado ha sido una disminucin de la productividad agrcola y un incremento significativo en los costos de produccin.
Se han logrado avances significativos en las regiones tropicales en el desarrollo de tecnologas adecuadas
para mejorar la productividad agropecuaria en sistemas sostenibles. Sin embargo, estos resultados raras
veces llegan al campo, debido principalmente a deficiencias en el entendimiento de las relaciones entre
los componentes de los sistemas agrcolas tropicales por aquellos que dirigen el sector, incluyendo profesionales agropecuarios y extensionistas. En el orden institucional, se observan organismos del sector pblico dbiles y con duplicidad de funciones, con escasos recursos para atender problemas que sobrepasan
sus capacidades. Ms an, faltan liderazgos institucionales que coordinen la formulacin e implementacin de las polticas.
Quizs, el mayor de todos los problemas que enfrenta la sociedad dominicana es la falta de entendimiento
de la profundidad y complejidad de problemas relacionados con el deterioro de los recursos naturales del
pas. Ese entendimiento podra variar si cientficos, administradores, profesionales y lderes tuvieran la
oportunidad de discutir, informar y persuadir a la comunidad en general acerca de la necesidad de enfrentar los problemas ambientales en general y en particular aquellos relacionados a la sostenibilidad de los
recursos naturales y la agricultura. Brindar esa oportunidad es precisamente lo que pretende el Proyecto
gora.
El Proyecto gora es, en esencia, un cambio del enfoque tradicional de un proyecto piloto para promover
cambios sistemticos. El mismo propone un atajo: agricultores claves, lderes y tomadores de decisiones
en los sistemas alimentario y agropecuario, expertos, polticos, periodistas y ONG son convocados y apoyados tcnicamente, para que lleguen a un entendimiento de consenso en temas claves relacionados al
manejo de los recursos naturales, la sostenibilidad de la agricultura y el combate de la pobreza rural. Basado en ese entendimiento, ellos guiarn o dirigirn sus propias instituciones o negocios para que sean ms
compromisarios a las necesidades de un mejoramiento sostenible de la calidad de vida de los pobladores
rurales. El componente Actualizacin Profesional de gora busca dotar al profesional dominicano de conocimientos actualizados sobre aspectos conceptuales de desarrollo reciente y sobre tecnologas de punta
de uso potencial en el pas. Por esta razn se han elaborado los documentos de capacitacin que ponemos
a disposicin del pas.
Altagracia Rivera de Castillo
Directora Ejecutiva del CEDAF
CEDAF
Ag r a d e c i mi ent os
La estrategia para la elaboracin de los documentos de la Serie Proyecto gora ha sido muy interesante y
ardua. Despus de muchos meses identificando autores dominicanos para la elaboracin de los documentos, nos dimos cuenta que no disponan de tiempo para escribirlos. De ah vino la idea de Vicente Zapata,
Gerente de La Organizacin que Aprende de Colombia, de contratar especialistas colombianos para elaborar los documentos y a expertos dominicanos que colaboraran con stos en el suministro de informaciones y datos dominicanos as como en la revisin de los contenidos. Por eso debemos agradecer al Dr.
Vicente Zapata por la idea, por disear la metodologa para la elaboracin de los documentos y por la coordinacin general de los trabajos. De la misma manera debemos reconocer y agradecer el esfuerzo de
los autores William M. Roca, del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), y Hernando Ramrez, de la Universidad Nacional de Colombia.
En diferentes momentos varios especialistas dominicanos aportaron sus ideas y recomendaciones sobre
el documento. Entre ellos debemos agradecer a Rafael Ortiz Quezada de la Universidad Nacional Pedro
Henrquez Urea (UNPHU), a Rafael Prez Duverg del CEDAF, y a Bienvenido Cabral del Instituto Superior de Agricultura (ISA) por sus aportes iniciales y sugerencias en la estructura del documento. Agradecemos adems a Bernarda Castillo, del Centro de Biotecnologa Vegetal de la Secretara de Estado de
Agricultura y Expedito Dilon, del Jardn Botnico Nacional, por su participacin y sugerencias en las
etapas avanzadas de edicin.
Todo el personal del CEDAF ha participado de alguna forma en la elaboracin, revisin, digitacin e impresin de los documentos que ha originado el Proyecto gora. A todos ellos muchas gracias por su dedicacin y cooperacin.
Finalmente, queremos agradecer a todas las personas, incluyendo a profesores y tcnicos que ofrecieron
sus sugerencias sobre los documentos durante los talleres y reuniones que para esos fines se celebraron
durante los casi dos aos de trabajo que dur el proceso completo de elaboracin y edicin de los documentos.
Gracias a todos.
Tefilo Suriel E.
Coordinador Proyecto gora
ii
CEDAF
I n troducci n
La agricultura moderna se basa en la utilizacin de variedades mejoradas (generalmente hbridos) en
combinacin con paquetes tecnolgicos de produccin agrcola, como fertilizacin, proteccin de plantas
y tcnicas de riego y cosecha. Esta alta tecnologa agrcola ha tenido gran xito, especialmente en los pases desarrollados. Sin embargo, an se presentan altas prdidas en los cultivos, debido principalmente al
ataque de enfermedades y plagas y por estreses abiticos, como salinidad, acidez y toxicidad por metales
pesados. Estos problemas son la principal causa del aumento en el uso de los agroqumicos, lo cual ha
contribuido al incremento no slo del costo de la produccin agrcola sino tambin al deterioro del medio
ambiente.
Mientras tanto, aumenta la demanda de alimentos, especialmente en los pases en desarrollo, que tienen
una alta tasa de crecimiento poblacional, por lo cual se requiere con urgencia incrementar la productividad agrcola.
Para lograr este objetivo se precisa la obtencin de variedades mejoradas con menor requerimiento de insumos, reduciendo significativamente los costos de produccin y el dao ambiental.
En aproximadamente 25 aos los avances en biologa molecular y celular se han traducido en una tecnologa emergente (la biotecnologa) que encuentra aplicacin en diversos sectores de la actividad humana.
La salud humana, la agroalimentacin, la produccin de energa y la proteccin del medio ambiente son
los sectores ms importantes que utilizan la biotecnologa. Hasta el presente la biotecnologa aplicada a la
salud humana ha tenido el desarrollo ms rpido. Unos cuarenta medicamentos y vacunas se han aprobado y ms de cien estn en fase avanzada de estudio y/o pendientes para su aprobacin. Gracias a la biotecnologa, disponemos o estn a punto de comercializarse productos teraputicos para tratar deficiencias
de la sangre, enfermedades autoinmunes, cardiovasculares, inflamatorias, algunos tipos de cncer, o para
combatir agentes infecciosos como el virus de la hepatitis B, el HIV, o el virus del papiloma.
En el mbito de la agricultura, la produccin de semillas resistentes a plagas, a herbicidas, o que mejoran
la calidad del fruto ya son realidad. Las ventajas de estas nuevas variedades son evidentes para los sectores productivos, incluyendo, en algunos casos, al consumidor.
Ser preciso que los consumidores tengan la informacin necesaria para poder elegir basados en la calidad y/o el precio y la seguridad de los productos.
El desarrollo de la biotecnologa est en sus inicios y el crecimiento previsto para la primera dcada del siglo XXI significar duplicar el valor de sus ventas cada cinco aos. Se prev un aumento significativo de
las aplicaciones en la agricultura, ya que se estima un crecimiento anual cercano al 20%. Es evidente que
si no es posible aumentar el rea de la tierra cultivable, y la poblacin de los pases en desarrollo crece al
ritmo actual, la agrobiotecnologa se constituye en una solucin para producir los alimentos que necesitar la humanidad en el futuro prximo.
iii
CEDAF
La biotecnologa vegetal comprende una serie de tcnicas que incluyen:

a. Las tcnicas de cultivo de clulas y tejidos in vitro, muy utilizadas para la clonacin de plantas y la
transformacin gentica;
b. Las tcnicas de DNA recombinante, que permiten hacer las construcciones genticas para la
transformacin de plantas;
c. Los marcadores moleculares que permiten "marcar" los genes de inters; para la construccin de
mapas genticos y para estudios de caracterizacin y filogenticos.
El objetivo de este mdulo, Introduccin a la Biotecnologa Vegetal, es presentar a los participantes, en
forma clara y amena los principios bsicos de la Biotecnologa Vegetal y su aplicacin en la obtencin de
materiales mejorados.
Este mdulo ha sido concebido de tal forma que el participante, al finalizar su lectura, no slo tendr un
concepto actualizado de la biotecnologa vegetal, sino que tendr nuevos elementos de juicio para ser utilizados en el desarrollo agrcola.
iv
CEDAF
A u toeval uaci n
1.
Elabore una definicin de lo que usted considera es biotecnologa.
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2.
Por qu cree usted que la cerveza, el vino el queso y el pan son productos biotecnolgicos?
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3.
Defina qu es el cultivo de tejidos vegetales
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4.
Qu aplicacin prctica le vera usted a esta tcnica?
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5.
Qu conoce usted de la ingeniera gentica?
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6.
Qu es un gen?
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7.
Qu es un genoma?
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8.
Qu entiende por marcador molecular?
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9.
Qu son plantas transgnicas?
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10.
Usted cree que es posible introducir un gen de una bacteria a una planta? Explique.
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11.
Qu entiende usted por bioseguridad en biotecnologa?
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12.
Usted considera que el consumo de cultivos transgnicos representan un peligro para la salud humana?
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CEDAF
Au to e v a l uaci n - I nf ormaci n d e R e to r n o
Respuestas
Para la pregunta 1
Biotecnologa es la aplicacin de principios cientficos y de ingeniera para el procesamiento de materiales por medio de
agentes biolgicos con el objetivo de producir bienes y servicios, en donde los agentes biolgicos se refieren principalmente a microorganismos, celulares de animales y plantas, enzimas, material gentico aislado y clonado.
Para la pregunta 2
La cerveza, porque se obtiene por un proceso de fermentacin.
El queso: es un producto obtenido por un proceso enzimtico.
El vino: Se obtiene por un proceso de fermentacin.
El pan : en su elaboracin interviene un proceso de fermentacin.
Para la pregunta 3
El cultivo de tejidos vegetales es una tcnica que consiste en aislar una porcin de una planta (tejido, rgano o clula), llamado explante, para cultivarlo en un medio nutritivo en condiciones fsicas y qumicas artificiales, para regenerar una planta completa.
Para la pregunta 4
El cultivo de tejidos vegetales puede ser til para la recuperacin de cultivos que estn en va de extincin, o para la propagacin masiva de plantas ornamentales, como el caso de rosas, orqudeas, etc.
Para la pregunta 5
La Ingeniera gentica es un conjunto de tcnicas que permiten la manipulacin del DNA y del RNA. Gracias a la Ingeniera gentica se pueden aislar y modificar genes que luego son utilizados para producir animales y plantas transgnicas.
Para la pregunta 6
Un gen es un pequeo segmento de DNA que contiene informacin para una caracterstica gentica. Unidad bsica de la
herencia.
Para la pregunta 7
Genoma es el contenido gentico total de un organismo. En las plantas el genoma est constituido por el contenido gentico
del DNA mitocondrial, del cloroplasto y del DNA nuclear.
Para la pregunta 8
Un marcador molecular es un segmento especfico de DNA que est ligado a una caracterstica gentica y se utiliza para el
monitoreo de esta caracterstica en un programa de mejoramiento.
Para la pregunta 9
Las plantas transgnicas son plantas a las que se les ha introducido un gen "extrao", el cual les confiere ciertas ventajas sobre las que no lo tienen, como por ejemplo, resistencia a una enfermedad, plaga, herbicida, o el aumento en la produccin
de un producto de uso comercial.
Para la pregunta 10
S es posible. Algunos genes que confieren resistencia al ataque de insectos en las plantas son aislados de bacterias. El
caso ms conocido es el de los genes de Bt, que confieren resistencia a algunos insectos lepidpteros.
Para la pregunta 11
La Bioseguridad consiste de polticas y mecanismos que se establecen para prevenir posibles riesgos de la tecnologa del
DNA recombinante en la salud, el medio ambiente y la biodiversidad.
Para la pregunta 12
No. En una planta transgnica slo se introduce uno o pocos genes cuyos productos han sido cuidadosamente evaluados
antes de ser introducidos a las plantas para descartar cualquier riesgo en la salud, el medio ambiente y la biodiversidad.
Mientras que en el mejoramiento tradicional se introducen muchos genes, de los que se desconocen sus productos y su posible riesgo para la salud, medio ambiente y biodiversidad.
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CEDAF
O b jet i vos
Presentar a los participantes los principios bsicos de la biotecnologa vegetal en la obtencin de
materiales mejorados.
S e cci n 1
Conocer los conceptos bsicos de la biotecnologa en general.
Conocer algunas etapas de su desarrollo.
Diferenciar algunos tipos de biotecnologas.
S e cci n 2
Entender los principios bsicos de las tcnicas de cultivo de tejidos vegetales.
Conocer algunas aplicaciones de estas tcnicas.
S e cci n 3
Conocer los fundamentos de la tecnologa del DNA recombinante.
Describir las herramientas ms importantes de esta tecnologa.
Conocer algunas de sus aplicaciones.
S e cci n 4
Entender los principios bsicos de los marcadores moleculares.
Conocer algunas de sus aplicaciones en el mejoramiento vegetal.
S e cci n 5
Conocer los fundamentos de la transformacin gentica de plantas.
Conocer los dos mtodos ms utilizados para transformar plantas.
Conocer algunas aplicaciones de esta tecnologa.
S e cci n 6
Entender los conceptos de bioseguridad, propiedad intelectual y patentes.
Conocer algunos factores que se consideran podran ser causa de riesgo por la introduccin de
cultivos transgnicos al campo.
Entender por qu los cultivos transgnicos son seguros.
vii
CEDAF
Est r u c tura general
Marc ado re s y Mapas

Mo le c ulare s
Ca ra cte riza cin de la biodive rs ida d

Ide ntifica cin de ge ne s tile s
Ma pe o de ca ra cte re s comple jos (QTLs )
Clona cin y modifica cin

de ge ne s
Ing e nie ra Ge n tic a
Introduccin y e xpre s in
de ge ne s
Marc ado re s y Mapas Mo le c ular

Cultivo de Te jido s y Trans fo rmac i n
Ge n tic a
P la nta s Tra ns g nica s
Marc ado re s
Mo le c ulare s
Cruzamie nto s
Me jo ramie nto
Multiplic ac i n
Cultivo de
Te jido s
Ens ayo s de Evaluac i n
Explicacin
Este flujograma muestra la interaccin de las diferentes metodologas de la Biotecnologa Vegetal (marcadores moleculares, ingeniera gentica o DNA recombinante, la tcnica de cultivo de tejidos y la transformacin gentica de plantas), que en forma lgica permiten la obtencin de un cultivo transgnico,
desde la caracterizacin del germoplasma para la bsqueda de genes tiles, hasta la introduccin de estos
genes a los cultivos, que luego son sometidos a todo un proceso de valuacin antes de ser comercializados.
viii
CEDAF
Ori gi na l e s pa r a t r a n sp a r e nc i a s
ix
Ingeniera Gentica
Marcadores y Mapas
Moleculares
Ensayos de Evaluacin
Multiplicacin
Cultivo de
Tejidos
Marcadores y Mapas Molecular

Cultivo de Tejidos y Transformacin
Gentica
Plantas Transgnicas
Mejoramiento
Introduccin y expresin
de genes
Clonacin y modificacin
de genes
Caracterizacin de la biodiversidad
Identificacin de genes tiles
Mapeo de caracteres complejos (QTLs)
Marcadores
Moleculares
Cruzamientos
CEDAF
Presentar a los participantes

los principios bsicos de la
biotecnologa vegetal en la
obtencin de materiales mejorados.
Objetivo General
CEDAF
xi
xii
- Perspectivas futuras de la Biotecnologa vegetal
- Transformacin gentica de plantas
- Marcadores moleculares
- Tecnologa del DNA recombinante
- Cultivos de tejidos vegetales
- Una introduccin a la biotecnologa
Secciones
CEDAF
CEDAF
Un a In tr o d u cc i n a l a B i o t ec n o lo g a
Seccin 1
CEDAF
Seccin 1 . Una In t r odu c c i n a l a B i ot e c n ol og a

Tabla de Contenido
Estructura de la Seccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Preguntas Orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1 Qu es la Biotecnologa? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2 Breve Historia de la Biotecnologa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3 La Nueva Biotecnologa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.4 Ejercicio 1.1 Introduccin a la Biotecnologa Vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Originales para Transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
CEDAF
Estructura de la Seccin
BIOTECNOLOGA
Prime ra
Ge ne rac i n
Prc tic a e mpric a

Po c o c o no c imie nto
c ie ntfic o
S e g unda
Ge ne rac i n
Fe rme ntac i n
Be bidas
Alime nto s
Co mbus tible s
Co no c imie nto
c ie ntfic o y de
ing e nie ra
Te rc e ra
Ge ne rac i n
Fe rme ntac i n
Indus trial
Frmac o s
Alime nto s
Pro c e s amie nto
de de s e c ho s
T cnica s de
Fe rme nta cin y
bioproce s os
Cultivo in vitro
de c lula s y
te jidos
DNA
re combina nte y
tra ns forma cin
ge n tica
Objetivos
Conocer los conceptos bsicos de la biotecnologa en general.
Preguntas Orientadoras
1. Algn participante nos puede explicar que es biotecnologa?
2. Algn participante puede dar ejemplos de productos biotecnolgicos?
3 Saban ustedes que el queso, el pan la cerveza son productos biotecnolgicos?
1 .1 Q u es l a B i ot ecnol og a ?
La biotecnologa se puede definir como: "la aplicacin de principios cientficos y de ingeniera para
el procesamiento de materiales por medio de agentes biolgicos con el objetivo de producir bienes y
servicios, en donde los agentes biolgicos se refieren principalmente a microorganismos, clulas de
animales y plantas, enzimas, y material gentico
aislado y clonado" (Sasson, 1989).
El concepto de biotecnologa fue ampliado a partir
de 1970, cuando se inician las tecnologas que permiten la manipulacin de la molcula del DNA,
dando origen a la ingeniera gentica y con ella
nace la "nueva biotecnologa".
La biotecnologa comprende un conjunto de tcnicas aplicables a diversas actividades de la sociedad, cuya base fundamental es multidisciplinaria,
con disciplinas bsicas como la biologa celular,
la biologa molecular, la bioqumica, la gentica,
la microbiologa, la inmunologa, la ingeniera
qumica y la ingeniera de procesos.
1 .2 Bre v e H i s t or i a de l a B i ot e c n o l o g a
Histricamente el desarrollo de la Biotecnologa
puede ser dividido en tres generaciones o etapas:
La biotecnologa de primera generacin se bas en
la fermentacin como proceso bsico para la produccin de bebidas, alimentos y combustibles.
Esta prctica era esencialmente emprica, se haca
en pequea escala, y estaba caracterizada por el
mnimo conocimiento cientfico y de ingeniera.
La biotecnologa de segunda generacin se caracteriz por la utilizacin de los conocimientos cientficos y de ingeniera para la obtencin de
procesos a escala industrial. Estos procesos estaban basados en la aplicacin integrada de la microbiologa (usando procesos de mutacin y de
4
CEDAF
seleccin), bioqumica e ingeniera qumica. Esta

segunda generacin incluye: la utilizacin de fermentaciones (bioconversiones y biocatlisis) para
la produccin de frmacos, combustibles, alimentos y procesamiento de desechos. En esta segunda
fase tambin se incluye el desarrollo de algunas
tcnicas recientes, como las de inmovilizacin de
enzimas y las de cultivo de tejidos vegetales y
animales.
La biotecnologa de tercera generacin, tambin
denominada "Nueva Biotecnologa" surge a comienzos de 1970 y se inicia con el descubrimiento
de la tecnologa del DNA recombinante. Esta generacin se basa en la biologa molecular, la cual
tuvo un acelerado desarrollo despus del descubrimiento de la estructura del DNA en 1953. Este
evento y el posterior descubrimiento de las enzimas de restriccin dieron origen a la ingeniera gentica y con esta nace la nueva biotecnologa.
Estas nuevas tecnologas dieron origen a empresas
biotecnolgicas, que explotan las tcnicas de ingeniera gentica para "cortar" y "confeccionar" los
genes que son colocados en microorganismos,
como bacterias o levaduras, para que "fabriquen
por encargo" productos qumicos y farmacuticos
de inters.
1.3 La Nueva Biotecnologa
Los inicios de la biotecnologa se caracterizan por
un lento progreso de los conocimientos. La rpida
expansin lleg con el descubrimiento de la estructura del DNA. La comercializacin de muchos de estos descubrimientos ha abierto un
mercado de gran envergadura, que incluye no slo
la medicina y la gentica, sino tambin, la industria alimentaria, la agrcola, la zootecnia y especialmente la farmacutica, con un aumento de la
propiedad intelectual.
CEDAF
Los eventos ms importantes del desarrollo de la

biotecnologa incluye:
> 1 944
A ve ry, Mc Ca rty y Mc L e od demuest r an que el
D NA pue de tra ns fe rir una car act er st i ca he r e dita ria de una c e pa ba c te ri ana a ot r a.
> 1 948
B e a dle y T a tun e s ta ble c e n q ue el papel de l os
g e ne s e s e s pe c ific a r la informaci n necesar i a
p a ra la produc c in de prote nas.
> 1 951
W ilkins y F ra nklin obtie ne n l as pr i mer as i m g e ne s de un c ris ta l de DNA .
> 1 952
H e rs he y y Cha s e c onfirm a n que el D N A es el
ma te ria l ge n tic o.
> 1 953
W a ts on y Cric k e s ta ble c e n l a est r uct ur a de l a
d oble h lic e , proponie ndo un model o t r i di me nc iona l e n e l que la s c ua t r o bases del D N A
se a c opla n e ntre s , s iguie nd o r egl as muy pr ecisas.
> 1 957
K ornbe rg ide ntific a la DNA pol i mer asa, enzi ma que pe rm ite la duplic a c in de l a dobl e hl ic e de l DNA.
> 1 958
S t e wa rd logra la re ge ne ra ci n de una pl ant a
c o m ple ta a pa rtir de c lul as somt i cas del
f loe m a de la z a na horia , m edi ant e l a embr i o g ne s is s om tic a .
> 1 961
Ja c ob y Monod propone n un model o de r egul a c in de los ge ne s ba s a d o en l a act i vi dad
i nhibidora de c ie rta s prote nas.
> 1 966
K hora na y Nire nbe rg de s ci f r an el l enguaj e
d e l c digo ge n tic o: la le ct ur a del D N A se
p roduc e e n grupos de tre s b ases ( t r i pl et as) .
> 1 970
K hora na s inte tiz a de form a qu mi ca el pr i mer
g e n.
> 1970
Smi t h y Wi l cox descubr en las enzimas de res t r i cci n.
> 1973 -1974

B er g pr oduce l a pr i mer a molcula de DNA recombi nant e ( un pl smi do) mediante el corte y
post er i or uni n de dos f r a gmentos distintos
de D N A .
> 1975
Sanger , Maxam y G i l ber t desarrollan tcnicas
par a l a secuenci aci n del DNA.
> 1975
En A si l omar , C al i f or ni a, s e realiza la primer a conf er enci a sobr e l a bi oseguridad en el uso
del D N A r ecombi nant e y l os organismos ge nt i cament e mani pul ados.
> 1977
Se descubr e que no t odo el DNA de un gen
si r ve par a l a s nt esi s de una protena, la cual
ocur r e sl o en l os "exones", es decir, las part es que son t r anscr i t as en el RNA mensajero.
Los "i nt r ones" son el i mi nados del RNA.
> 1978
La compa a G enet ech ( EE. UU. ) utiliza bact er i as par a l a pr oducci n de insulina humana
r ecombi nat e, que se comer cializa cuatro aos
despus.
1982
Pal mi t er y B r i nst er cr ean el primer animal
t r ansgni co, i nt r oduci endo la hormona de
cr eci mi ent o de r at a en un r atn.
> 1982
La compa a C al gene ( EE.UU. ) clona el gen
r esponsabl e de l a r esi st encia a un herbicida.
> 1982
V anMont agu y Schel l pr o ducen la primera
pl ant a t r ansgni ca ( t abaco) usando el plsmido Ti del A gr obact er i um t u mefaciens.
> 1983
Mul l i s pone a punt o l a t cnica de la reaccin
en cadena de l a pol i mer asa (PCR), que permi t e ampl i f i car ( mul t i pl i car) secuencias de
DNA.
> 1984
S a n f o r d logra tra ns form a r te jidos de pl ant as
m e d i a n t e e l bom ba rde o de pa rtcul as ( bi ol stic a ).
> 1985
J e ffre y s de s c ubre que e l DNA de cada i ndi vi d u o p roduc e fra gm e ntos c a ra ct er st i cos al
s e r t ra ta dos c on e nz im a s de re s tr i cci n. Por
lo ta n t o s irve n c om o " hue lla s da ct i l ar es" mole c u l a re s .
> 1985
S e a p r u eba e l pa te nta m ie nto de pl ant as t r ans g n ic a s e n E E . UU.
> 1986
T a n k s le y c re a los prim e ros m a pas gent i cos
m o l e c u l a re s us a ndo RF L P s .
> 1987
L a c o mpa a Ce tus Corpora tion ( EE. U U .)
a u t o m a t iz a la t c nic a de l P CR.
> 1988
S e p a te nta ofic ia lm e nte e n E E .UU . el pr i mer
a n i m a l tra ns g nic o, e l " onc ora t n".
> 1988
S e i n i c ia e l proye c to de l " Ge noma H umano",
c o n e l f in de ide ntific a r todos lo s genes que
c o n fo r m a n e l DNA de l hom bre .
> 1990
W i llia m s de s a rrolla la t c nic a de R A PD par a
la m a rc a c in y m a pe o de ge ne s .
> 1991
S e a n a liz a n
los c om pone nte s gent i cos
(QT L s ) re s pons a ble s de c a ra c te r st i cas comp l e ja s u s a ndo m a rc a dore s m ole cul ar es.
> 1993
S e d e sa rrolla la biote c nologa de bi or r eact o re s p a ra e l c ultivo de c lula s y te ji dos veget a le s d e f orm a m a s iva .
CEDAF
> 1995
Se desar r ol l an l os pr i mer os sec uenciadores
aut omat i zados de D N A .
> 1996
N ace l a ovej a "D ol l y", l a pr i mera oveja clo nada: el ncl eo de una cl ul a somtica de una
ovej a adul t a donant e f ue i nt r od ucido en un
vul o enucl eado.
> 1996
Se si embr an l os pr i mer os cul t i vo s comercial es de pl ant as t r ansgni cas ( EE.UU. ): 3 mi l l ones de hect r eas.
> 1998
La si embr a de cul t i vos t r ansgnicos comerci al es cubr en 30 mi l l ones de hectreas, prin ci pal ment e en EE.U U ., C anad, Argentina,
C hi na y Mexi co.
> 1998
Se f abr i can si st emas aut omat i zad os (robots)
par a l a ext r acci n, di st r i bucci n y plaqueo de
muest r as de D N A y ot r as act i vi da des de biolog a mol ecul ar .
> 1998
Se pr oducen l os l l amados "chi ps" de DNA:
mat r i ces di mi nut as de pl st i co para fijar gran
numer o de muest r as de D N A par a el tamizado
y/ o l ect ur a masi va de expr esi n de genes.
> 1999
Se i ni ci a l a "nanobi ot ecnol og a" (miniaturi zaci n del anl i si s, det ecci n y separacin
de mat er i al gent i co de maner a masiva).
> 1999
Se da i mpul so a l a bi oi nf or mt i ca: la obten ci n , acumul aci n, anl i si s, co mparacin e
i dent i f i caci n de dat os mol ecul ares / genti cos que son ut i l i zados par a l a i d entificacin
de nuevas secuenci as y genes.
> 1994
L a c o mpa a Ca lge ne re c ibe la apr obaci n
p a r a c o m e rc ia liz a r tom a te s tra n sgni cos de
m a d u ra c in re ta rda da .
CEDAF
Un aspecto importante de la nueva biotecnologa

es que es extensiva en el uso del conocimiento
cientfico. En el perodo anterior a Pasteur, la biotecnologa se limitaba a la aplicacin de una experiencia prctica que se transmita de generacin en
generacin. Con Pasteur, el conocimiento cientfico de las caractersticas de los microorganismos
comienza a orientar su utilizacin prctica, pero las
aplicaciones industriales se mantienen fundamentalmente como artesanales, con la excepcin de
unas pocas reas en la industria qumica y farmacutica (como los antibiticos), en las cuales se inicia la actividad de investigacin y desarrollo en el
seno de la corporacin transnacional. En todos estos casos, la innovacin biotecnolgica surgi en el
sector productivo; en cambio, los desarrollos de la
nueva biotecnologa se originan en los centros de
investigacin, generalmente localizados en el seno
de las universidades.
Las nuevas biotecnologas pueden agruparse en
tres categoras bsicas:
1. Tcnicas para el cultivo in vitro de clulas y tejidos,
incluyendo el cultivo de microorganismos.
2. Tcnicas de fermentacin y bioprocesos, incluyendo
tcnicas de inmovilizacin de enzimas.
3. Tcnicas para la identificacin, mapeo, clonacin,
manipulacin y transferencia de genes.
An cuando los tres grupos se complementan entre s, existe una diferencia fundamental entre los
dos primeros y el tercero. Los primeros se basan
en el conocimiento de las caractersticas y comportamiento de las clulas y microorganismos y en el
uso deliberado de estas caractersticas (de cada organismo en particular), para el logro de objetivos
especficos en materia de nuevos productos y procesos. Mientras que el tercer grupo se caracteriza
por su potencialidad para manipular la gentica y
las caractersticas estructurales y funcionales de
los organismos y de la aplicacin prctica de esta
capacidad para superar ciertos lmites naturales

para el desarrollo de nuevos productos o procesos.
Entre los eventos claves de la nueva biotecnologa
que permitieron el desarrollo de la biotecnologa
vegetal se incluyen:
a. La regeneracin de plantas completas a partir de partes de plantas (explante), cultivadas in vitro;
b. Tcnicas para identificar y mapear genes y para detectar diferencias entre individuos comparando directamente sus genomas ;
c. Tcnicas para aislar, modificar y clonar genes;
d. Tcnicas que permiten la transferencia de estos genes a plantas. Estas metodologas sern explicadas
ms adelante.
Las aplicaciones a corto plazo de la nueva biotecnologa en la agricultura incluyen: el manejo y

conservacin de recursos genticos; la propagacin masiva de plantas; los mtodos para deteccin de plagas y enfermedades y la construccin
de mapas moleculares para agilizar los programas
de mejoramiento tanto animal como vegetal; la introduccin y expresin de genes para obtener resistencia a insectos; patgenos, herbicidas; o para
el mejoramiento de la calidad de protenas, carbohidratos y aceites o grasas.
A largo plazo: la manipulacin de caracteres complejos, lo cual requiere de un previo entendimiento
de los mecanismos bioqumicos y genticos de las
caractersticas polignicas de inters.
Por esta razn, las actuales investigaciones en biotecnologa vegetal estn encaminadas al aislamiento y caracterizacin de genes de importancia
econmica, sobre todo de secuencias reguladoras,
tales como: floracin, fotosntesis, fijacin biolgica de nitrgeno, etc. Mientras tanto, las aplicaciones ms importantes incluyen:
a. El uso de mapas genticos y marcadores moleculares para la identificacin de genes de resistencia a
plagas y enfermedades;
7
b. Transferencia de caracteres de inters de especies

silvestres a cultivadas mediante cruces interespecficos o distantes;
c. Produccin de plantas transgnicas usando genes
simples de resistencia a virus, insectos y herbicidas,
de calidad de protena de semillas, contenido de almidn y para retardar la maduracin del fruto;
d. Utilizacin de marcadores moleculares para el estudio de la diversidad gentica de plantas, animales y
microorganismos. La Tabla 1.1 presenta algunas
aplicaciones de la nueva biotecnologa en la produccin vegetal.
Un paso crucial para la aplicacin de la biotecnologa en la solucin de problemas de la agricultura

es la identificacin de problemas recalcitrantes a
una solucin por mtodos convencionales, seguido de un anlisis de costo/beneficio de la aplicacin biotecnolgica.
La biotecnologa tradicional y la nueva biotecnologa ofrecen tambin una amplia aplicacin no slo
en la industria alimenticia y farmacutica, sino
tambin en muchos procesos industriales (Tabla
1.2).
CEDAF
Tabla 1.2 Aplicaciones de la biotecnologa en el sector
industrial. Fuente: Bull et al. 1982.
Qumica
Orgnica
Perfumes
Polmeros (principalmente polisacridos)
Inorgnica
Farmacutica
Esteroides
Vacunas
Energa
Produccin de:
Etanol (gasohol)
Metanol (biogas)
Alimentos
Produccin de :
Lcteos, productos de pescado y de
carne
Bebidas (alcohlicas, t y caf)
Levadura para panadera
Aditivos para alimentos (antioxidantes,
colorantes, saborizantes, estabilizadores)
Produccin de championes
Aminocidos, vitaminas
Produccin de almidn
Glucosa y jarabe de alta fructosa
Modificaciones funcionales de protenas,
Pectinas
Remocin de toxinas.
Agricultura
Produccin de:
Alimentos para animales
Vacunas para animales
Ensilaje y procesos de descomposicin
Pesticidas microbianos
Control biolgico
Biopesticidas
Rhizobium y otros inoculantes

bacteriolgicos para la fijacin de
nitrgeno
Biofertilizantes
Bioconversin
Produccin de:
Inhibidores de enzimas
Mejoramiento gentico
Cruzamientos distantes
Haploida
Mapas y marcadores moleculares
Transformacin gentica
2. En el Manejo (Reciclaje) de Productos Agrcolas
Bioacumulacin y Lixiviacin
AntibiticosAgentes para diagnstico

(enzimas, anticuerpos)
1. En la Produccin Vegetal:
Agroindustria
Propagacin masiva
Control de calidad
Valor agregado
Etanol, Acetona, Butanol, Acidos

orgnicos
Enzimas
Tabla 1.1 Aplicaciones de la nueva biotecnologa.

Fuente: Roca, W. 1986.
Recursos genticos
Conservacin
Caracterizacin
Utilizacin
Produccin de:
Inoculantes de micorrizas
Servicios
Industriales
Purificacin de agua
Tratamiento de afluentes
Manejo de desechos
Recuperacin de aceites
3. En la Proteccin del Ambiente (Aguas y Suelos)

Biorremediacin
CEDAF
1 .4 E j er ci ci o 1. 1 I nt r odu c c i n a l a
B i ot ecnol og a V eget a l
Objetivos
Elaborar el concepto de biotecnologa y sus
aplicaciones.
Diferenciar productos biotecnolgicos de uso
cotidiano.
Orientaciones para el Instructor
Con el siguiente ejercicio se busca reafirmar el
concepto de Biotecnologa, a travs de la identificacin y clasificacin de productos elaborados mediante procesos biotecnolgicos.
dos en productos biotecnolgicos de primera, segunda y tercera generacin.

Motive una discusin con base a las respuestas
dadas al ejercicio.
Proporcione la informacin de retorno, sealando los productos de origen biotecnolgico y su
clasificacin de primera, segunda o tercera generacin.
Recursos necesarios
Papelgrafo, papel, marcadores
Cuatro mesas grandes
Un sitio de trabajo ( un saln)
Los siguientes productos: Queso, pan, cerveza,

La idea es crear un escenario donde los participanvino, papel, insulina, penicilina (antibitico), vetes puedan tener contacto directo con productos de
las (de parafina), un "tarro" de grasa, azcar, sal,
una planta de tomate, tomate (fruto), vinagre.
uso cotidiano, muchos de los cuales obtenidos por
procesos biotecnolgicos, para motivar una discu- Fotocopias de las instrucciones e informacin de
retorno para los participantes.
sin sobre su obtencin y las aplicaciones de algunos productos biotecnolgicos, muchos de los Tiempo sugerido: 60 minutos.
cuales hacen parte de nuestra vida cotidiana.
Instrucciones para el participante
Para la realizacin de este ejercicio se recomienda
De acuerdo con la informacin suministrada en la
que el Instructor lea atentamente las siguientes insSeccin 1, y mediante el reconocimiento de productrucciones:
tos de origen biotecnolgico, los participantes ten Suministrar informacin sobre los objetivos del
drn la oportunidad de desarrollar el concepto de
ejercicio.
biotecnologa.
Ubique en un saln cuatro mesas grandes. En
cada una de ellas colocar los productos mencio- Pasos a seguir:
nados en la lista de recursos.
Conformen cuatro grupos de trabajo de acuerdo
Conforme cuatro grupos de trabajo. Ubique
cada grupo en cada una de las mesas (con los
productos).
En cada grupo de trabajo, los participantes deben separar aquellos productos que ellos consideren son de origen biotecnolgico.
Hacer un listado de los productos seleccionados, argumentando por que consideran que son
productos biotecnolgicos en cada seleccin.
Luego, solicite a los participantes que clasifiquen los productos biotecnolgicos seleccionaWilliam M. Roca / Hernando Ramrez
con las instrucciones dadas por el instructor.
Nombren un relator por grupo, el cual presentar

en plenaria los resultados obtenidos por el grupo.
Realice un listado de los productos de origen biotecnolgico. Argumenten sus selecciones.
De los productos biotecnolgicos seleccionados, realizar un listado de los que corresponden
a la primera, segunda o tercera generacin. Argumenten sus selecciones.
Al finalizar, el Instructor les proporcionar la
informacin de retorno.
9
Ejercicio 1.1
CEDAF
Introduccin a la Biotecnologa Vegetal - Informacin de retorno
Producto
Clasificacin
Argumento
Queso
Biotecnologa
1ra.Generacin
Proceso enzimtico
Para elaboracin de quesos
Pan
Biotecnologa
1ra generacin
Levadura y proceso enzimtico.
Cerveza
Biotecnologa
2da generacin
Fermentacin
Vino
Biotecnologa
1ra generacin
Fermentacin
Insulina
Biotecnologa
3ra generacin
DNA recombinante
Penicilina
Biotecnologa
2da generacin
Bioprocesos
Grasa
N O
-------
Azcar
N O
-------
Sal
N O
-------
Planta de tomatetransgnica
Biotecnologa
3ra generacin
Ingeniera gentica
Fruto de tomateRetarda en madurar
Biotecnologa
3ra generacin
Ingeniera gentica
Vinagre
Biotecnologa
1ra generacin
Fermentacin
Bib lio g r af a
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10
CEDAF
Ori gi n a l e s pa r a T r a n sp a r e nc i a s
11
12
Bebidas
Alimentos
Combustibles
Fermentacin
Primera
Generacin
Frmacos
Alimentos
Procesamiento
de desechos
Fermentacin
Industrial
Segunda
Generacin
Prctica emprica
Poco conocimiento
cientfico
Tcnicas de
Fermentacin y
bioprocesos
Conocimiento
cientfico y de
ingeniera
BIOTECNOLOGA
Cultivo in vitro
de clulas y
tejidos
Tercera
Generacin
DNA
recombinante y
transformacin
gentica
CEDAF
Conocer los conceptos bsicos de la

biotecnologa en General.
Objetivos
CEDAF
13
14
(Sasson, 1989)
Material gentico aislado y clonado
Enzimas
Clulas de animales y plantas
Microorganismos
Los agentes biolgicos se refieren a:
servicios.
biolgicos para producir bienes y
de materiales por medio de agentes
y de ingeniera para el procesamiento
Es la aplicacin de principios cientficos
Qu es la Biotecnologa?
CEDAF
ingeniera.
Mnimo conocimiento cientfico y de
Se realizaba en pequea escala.
Prctica esencialmente emprica.
bebidas, alimentos y combustibles.
proceso bsico para producir:
Se bas en la fermentacin como
Biotecnologa de Primera Generacin
Biotecnologa
Desarrollo histrico de la
CEDAF
15
16
Tcnicas de inmovilizacin de enzimas

Tcnicas de cultivos de tejidos
Tambin incluye:
Utiliza bioconversiones y brocatlisis para producir frmacos, combustibles,

alimentos y procesamiento de desechos.
Se basa en la aplicacin integrada de la microbiologa, la bioqumica y la

ingeniera qumica.
Obtencin de procesos a escala industrial.
Se caracteriz por la utilizacin de los conocimientos cientficos y de ingeniera.
Biotecnologa de Segunda Generacin
Desarrollo Histrico de la Biotecnologa
CEDAF
- Se basa principalmente en la biologa Molecular y la Ingeniera gentica.

- Nacen las empresas biotecnolgicas
- Tambin llamada Nueva B iotecnologa

- Se inicia con el descubrimiento del DNA recombinante.
Biotecnologa De Tercera Generacin
Desarrollo Histrico de la Biotecnologa
CEDAF
17
18
genes.
3. Tcnicas para: Identificacin mapeo clonacin, manipulacin y transfer encia de
2. Tcnicas de fermentacin y bioprocesos y de inmovilizacin de enzimas.
1. Tcnicas de cultivo de tejidos y microorganismos
Se agrupa en tres categoras bsicas
Extensiva en el conocimiento cientfico
La nueva Biotecnologa
CEDAF
CEDAF
C u l t i v o d e T ej i d o s V e g e t a l e s
Seccin 2
19
Seccin 2 .
CEDAF
Cultiv o de Te j i dos V e ge t al e s
Tabla de Contenido
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.1 Fundamentos del Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2 Aplicaciones del Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3 Ejercicio 2.1El Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
20
CEDAF
Cultivo de Tejidos Vegetales
Contribucin al
fitomejoramiento
Micropropagacin
Cultivo de
meristemos
pices y yemas
Propagacin
masiva
Cultivo de
ovulos y
embriones
Eliminacin de
enfermedades
Cultivo de
anteras
Cultivo de
suspensin
celulares
Cruces
interespecficos
Produccin de
haploides
Produccin de protoplastos para

transformacin o hibridacin somtica
Metabolitos secundarios
Objetivos
Entender los principios bsicos de las tcnicas de cultivo de tejidos vegetales.
Conocer algunas aplicaciones de estas tcnicas.
1. Saban ustedes que a partir de una clula somtica del floema de la raz de la zanahoria se puede desarrollar
una planta completa de zanahoria?
2. Algn participante puede dar una definicin de cultivo de tejidos vegetales?
3. Saban ustedes que las flores naturales que venden en floristeras y supermercados son producidas por cultivo
in vitro?
21
In tro d u c ci n
El cultivo de tejidos vegetales es una tcnica que
consiste en aislar una porcin de una planta (tejido,
rgano o clula), llamado explante, para cultivarlo
en un medio nutritivo en condiciones fsicas y qumicas artificiales. El objetivo es conseguir que las
clulas expresen su totipotencialidad, o sea, la capacidad que tienen las clulas vegetales de regenerar una planta completa cuando son separadas del
organismo. La totipotencialidad de las clulas vegetales cultivadas in vitro fue establecida por
Steward y colaboradores en 1958, quienes describieron el desarrollo de una planta de zanahoria a
partir de clulas somticas del floema de la raz de
zanahoria. (Figura 2.1).
Cuando los explantes se cultivan en condiciones
apropiadas, es posible inducir la formacin de es-
CEDAF
tructuras organizadas y la formacin de plantas

completas. Si la formacin de la planta completa
se realiza mediante la formacin de brotes o yemas
adventicias y posterior enraizamiento de stos, se
dice que el proceso es de organognesis. Pero si la
regeneracin se obtiene a travs de estructuras semejantes a los embriones sexuales, se dice que la
va es embriognesis somtica.
Puede suceder que al cultivar in vitro un explante
vegetal no se obtengan clulas diferenciadas o estructuras organizadas, sino la proliferacin celular
para formar un tejido amorfo no diferenciado. Este
tejido recibe el nombre de callo. El callo puede ser
sometido a agitacin en un medio de cultivo lquido lo cual logra separar sus clulas constituyentes
para formar un cultivo de clulas en suspencin.
La tcnica de cultivo de tejidos puede cubrir un
amplio rango de aplicaciones, tales como:
1. Investigacin bsica sobre procesos bioqumicos y morfolgicos de la
diferenciacin celular;
2. Investigacin aplicada;
3. Desarrollo de tcnicas
para la propagacin clonal o para el mejoramiento gentico de
plantas.
Figura 2.1. Desarrollo de una planta de zanahoria a partir de clulas somticas

del floema de la raz. Fuente: Ville y Colaboradores, 1998.
22
El objetivo de este captulo es mostrar los

fundamentos bsicos
de esta metodologa
para que el participante
conozca la importancia
de esta herramienta de
la Biotecnologa Vegetal.
CEDAF
2 .1 F undam ent os del C ul t i v o d e

T ej i dos V eget al es
En el cultivo in vitro n vitro de tejidos vegetales, un
explante (clulas, tejido, rgano), se cultiva aspticamente en un medio de composicin definida y en
condiciones ambientales controladas. En la Tabla
2.1 se presenta un cronograma de los eventos cientficos y tecnolgicos ms importantes que contribuyeron al desarrollo del cultivo in vitro de clulas
y tejidos de plantas.
Tabla 2.1 Eventos cientficos y tecnolgicos claves en
la evolucin del cultivo in vitro de clulas y tejidos
vegetales. Fuente: Villalobos (1990).
1953
1955
Skoog
Descubrimiento de la cintica.
1956
Nichel
Subcultivos durante 4 aos de

suspensiones celulares.
1957
Skoog & Miller
Diferenciacin del callo en vstago

y raz.
1960
Bergmann
Cultivo y pruebas de regeneracin

de clulas aisladas.
1960
Cocking
Obtencin de protoplastos
empleando enzimas.
1962
Murashige & Skoog Medio MS.
1964
Morel
Cultivo de meristemos, eliminacin

de virus.
1964
Nitsch
Induccin de flores in vitro.
1964
Guha &
Maheshwar
Plantas haploides a partir de

anteras.
1965
Ledoux
Introduccin de DNA extrao en

clulas.
1966
Lutz
Totipotencia: uso de la clula

aislada.
1970
Backs Husemann Tcnicas de regeneracin completa

Reinert
a partir de una clula.
1970
1971
Kao et al
Pruebas de regeneracin de plantas

a partir de protoplastos.
1971
Tabeke
Regeneracin de plantas a partir de

protoplastos.
1972
Carison Et al.
Funcin de protoplastos y
regeneracin de hbridos.
1978
Melchers
Pomato. Topato.
1665
Hooke
Primera descripcin de una clula.
1674
Leeuwenhoek
Observacin de la vida celular.
1835
Von Mohl
Descripcin de la vida; protoplasta.
1838
Schilden
Conjunto celular de las plantas;

totipotencia de la clula vegetal.
1839
Schwann
Aplicacin del concepto a animales.
1846
Nageli
Clulas vegetales se forman por

divisiones de clulas existentes.
1855
Virchow
Aforismo: Omnis cellula e cellula.
1888
1902
Haberlandt
Pruebas de cultivo de clulas de

mesfilo; predicciones.
1922
Kotte
Cultivo de pices de races por

poco tiempo
1926
Went
Descubrimiento de las auxinas.
1928
Kuster
Trabajos con protoplastos obtenidos

mecnicamente.
1934
White
Cultivo de races con crecimiento

activo.
1934
Gautheret
Cultivo del cambio de rboles.
1937
White
Importancia de la vitamina B para el

crecimiento de las races.
1937
When & Thimann
Trabajos intensivos con auxinas.
1939
Gautheret
Uso de las auxinas en los cultivos;

proliferacin; potencialmente
crecimiento sin lmites.
1939
Nobecourt
Cultivo de races de zanahoria,

proliferacin de clulas.
1939
While
Subcultivos sucesivos de Nicotiana.
1942
Van Overbeek
Rescate de embriones en cruzas

interespecficas.
1949
Camus
Diferenciacin vascular.
1952
Steward
Agua de coco, embriognesis

somtica.
1953
Muir
Cultivo de suspensiones celulares;

ailslamento de clulas individuales.
1953
Tulecke
Cutivo de poln.
La formacin de plantas por medio del cultivo de

tejidos puede ocurrir como una continuacin del
crecimiento y desarrollo de estructuras organizadas, por ejemplo, meristemas apicales y axilares
del tallo; o puede ser el resultado de un proceso de
23
Para el establecimiento del cultivo in vitro de una

especie en particular se debe tener en cuenta una
serie de factores, de cuyo manejo depende el xito
del cultivo.
Cada sistema de cultivo in vitro presenta caractersticas particulares que permiten producir plantas
completas a partir de explantes. Estas caractersticas tienen que ver con: el explante, las normas de
asepsia, los medios de cultivo y las condiciones
ambientales de incubacin. La interaccin de estos
factores es lo que determina la respuesta del explante al cultivo in vitro.
CEDAF
formacin de novo, a partir de clulas donde no

exista organizacin alguna; estas clulas pueden
derivarse de los rganos vegetativos (somticos) o
de las estructuras sexuales (gamticas) de la planta.
(Figura 2.2).
La formacin de plantas de novo puede ocurrir a
travs de la diferenciacin de embriones que se inicia en clulas individuales o en grupos de clulas
(embriognesis somtica o asexual) o va diferenciacin de rganos vegetativos (organognesis)
que se inicia en grupos de clulas.
Como se mencion antes, la regeneracin de plantas in vitro depende de varios factores, siendo los
ms importantes: la variedad de la planta (genotipo), la clase de tejido a cultivar (explante), la composicin qumica del medio de cultivo (factor
qumico) y las condiciones ambientales de la incubacin (factor fsico).

Las tcnicas de cultivo de meristemos, pices y yemas pueden considerarse como clsicas dentro del
cultivo de tejidos y su aplicacin, en la propagacin clonal de plantas, la recuperacin de la sanidad, as como en la conservacin e intercambio de
germoplasma, estn ampliamente diseminadas.
Por otro lado, el cultivo de microsporas y de anteras para la produccin de haploides es una herramienta importante para el mejoramiento gentico
de plantas.
Para cultivar clulas, tejidos y rganos in vitro se
deben seguir los siguientes pasos:
1. Seleccionar y separar de la planta el explante que
se desea cultivar.
2A
2
2B
Figura 2.2 Formacin de plantas in vitro. 1. Cultivo de meristemos y yemas del tallo. 2. Regeneracin de
plantas. 2A. Va organognesis; 2B. Va embriognesis somtica. Fuente: George y Sherrington, 1984.
24
CEDAF
2. Desinfectar el explante.
3. Sembrar el explante en un medio de cultivo apropiado.
4. Cultivar el explante en condiciones ambientales
controladas.
Entre los factores qumicos que influyen en el cultivo in vitro estn: los nutrientes (macro y microelementos y fuentes de carbohidratos) y algunos
compuestos orgnicos (vitaminas) y los reguladores de crecimiento.
Entre los factores fsicos estn: la luz, la temperatura, el pH y la concentracin de O2 y CO2. Estos
factores ejercen un papel importante en el desarrollo y diferenciacin celular.
El tipo de diferenciacin que ocurre en un cultivo
in vitro en general depende de la relacin de dos tipos de reguladores de crecimiento: las auxinas y
las citocininas. Cuando la relacin auxina/citocinina es alta se puede dar la formacin de races, la
induccin de embriognesis y la induccin de callos. Mientras que si la relacin de auxina/citocini-
na es baja se puede dar el desarrollo de yemas axilares, o la induccin de brotes adventicios.

Manipulando las combinaciones y concentraciones de los reguladores de crecimiento, es posible
regenerar plantas completas a partir de clulas, tejidos u rganos.
2.2 Aplicaciones del Cultivo de Tejidos
Vegetales
Las aplicaciones de esta tcnica se dan bsicamente en tres reas fundamentales:
a. La micropropagacin,
b. La contribucin del cultivo in vitro en el mejoramiento vegetal y
c. La produccin de metabolitos secundarios. (Tabla
2.2).
2.2.1 Micropropagacin
Uno de los mayores usos del cultivo in vitro de tejidos es la propagacin vegetativa de plantas, la cual
se realiza en forma extensiva. Esta metodologa
Tabla 2.2 Tcnicas de cultivo in vitro de clulas y tejidos vegetales y sus aplicaciones en la agricultura. Fuente: Roca
(1986).
Tecnologas
Aplicaciones
Plazos para
utilizacin
Cultivo de Meristemas, pices,

yemas, embriognesis somtica
1. Propagacin masiva
- Inmediato
2. Eliminacin de enfermedades
- Inmediato
3. Conservacin de germoplasma
- Inmediato
4. Intercambio de germoplasma.
- Inmediato
Cultivo de embriones, cultivo de

vulos, fertilizacin in vitro
1. Obtencin de hbridos entre especies de gneros distintos
- Inmediato
Cultivo de anteras, Cultivo de

microsporas, Cultivo de embriones
1. Obtencin rpida de lneas genticamente puras
- Inmediato
2. Obtencin de variacin gentica nueva
- Mediano
3. Aumento de heterosis
Cultivo de clulas, callos
Funsion de Protoplastos
1. Obtencin de variantes somaclonales
- Mediano
2. Acelerar mejoramiento gentico intravarietal
- Mediano
3. Seleccin de lneas resistentes a enfermedades, estrs, etc.
- Mediano
4. Transformacin gentica
- Largo
1. Obtencin de hbridos asexuales.
- Largo
2. Transferencia de genes citoplasmticos
- Largo
25
CEDAF
permite la multiplicacin masiva de plantas en espacio y tiempo reducidos, ganancia que es bastante
significativa cuando se compara con los mtodos
convencionales de propagacin asexual.
En general, la micropropagacin se puede conseguir a travs de tres vas:
a. Por medio de la proliferacin de yemas axilares;
b. Por la induccin de yemas o brotes adventicios y
c. Por embriognesis somtica (Figura 2.2).
Las yemas apicales o axilares se pueden desarrollar in vitro promoviendo el crecimiento de las yemas latentes o de las yemas activas. Un segmento
de la planta que contenga una sola yema puede originar un solo tallo o puede producir tallos mltiples (Figura 2.3). A medida que el tallo o las ramas
se desarrollan producen a su vez ms yemas axilares; por el subcultivo peridico se podrn producir
tallos o ramas indefinidamente. Este mtodo de
micropropagacin ha sido el ms popular debido a
su aplicabilidad a un mayor nmero de especies
vegetales y a su simple implementacin.
Los brotes o yemas adventicias son estructuras que
se originan de novo en reas diferentes a los sitios
MICRO-PROPAGACIN
de formacin de las yemas axilares o apicales. Los

brotes, races, bulbos adventicios y otras estructuras similares se pueden inducir en segmentos de tallo, hojas, tubrculos, cormos, bulbos, rizomas o
estructuras florales. Normalmente el nmero de
propgulos se incrementa por subdivisin de los
propios rganos inducidos in vitro. Esta va puede
resultar en un sistema de multiplicacin mayor que
la propagacin por proliferacin de yemas axilares.
La embriognesis somtica es el sistema de mayor
potencial para la propagacin clonal rpida. A travs de este mtodo es posible obtener miles de embriones somticos a partir de unos pocos gramos de
callo o de pocos mililitros de una suspensin celular. Durante este proceso cada clula o grupo de
clulas es capaz de dividirse y diferenciarse en un
embrin somtico, que luego puede dar origen a
una planta completa. Debido a su similitud con los
embriones cigticos, los embriones somticos se
utilizan para la produccin de las llamadas semillas artificiales.
La ventaja de la embriognesis somtica, comparada con los dos mtodos de micropropagacin mencionados anteriormente, se debe principalmente al
manejo de un alto volumen de material propagado
y a un bajo costo de produccin. Sin embargo, el
principal problema de este sistema es el reducido
nmero de especies que pueden ser propagadas por
esta va.
La micropropagacin tiene una amplia aplicacin

e n c u l t i v o s c o m e rc i a l e s c o mo p l a n t a s
ornamentales, frutales, forestales y especies
hortcolas comestibles. En Amrica Latina existen
unos 180 laboratorios de micropropagacin de
variada capacidad. De stos, slo 50 desarrollan
Figura 2.3. Cultivos de meristemos de yuca en dos propagacin de plantas a nivel comercial. Sin
etapas de micropropagacin por cultivo de nudos. embargo, son pocos los que alcanzan niveles de
I. INICIACIN
II. ENRAIZAMIENTO
Fuent: Roca, W. 1980.

26
CEDAF
produccin superior al milln de plantas al ao

(Tabla 2.3). Las plantas para las cuales se han
desarrollado tcnicas de micropropagacin
incluyen principalmente ornamentales, herbceas,
frutales y forestales, aunque la propagacin masiva
(a nivel comercial) es ms utilizada con las
ornamentales (Tabla 2.4).
Tabla 2.3
comercial.
Laboratorios
de
micropropagacin
Pas
Nmero de laboratorios
Estados Unidos
105*
Australia
35*
Inglaterra
15*
Nueva Zelandia
15*
Francia
10*
China
10*
Brasil
10*
Israel
7*
Italia
6
Argentina
6
Holanda
5*
Canad
5*
Rep. Dominicana
5*
Mxico
5*
Colombia
5
Costa Rica
5*
Sur Africa
5
Filipinas
4
Tailandia
4
Indonesia
3
Singapur
3*
Venezuela
3
Kenya
2
Malasia
2
Taiwan
2*
* Produccin mayor de 1 milln de plantas.
El m er cado pot enci al p a r a l a s p l a n t a s

micropropagadas es muy grande, siendo Holanda
e l pr i nci pal pa s pr oduc t o r d e p l a n t a s
micropropagadas, seguido por los Estados Unidos
de Amrica y por Israel.
Es importante anotar que no todas las especies vegetales responden con facilidad a la micropropagacin, como es el caso de especies forestales. Sin
embargo, se debe enfatizar que la micropropagacin es recomendable para la multiplicacin rpida
de materiales en va de extincin y materiales valiosos o de alto valor agregado para el comercio.
Tabla 2.4 Plantas propagadas in vitro. Fuente:

Compilado por Roca, W., (1995).
Tipo de planta
Nmero de Variedades o Tipos

Micropropagadas
Propagacin
masiva
Ornamentales
Herbceas
189
85
Leosas
96
Frutales
50
40
Angiospermas
60
24
Gimnospermas
30
15
Hortalizas
60
10
Gramneas
50
10
Orqudeas
37
28
Medicinales
43
Plantaciones
20
Oleaginosas
14
Fibras
17
Forestales
Total
672
238
100
35
Races y tubrculos
Micropropagacin comercial
Existen numerosas compaas comerciales que
producen millones de plntulas al ao por micropropagacin. Compaas de este tipo se hallan localizadas en EE. UU, Australia, Reino Unido, e
Israel principalmente, donde el principal mercado
son las plantas ornamentales de flores para corte
(Tabla 2.3).
Eliminacin de virus y otros patgenos
Las plantas son susceptibles a muchos agentes patgenos como bacterias, hongos, virus, viroides y
nemtodos. Aunque la esterilizacin superficial de
los explantes elimina agentes superficiales, este
tratamiento no permite la eliminacin de infecciones sistmicas, de tipo bacteriano o vricas. Aunque resulta relativamente sencillo eliminar los
patgenos de etiologa fngica o bacteriana por
tratamiento qumico u otros medios, la eliminacin
de los virus representa un verdadero problema.
27
CEDAF
De la observacin de que la distribucin de las partculas virales en la planta es irregular y que existe
menor nmero de partculas virales en los meristemos apicales, fue posible llegar a una solucinde
este problema.
Los meristemas apicales son grupos de clulas localizadas en el extremo del pice de crecimiento y
que normalmente se dividen activamente y de
modo organizado. El meristema apical de brotes
esterilizados superficialmente pueden ser cortados
conteniendo las clulas apicales y los primordios
foliares adyacentes, y cultivados en un medio de
cultivo y condiciones de crecimiento adecuados
para obtener plantas completas.
Las plantas producidas por este procedimiento generalmente no presentan infeccin viral, comprobada por la tcnica ELISA (prueba inmunolgica
para deteccin de virus en tejidos vegetales) con
indicadores o con sondas de DNA.
Para que este procedimiento sea eficiente se deben

tener en cuenta factores como: el tamao del pice
que se extrae para el cultivo, factores del medio y
tratamientos qumicos o trmicos antes o durante
el cultivo in vitro. De todos ellos, el factor ms importante es el tamao del explante; generalmente el
porcentaje de obtencin de plantas aumenta con el
tamao del explante, pero si el meristemo es relativamente pequeo, la proporcin de plantas sin virus ser relativamente elevada. En algunos casos
resulta efectivo el tratamiento trmico (por ejemplo, durante 10 - 20 das a 35 - 38 oC) antes de que
se efecte la extraccin del meristemo, ya que la
multiplicacin viral es sensible a las temperaturas
elevadas (Figura 2.4).
La tcnica del cultivo in vitro de meristemos ha
sido efectiva para la propagacin de plntulas libres de virus en por lo menos unas 65 especies de
plantas.
TERMOTERAPIA
Da: 35C
PRUEBAS
DE
DETECCIN
Noche: 35C
Da: 40C
Noche: 35C
MATERIAL
CLONAL
CLONES INFECTADOS
CULTIVO DE MERISTEMAS
SEMBRAR EN POTES
PRUEBAS DE DETECCIN
PROPAGACIN PLANTAS SANAS
(-)
(+)
DESTRUCCIN
PLANTAS ENFERMAS
PLANTAS SANAS
Figura 2.4. Procedimientos para la produccin de plantas de yuca libres de virus mediante la
termopterapia y el cultivo de meristemos. Fuente. Roca y Jayasinghe, 1982.
28
CEDAF
2 .2 . 2 C ont ri buci n del c u l ti v o i n v i t ro

en el mej orami ent o v e g e t a l
Res cat e de embri ones zi g ti c o s
Las barreras que se oponen al logro de la produccin de hbridos entre especies distantes taxonmicamente pueden ser superadas mediante las
tcnicas de cultivo in vitro. En aquellos casos en
que la fecundacin tiene xito, pero el embrin no
consigue desarrollarse, es posible aislar los embriones cigticos inmaduros y cultivarlos en medios y condiciones apropiadas para regenerar
plantas hbridas (Figura 2.5).
Pr oducci n de pl ant as h a p l o i d e s m e d ia nt e el cul t i vo de ant e r a s y d e o v a r io s
Las plantas haploides contienen el nmero gamtico de cromosomas, es decir la mitad del nmero total de cromosomas de la planta. Son de gran
Embrin
Mediante el cultivo de anteras es posible regenerar

plantas haploides en ms de 50 especies vegetales,
siendo la mayora de ellas de las familias Graminae, Solanaceae y Cruciferae. Estas familias incluyen muchas especies agrcolas de importancia
econmica como el trigo, la cebada, el maz, el
arroz, el centeno, los pastos, las brassicas, la papa,
el tomate y el tabaco.
Los factores ms importantes para la produccin
eficiente de plantas haploides son los siguientes:
x
P. vulgaris
utilidad en los programas de mejoramiento, tanto

para la produccin rpida de lneas homocigticas,
como para la deteccin y seleccin de mutantes recesivos. La produccin de haploides puede ocurrir
por medio de la regeneracin de plantas a partir del
cultivo de granos de polen inmaduros aislados
(cultivo de microsporas) o contenidos en la antera
(cultivo de anteras). En la cebada, por ejemplo,
que posee del orden de
2 - 3x103 granos de polen por antera y 60 anteras aprovechables por cada
espiga, existen potencialmente 105 microesporas
por espiga que pueden ser aprovechadas para el
cultivo in vitro.
1. El crecimiento de las plantas donantes en condiciones ptimas,

P. coccineus
P. acutifolius
P. lunatus
2. Una muestra adecuada de diferentes genotipos;

3. Eleccin del estadio adecuado del desarrollo del
polen ;
4. Condiciones del pretratamiento de las anteras, especialmente el tratamiento por fro o por calor;
5. Efecto de los aditivos en el medio de cultivo, por
ejemplo, el nitrgeno orgnico, un aumento en el
contenido de sacarosa, carbn activado, etc.
Callo
Plantas
Figura 2.5 Produccin de plantas hbridas de cruzas

interespecficas mediante el rescate y cultivo in
vitro de embriones inmaduros. Fuente: Muoz y
Colaboradores, 1990.
En el mejoramiento tradicional son necesarias 5 - 6

generaciones del material segregante para obtener
lneas uniformes, las cuales nunca son 100% homocigotas. Estas generaciones requieren adems
de tiempo y mano de obra intensa. El cultivo de
anteras permite eliminar varias generaciones se29
CEDAF
gregantes, economizando tiempo, espacio y costos. El cultivo de anteras para la produccin de

haploides es ya un proceso rutinario en muchos
cultivos. Tal es el caso del arroz, que en 7 - 8 meses
es posible obtener semilla totalmente homocigota,
que por el mtodo tradicional tomara 3 - 4 aos

(Figura 2.6).
La consecuencia gentica del cultivo de anteras en
el fitomejoramiento se presenta en la Tabla 2.5
Nmero Aproximado
Actividad
Duracin calculada
Seleccin de progenitores
Cruzamientos
25-50 plantas/cruce
Seleccin de plantas F1.
3 meses
Cultivo de anteras
100 anteras/frasco; 100 frascos/cruzamiento

(10,000 anteras/cruzamiento)
1.5 meses
700-4000 callos/100 anteras

7%-40%
Induccin de callos
1.5 meses
50-700 plantas verdes/100 anteras
0.5%, 0.7%
50% R1 son DH
Regeneracin de plantas R1.
Obtencin de semilla R2.

(homocigtica)
25-350 lneas R2/cruzamiento.
Evaluacin de lneas R2.

calidad de grano, tipo de planta, resistencia
a enfermedades y tolerancias fisiolgicas.
5-70 lneas R2 seleccionadas/cruzamiento

(aprox. 20% seleccin)
4 meses
6 meses
Ensayos de rendimiento con lneas R3.
3-4 aos
Ensayos regionales en campos de agricultores con lneas R4
Ensayos comerciales con lneas R5
Liberacin de la variedad
Figura 2.6 Procedimiento general para el mejoramiento de arroz mediante el cultivo de anteras. Fuente:
Lentini y colaboradores, 1997.
30
CEDAF
para plantas autgamas. La determinacin del beneficio / costo del cultivo de anteras es un paso necesario para la implementacin del cultivo de
anteras en un programa de mejoramiento (Tabla
2.6).
Tabla 2.5 Consecuencia gentica del cultivo de anteras.
Hibrido
Gametos
AaBb
Cultivo de
Anteras
Plantas
Homocigotas
AB
AABB
aB
aaBB
Ab
AAbb
ab
aabb
1. Puede tratarse de compuestos qumicos de valor comercial;
Costo en Dlares
Indica
Japonica
Mtodo de pedigr
203.791
348.483
Cultivo de anteras
121.385
195.438
Ahorro respecto al mtodo de pedigr
82.046
153.044
29
44
60.000
5.500
% de ahorro
Capacidad de operacin ptima
(nmero de anteras por semana)
Un gran nmero de compuestos qumicos importantes desde el punto de vista comercial provienen
directamente de plantas y estos incluyen los metabolitos secundarios. La aplicacin de estos productos puede clasificarse en cinco grupos:
frmacos, aromas, perfumes, pigmentos y plaguicidas.
La importancia biotecnolgica de los metabolitos
secundarios es triple:
Tabla 2.6 Anlisis de costo-beneficio del cultivo de

anteras para el mejoramiento de arroz: costo total
estimado para obtener una variedad de arroz usando el
cultivo de anteras, y comparacin con el mtodo de
pedigr. Fuente: Sanint, y colaboradores, (1.993).
Mtodo
traquinonas y fenoles simples o polifenoles, tienen

de manera caracterstica una distribucin limitada.
2 .2 . 3 P roducci n de meta b o l i t o s
s ecundari os us and o c u l ti v o d e
t ej i dos
2. Algunos de ellos son txicos y deben eliminarse de

los alimentos; y
3. Podran actuar como agentes protectores, utilizados
por la planta contra agentes patgenos, insectos y
animales herbvoros.
Existen dos estrategias generales para la produccin a gran escala de metabolitos secundarios vegetales. stas estrategias se basan en :
1. Sistemas de fermentadores en el que las clulas en
suspensin crecen libremente hasta una fase estacionaria en un proceso de una o dos etapas. Estas
se cosechan para extraer el producto;
2. Sistema de clulas inmovilizadas, en los que las clulas son embebidas o atrapadas en una matriz polimrica inerte, como gel, espuma o cartuchos de
fibra hueca. En este ltimo sistema el objetivo es
conseguir un proceso de produccin continuo o semicontinuo, que requiere a su vez que el producto
se libere naturalmente, o que la liberacin pueda inducirse permeabilizando reversiblemente las clulas.
Los metabolitos secundarios son compuestos que

no tienen una funcin reconocida en los procesos
fisiolgicos de los organismos que los sintetizan.
Estos compuestos, entre los que se incluyen los alcaloides, terpenoides, esteroides, antocianinas, an-
31
CEDAF
2 .3 Eje r ci ci o 2. 1 E l cul t i vo d e t e j i d o s
v e g e t al es
Coloque en cada mesa las cuatro especies vegetales recomendadas.
Objetivos

cada grupo en cada una de las mesas de trabajo.
Elaborar el concepto de cultivo de tejidos vegetales y sus aplicaciones.

Identificar el explante y la tcnica de cultivo de
tejidos ms adecuada para:
a. el rescate de germoplasma en va de extincin,
b. la eliminacin de patgenos de materiales
"preciosos",
c. la multiplicacin masiva de materiales comerciales (flores) y
d. la produccin de plantas haploides para ser
utilizadas en mejoramiento vegetal.
Orientaciones para el instructor
El siguiente ejercicio busca que los participantes
seleccionen los explantes y tcnicas de cultivo de
tejidos apropiados para el rescate de germoplasma
en va de extincin, la eliminacin de patgenos de
materiales "preciosos", la multiplicacin masiva
de materiales comerciales (flores) y la produccin
de plantas haploides para ser utilizadas en mejoramiento vegetal.
Con este ejercicio, se busca que los participantes
fijen el concepto de cultivo de tejidos vegetales y
sus aplicaciones.
que el instructor lea atentamente las siguientes instrucciones:
Suministre orientacin general sobre los objetivos del ejercicio.
En cada grupo, los participantes deben indicar:

a. El cultivo de ms difcil propagacin por va
convencional;
b. El cultivo que podra ser usado como modelo
para la eliminacin de patgenos (virus);
c. el cultivo que podra ser usado como modelo
para propagacin masiva;
d. el cultivo que podra ser utilizado como modelo para la produccin de plantas haploides.
En cada caso seleccione el explante y la tcnica
de cultivo de tejidos ms apropiada para cumplir con cada uno de los objetivos planteados.
Elaborar una lista del explante(s) y la tcnica(s)
de cultivo in vitro seleccionados para cada cultivo.
dadas.
Proporcione la informacin de retorno, sealando los explantes y tcnicas de cultivo in vitro
ms apropiadas en cada cultivo para lograr el
objetivo planteado.
Recursos necesarios
Papelgrafo, papel, marcadores.
Cuatro mesas medianas y un sitio de trabajo.
Las siguientes plantas en materas pequeas o en
bolsas de plstico: Palma, yuca, rosa, y arroz.
Fotocopia de las instrucciones e informacin de
retorno para los participantes.
Tiempo sugerido: 60 minutos.
Ubique cuatro mesas en el sitio de trabajo.
32
CEDAF

De acuerdo con la informacin suministrada en a
Seccin 2, y mediante la seleccin del explante y
tcnica de cultivo ms apropiada para:
la oportunidad de construir el concepto de cultivo

de tejidos vegetales.

con las instrucciones dadas por el instructor.
a. el rescate de germoplasma en extincin,
Nombrar un relator por grupo, el cual presentar en plenaria los resultados obtenidos por el
grupo.
b. eliminacin de patgenos en materiales "preciosos",
Realizar un listado de los explantes y tcnicas

de cultivo in vitro para cada cultivo, de acuerdo
con su objetivo particular.
c. la multiplicacin masiva de materiales comerciales

y
Al final el instructor les proporcionar la informacin de retorno.
d. la produccin de plantas haploides para ser usadas

en mejoramiento vegetal, los participantes tendrn
Especie
Vegetal
Palma
Yuca
Rosa
Arroz
Caso particular
Explante (s)
Seleccionado(s)
Tcnica de
Cultivo in vitro
Producto
Multiplicacin
Apices laterales
Micropropagacin Multiplicacin rpida
Limpieza clonal por termoterapia
Meristemos
Micropropagacin Plantas libres de virus
Propagacin masiva
Yemas axilares
Micropropagacin Incremento en la produccin de plntulas
Produccin de plantas
haploides
Anteras
Cultivo de anteras Produccin de plantas haploides para ser usadas

en un programa de mejoramiento
33
CEDAF
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CEDAF
Ori g i n a l e s pa r a T r a n sp a r e nc i a s
35
36
pices y yemas
Cultivo de
meristemos
Eliminacin de
enfermedades
Propagacin
masiva
Micropropagacin
Cultivo de
suspensin
celulares
Produccin de
haploides
Cruces
interespecficos
Metabolitos secundarios
Produccin de protoplastos para

transformacin o hibridacin somtica
Cultivo de
anteras
Cultivo de
ovulos y
embriones
Contribucin al
fitomejoramiento
CEDAF
estas tcnicas.
Conocer algunas aplicaciones de
tejidos vegetales.
de las tcnicas de cultivo de
Entender los principios bsicos
Objetivos
CEDAF
37
38
artificiales.
condiciones fsicas y qumicas
para cultivarlo en un medio nutritivo en
rgano o clula), llamado explante,
una porcin de una planta (Tejido,
Es una tcnica que consiste en aislar
Qu es el Cultivo de Tejidos Vegetales?
CEDAF
Celulas en
suspensin
Callo
Planta
(brotes o yemas,
raz adventicia)
Organognesis
Explante
(produccin de
embriones)
Embriognesis
CEDAF
39
40
mejoramiento gentico de plantas.
propagacin clonal o para el
Desarrollo de tcnicas para
Investigacin aplicada.
diferenciacin celular.
bioqumicos y morfolgicos de la
Investigacin bsica sobre procesos
Utilizacin de las Tcnicas de

CEDAF
Desinfeccin del explante.

Siembra en un medio apropiado.
Cultivar el explante en condiciones
ambientales controladas.
Seleccin y separacin del explante.
Pasos a Seguir en el Cultivo

de Tejidos Vegetales
CEDAF
41
42
3.
2.
1.
Produccin de metabolitos secundarios
Rescate de embriones
Cultivo de anteras para la produccin de plantas haploides
Contribucin al mejoramiento vegetal
Micropropagacin comercial
Eliminacin de virus y otros patgenos
Micropropagacin
Aplicaciones del Cultivo de Tejidos Vegetales
CEDAF
CEDAF
Te c n ol og a d e l D NA Re c o mb i n a n t e
Seccin 3
43
Seccin 3 .
CEDAF
Tecno l og a de l D N A r e c ombi n an t e
Tabla de Contenido
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.1 Qu es la Ingeniera Gentica? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.2 Aspectos Fundamentales y Tecnolgicos de la Ingeniera Gentica . . . . . . . . . . . 47
3.3 Aislamiento de genes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.4 Secuenciacin del DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.5 Ejercicio 3.1 Tecnologa del DNA recombinante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
44
CEDAF
Tecnologa del DNA recombinante
Herramientas
Enzimas de restriccin
Enzimas modificadoras del DNA
Vectores
Hospederos
Clonacin y aislamiento
de genes
Generacin de
fragmentos de DNA
Unin de los
fragmentos a un
vector molecular
Introduccin del
vector a una clula
hospedante para la
amplificacin
Seleccin de una
secuencia (gen)
especfica
Utilizand o
sondas"
Utilizando
anticuerpos
especficos
Objetivos
Conocer los fundamentos de la tecnologa del DNA recombinante
Describir las herramientas ms importantes de esta tecnologa.
1. Saban ustedes que la insulina, hormona que regula los niveles de azcar en la sangre es producida a nivel industrial por una bacteria que vive en su intestino?
2. Algn participante puede decir que es la ingeniera gentica?
3. Saban ustedes que pequeos segmentos de DNA pueden ser aislados secuencias modificados y transferidos de
un organismo a otro.?
45
3 .1 Q u es l a I ngeni er a G en t i c a ?
En muchos laboratorios alrededor del mundo, ya es
una rutina el aislamiento de fragmentos especficos de DNA de un organismo para determinar su
secuencia de bases y utilizar esta informacin
para determinar su funcin. Lo que es realmente
interesante es que es posible su acceso, a nivel experimental bsico, con muy poco equipo y a un
costo relativamente bajo.
Ingeniera gentica es el trmino ms utilizado
para referirse al conjunto de tcnicas involucradas
en la manipulacin del material gentico (DNA y
RNA). La ingeniera o manipulacin gentica se
basa en la tecnologa del DNA recombinante.
CEDAF
de resistencia a un antibitico presente en el plsmido vector (Figura 3.1).
Plsmidio bacteriano
DNA de otro organismo

AAGCTT
TTCGAA
AAGCTT
TTCGAA
Un gen de inters
AGCTT
A
A
T T CGA
b
T T
La tecnologa del DNA recombinante bsicaLa mezcla hace que los extremos
mente consiste en aislar segmentos especficos de
complementarios se apareen y
que la DNA ligasa una estos
DNA (genes) e introducirlos en vectores especiaextremos
les (plsmidos) para formar molculas de DNA
c
recombinantes. Este proceso es posible gracias a
un grupo de enzimas que permiten la manipulacin del DNA, tales como las enzimas de restriccin, que reconocen y cortan en sitios especficos Figura 3.1 Principio bsico de la tecnologa del DNA
recombinante. Fuente: Ville y colaboradores, 1992.
la molcula de DNA, y las ligasas, que sellan permanentemente los fragmentos insertados en el vector. Los vectores recombinantes son introducidos a Hay cuatro reas principales en las cuales la tecnouna clula hospedera (generalmente a la bacteria loga del DNA recombinante es de gran utilidad.
Escherichia coli) para el mantenimiento y amplifi- a. Investigacin bsica de la estructura y funcin de los
genes.
cacin (multiplicacin) de las molculas de DNA
b. Identificacin y mapeo de genes
recombinante.
C
El proceso por el cual un segmento especfico de

DNA o un gen es amplificado en forma selectiva se
llama clonacin. En este caso, el DNA forneo se
inserta in vitro en un plsmido pequeo (por ejemplo, al plsmido comercial pUC19). El plsmido
recombinante se introduce por transformacin a
una clula hospedera (la bacteria E. coli) en la que
se mantiene mediante seleccin a travs de un gen
46
c. Nuevos mtodos de produccin de protenas tiles.

d. Produccin de plantas y animales transgnicos.
La clonacin gentica es el aislamiento de una secuencia especfica de DNA del genoma. La esencia
de la clonacin de genes se puede resumir en las
cuatro etapas mostradas en la Figura 3.2, cuyo producto es el aislamiento de una secuencia especfica
de DNA la cual puede ser utilizada para varios propsitos.
CEDAF
lizadas en los cromosomas, cuyo principal constituyente es la molcula del DNA. Los segmentos
de esta gran molcula que codifican las diferentes
caractersticas de un individuo se denominan genes.
Generacin de Fragmentos de ADN
Unin de los Fragmentos

a un Vector Molecular
Introduccin del Vector a una Clula Hospedante,

para la Amplificacin
Seleccin de una Secuencia Especfica
Figura 3.2 Las cuatro etapas bsicas para la clonacin de genes.
3 .2 A s pect os F undam ent a l e s y

T ecnol gi cos de l a I n g e n i e r a
G ent i ca
3 .2 . 1 L os ci dos nucl ei c o s
Los genes de los organismos eucariticos estn

conformados bsicamente de tres regiones: la estructural, la promotora y la reguladora. La regin
estructural est constituida por secuencias codificadoras, llamadas exones y secuencias no codificadoras, denominadas intrones, las cuales son
removidas del mRNA despus de la transcripcin.
La regin estructural est adems flanqueada en
su extremo 5' por un sitio de iniciacin de la transcripcin y en su extremo 3' por un sitio de terminacin. La regin promotora contiene secuencias
especficas que interactan con varios factores
protenicos para regular la transcripcin, y la regin reguladora determina cuando el gen debe comenzar a transcribirse. Estos reguladores son de
dos tipos: los amplificadores, que incrementan la
velocidad de la transcripcin y los silenciadores,
que son los que la disminuyen. En la Figura 3.3, se
muestran los componentes ms importantes de los
genes de los organismos eucariticos.
Las caractersticas hereditarias que se transmiten

de los parentales a su descendencia se hallan locaPotenciador
Elementos
cuesta arriba
TATA
Exn
Elementos
cuesta arriba
TATA
Exn
Intrn
Exn
Sitio de
iniciacin de
la transcripcin
100 pares de bases
Intrn
Exn
Intrn Potenciador
Intrn
Exn
hnRNA
hnRNA
Sitio de
iniciacin de
la transcripcin
Figura 3.3 Componentes de un gen eucaritico. Fuente: Ville y colaboradores, 1992.

47
CEDAF
El flujo de la informacin gentica es unidireccional:
DNA mRNA protena

El proceso que permite copiar la informacin gentica (a travs de una molcula intermediaria denominada mRNA) se llama transcripcin, y la
conversin de la informacin gentica en el producto final (una protena) se denomina traduccin. Este concepto del flujo de la informacin gentica es conocido como el Dogma Central de la
Biologa. Dos excepciones que se deben agregar
al dogma central de la biologa son los siguientes:
1. La duplicacin de material gentico, que ocurre antes de la divisin celular, representada como DNA
DNA, se denomina replicacin y
2. La informacin gentica de algunos organismos,
como los retrovirus, se halla codificada en la molcula de RNA en vez de DNA. Estos virus contienen
una enzima llamada transcriptasa reversa que produce una molcula de DNA de doble cadena a partir
de la cadena simple del RNA genmico. En este caso
el flujo de la informacin gentica ser en "reversa",
comparado con la convencin normal, de modo que
el dogma central completo de la biologa se esquematiza en la Figura 3.4.
Los cidos nucleicos son conglomerados en forma

de cadena (heteropolmeros) formados por unidades (monmeros) llamadas nucletidos; por esta
razn una cadena de cido nucleico se le conoce
como un polinucletido. Las unidades o nucleti-
dos estan formados por tres componentes: un azcar (2-desoxirribosa para DNA y ribosa para
RNA), un grupo fosfato y una base nitrogenada.
Las bases nitrogenadas son de dos tipos: las purinas que presentan doble anillo y se llaman adenina
y guanina, designadas por las letras A y G, respectivamente; y las pirimidinas, que presentan un
solo anillo, y se llaman timina, citosina y uracilo,
designados por las letras T, C y U, respectivamente. La timina no se presenta en el RNA, en su lugar
se encuentra el Uracilo.
La estructura del DNA tiene la forma de una doble
hlice, donde las bases nitrogenadas se hallan en el
interior. Cada base se aparea con la base de la cadena complementaria a travs de puentes de hidrgeno (H), que unen a la A con la T mediante dos
puentes de hidrgeno y a la G con la C mediante
tres puentes.
Hay tres tipos de molculas de RNA en las clulas:
RNA mensajero (mRNA), RNA ribosomal (rRNA
) y RNA de transferencia (tRNA). El rRNA es el
ms abundante de los tres (85% del RNA total) y
est asociado con los ribosomas, que son parte
esencial de la maquinaria de traduccin. El tRNA
(10% del RNA total) se encarga de insertar aminocidos siguiendo un orden codificado por el
mRNA. El mRNA (5% del RNA total), acta
como transportador de la informacin gentica
Transcripcin
Replicacin
D NA
Traduccin
mRNA
PRO TEINA
Transcripcin
Reversa
Figura 3.4 El dogma central de la biologa.
48
CEDAF
desde el DNA hasta el sitio de traduccin (los ribosomas), cuyo producto final son las protenas.
El arreglo lineal de la secuencia de aminocidos de
una protena est determinado por la secuencia de
bases en el mRNA, cuyo orden es especificado por
el DNA, de donde se copi o transcribi.
Una secuencia de tres bases que codifica para un
aminocido se llama un codon. Como hay cuatro
bases diferentes entonces existen 64 codones posibles para los 20 aminocidos esenciales diferentes.
Tres de esos codones son utilizados como seales
de terminacin de la traduccin, el resto corresponde a los aminocidos. Por ejemplo, hay seis codones para leucina, cuatro para treonina, uno para
metionina, uno para triptofano, etc.
El ingeniero gentico necesita cortar y unir segmentos de DNA de diferentes fuentes (Figura 3.1).
Adems, es necesario realizar ciertas modificaciones en el DNA en la diferentes etapas requeridas
para producir, clonar e identificar molculas de
DNA recombinante. Las herramientas que hacen
posible todas esas manipulaciones son enzimas.
Algunas de estas enzimas utilizadas en la ingeniera gentica, son las siguientes :
3 .2 . 2 L as enzi mas de res t r i c c i n
Las enzimas de restriccin permiten cortar el DNA
de doble cadena por sitios especficos o secuencias
de reconocimiento (Figura 3.5). Estas enzimas son
extradas de bacterias, en donde funcionan como
parte de un mecanismo de proteccin de la bacteria
contra la invasin de DNA extrao. Para prevenir
la digestin o la hidrlisis del DNA de la propia clula, una enzima (una metilasa) que modifica el
DNA de la clula, metilando ciertas bases de la secuencia de reconocimiento, lo cual evita que la enzima de restriccin corte su propio DNA.
La mayora de las enzimas de restriccin usadas en

ingeniera gentica presentan un modo de accin
relativamente simple. Estas enzimas son nucleasas y como cortan una seccin interna del DNA
son denominadas endonucleasas de restriccin.
a)
G-A-A-T-T-C
C-T-T-A-A-G
Eco RI
G
A-A-T-T-C
C-T-T-A-A
G
b)
G-A-A-T-T-C
C-T-T-A-A-G
DNA Ligasa
G-A-A-T-T-C
C-T-T-A-A-G
Figura 3.5 Enzimas que cortan y ligan molculas

de DNA. a) La enzima de restriccin EcoRI reconoce y corta en la secuencia GAATTC, generando
segmentos con extremos pegajosos. b) En condiciones apropiadas, los segmentos con extremos
pegajosos complementarios se realinean y los
cortes son reparados con la enzima DNA Ligasa.
Fuente: Astec, 1993.
La nomenclatura para nombrar las enzimas de restriccin se basa en algunas convenciones: Por
ejemplo,
Hind III:
Se refiere a la tercera enzima de restriccin

caracterizada de la cepa Rd de la bacteria
Haemophilus influenzae.
EcoRV
Se refiere a la quinta enzima de restriccin

caracterizada de la cepa RY13 de la bacteria
Escherichia coli
49
CEDAF
Cada enzima de restriccin reconoce una secuencia especfica de pares de bases en la molcula de
DNA, siendo las secuencias ms comunes las de
cuatro, cinco o seis pares de bases.
3 .2 .3
O t ras enzi mas i mport a n t e s

p ara l a i ngeni er a gen t i c a
DNA Ligasas
Estas enzimas catalizan la formacin de enlaces
entre dos nucletidos contiguos en una cadena de
DNA de doble banda, por lo que uno de los usos de
esta enzima es para reparar "huecos" en una de las
bandas del DNA. Esta enzima tambin se usa para
unir fragmentos en un vector de clonacin, originando un vector recombinante (Figura 3.5).
Figura 3.6. Replicacin del DNA, antes de la divisin celular. Las dos cadenas del DNA se separan y sirven de moldes para la sntesis de dos
nuevas cadenas. Fuente: Astec, 1993.
La Taq polimerasa
Es una DNA polimerasa extrada de la bacteria
Thermus aquaticus, que habita en los baos termaEstas enzimas son las que permiten la formacin les. Por esta razn, esta enzima no pierde su activide cadenas (polmeros) de DNA, como se puede dad cataltica cuando se incuba a una temperatura
apreciar en la Figura 3.6. La sntesis es exclusiva- de 94oC. Debido a esta propiedad la Taq polimeramente en la direccin 5' 3' con respecto a la ban- sa es utilizada en la tcnica de la Reaccin en Cad a q u e s e es t s i nt et i za n d o . C a d a dena de la Polimerasa (PCR) utilizado para la
desoxirribonucletido que es incorporado durante multiplicacin in vitro de DNA a partir de poca
la polimerizacin es complementario al de la ban- cantidad de ste.
da molde (dA es complementaria a dT y dG es
3 . 2 . 4 V e c to r g e n t i c o
complementaria a dC).
DNA Polimerasas
Un vector gentico es una molcula pequea de

DNA con un origen de replicacin autnomo y que
Es una DNA polimerasa que forma polmeros de
posee zonas que no son esenciales para su multipliDNA de cadena sencilla usando como molde una
cacin. Al eliminar estas regiones, stas pueden
cadena de RNA. Esta enzima es utilizada para sinser reemplazadas por DNA forneo. Estos vectotetizar cadenas de DNA a partir mRNA en el prores actan como portadores y multiplicadores de
c e s o d e pr oducci n de cD N A ( D N A
DNA exgeno, cuando el vector se replica dentro
complementario), paso importante en la construcde la clula hospedera. En general, el DNA del
cin de bancos de cDNA, los cuales son muy tivector es fcilmente separable del DNA genmico
les para el aislamiento de genes de inters.
La transcriptasa reversa
50
CEDAF
del hospedero, pudindose obtener buenas cantidades del DNA exgeno insertado en el vector.
Dos vectores plasmdicos comnmente utilizados

son el plsmido pBR322 y el plsmido pUC19 (Figura 3.7).
Los vectores ms comnmente utilizados en ingeniera gentica son algunos plsmidos de Escherichia coli y el bacterifago Lambda (l).
3.2.6 Hospederos
Un hospedero ideal debe ser de fcil manipulacin
y propagacin. Debe estar disponible en un amplio
rango de cepas definidas genticamente, y debe
aceptar un amplio rango de vectores. La bacteria
Escherichia coli rene todos estos requisitos, por
lo cual es utilizada en muchos protocolos de clonacin.
3 .2 . 5 L os pl s mi dos
Los plsmidos son pequeas molculas circulares
de DNA de doble banda, que estn presentes en algunas bacterias como elementos extracromosomales. Los plsmidos confieren a sus hospederos
bacterianos una variedad de caractersticas fenotpicas que no son necesarias para su reproduccin,
pero que pueden conferirle alguna ventaja, como
por ejemplo, la resistencia a un antibitico.
La entrada de un vector al interior de un hospedero

se denomina transformacin cuando el vector es un
plsmido o transfeccin si el vector es un fago
como el fago .
Para que un plsmido pueda ser utilizado como

vector en ingeniera gentica debe poseer las siguientes propiedades:
a. Tener una replicacin autnoma
en la clula hospedera;
EcoO 109 2674
b. Conferirle a la clula hospedera

resistencia a uno o varios antibioticos, para identificar aquellas
bacterias que lo contienen;
Ndel 183
Sspl 2501
EcoRl
Narl 235
Sacl
Kpnl
Xmnl 2294
Smal Xmal
c. Poseer una regin con secuencias

de reconocimiento y corte nico
para varias enzimas de restriccin de manera que sea inactivado en los eventos de insercin del
DNA exgeno, permitiendo la
seleccin de los plsmidos recombinantes;
d. Desde el punto de vista de bioseguridad, los plsmidos usados
como vectores no deben ser
transmisibles ni mviles, y deben
tener hospederos especficos que
slo sobrevivan en medios de
cultivos especficos.
396
Aatll 2617
BamHl
lacz
Scal 2177
Xbal
Hincl
Plac
Pstl
Hindll
amp
lacl
pUC19
2686bp
447
Gsul 1784
Afllll 806
ori
Cfr10l 1779
Ppal 1766
460
440
420
400
AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCAT
EcoRI
Sacl
Kpnl
Smal
Xmal
BamHi
Xbal
Hincll
Accl
Sail
Pstl
Sphl
Hin dlll
lacZ
ThrlleMetThr(Met)
Figura 3.7 Mapa de un vector comercial (el plsmido pUC19).

Fuente: Ausubel y colaboradores, 1988.
51
CEDAF
Algunos vectores comerciales como los plsmidos

de la serie pUC, presentan una regin de clonamiento mltiple (polilinker) dentro de la secuencia
que codifica por la subunidad alfa de la enzima beta-galactosidasa, la cual se complementa con otra
subunidad codificada en el cromosoma del hospedero, para formar la enzima activa. La enzima beta-galactosidasa acta sobre el sustrato X-gal,
liberando el colorante azul ndigo, tiendo de azul
las colonias bacterianas que expresan la enzima.
Cuando se inserta un segmento de DNA forneo en
la regin de clonamiento mltiple del vector, se
inactiva la enzima y las colonias bacterianas presentan su color blanco natural. Esta estrategia
ofrece la posibilidad de identificar rpidamente las
colonias con plsmidos recombinantes a travs de
esta sencilla prueba.
En un banco genmico estn presentes todas las secuencias del DNA genmico, como son los exones, los intrones, y secuencias regulatorias. El
nmero de clones requeridos para tener un banco
genmico completo depende del tamao del genoma de la planta y del tipo de vector de clonaje utilizado.
3 .3 Aislam i ent o de genes
Introduccin del vector a un hospedero, para la

multiplicacin de los vectores recombinantes.
Uno de los principales usos de la tecnologa del

DNA recombinante es el aislamiento y clonacin
de genes de inters de un organismo. Sin embargo,
esta tarea es ms complicada cuando se trata de aislar genes de organismos complejos, como son los
animales y plantas.
Los pasos bsicos que se siguen para la construccin de un banco genmico son los siguientes: (Figura 3.8).
Aislamiento de DNA genmico de alta calidad
y de alto peso molecular.
Digestin con una endonucleosa de restriccin.
Separacin de los fragmentos por electroforesis
o por cromatografa de columna.
Seleccin de fragmentos del tamao deseado.
Unin de los fragmentos a un vector.
DNA Genmico
Fragmentos de Restriccin
Existen algunas estrategias para aislar un gen especfico de entre los miles presentes en el genoma vegetal. Primero, hay que construir un banco de
"genes", ya sea un banco genmico o un banco de
cDNA y seguir procedimientos especficos para
aislar el gen de inters de los bancos de genes.
3 .3 .1 Ba nco de D N A genmi c o
Un banco genmico es una coleccin de vectores
recombinantes (en un hospedero como E. coli ) que
contienen segmentos de DNA, los cuales representan el genoma del organismo.
Separacin por Electroforesis
Electroclucin
Fragmentos de
500-3000 bp
Lac Z
Lac Z
AMP
Plsmidio
Plsmidio
Abierto
AMP
Bacteria Competente
Seleccin de
Colonias con Insertos
Figura 3.8. Pasos bsicos para la construccin de

un banco de DNA genmico.
52
CEDAF
3 .3 . 2 B anco de cD N A
Un banco de cDNA es una coleccin de vectores
recombinantes que contienen cDNAs de todos los
mRNAs presentes en un tejido o clula, en un determinado estado de desarrollo, y en condiciones
de crecimiento definido.
En un banco de cDNA no estn representados todos los genes de un organismo, pues la proporcin
de cada tipo de cDNA particular depende de:
se aislan los vectores recombinantes portadores de

las secuencias presentes en cada uno de los bancos.
3 . 3 . 3 Id e n t i f i c a c i n y a i s l a m i e n t o
de genes
Existen varios mtodos para la identificacin y
aislamiento de secuencias de genes especficas, a
partir de un banco genmico o de cDNA :
a. Los genes expresados al momento de la toma de la

muestra;
1. Hibridacin de cidos nucleicos, utilizando sondas

construidas a partir de una secuencia parcial de la
protena codificada por el gen (Figura 3.9).
b. Los genes expresados en el tejido utilizado par extraer el mRNA y,
2. Utilizando anticuerpos especficos que pueden detectar la presencia del producto gnico (protena).
c. La abundancia relativa de los

mRNAs del tejido seleccionado.
Colonias de un banco de cDNA
Los pasos bsicos para la

construccin de un banco de
cDNA son los siguientes:
Transferencia de las colonias a una

membrana de nylon
Aislamiento del RNA total del tejido seleccionado.

Aislamiento del mRNA .
Sntesis del cDNA .
Lisis de la
bacteria y liberacin
del DNA
Las cadenas de DNA

se separan y se ligan
a la membrana
Membrana
sumergida en
solucin alcalina
Adicin de adaptadores
al cDNA .
Unin de los cDNA al
vector.
Introduccin del vector
recombinante a un hospedero para la multiplicacin de los vectores
recombinantes.
Sonda radioactiva
Membrana
sumergida en una
solucin con la
sonda radioactiva
La sonda radioactiva se
hibridiza a una secuencia
complementaria en la
membrana de nylon
Autorradiografa
Pelcula fotogrfica
colocada sobre la
Los dos tipos de bancos (gemembrana de nylon
nmico y de cDNA) son inIdentificacin de la colonia con
el "gen" en la caja madre
c re ment ados en cepas
bacterianas especiales. De
stas se pueden aislar colonias; y en su turno, de stas Figura 3.9 Aislamiento de un gen a partir de un banco de DNA genmico.
53
CEDAF
3 .4 S e c uenci aci n del D N A

Cuando se ha aislado un gen de inters es necesario
conocer la secuencia lineal de sus nucletidos para
estudios sobre la estructura gnica y las secuencias
que controlan su expresin. Este conocimiento
adems permite la modificacin necesaria para que
dicho gen pueda ser transferido y expresado en
otro organismo.
O
O=
=O
O
O=
=O
NH2
O
O=
=O
N
Trifosfato de
didesoxiadenosina
(ddATP)
2. El mtodo qumico (Mtodo de Maxam y Gilbert).
El mtodo ms utilizado es el mtodo enzimtico

(Figura 3.10). Este mtodo consiste en sintetizar
una cadena complementaria a una cadena molde
que se quiere secuenciar, de tal forma que el crecimiento de la cadena complementaria se puede detener en posiciones especficas, lo cual se logra
utilizando compuestos anlogos a los cuatro desoxinucletidos (dNTPs) que conforman la molcula
de DNA. Estos compuestos anlogos son denominados dideoxinucletidos (ddNTPs).
Grupo 3 desoxi
(a)
1. El mtodo enzimtico (Mtodo de Sanger) y,
La alta resolucin de esta tcnica permite separar

por tamao segmentos de DNA que se diferencian
en tan slo un nucletido. La secuencia del frag-
O
CH2
Existen dos tcnicas para secuenciar segmentos de

DNA:
Fragmento de la cadena sencilla de DNA cuya secuencia se determinar
5
A
T G
C T
T G C
400
350
300
250
Todas las mezclas de reactivos contienen

dATP, dTTP, dGTP y dGTP y DNA polimerasa
200
(b)
+ddATP
+ddGTP
+ddCTP
ddA
T G
C T
T G C
dd A C
G A
ddA
ddA
G A G
G A G
C G
A G
ddA G
G
G
Sentido de la
sntesis
(c)
Productos de la reaccin
en la mezcla con
dideoxiATP
ddC
ddG
ddT
Fragmentos
Mayores
T
A
C
G
A
T
A
C
G
A
G
G
5
A
150
+ddTTP
100
75
50
GCAT
Fragmentos
Menores
(d)
(e)
Figura 3.10 Secuenciacin de segmentos de DNA por el mtodo enzimtico.

Fuente: Ville y colaboradores, 1998.
54
CEDAF
mento de DNA analizado se puede determinar de

un modo directo mediante lectura del gel, visualizando las bandas que aparecen escalonadamente
leyendo el gel de abajo hacia arriba los cuatro "carriles" de la autorradiografa.
Actualmente existen secuenciadores automticos
que permiten secuenciar hasta 96 muestras dife-
rentes de DNA en pocas horas. Dado que la resolucin de esta tecnologa llega hasta un solo
nucletido, la secuenciacin se ha convertido en la
forma ms precisa de medir la variabilidad y diversidad gentica. La masificacin tambin ha reducido significativamente el costo de la
secuenciacin.
3 .5 E j er ci ci o 3. 1 T ecnol o g a d e l D N A
r ecom bi nant e

cada grupo en cada una de las mesas de trabajo.
Objetivos
En cada grupo, los participantes deben analizar

e interpretar los diagramas de los patrones electroforticos y responder las siguientes preguntas:
Desarrollar el concepto de DNA recombinante.

Analizar e interpretar los patrones electroforticos: a) de un segmento de DNA digerido con
dos enzimas de restriccin; y b) de un plsmido
recombinante, digerido con una enzima de restriccin.
El siguiente ejercicio consiste en el anlisis de diagramas con muestras de un segmento de DNA digerido con dos enzimas de restriccin y un
diagrama de electroforesis de un plsmido sin inserto, con inserto y de un plsmido recombinante
digerido con la enzima de restriccin EcoRI. En
este ejercicio se busca que los participantes fijen el
concepto de DNA recombinante y sus aplicaciones.
a. Los sitios de reconocimiento y de corte de las

enzimas de restriccin EcoRI y Hind III en el
segmento de DNA son los mismos o diferentes.
Explique.
b. Cuntos sitios de reconocimiento y de corte
se presentan en el segmento de DNA para cada
una de las enzimas de restriccin del ejercicio?
c. Por qu el segmento de DNA sin digerir migra poco? Explique.
d. Por qu el plsmido pUC19:
- Sin inserto,
- con inserto y

que el instructor lea cuidadosamente las siguientes
instrucciones:
- con inserto y digerido con EcoRI presentan diferente patrn de bandas? Explique.
e. Haga un dibujo de un gel que presenta las siguientes muestras.
1. Plsmido pUC19 sin inserto.
Colocar en cada mesa un juego de los diagramas de los geles suministrados.
2. Plsmido pUC19 con un inserto de 1Kb.

3. Plsmido pUC19 con inserto de 2Kb
55
4. Un inserto de 1Kb
Motive una discusin a base de las respuestas
dadas.
Proporcione la informacin de retorno, con las
respuestas de este ejercicio.
Recursos necesarios
Diagramas de los patrones electrofrticos :
CEDAF
a. Los sitios de reconocimiento y de "corte" de

las enzimas de restriccin EcoRI y Hind III en
el segmento de DNA son los mismos o diferentes. Explique.
b. Cuntos sitios de reconocimiento y de "corte" se presentan en el segmento de DNA para
cada una de las enzimas de restriccin del ejercicio?
c. Por qu el segmento de DNA sin digerir migra poco? Explique.
a. de un segmento de DNA digerido con EcoRI

y Hind III, (Figura 1) y
d. Por qu el plsmido pUC19:

-
Sin inserto,
b. de un plsmido recombinante digerido con

EcoRI (Figura 2).
Con inserto y
Fotocopias con las Instrucciones e informacin

de retorno para los participantes.
De acuerdo con la informacin suministrada en la
seccin 3 y mediante el anlisis e interpretacin de
los diagramas de geles con un segmento de DNA
digerido con las enzimas de restriccin EcoRI y
Hind III y del gel con el plsmido pUC19:
a. sin inserto,
- Con inserto y degerido con EcoRI presentan diferente patrn de bandas? Explique.
e. Haga un dibujo de un gel que presenta las siguientes muestras.
1. Plsmido pUC19 sin inserto.
2. Plsmido pUC19 con un inserto de 1Kb.
3. Plsmido pUC19 con inserto de 2Kb
Al finalizar el Instructor les proporcionar la informacin de retorno.
b. con inserto y
Respuestas a las preguntas del ejercicio.
c. con inserto y digerido con Eco RI, los participantes

debern desarrollar el concepto de DNA recombinante.
Para la pregunta a
Pasos a seguir
Conforme cuatro grupos de trabajo de acuerdo
con las instrucciones dadas por el Instructor.
Nombrar un relator por grupo, el cual presentar en plenaria las respuestas dadas por el grupo.
Analizar e interpretar los diagramas suministrados y contestar las siguientes preguntas.
56
Son diferentes.
Primero, porque el nmero de fragmentos generados con EcoRI son 3, mientras que con
Hind III son 4.
Segundo, porque el tamao de los fragmentos
generados con cada una de las enzimas son diferentes.
CEDAF
Para la pregunta b
Hay 2 para EcoRI y 3 para Hind III.
Para la pregunta c
El segmento de DNA sin digerir es un DNA de
gran tamao y la migracin en el gel (en la electroforesis) es proporcional al tamao. Fragmentos
grandes migran poco, fragmentos pequeos migran mucho.
Para la pregunta d
El plsmido pUC19 sin inserto tiene un tamao de
3Kb, el plsmido pUC19 con un inserto de 1Kb
tiene un tamao de 4 Kb y el plsmido pUC19 con
un inserto de 1 Kb digerido con EcoRI libera el inserto, presentando 2 segmentos de DNA uno del
plsmido de 3 Kb y el otro que corresponde al inserto de 1 Kb.
En una electroforesis migracin as:
1. pUC19 (abierto)
2. pUC19 + I (1 Kb)
3. pUC19 + I (1 Kb)
digerido con Eco RI.

Segmento de DNA de 25 kb. 1) Sin digerir. 2) Digerido con EcoRI y 3) Digerido con Hind III.
Para la pregunta e
1. pUC19
2. pUC19 + I (1 Kb)
3. pUC19 + I (2 pK)
4. Inserto (1 Kb)
5. Inserto (2 Kb)
Plsmido pUC19. 1) sin inserto, 2) con un sinderto

de 1 kb, y 3) con inserto de 1 kb y digerido con EcoRI.
57
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CEDAF
Ori g i n a l e s pa r a T r a n sp a r e nc i a s
59
60
Enzimas modificadoras del DNA
Vectores
Hospederos
Herramientas
Utilizando
sondas"
Utilizando
anticuerpos
especficos
Seleccin de una
secuencia (gen)
especfica
Introduccin del
vector a una clula
hospedante para la
amplificacin
Unin de los
fragmentos a un
vector molecular
Generacin de
fragmentos de DNA
Clonacin y aislamiento
de genes
Tecnologa del DNA recombinante
CEDAF
importantes de esta tecnologa.
Describir las herramientas ms
tecnologa del DNA recombinante
Conocer los fundamentos de la
Objetivos
CEDAF
61
62
En DNA recombinante consiste en aislar segmentos

especficos de DNA para introducirlos en vectores
(plsmidos)a fin de formar mol
culas de DNA recombinantes que son introducidas
por transformacin a un hospedero (E. Coli) para el
mantenimiento y amplificacin del DNA
recombinante.
Es el conjunto de tcnicas involucradas en la

manipulacin del material gentico (DNA o RNA), la
cual se basa en la tecnologa del DNA recombinante.
Qu es la Ingeniera Gentica?
CEDAF
Produccin de animales y plantas

transgnicas.
Produccin de Enzimas y protenas por

clonacin de genes.
Identificacin y mapeo de genes.
Investigacin bsica (estructura y funcin

de los genes).
Utilizacin del DNA Recombinante
CEDAF
63
64
Seleccin de una secuencia especfica
Introduccion del vector a una clula

hospedante, para la amplificacin
Unin de los fragmentos

a un vector molecular
Generacion de fragmentos
de ADN
Etapas Bsicas para la

Clonacin de Genes
CEDAF
Replicacin
D NA
Transcripcin
Reversa
Transcripcin
mRNA
Traduccin
PRO TEINA
El Dogma Central de la Biologa
CEDAF
65
66
Los hospederos
Los vectores
Las enzimas modificadoras del DNA
Las enzimas de restriccin
Herramientas de la Ingeniera
Gentica
CEDAF
Identificacin y aislamiento de genes de un banco de cDNA.
presencia del producto gnico (proteina).
Utilizando anticuerpos especficos que pueden detectar la
parcial de la protena codificada por el gen.
Utilizando Sondas construidas a partir de una secuencia
Construccin de un banco del cDNA.
Pasos para el Aislamiento de Genes
CEDAF
67
68
CEDAF
CEDAF
Ma rc a d o r e s Mo l e c u l a r e s
Seccin 4
69
Seccin 4 .
CEDAF
Marc ador e s Mol e c u l ar e s
Tabla de Contenido
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.1 El genoma y la variabilidad gentica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.2 Los marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.3 Breve resea de algunos marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.4 Ejercicio 4.1 Marcadores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
70
CEDAF
Marcardores Molecurales
Caracterizac in y anlisis
de la variabilidad gentica
Identificacin de acervos
genticos
Mapeo de genes cualitativos y

cuantitativos
RFLPs
Microsatelites
RFLPs
Microsatelites
RAPDs
Seleccin asistida por
marcadores moleculares
Estrategias de fitomejoramiento
Majoramiento asistido por

Clonacin de genes con base a

mapas genticos
Identificacin y transferencia de
QTLs de germoplasma silvestre
Introgresin de transgenes
Microsatelites
RFLPs
RFLPs
Microsatlites
RFLPs
RFLPs
Microsatlites
AFLPs
Objetivos
Entender los principios bsicos de los marcadores moleculares.
Conocer algunas de sus aplicaciones en el mejoramiento vegetal.
1. Saban ustedes que cada uno de nosotros tiene un huella digital a nivel molecular llamada DNA fingerprinting?
2. Algn participante puede dar una definicin de genoma?
3. Saban ustedes que los marcadores moleculares nos permiten detectar cualquier cambio en los genomas de los
individuos y nos permite diferenciar individuos idnticos fenotipicamente?
71
CEDAF
In tro d u c ci n
El estudio de la diversidad gentica y la relacin
entre y dentro individuos de especies animales y
vegetales es un tema de mucho inters no slo para
los mejoradores sino tambin para otras disciplinas
biolgicas, incluyendo ecologa, medio ambiente y
biodiversidad.
La evaluacin de la variabilidad gentica entre individuos de una misma especie puede realizarse
mediante el uso de marcadores morfolgicos (fenotipo), marcadores bioqumicos (isoenzimas) y
marcadores moleculares basados en el DNA (genotipo). Los dos primeros permiten realizar el estudio indirecto del genoma, ya que ambos son
producto de la expresin gnica. Estos fueron de
gran utilidad en el desarrollo de los primeros sistemas de clasificacin y las primeras versiones de
mapas genticos. Los marcadores moleculares sin
embargo, permiten realizar la caracterizacin y
evaluacin directa de los genomas de los individuos.
Un marcador molecular es un segmento especfico
de DNA correspondiente a regiones codificantes o
no codificantes del genoma y cuya secuencia puede o no ser conocida.
El objetivo de esta seccin es presentar en forma
didctica los principios y usos de los marcadores
moleculares, ms utilizados. En las Tablas 4.1 y
4.2 se presenta un anlisis comparativo de las ca-
Tabla 4.1 Anlisis comparativo de los principales marcadores moleculares utilizados para el anlisis gentico de
plantas. Fuente: Ferreira y Grattapaglia, 1995.
Variable
RFLPs
Modo de observacin del

polimorfismo
Fragmentos de restriccin
de DNA detectado por
hibridizacin con una sonda
de DNA genmico o de
DNA
Expresin gentica
Co Dominante
Nmero de alelos por locus
Multialtico
Disponibilidad de marcadores Prcticamente ilimitada
en el genoma
Distribucin en el genoma
Regiones con bajo nmero
de copias; mediante
repetitivas en telomeros y
centromeros (minisatelite)
Transferencia de la ocurrencia Intra especfica; alta para
de los marcadores
especies prximas
Pasos para su deteccin.
Informacin previa para la

aplicacin de la tcnica
Accesibilidad
Costo de implementacin /
costo de operacin
72
Extraccin de DNA
Digestin con Enzima de
restriccin
Electroforesis (agoniza)
Transferencia membrana
Nylon
Hibridacin con sonda
Autorradiografa
Construccin de banco de
DNA genmico o de cDNA
de la especie para obtencin
de las sondas
Media
Medio / medio
RAPDs
Microsatlites
AFLPs
Segmentos de DNA
amplificados
aleatoriamente
Ampliacin especfica de
regiones con secuencias
repetitivas.
Segmentos amplificados va
PCR despus de digestin con 2
enzimas de restriccin
Dominante
2 alelos (binarios)
Prcticamente ilimitada
Co Dominante
Altamente Multialtico
Prcticamente ilimitada
Dominante
2 alelos (binario)
Prcticamente Ilimitada
Ms o menos en todo el
genoma
genoma
genoma
Intra poblacional; media

Intra especfica
Extraccin del DNA
. Amplificacin va PCR
Electroforesis (agarosa)
Tincion con bromuro del
etidio
Visualizacin de bandas
con luz U.V
Intra especfica; baja para

especies prximas
Intrapoblacional y media
intraespecfica
Extraccin del DNA

Amplificacin especfica va
PCR
Electroforesis en gel de
poliacrilamida o agarosa
Autorradiografa o
coloracin con bromuro del
etidio.
Extraccin de DNA
Digestin con EcoRI y MseI
Ligacin de adaptadores
Amplificacin va PCR
Electroforesis (acrilamida)
Autorradiografa.
Utilizacin inmediato de
Primers arbitrarios
disponibles en el
mercado.
Construccin de banco de
DNA genmico
Seleccin de clones con
microsatlites adecuados
Secuenciacin de los clones.
Construccin de los primers
Ensayo del polimorfismo
con estos primers
Muy baja
Muy alto / medio
Ensayos de combinaciones de
enzima / primers con bases
arbitrarias adecuados.
Muy alta
Bajo / bajo
Media
Bajo / bajo
CEDAF
Telmero
ractersticas de los cuatro principales marcadores

moleculares utilizados en el mejoramiento gentico
de plantas.
Satlites Variables
Tabla 4.2 Anlisis de la eficiencia de los marcadores

moleculares en diferentes aplicaciones del anlisis gentico. Fuente: Ferreira y Grattapaglia (1995).
RFLPs
RAPDs
MICROSATELITES
Muy alta
Identificacin de
genotipos
Alta
Muy
alta
Muy alta
Evaluacin de
germoplasma
Alta
Alta
Alta
Muy alta
Mapeo gentico
Alta
Alta
Muy alta
Alta
Mapeo direccionado
a regiones
especficas
Media
Muy
alta
Media
Muy alta
Mapeo comparativo
Muy
alta
Media
Baja
Alta
Baja
Alta
Muy alta
Muy alta
Gentica de
algamas
Muy
alta
Muy
alta
Muy alta
Muy alta
Anlisis filogentico
Muy
alta
media
Alta
Media
Gentica de
autgamas
AFLPs
4 .1 E l genom a y l a var i a b i l i d a d g e n t i c a
El trmino genoma se refiere al contenido gentico
total de un organismo. En las plantas el genoma est
constituido por el contenido gentico nuclear y organelar (mitocondrias y cloroplastos). Sin embargo, el
trmino genoma casi siempre se utiliza para referirse
a la informacin gentica presente slo en el genoma
nuclear. Los cromosomas de las plantas contienen
una gran cantidad de DNA y su organizacin es muy
compleja (Figura 4.1). Presenta regiones codificantes (genes) separados por largas regiones de DNA no
codificante; stas a su vez estan formadas por bloques de secuencias repetitivas denominadas VNTRs
(del ingls variable number of tandem repeats), que
fueron identificados por primera vez en el genoma
humano. Adems dentro de las regiones codificantes
(genes) hay pequeas regiones no codificantes (Intrones), que tambin estn formadas por secuencias repetidas (Figura 4.2).
rDNA
Genes
Repeticiones en Tandem
Centrmero
Genes
Telmero
Figura 4.1 Distribucin de la informacin en un cromosoma. Fuente: Tohme, J., (Comunicacin personal, 1998)
GEN
DNA
Flanqueador
GEN
DNA
Codificante
DNA
Flanqueador
Figura 4.2 Organizacin del DNA en el cromosoma.

El DNA en el cromosoma est organizado en genes y
DNA espaciador. El DNA espaciador adyacente a los genes se llama DNA flanqueador.
El DNA codificante, codifica para protenas y el DNA
flanqueador regula la expresin de los genes. Por ejemplo:
Secuencias de Iniciacin
Secuencias de terminacin
Promotores
Activadores
Silenciadores
73
Existen adems copias de genes no funcionales

(seudogens) que son incapaces de expresarse debido a deleciones u otras alteraciones en su secuencia. En resumen, los genes de los organismos
eucariotes pueden presentarse como copia nica o
como copias mltiples organizados en familias de
genes, o dispersos en los diferentes cromosomas.
Durante la divisin celular cada organismo reproduce una copia fiel de su genoma. Sin embargo,
existen muchos mecanismos que pueden causar alteraciones en el DNA durante la evolucin y seleccin natural y / o artificial. Los cambios pueden
ser simples, es decir que afectan slo un par de bases (mutacin puntual); o grandes cambios como
resultado de inversiones, translocaciones, deleciones o transposiciones. Si a esto le sumamos los intercambios genticos que ocurren en los procesos
de recombinacin, durante la reproduccin sexual,
resulta una gran variabilidad en las secuencias de
los genomas de los individuos. Esta variabilidad
es aprovechada en el mejoramiento gentico de
plantas y animales; y es fuente de genes para la
biotecnologa.
La variabidad gentica puede ser detectada de diferentes maneras:
a. Usando marcadores morfolgicos y marcadores
bioqumicos (isoenzimas) que son productos de la
expresin de los genes y
b. Usando los marcadores moleculares, que permiten
detectar diferencias entre individuos directamente
a nivel de las secuencias del DNA de su genoma.
Los marcadores visibles (fenotipo) como son las

mutaciones en genes con consecuencias en la morfologa, por ejemplo, el color de los ojos en la
mosca de la fruta (Drosfila melanogaster) han
sido usados en estudios genticos desde comienzos
del siglo XX.
CEDAF
En 1959, Market y Moller mostraron diferencias

genticas usando cambios en la tasa de migracin
de isoenzimas a travs de un gel de almidn, en un
campo elctrico (electroforesis).
Estos marcadores (morfolgicos y bioqumicos)
fueron tiles para la construccin de los primeros
mapas genticos de algunos organismos en la dcada del 70. Sin embargo, estos marcadores presentan algunos inconvenientes para una buena
evaluacin del genoma de un organismo:
a. Un reducido nmero de marcadores que no permite
hacer un buen cubrimiento del genoma;
b. Efecto ambiental en la expresin de ellos;
c. "Enmascaramiento" de la expresin de los genes
recesivos;
d. Efectos epistticos, etc.
Con el descubrimiento de las enzimas de restriccin, el desarrollo de las tcnicas del DNA recombinante, y de la tcnica de PCR (Reaccin en
cadena de la polimerasa), se desarrolla una nueva
clase de marcadores, denominados marcadores
moleculares, los cuales son el objetivo de esta seccin.
4 . 2 L o s m a rc a d o re s m o l e c u l a r e s
Los marcadores moleculares (MM) son un grupo
de tcnicas que permiten el estudio del genoma de
un organismo a nivel del DNA. Los MM estn basados en el grado de polimorfismo (diferencias)
que ocurre naturalmente en el material gentico de
los organismos eucariticos superiores, debido a la
gran complejidad en la estructura de sus genomas.
Para ser til, un marcador molecular debe reunir
las siguientes propiedades:
a. Que sea altamente polimrfico, es decir, que permita
claramente diferenciar dos indivduos;
b. Que sea codominante, para que permita discriminar
un individuo homocigoto de uno heterocigoto;
c. Que este distribuido a travs del genoma;
74
CEDAF
d. Que no presente efecto pleiotrpico , es decir, que un

gen no afecte ms de una caracterstica;
e. Que sea de fcil y rpida ejecucin, con mira a una
posible automatizacin;
f. Que tenga alta reproducibilidad;
g. Que permita el fcil intercambio de datos entre
laboratorios.
Los marcadores moleculares permiten estimar :

El nmero de genes responsables de una caracterstica.
La localizacin cromosmica de genes, por
ejemplo, cerca de qu marcador molecular?
El efecto fenotpico, es decir, cunto afecta
cada gen la caracterstica?
La dosis gnica (o accin gnica): un individuo con dos copias del gen es diferente de
aquel que presente una sola copia?
La pleiotropa: un gen afecta ms de una caracterstica?
La sensibilidad ambiental: la funcin de los
genes es similar en diferentes ambientes?
4 . 3 B r e v e r e se a d e a l g u n o s
4 . 3 . 1 P o l i m o r fi sm o e n l a l o n g i t u d d e
l o s f r a g m e n to s d e r e s t r i c c i n
(en ingls RFLPs)
La presencia o ausencia de sitios de reconocimiento para una determinada enzima de restriccin puede variar en los genomas de los diferentes
individuos, lo cual puede generar un polimorfismo
(Figura 4.3). Las diferencias en los sitios de reconocimiento para una enzima de restriccin puede
ser debido a la ocurrencia de : mutaciones puntuales, inserciones, deleciones, o rearreglos en el genoma debido a translocaciones o inversiones,
alterando asi la distancia entre los sitios de corte de
la enzima. Esto genera segmentos de DNA (fragmentos de restriccin) de diferentes tamaos.
Cuando el genoma es pequeo (por ejemplo, de
una bacteria o de un virus), estos fragmentos pueden ser separados por electroforesis en un gel de
La epistasis: el efecto de un gen influencia el

efecto de otros genes?
Es concepto de marcadores moleculares ha revolucionado la
habilidad de detectar regiones
(segmentos) dentro del genoma,
responsables de caracteres importantes (cuantitativos), y ha
acelerado el proceso de construccin de mapas genticos lo
cual permite un mejoramiento
ms dirigido. Los MM son discretos, codominantes, no deletreos, sin efecto ambiental, libre
de epstasis y pueden ser generados en nmero ilimitado, permitiendo una cobertura saturada
del genoma.
ER
A __ __ ___________________________ __ __
1
B __ __ ________________________ __ __
S onda
A
Figura 4.3 Base molecular del polimorfismo de los marcadores moleculares

RFLPs. 1. Digestin de segmentos homlogos de DNA genmico de dos individuos (A y B) con una misma enzima de restriccin (ER). 2. Separacin de los
fragmentos por electroforesis. El polimorfismo se aprecia en la diferencia de
los tamaos de los fragmentos de restriccin. Fuente: Bernatzky, R., 1988.
75
CEDAF
agarosa y visualizados al "teir" el gel con una solucin de bromuro de etidio (Figura 4.4).
de mejoramiento. Algunas de stas son: el nmero

de RFLPs es ilimitado, no presentan efectos pleiotrpicos ni epistticos, la herencia de los fragmentos es mendeliana y estable, y son codominantes.
(Figura 4.6). Tambin los RFLPs pueden ser analizados en todas los tejidos y a cualquier edad fisiolgica del individuo; las muestras de DNA pueden
ser almacenadas por largos perodos de tiempo; se
puede obtener un nmero ilimitado de combinanciones enzimas/sondas; los genes heterlogos pueden ser usados como sondas y se puede analizar
varios loci con una sonda.
DNA
Genmico
Digestin
con enzima de Restriccin
7kb
3kb
0
5kb
(-)
10kb
1.5kb
Fragmentos
de Restriccin
10kb
7kb
5kb
3kb
Separacin de
los fragmentos
por su tamao
1.5kb
(+)
Extraccin de DNA
Ezimas de restriccin
Fragmentos de DNA
Pst 1
Fragmentos de DNA
Plsmido
Figura 4.4 Separacin y visualizacin de los

fragmentos de restriccin utilizando la tcnica
de electroforesis en geles de agarosa.
Fragmentos de
500 A 2500 bp
Ligamiento
Cuando el genoma es grande (por ejemplo, plantas o animales), los fragmentos

generados son separados por electroforesis, transferidos a una membrana de
nylon (Southern blot), donde son fijados
a la membrana con luz ultravioleta. Las
membranas se tratan con una solucin alcalina para abrir las cadenas y luego se
hibridiza con una sonda radioactiva o no
radioactiva (hibridizacin). Finalmente
la membrana se expone a una pelcula de
rayos X que al revelar se obtiene una autorradiografa que permite visualizar el
polimorfismo. (Figura 4.5).
Los RFLPs presentan ventajas que los
hacen atractivos y tiles en programas
76
Plsmidio
abierto
+
Fragmento
Transferencia a membrana
de nitrocelulosa
Clulas
Competentes
Sonda radiactiva
Fragmentos
de DNA
(Muchas copias PstI)
Hibridacin
Plsmido con
fragmento
de DNA
Autorradiografa
Clula
transformada
por el plsmido
Colonias de
Plsmidos
Genoteca
Selecciona
colonias con
plsmido que
contienen los
fragmentos
Anlisis
Figura 4.5 Secuencia del proceso de deteccin de los RFLPs en genomas grandes (por ejemplo, animales y plantas).
Pst1= Endonucleasa de restriccin obtenida de la bacteria Providencia Stuartii; bp= pares de bases. Fuente: Ramrez y colaboradores,
1991.
CEDAF
R/R
b. Alineamiento de los "primers" a las cadenas del

DNA patrn, a una temperatura muy cercana al Tm
(temperatura a la cual el 50% del DNA est
desnaturalizado), generalmente entre 37-60 oC;
8 kb
r/r
6 kb
6kb/6kb
8kb/8kb
R/r
c. Extensin de los "primers": la Taq polimerasa

incorpora desoxirribonucletidos a la cadena nueva,
produciendo una copia complementaria del DNA
patrn, a una temperatura de 72 oC.
8 kb
6 kb
F1
8kb/6kb
R/r
R/R
F2
6 kb
6kb/6kb
8kb/6kb
r/r
R/r
8 kb
8 kb
6 kb
6 kb
8kb/6kb
8 kb
8kb/8kb
Figura 4.6 Anlisis gentico de plantas utilizando marcadores moleculares RFLPs. Fuente: Kochert, G. 1989.
Las copias de DNA aproximadamente se duplican

en cada ciclo. En la prctica la amplificacin no es
100% eficiente, pues en 20 ciclos, la produccin es
de 105 a 108 veces la cantidad inicial de segmentos
de DNA. Esta escala de amplificacin permite iniciar el proceso con cantidades mnimas de DNA
(del orden de picogramos o nanogramos), y terminar con grandes cantidades de una secuencia especfica de DNA. (Figura 4.7).
Secuencia que se va
a amplificar
4 .3 . 2 M arcadores mol ec u l a r e s b a sa dos en l a reacci n e n c a d e n a d e

l a pol i meras a ( P C R )
La reaccin cadena de la polimerasa (PCR) es un
mtodo para la multiplicacin in vitro de secuencias especficas de DNA. Se utilizan "primers" (cebadores) que delimitan la regin de inters en el
DNA que se va a amplificar o multiplicar. El PCR
fue descubierto por K. Mullis en la dcada de los
80s. En 1988, Saiki y colaboradores aislaron una
DNA polimerasa de la bacteria termoflica Thermus aquaticus, denominada "Taq polimerasa", la
cual es termoestable a altas temperaturas. Este hallazgo permiti la automatizacin del PCR.
DNA Original
Ciclo 1
Ciclo 2
Ciclo 3
La tcnica PCR consiste de una serie repetitiva de

ciclos (20-40), consistiendo cada una de tres etapas:
a. Desnaturalizacin del segmento de DNA que se va a
amplificar, generalmente se utiliza una temperatura
de 94oC;
Ciclo 4, etc.
Figura 4.7. Principio de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).Fuente: Weising y colaboradores, 1995.
77
CEDAF
La naturaleza molecular del polimorfismo de los

RAPDs no est totalmente conocida. Evidencias
experimentales indican que diferencias de apenas
un par de bases (mutacin puntual) es suficiente
para que no haya una perfecta complementaridad
del "primer" con el sitio de iniciacin, impidiendo
la amplificacin de este segmento.
La tcnica del PCR es aplicable a muchas reas bsicas y prcticas; por ejemplo: diagnstico, investigaciones mdicas, medicina forense, y es base para
la utilizacin prctica de los marcadores moleculares como: RAPDs, microsatlites, AFLPs, etc.
4 .3 .3 Po l i morf i s mo de D N A a m p l i fi c a d o al eat ori ament e ( en i n g l s
RA P D s )
El polimorfismo gentico detectado por los marcadores RAPD tambin son de naturaleza binaria,
esto significa que un segmento amplificado (banda
en el gel) puede estar presente o ausente (Figura
4.8).
Esta metodologa permite detectar polimorfismos

de secuencias de nucletidos, utilizando solamente
un "primer" (decanucletido) de secuencia "arbitraria" para la amplificacin del DNA.
Una limitacin de los RAPDs (por ser marcadores

dominantes), es la dificultad de discriminar directamente los genotipos homocigotos.
La mayor ventaja de esta tcnica es que no se requiere informacin de la secuencia del DNA, adems el protocolo es relativamente rpido y fcil de
realizar y no utiliza radioctividad. Como esta tcnica esta basada en la amplificacin de segmentos
por medio del PCR, se necesita poca cantidad de
DNA genmico (nanogramos
Individuo A
Adems, los perfiles de amplificacin pueden variar de un laboratorio a otro debido a diferencias en
los termocicladores utilizados.
Individuo B
5
P rime rs
1.5 kb
1.0 kb
3.0 kb
1.5 kb
3kb
5kb
1.5kb
2.5 kb
3.0 kb
S e pa ra cin de los
fra gmentos por
e le ctrofores is
1.0kb
Figura 4.8 Base molecular del polimorfismo de los RAPDs. Fuente: Adaptado por Ramrez, H., 1993.
78
CEDAF
4 .3. 4
M i cros at l i t es
Los microsatlites o secuencias simples repetidas

(SSR - Simple Sequence Repeats) son secuencias
pequeas de 1a 4 nucletidos que se repiten en bloques. En los genomas de los organismos eucariticos, estas secuencias simples son ms frecuentes,
bin distribuidas y presentan loci genticos altamente polimrficos.
Este tipo de secuencias varan entre animales y vegetales. Por ejemplo, en mamferos las secuencias
ms comunes son (GT)n y (CA)n, donde n representa el nmero de veces que se repite la secuencia.
En plantas, las secuencias ms comunes son (AA)n
y (AT)n. Wu y Tanksley encontraron en 1993 que
en el genoma de maz y arroz las secuencias ms
comunes son (GA)n, (GT)n y las complementarias
(CT)n y (CA)n.
Los microsatlites pueden ser amplificados individualmente va PCR, utilizando un par de "primers"
especialmente diseados (de 20-30 bases), complementarios a las secuencias nicas que limitan
(flanquean) los microsatlites. Los segmentos amplificados son separados por electroforesis en un
gel de agarosa y visualizados, despus de la tincin
con bromuro de etidio, en una pantalla con luz ultravioleta.
La base molecular del polimorfismo radica en la
diferencia del nmero de unidades repetidas en los
diferentes loci de microsatlites. Cada segmento,
de tamao diferente (amplificado generalmente
desde varias decenas hasta centenas de pares de
bases) representa un alelo diferente de un locus.
Los microsatlites amplificados va PCR ofrece
ventajas como:
a. Su alto polimorfismo, y por consiguiente son
altamente informativos;
b. Son codominantes, lo que permite diferenciar
individuos homocigotos y heterocigotos;
c. Disponibilidad de una buena coleccin de diferentes

microsatlites, algunos de los cuales ocurren en alto
nmero de copias;
d. Estn ms o menos dispersos a travs del genoma;
e. La tcnica puede ser automatizada.
Por estas caractersticas, los microsatlites son

ideales para el mapeo gentico y mapeo fsico de
genomas, para la identificacin y discriminacin
de genotipos y para estudios de gentica de poblaciones.
4.3.5 Polimorfismo en la longitud de
f r a g m e n to s a m p l i f i c a d o s ( e n i ngls AFLPs)
La tcnica AFLP se basa en la amplificacin selectiva, va PCR, de fragmentos de restriccin de
DNA genmico. La tcnica comprende cuatro etapas:
1. Generacin de fragmentos de restriccin de DNA
genmico.
2. Ligacin de adaptadores especficos a los
fragmentos.
3. Amplificacin selectiva de un grupo de fragmentos
va PCR.
4. Separacin de los fragmentos amplificados por
electrosforesis y anlisis de los fragmentos
amplificados.
La base molecular del polimorfismo de los AFLPs,

al igual que el de los RFLPs, se debe a las diferencias en los sitios de reconocimiento de las enzimas
de restriccin utilizados en el estudio (en este caso
EcoRI y MseI). Estos cambios se deben a mutaciones puntuales, inserciones, deleciones, o rearreglos
en el genoma debido a translocaciones e inversiones, lo cual causa la prdida o ganancia de secuencias de reconocimiento.
Los AFLPs, al igual que los RAPDs, son marcadores dominantes, lo cual no permite diferenciar individuos homcigotos de heterocigotos.
79
El poder de la tcnica de AFLP se basa en las variaciones genticas que existen entre especies, variedades o cultivares estrechamente relacionados.
Estas variaciones en su secuencia del DNA son explotadas por esta tcnica para la obtencin rutinaria de "fingerprintings" (huellas dactilares) de un
genotipo en particular. Estos "fingerprintings" son
simples RFLPs amplificados selectivamente va
PCR.
Desde su desarrollo, esta tcnica ha sido utilizada
para discriminar genotipos, para mapeo gentico
localizado (Bulk Segregant Analysis) y para la
construccin de mapas genticos.
4 .3 .6 Marcaj e de s ecuenci as e x p r e sa d as ( en i ngl s E ST s )
Los ESTs son secuencias cortas de DNA (200-500
pb) de clones seleccionados al azar de un banco de
cDNA. El propsito de estas secuencias es realizar
un monitoreo rpido de todos los genes que conforman el genoma de un cultivo en particular, con el
fin de "marcar" su localizacin en los cromosomas.
Una aplicacin obvia de los ESTs es la identificacin, localizacin y aislamiento de nuevos genes,
en donde la secuencia EST es utilizada como "sonda" para "pescar" el gen completo en un banco genmico o en bancos de cromosomas artificiales
YACs (yeast artificial chromosomes) o BACs
(bacterial artificial chromosomes).
Los ESTs tambin se utilizan para identificar y aislar genes homlogos en cultivos relacionados. En
especies no relacionadas, la comparacin de los
ESTs permite la identificacin de secuencias altamente conservadas que luego se utilizan para disear "primers" apropiados para aislar los genes
completos en bancos genmicos o de cromosomas
artificiales de los respectivos cultivos.
80
CEDAF
Los ESTs son tiles para la construccin de "sondas" de genes especficos para el anlisis de la expresin diferencial de familias multignicas.
Adems se usan para el mapeo y secuenciacin del
genoma, utilizando clones de cromosomas artificiales (YACs o BACs).
En conclusin, los ESTs constituyen una valiosa
herramienta que es muy til en los programas de
mejoramiento animal y vegetal.
4 . 3 . 7 M i n i sa t l i te s
Los organismos superiores presentan gran abundancia de DNA repetitivo, que podra comprender
ms del 90% del DNA total en ciertos genomas de
plantas. El trmino minisatlite designa a una familia de secuencias repetitivas organizadas en bloques. Esta clase de DNA consiste de pequeas
unidades (10-60 pb) y presentan un bajo grado de
repeticin en locis determinados.
En 1985 Alec J. Jeffreys y su grupo, describieron la
presencia de minisatlites en el genoma humano y
aislaron dos regiones conservadas: una llamada
33.6 de 16 pb, y otra denominada 33.15 de 20 pb.
Ambas regiones conservadas son conocidas como
las sondas de "Jeffreys".
Genomas humanos hibridizados con una sonda de
Jeffreys produce un patrn de bandas un poco
complejo. Este patrn de muchas bandas es lo que
constituye un "fingerprinting" de DNA el cual es
nico para cada individuo. Esto se debe a la gran
variabilidad en los minisatlites dentro de la especie Homo sapiens.
En los ltimos aos, no slo se han descubierto
marcadores moleculares de gran poder de resolucin, sino que tambin se ha simplificado y masificado su uso. Entre los usos ms importantes de los
CEDAF
MM en el mejoramiento gentico de
plantas se encuentran:
1. En el manejo de germoplasma:
caracterizacin y anlisis de la
variabilidad gentica, identificacin de
acervos genticos y de parentales para
el mejoramiento. Los marcadores ms
apropiados para estas aplicaciones son
los RFLPs, y los microsatlites.
2. El mapeo de genes cualitativos y
cuantitativos (QTLs). Los marcadores
ms usados: RFLPs, microsatlites y
RAPDs.
3. En estrategias de fitomejoramiento:
seleccin asistida por marcadores
(marcador apropiado: microsatlites),
identificacin y transferencia de QTLs
de germoplasma silvestre (marcador:
RFLPs) e introgresin de transgenes
(marcadores apropiados: RFLPs y
microsatlites).
4. Mejoramiento asistido por marcadores
moleculares (marcador: RFLP). (Figura
4.9).
Mapa Molecular con RFLPs
20
2
1
12
Ensayo de Campo con

Poblaciones de Inters
23
7
18
9
19
11
16
3
13
5
21
25
4
8
10
14
15
17
24
Correlacin de datos de campo con

marcadores de RFLP
Los marcadores RFLPs con correlaciones positivas

son tiles para el monitoreo de los caracteres
Un programa de mejoramiento con estas poblacin puede tener

xito si se seleccionan los marcadores RFLPs apropiados
5. Clonacin de genes con base a mapas Figura 4.9 Utilizacin de un mapa molecular en un programa de mejoragenticos (marcadores apropiados: miento vegetal. Fuente: Tohme, J. (comunicacin personal, 1997).
RFLPs, microsatlites y AFLPs).
Para realizar numerosas aplicaciones,

la construccin de mapas genticos moleculares es un paso previo necesario (Figura 4.10). Actualmente existen mapas
genticos basados en marcadores moleculares para un nmero grande de especies
econmicamente importantes.
Entre estas se encuentran : maiz, tomate,
arroz, soya, frijol, yuca, algodn, caa de
azcar, naranjo, tabaco, manzano, cebada, zanahoria, esprrago, alfalfa y girasol.
(7.7%)
(2.6%)
Cromosoma 4
Diat
Marcador
cM
Id
(45)
10.4
(11)
7.8
(23)
2.6
(36)
(17.9%)
18.8
(2.8%)
(3.2%)
2.8
3.2
(16.9%)
17.6
REC
Frac.
(10.3%)
Nombre
RG 143
RG 463
RG214
RG864
(3)
(25)
(15)
Pi (t)
B10700
B8350
(33)
C15600
Figura 4.10 Ejemplo de un grupo de ligamiento construido con marcadores moleculares. Fuente: Tohme, J., 1996.
81
CEDAF
4 .4 Eje r ci ci o 4. 1 Mar cador es

m o le cul ar es
b. Si se cruzan dos plantas F1, de qu color sern las

flores de las plantas de la F2?
Objetivos
c. En la F2 es posible diferenciar las plantas de flores

rojas homocigotas de las plantas de flores rojas
heterocigotas? Explique.
Desarrollar el concepto de marcadores moleculares .

Identificar individuos homocigotos y heterocigotos utilizando: a) marcadores morfolgicos,
y b) marcadores moleculares.
Confirmar el poder de discriminacin que tienen los marcadores moleculares.
Este ejercicio consiste en identificar en un diagrama, individuos homocigotos y heterocigotos utilizando marcadores morfolgicos y marcadores
moleculares (RFLPs).
Con este ejercicio se busca que los participantes fijen el concepto de marcadores moleculares y sus
aplicaciones.
d. Utilizando marcadores moleculares, cmo hara

usted para diferenciar plantas de flor roja
homocigotas de plantas de flor roja heterocigotas?
e. Explique con un ejemplo, cmo se puede utilizar un
marcador molecular en un programa de
mejoramiento.
- Presentar por escrito las respuestas a las

preguntas de este ejercicio.
- Motive una discusin con base en las
respuestas dadas.
- Proporcione la informacin de retorno
suministrando las respuestas a las preguntas a
este ejercicio.

que el Instructor lea cuidadosamente las siguientes
instrucciones:
Recursos necesarios
- Cuatro mesas medianas y un sitio de trabajo.

Colocar en cada mesa 5 plantas con flores rojas
( por ejemplo, claveles) y dos plantas con flores
blancas.
cada grupo en cada una de las mesas.
En cada grupo los participantes deben responder las siguientes preguntas:
Si el color de la flor es un carcter monognico
(RR = rojo y rr = blanco). Al cruzar una planta de
flor roja homocigtica (RR) con una planta de flor
blanca (rr) :
- Papelgrafo, papel, marcadores.
- 20 plantas con flores rojas (por ejemplo,

claveles) y ocho plantas con flores blancas en
materas o bolsas de plstico.
Con la informacin suministrada en la Seccin 4 y
con la identificacin de un marcador molecular
para diferenciar plantas de flores rojas homocigticas de plantas de flores rojas heterocigticas, los
participantes debern construir el concepto de
marcadores moleculares.
a. De qu color sern las flores de las plantas de la F1?

Explique.
82
CEDAF
Pasos a seguir
Respuestas
Conforme cuatro grupos de trabajo de

acuerdo con las instrucciones dadas por el
Instructor.
Para la pregunta a
Nombrar un relator por grupo, el cual presentar en plenaria las respuestas dadas
por el grupo.
Contestar por escrito las respuestas a las
siguientes preguntas:
Sern rojas, porque:
P1
RR
(roja)
Si el color de la flor es un caracter monognico (RR = rojo y rr = blanco). Al cruzar una

planta de flor roja homocigtica (RR) con
una planta de flor blanca (rr) :
c. En la F2 es posible diferenciar las plantas de

flores rojas homocigotas de las plantas de
flores rojas heterocigotas? Explique.
d. Utilizando marcadores moleculares, cmo
hara usted para diferenciar plantas de flor roja
homocigotas de plantas de flor roja
heterocigotas?
Porque el alelo R es dominante sobre el alelo r.

Para la pregunta b
Sern de flores rojas y de flores blancas en una proporcin de 3 : 1.
e. Explique con un ejemplo, cmo se puede

utilizar un marcador molecular en un
programa de mejoramiento.
Al final el instructor les proporcionar la

Rr
informacin de retorno a las preguntas
(rojas)
planteadas.
Rr
(rojas)
(rojas)
Informacin de retorno
Respuestas a las preguntas realizadas en este
ejercicio.
F1
Rr
(roja)
a. De qu color sern las flores de las plantas de

la F1? Explique.
b. Si se cruzan dos plantas F1, de qu color
sern las flores de las plantas de la F2?
P2
rr
(blanca)
RR
Rr
3
(blancas)
rr
Rr
:
F2
Si el color de la flor es un caracter monognico (RR = rojo y rr = blanco). Al cruzar una

planta de flor roja homocigtica (RR) con
una planta de flor blanca (rr) :
83
CEDAF
B i b l i o g r a f a
Porque:
Para la pregunta c
No es posible. Las plantas RR y Rr son de flores rojas porque el alelo R es dominante sobre el alelo
r.
Para la pregunta d
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Figura 4.6 Anlisis gentico de plantas utilizando marcadores moleculares RFLPs. Fuente: Kochert, G. 1989.
Para la pregunta e
En tomate, la resistencia a nemtodos es un carcter monognico. Este carcter est asociado a un
marcador molecular (RFLP). A travs de este marcador molecular, es posible seleccionar los materiales de tomate resistentes a nemtodos, en un
programa de mejoramiento para este carcter.
84
CEDAF
85
86
Majoramiento asistido por

Estrategias de fitomejoramiento
Mapeo de genes cualitativos y

cuantitativos
Caracterizac in y anlisis
de la variabilidad gentica
Identificacin de acervos
genticos
Clonacin de genes con base a

mapas genticos
RFLPs
Microsatlites
AFLPs
RFLPs
Introgresin de transgenes
Identificacin y transferencia de
QTLs de germoplasma silvestre
Seleccin asistida por

RFLPs
Microsatelites
RAPDs
RFLPs
Microsatelites
Marcardores Molecurales
RFLPs
Microsatlites
RFLPs
Microsatelites
CEDAF
el mejoramiento vegetal.
Conocer algunas de sus aplicaciones en
marcadores moleculares.
Entender los principios bsicos de los
Objetivos
CEDAF
87
88
complejidad de sus genomas.
eucariticos superiores, debido a la gran
material gentico de los organismos
(diferencias) que ocurre naturalmente en el
Estn basados en el grado de polimorfismo
nivel del DNA.
estudio de gemona de los organismos a
Son un grupo de tcnicas que permiten el
Qu son los marcadores moleculares?
CEDAF
Que tenga alta reproducibilidad.
Que sea de fcil y rpida ejecucin.
Que est distribuido a travs del genoma.
Que sea co dominante.
Que sea altamente polimorfico.
Propiedades de un marcador
molecular
CEDAF
89
90
Minisatlites.
Marcaje de secuencias expresadas (ESTs).
Polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados (AFLPs).
Microsatlites.
Polimorfismo de DNA amplificado aleatoriamente (RAPDs).
Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLPs).
Breve resea de algunos grupos moleculares
CEDAF
CEDAF
T r an sfor ma ci n g en t i c a d e p l a n t a s
Seccin 5
91
Seccin 5 .
CEDAF
Trans for mac i n ge n t i c a de pl an t as
Tabla de Contenido
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.1 Porqu transformar plantas? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.2 Un vector natural para introducir genes forneos a las plantas . . . . . . . . . . . . . 95
5.3 Transformacin gentica de plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens . . . . . . 98
5.4 Transformacin por introduccin directa de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
5.5 Logros de la ingeniera gentica de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
5.6 Ejercicio 5.1 Transformacin gentica de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
Originales para transparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
92
CEDAF
Transformacin Gentica de Plantas
Bombardeo de
partculas o biolsticas
Construccin
Gentica
Transformacin
gentica va Agrobacterium
Explante
Explante o protoplastos
CO - cultivo
Regeneracin de plantas en
medio de seleccin
Plantas Transgnicas
Prueba de
transgnesis
Pruebas
genticas
Ensayos
agronmicos y de
bioseguridad
Mercado
Mejoramiento
convencional
Objetivos
Conocer los fundamentos de la transformacin gentica de plantas.
Conocer los dos mtodos ms utilizados para transformar plantas.
1. Saban ustedes que es posible producir hormona de crecimiento humana en plantas de tabaco?
2. Algn participante nos puede decir que es una planta transgnica?
3. Saban ustedes que el Agrobacterium tumefaciens, una bacteria del suelo, ha venido realizando ingeniera
gentica desde hace miles de aos?
93
CEDAF
In tro d u c ci n
La transformacin gentica de plantas se refiere a
la introduccin de genes modificados (llamados
genes quimricos) al genoma de las clulas vegetales, utilizando un mtodo apropiado. Los mtodos
de transformacin ms utilizados son: mediante
Agrobacterium tumefaciens y mediante el bombardeo de partculas o biolstica. El gen o genes introducido (s) es (son) incorporado (s) al genoma de la
clula vegetal, al que debe integrarse de manera estable y expresarse en la biosntesis de protenas especficas. La clula o tejido transformado se
cultiva in vitro para regenerar plantas normales
que expresen el transgen.
La transformacin gentica ampla grandemente el
rango de genes disponibles para el mejoramiento
de plantas. En el mejoramiento convencional, los
genomas de dos parentales se combinan en alto
grado, a pesar de que el mejorador est interesado
en la transferencia de una sola caracterstica, la
cual podra estar controlada por un gen simple.
Para eliminar las caractersticas indeseables del hbrido resultante, deben realizarse varios ciclos de
retrocruzamiento hacia el parental deseable, proceso que toma varios aos, para finalmente obtener
un material mejorado.
En contraste, con las tcnicas de ingeniera gentica de plantas, un gen de inters puede ser identificado, aislado, clonado y transferido de una planta a
otra en una forma directa, lo que significa que por
esta va el mejoramiento de un cultivo es ms dirigido. Por otro lado, en el mtodo tradiconal los fitomejoradores solo pueden trabajar con plantas
que sean compatibles (cruzables), mientras que por
ingeniera gentica se puede transferir cualquier
gen de inters sin importar su procedencia (virus,
bacterias, hongos, animales o plantas).
94
El objetivo de esta seccin en mostrar en forma

sencilla los dos mtodos ms utilizados para la
transformacin gentica de plantas: La va Agrobacterium y la va biolstica. Adems, se presentarn algunos logros de esta metodologa que estn
contribuyendo a la solucin de algunos problemas
agrcolas.
5 . 1 P o rq u t ra n sfo r m a r p l a n t a s ?
Las plantas ocupan el primer eslabn de la cadena
alimenticia. A travs de la fotosntesis, utilizan la
energa lumnica del sol para producir carbohidratos que son la fuente del 90% de las caloras consumidas por los humanos. Adems, las plantas
proporcionan el 80% de las protenas que consumimos en nuestras dietas alimenticias.
Por miles de aos, el hombre ha manipulado las caractersticas genticas de las plantas. Primero, por
seleccin consciente o inconsciente de caracteres
especficos; luego, por cruces dirigidos basados en
las leyes de la herencia.
Sin embargo, muchas caractersticas genticas de
inters agronmico tales como: resistencia a enfermedades y plagas, tolerancia a heladas, salinidad,
sequa, etc., presentes en otras especies no pueden
ser transferidas por cruzamiento gentico convencional debido principalmente a barreras de incompatibilidad.
La ingeniera gentica y la transformacin de plantas constituye una poderosa herramienta para superar estas barreras de cruzabilidad, permitiendo la
transferencia de genes de inters a las plantas, cualquiera que sea su procedencia. Esta alternativa
permitir un mejoramiento ms dirigido, con una
reduccin significativa del tiempo en la produccin de nuevas variedades. As, la transformacin
CEDAF
gentica contribuir no solamente a la reduccin

del costo de la produccin agrcola sino tambin a
una mayor proteccin del medio ambiente como
consecuencia de la disminucin sustancial del uso
de los agroqumicos.
Herida
5 .2 U n vect or nat ur al pa ra i n t r o d u c i r
genes f or neos a l as p l a n t a s
DNA cromosmico
T-DNA
Agrobacterium
infecta la herida
Plasmido Ti
Agrobacterium tumefaciens es una bacteria del

suelo que infecta a un buen nmero de especies vegetales, principalmente dicotiledones, produciendo la enfermedad denominada Agalla de la Corona
(un tumor vegetal) (Figura 5.1). La produccin de
esta enfermedad es el resultado de un evento natural de ingeniera gentica en el que una regin especfica del plsmido Ti (inductor de tumores) de
la bacteria, se integra al genoma de la clula infec-
Agrobacterium
DNA cromosmico
de la planta
Integrado al genoma
de la clula vegetal
Agalla de la corona
(tumor vegetal)
Figura 5.2 La bacteria Agrobacterium tumefaciens es la

causante de la enfermedad Agalla de la Corona. Fuente:
Watson y colaboradores, 1992.
PLANTAS
BACTERIA
Cromosoma
9
4 x 10
sC
ata
bo
lico
E
C
co atab nzim
mo ol
a
so iza o s
la
p
i
C fue nas
y N nte
de
Plsmido Ti
8
1.2 x 10
ne
Fotosintesis
T-DNA
Ti
mido
n plas
in co
T-DNA
Infecc
ia de
ferenc
Trans
Ge
Plasmido Ti
CO2 + H2O
Compuestos orgnicos
Genes para crecimiento tumorignico

DNA-T
Genes para sintesis de opina
Fotosintesis aminocidos
Agalla de la corona
DNA de la planta + T-DNA
aminocidos
oPINAS
Agalla de la corona
Proliferacin de Agrobacterium
con Plasmido Ti Catablicos y
Plasmido asociado Ti
Figura 5.1
Principios de colonizacin gentica. Fuente: Caldern, A. 1990.
95
CEDAF
tada. Este proceso es el resultado de miles de aos

de evolucin de la bacteria. (Figura 5.2).
El plsmido Ti presenta dos regiones claves para el
proceso de transformacin: la regin T-DNA que
es la regin que se transfiere desde el plsmido Ti
al genoma vegetal; y la regin vir (regin de virulencia) que presenta ocho operones (virA, virB,
virC, virD, virE, virF, virG, y virH), cuyos productos procesan el T-DNA y coordinan todo el
proceso de transferencia del T-DNA al genoma de
la planta (Figura 5.3).
La regin que se transfiere se llama T- DNA (DNA
transferible) y contiene genes responsables para la
biosntesis de dos hormonas vegetales una auxina
(cido indolactico) y una citoquinina (riboxido de
zeatina). Estas son los responsables del sobrecre-
cimiento del tejido infectado. La regin T-DNA

presenta otros genes que promueven la sntesis de
opinas (derivados de aminocidos) que son utilizados por la bacteria como fuente de carbono y de nitrgeno. La regin T-DNA esta compuesta por
tres elementos importantes: la secuencia de bordes
del T-DNA conteniendo secuencias repetidas, los
genes de biosntesis de fitohormonas (regin onc)
y los genes de biosntesis de opinas (regin ops)
(Figura 5.3).
Los plsmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens
han sido explotados como vectores para la introduccin de DNA forneo en las plantas. Para que
estos plsmidos puedan ser utilizados como vectores de transformacin, la regin onc (oncogene)
debe ser removida, para producir plsmidos Ti
Regin T
Produccin deauxina
Produccin decitocinina
Sntesis de opina
Borde derecho (24pb)
Borde izquierdo (24 pb)
Genes onc
Transferencia
conjugativa
Regin de
virulencia
Plsmido Ti
Catabolismo de
opinas
Replicador
Figura 5.3 Mapa gentico de un plasmidio Ti de Agrobacterium tumefaciens. Fuente: Beijersbergen y Hooykaas,
1993.
96
CEDAF
llamada gus. Tambin es necesario

colocar en la regin T-DNA un gen de
seleccin, como el gen nptII que codifica para la enzima neomicina fosfotransferasa. Esta permite el crecimiento de
clulas transformadas en medios de cultivo que contienen el antibitico kanamicina (Figura 5.4).
Figura 5.4 Proceso de transferencia de la regin T-DNA del plsmido

Ti del Agrobacterium al genoma de una clula vegetal. Fuente:
Lindsey y Jones, 1992.
"desarmados", y en su reemplazo se coloca un gen quimrico, portando la secuencia de inters que se va a transferir al
genoma de la planta. Adems se colocan secuencias fcilmente identificables en los tejidos transformados (genes reporteros), como el gen de la b-glucuronidasa comnmente
Un gen quimrico de inters, es un gen

donde el promotor, la secuencia codificante y las secuencias de terminacin
provienen de organismos diferentes. Un
ejemplo de un gen quimrico tpico contiene: el promotor 35s del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35s), la
secuencia codificante CryIA(b), que codifica para una d-endotoxina de la bacteria Bacillus thurigiensis;
y la
secuencia de terminacin la regin 3'
nos del gen nopalina sintetasa de la bacteria Agrobacterium tumefaciens. Generalmente el promotor se identifica y
se aisla de la planta que se pretende
transformar (Figura 5.5).
Existen dos clases de vectores derivados
del plsmido Ti: vectores cis co-inte-
Figura 5.5 Mapa de una regin de T-DNA de una construccin gentica que contiene el gen CryIA(b), el gen reportero
gus-intron y el gen de seleccin nptII que confiere resistencia al antibitico kanamicina. Fuente: Mancilla, L. 1997.
(comunicacin personal)
97
CEDAF
grados y vectores trans o binarios. En los vectores

co-integrados tanto el T-DNA como la regin vir
estn presentes en el mismo plsmido; mientras
que en los vectores binarios el T-DNA y la regin
vir se hallan en plsmidos separados dentro de la
misma bacteria hospedera (Agrobacterium). De
estos dos tipos de vectores el ms utilizado para la
transformacin gentica de plantas es el sistema
binario (Figura 5.6).
mefaciens, bsicamente consiste en cultivar conjuntamente los explantes ( tejidos, rganos, clulas) con una cepa de Agrobacterium tumefaciens
portadora de un vector apropiado con el gen de inters y los genes marcadores (reportero y de seleccin), que se va a transferir al genoma vegetal.
El cultivo se incuba a 28 C por un perodo suficiente (24-48 horas) para garantizar la transferencia del T-DNA del vector (plsmido Ti) a las
clulas de la planta. La bacteria se elimina con un
antibitico y el tejido se coloca en un medio de regeneracin (va embriognesis o va organognesis) en presencia de un agente de seleccin (por
ejemplo un antibitico) para permitir el desarrollo
de slo los tejidos transformados.
5 .3 Tra n s f or m aci n gent i ca d e

p la n t as ut i l i z ando A gr oba c t e ri u m
tu mef aci ens
La metodologa general para la transformacin gentica de plantas se presenta en la Figura 5.7. La
transformacin de plantas con Agrobacterium tu-
Clula de Agrobacterium
Gen opina
Oncogenes
L
Genes VIR
T-DNA transferido e integrado en el cromosoma vegetal
L
Plsmido Ti
tipo salvaje
200 kb
Oncogenes
Gen de sntesis de opina
Caractersticas:
Produccin de hormona vegetal
Formacin de tumor
Produccin de opina
No se regeneran plantas
Origen de
replicacin
Gen extrao
Gen seleccionable
Origen de
replicacin
Vir
Plsmido
T-DNA
binario
25 kb
Gen seleccionable
Gen extrao
Plsmido Ti
desarmado
100 kb
Origen de
replicacin
Caractersticas:
Plsmido con amplio espectro de hospedadores
que puede ser construido en E Coli
No hay produccin en exceso de hormonas vegetales
solo los transformantes seleccionados que contengan
el gen extrao regenerarn plantas normales
Figura 5.6 Sistemas de vectores empleados en la transformacin gentica de plantas va Agrobacterium. a) Vector
cointegrado (plsmido Ti en estado silvestre). En este sistema la regin T-DNA y la regin vir estn en el mismo
plsmido. b) Vector binario. En este sistema, las regiones T-DNA y vir estn en plsmidos separados. Fuente:
Lindsey y Jones, 1992.
98
CEDAF
Construccin
Gen(s) de inters
Gen reportero
Gen de seleccin
Secuencia reguladoras
Introduccin a una Cepa de

Agrobacterium
EXPLANTE
CO-CULTIVO
medio de seleccin
Prueba de transgnesis
Pruebas genticas
Integracin del gen (s)

al genoma vegetal
Expresin del gen (s)
Nivel de RNA
Nivel De Protena
Herencia del transgen

Resistencia/tolerancia/
biosntesis
Ensayo agronmicos:
Bioseguridad
Invernadero
Campo
Mercado
Mejoramiento
convencional
Figura 5.7 Secuencia de pasos para la transformacin gentica de plantas va Agrobacterium.
La seleccin de clulas transformadas debe cumplir las siguientes caractersticas:

a .las clulas transformadas deben tener un alto nivel de
resistencia al agente de seleccin;
b. las clulas no transformadas deben ser totalmente
eliminadas por el agente de seleccin;
c. los tejidos transformados deben ser fcilmente detectables para distinguir posibles "escapes" que puedan crecer a expensas de los tejidos transformados,
degradando el agente de seleccin.
Despus de la formacin de callos a partir de las

clulas transformadas, stos se transfieren a medios apropiados conteniendo el agente de seleccin, para la induccin de brotes y luego plntulas.
En la etapa de enraizamiento se reduce el agente de
seleccin (si ste es un antibitico) para favorecer
el enraizamiento de las plntulas.
99
CEDAF
5 .4 Tra n s f or m aci n por i nt r o d u c c i n

d ire c t a de D N A
5 . 4 . 1 T r a n sfe r e n c i a m e d i a d a p o r
a g e n t e s o sm t i c o s
En las gramneas, y en concreto, en los cereales, la

transformacin va Agrobacterium ha tenido poco
xito. Debido a esto, se ha desarrollado mtodos
alternativos que permiten la introduccin directa
de DNA al genoma vegetal (Figura 5.8). Algunos
de estos mtodos son:
Fue el primer sistema desarrollado para la introduccin directa de DNA a protoplastos (clulas vegetales a las cuales se les ha removido la pared
celular). Los protoplastos se tratan con el osmtico
polietilenglicol (PEG) con fostato de calcio, en
presencia del DNA forneo.
a. Transferencia mediada por agentes osmticos
El tratamiento PEG/Ca++ permite un aumento en

la permeabilidad de la membrana del protoplasto
facilitando as la entrada del DNA forneo. Aunque la incorporacin de DNA a los protoplastos no
depende de la especie, la regeneracin de plantas
completas a partir de protoplastos puede resultar
difcil, lo cual constituye una gran limitacin para
el uso generalizado de esta metodologa.
b. Microinyeccin
c. Electroporacin
d. Bombardeo de partculas o Biolstica
5.4.2 Microinyeccin
Por tratamiento con
++
PEG Y Ca
Por electrochoque
Por microinyeccin
Por biolstica
Figura 5.8 Mtodos utilizados para la introduccin directa de

DNA al interior de las clulas vegetales. A) Transferencia
mediada por agentes osmticos. B) Electroporacin. C)
Micro-inyeccin y D) Bombardeo de partculas o biolstica.
Fuente: Caldern y colaboradores, 1991.
100
Esta tcnica consiste en inmovilizar una clula en

la punta de un microtbulo, usando presin negativa ligera para inyectar una solucin de DNA
usando un capilar de vidrio fino. Este atraviesa la
membrana citoplasmtica de la clula y llega al
ncleo sin producirle ningn dao.
Utilizando esta metodologa se ha logrado transformar algunas plantas como el tomate y la zanahoria. Algunas desventajas de este mtodo
son: la baja viabilidad de las clulas inyectadas, el
alto nivel tcnico y experiencia requeridas, y el
hecho de que slo se pueda inyectar una clula a
la vez. Todo esto hace que ste mtodo sea poco
eficiente.
5 . 4 . 3 E l e c tr o p o r a c i n
En esta tcnica, protoplastos son sometidos a impulsos elctricos de alto voltaje por fracciones de
segundos. Este tratamiento permeabiliza la membrana induciendo la formacin reversible de poWilliam M. Roca / Hernando Ramrez
CEDAF
ros que permiten la introduccin de

macromolculas como el DNA. Este mtodo ha
permitido la transformacin de especies como:
arroz y maz.
5 .4 . 4 B ombardeo de par t c u l a s o
bi ol s t i ca
Este mtodo fue desarrollado por Klein y colaboradores en 1987. Esta metodologa utiliza un dispositivo que dispara microproyectiles (esferas
diminutas de tungsteno o de oro, de 4 mm de dimetro) recubiertos con el DNA forneo que se
quiere introducir en las clulas.
El proceso se basa en la aceleracin de las micropartculas, a travs de un tubo en el cual se ha producido vaco, a velocidades tales que permiten su
paso a travs de la pared y membrana celulares, y
la integracin del DNA forneo al genoma de las
clulas de los tejidos bombardeados (Figura 5.9).
De los mtodos de transformacin directa, el mtodo biolstico es el ms utilizado. Actualmente se
ha transformado un nmero grande de especies,
muchas pertenecientes al grupo de la gramneas.
5.5 Logros de la ingeniera gentica de

plantas
En la actualidad se han transformado aproximadamente 50 especies de plantas con caractersticas de
inters como resistencia a insectos, virus y herbicidas. Esto se debe a la disponibilidad de muy buenos sistemas de regeneracin y de transformacin
para muchos cultivos de importancia econmica
(Tabla 5.1). El carcter con mayor modificacin
por ingeniera gentica ha sido la resistencia a herbicidas, seguido por la resistencia a insectos y a virosis; y los cultivos ms utilizados han sido la
soya, el maz, la colza y el algodn.
Tabla 5.1 Siembras comerciales con cultivos
transgnicos en 1997. Fuente: James ,1997.
Cultivo
Caracteres
Pases
Soya
40
Resist. herbicidas
55
EE.UU
65
Maz
25
Resist. Insectos
30
China
14
Tabaco
13
Resist. Virus
15
Argentina
11
Algodn
11
Otras
Canad
10
Canola
10
Australia
<1
Tomate
Mxico
<1
Papa
Figura 5.9 Diseo del equipo utilizado para la transformacin gentica de plantas mediante el bombardeo de partculas
o biolsticas. Fuente: Caldern, A. 1990.
101
Aunque la transferencia de caractersticas genticas

que dependen de muchos genes (polignicas), est
todava a nivel de investigacin, la transferencia de
caractersticas monognicas ya son procesos de rutina para muchos cultivos. La rapidez con que se obtienen plantas transformadas con caractersticas
deseables es bastante sorprendente, por ejemplo:
tres meses en arroz, cuatro meses en soya, etc.
La meta es utilizar esta tecnologa para el mejoramiento de caractersticas que no podran ser manipuladas por los mtodos tradicionales (Tabla 5.2).
Hay que reconocer que la transformacin de plantas
ha sido uno de los mayores logros de la biotecnologa y las aplicaciones futuras parecen estar limitadas slo a nuestra imaginacin.
Tabla 5.2 Algunas metas de la ingeniera gentica de
plantas. Fuente: Chrispeels y Sadava (1994)
1.
Mejoramiento para el control de plagas y malezas

Tolerancia a Herbicidas
Resistencia a virus
Resistencia a bacterias
Resistencia a hongos
2. Mejoramiento de propiedades agronmicas

Tolerancia a heladas
Tolerancia al estrs hdrico
Tolerancia a la salinidad
Tolerancia a toxicidad por aluminio
3. Mejoramiento de la calidad postcosecha
Retardar la maduracin del fruto
CEDAF
Los cultivos transgnicos de primera generacin

(resistencia a herbicidas, a insectos y a virus) estn impactando la agricultura, principalmente en
pases desarrollados. El crecimiento del rea cultivada a nivel comercial, con cultivos transgnicos ha sido espectacular en los ltimos aos: de
tres millones de hectreas en 1990, pas a 12 millones en 1997 y a 30 millones de hectreas en
1998. De stas, cinco millones se cultivaran en
Amrica Latina: cuatro en Argentina y una en
Mxico. Los cultivos ms impactados han sido la
soya, el maz, el algodn, la colza y la papa. Adems de la ganancia econmica para los agricultores por el aumento en las cosechas y el menor uso
de pesticidas, un beneficio importante del uso de
cultivos transgnicos ha sido en la proteccin ambiental : En 1997, en Mxico y Argentina, el uso
de insumos qumicos se redujo entre el 50 al 90%,
debido al cultivo comercial de transgnicos con
Bt resistentes a insectos.
A continuacin se presentan algunos de los logros
de la ingeniera gentica de plantas en la solucin
de algunos problemas que afectan los cultivos
modernos como es el ataque de enfermedades y
plagas, el control de malezas, el manejo de postcosecha, etc.
Retardar la senescencia floral

Tomates con alto contenido de slidos solubles
Papas con alto contenido de almidn
Hortalizas ms dulces
4. Contribuyendo al mejoramiento vegetal
Esterilidad masculina para la produccin de semilla hbrida
5. Mejoramiento de la calidad nutricional
Semillas con alto contenido de metionina y lisina
Forrajes ricos en animocidos sulfurados
6. Mejoramiento de Compuestos de Uso Industrial
Aceites
Almidn
Plstico
Enzimas
Frmacos
7. Detoxificacin de suelos contaminados
102
5.5.1 Resistencia a herbicidas

Los herbicidas son ampliamente utilizados en la
agricultura para minimizar las prdidas en los cultivos debido a la presencia de malezas.
Algunos de estos herbicidas actan inhibiendo
ciertos procesos como la fotosntesis, otros inhiben vas biosintticas por ejemplo de aminocidos esenciales. Mediante la transgnesis, se
modifica el genoma de la planta para que produzca una accin metablica que lo proteja de un determinado herbicida.
CEDAF
Un herbicida bien conocido es el glifosato (N-fosfonometil-glicina). Este herbicida inhibe la enzima

5-enol-piruvil-shikimato-3-fosfato (EPSP) sintasa, bloqueando la va biosinttica de aminocidos
aromticos. La produccin de plantas transgnicas
resistentes a este herbicida se puede conseguir a
travs de dos vas:
a .Por la introduccin al genoma de un gen de origen
bacteriano (Aerobacter aerogenes) que codifica para
la enzima EPSP sintasa, que inhibe la accin del
herbicida.
b .Por la introduccin al genoma vegetal del gen EPSP
sintasa de origen vegetal bajo el control del promotor CaMV35s. El resultado es el incremento de 40
veces la actividad enzimtica de la EPSP sintasa.
FOSFINOTRICINA
Modo de accin
:
GLUTAMATO
NH4
Glutamato sintasa (GS)
L GLUTAMINA
Inhibicin
FOSFINOTRICINA (PPT)
Producto del GEN BAR:

Fosfinotricina Acetil Transferasa (PAT)
Acetil CoA
Acetil
Fosfinotricina
(inactiva)
Fosfinotricina
(Activa)
En ambos casos la tolerancia al herbicida fue debido a una sobreproduccin de la enzima, por la expresin del transgen.
Figura 5.10 Tolerancia a la fosfinotricina.

Fuente: Adaptado por Roca, W. (1997)
Se obtuvieron plantas transgnicas de tomate y

papa utilizando la primera estrategia y plantas
transgnicas de petunia, soya, maz y otras, utilizando la segunda estrategia.
Con este sistema se obtuvo plantas transgnicas resistentes al herbicida Basta en arroz y otros cultivos.
Otro herbicida muy conocido es el Basta (fosfinotricina o PPT), el cual es un anlogo del cido glutmico y acta inhibiendo la enzima glutamina
sintetasa encargada del metabolismo del amonio
en la planta. El efecto del herbicida es inhibido por
la enzima fosfinotricina acetiltransferasa, codificada por el gen "bar" cuyo origen es el hongo Streptomyces hygroscopicus (Figura 5.10).
Una planta transgnica resistente a este herbicida
se obtiene por la introduccin al genoma vegetal
del gen "bar" bajo el control del promotor
CaMV35s, u otros promotores. Se produce altos
niveles de la enzima fosfinotricina acetiltransferasa la cual inhibir el efecto del herbicida.
PAT
5 . 5 . 2 R e si ste n c i a a i n se c t o s
Las prdidas en la produccin agrcola debido a
enfermedades y plagas es bastante considerable.
De los insectos plagas en la agricultura los ms importantes son los Lepidopteros, siendo el costo por
su control, slo los Estados Unidos de 400 millones de dlares para el ao de 1995. El alto costo
del control qumico de los insectos plagas, justifica
el desarrollo de plantas transgnicas resistentes, no
slo para reducir los costos de produccin, sino
tambin el deterioro del medio ambiente.
Una estrategia clsica para el control de insectos
Lepidopteros ha consistido en el uso de bioinsecticidas basados en cepas de Bacilus thuringiensis
(Bt). El Bt produce una toxina que se liga a receptores especficos de las clulas epiteliales del intes103
CEDAF
tino medio de la larva, desencadenando una serie

de eventos que conducen a la muerte de la misma.
Esto impide la liberacin del DNA de la partcula

viral de la cepa virulenta.
Para la produccin de plantas transgnicas resistentes a Lepidopteros, se transfiere al genoma de la

planta genes que codifican para las endotoxinas de
Bt (genes cry). El uso del promotor CaMV35s logra una alta expresin del gen. Las plantas transgnicas expresan constitutivamente la toxina, que
al ser ingerida por las larvas producir su muerte.
Utilizando esta estrategia se han obtenido plantas

transgnicas resistentes a ciertas cepas de virus,
mediante la introduccin al genoma de la planta
del gen que codifica para la protena de la cubierta
del virus. Un ejemplo de esta estrategia son las
plantas transgnicas de tabaco con resistencia al
virus del mosaico del tabaco (TMV), plantas
transgnicas de tomate y papa resistentes a un amplio espectro de virus, incluyendo el virus del mosaico de la alfalfa, el virus del mosaico del pepino y
los virus X y Y de la papa.
Otros genes usados para la produccin de plantas

transgnicas resistentes a Lepidopteros son los
inhibidores de proteinasas (Inhibidores de Tripsina
y de Quimiotripsina). Estos inhibidores bloquean
la actividad proteoltica de las enzimas digestivas
de los insectos. Estos genes han sido aislados y
transferidos a tabaco reduciendo significativamente el desarrollo de larvas como Manduca sexta.
Otros genes como las protenas insecticidas vegetativas (ViPs), la colesterol oxidasa, las quitinasas,
las peroxidasas, pueden ser utilizados para la obtencin de resistencia contra los insectos plagas de
la agricultura.
5 .5 .3 Res i s t enci a a vi rus
Las enfermedades virales de las plantas constituyen un serio problema para la agricultura, ya que
estos patgenos disminuyen significativamente el
rendimiento de los cultivos.
Una de las estrategias utilizadas para la proteccin
de las plantas contra el ataque de virus es la denominada proteccin cruzada. Al infectar una planta con una cepa atenuada del virus, la planta
adquiere resistencia al ataque de la cepa virulenta
del mismo virus. Aunque el mecanismo de la proteccin no es muy claro, se cree que se debe a la
sobreproduccin de protena de la cubierta del virus causada por la infeccin con la cepa atenuada.
104
Otra estrategia para inhibir la infeccin de algunos

virus RNA en las plantas es a travs de RNAs satlites los cuales atenan los sntomas de la enfermedad en las plantas infectadas. Los RNAs
satlites, son secuencias cortas de RNA no necesarias para la propagacin de los virus con que estn
asociados, pero son replicadas y encapsidadas conjuntamente con las partculas virales. Utilizando
esta estrategia se obtuvo plantas transgnicas de tabaco resistentes al virus del mosaico del pepino
(CMV).
Una tercera estrategia para reducir la infeccin viral en plantas infectadas es mediante la tcnica del
RNA antisentido. Esta tcnica se basa en la produccin de un mRNAss (sin sentido) que es complementario al mRNAcs (con sentido) formando
un hbrido de doble cadena que impide la traduccin del mRNAcs (figura 5.11).
Plantas transgnicas que produzcan mRNAs sin
sentido de alguna secuencia clave para la propagacin del virus, inhibir su sntesis y por consiguiente no se podr formar la partcula viral.
CEDAF
5 .5 . 4 R es i s t enci a a hong o s
Las prdidas econmicas de los cultivos debido al
ataque de hongos patgenos es alta y la aplicacin
qumica es la va clsica usada para el control de
estos patgenos.
Una estrategia transgnica empleada para producir plantas resistentes al ataque de hongos patgenos es la introduccin al genoma de la planta genes
que codifiquen para enzimas que degraden la pared
celular del hongo. La pared celular del hongo consiste de dos polmeros: el glucan y la quitina que
pueden ser hidrolizados por las enzimas glucanasas y quitinasas, respectivamente. Sin embargo, la
quitina de algunas especies de hongos puede ser
algo diferente a la de otras especies, por lo que una
quitinasa en particular puede ser efectiva contra
una especie de hongo pero no necesariamente contra otra especie.
Por esta razn las plantas transgnicas con genes
de quitinasa sern resistentes slo a aquellas especies de hongos cuya pared celular sea degradada
con la quitinasa especfica.
VIA NORMAL
mRNA
Traduccin
Transcripcin
Gen que ser
controlado
ATGATC
Producto Proteico
TACTAG
VIA CONTROLADA
Transcripcin
m RNA
+
AUGAUC (A)N-3
3 -(A)N UACUAG
RNA de antisentido
(micRNA)
Formacin del RNA de

doble cadena que
inhibe la expresin
gentica a nivel de la
traduccin del mensaje
gentico
Transcripcin
Gen que codifica

para el micRNA
GATCAT
CTAGTA
Figura 5.11 Mecanismo de la inhibicin de la expresin gentica mediante la tcnica del RNA antisentido. Fuente:
Caldern y colaboradores, 1991.
105
CEDAF
5 .5 .5 R egul aci n de l a madu r a c i n d e

frut os
La maduracin de los frutos esta asociada con
cambios fisiolgicos como el ablandamiento, la
conversin de almidn en azcar, la prdida de clorofila, la sntesis de pigmentos rojos y la sntesis de
compuestos aromticos. Todos estos procesos estn regulados por la fitohormona etileno. En la
biosntesis del etileno (Figura 5.12) hay dos enzimas claves que al ser bloqueadas se producir su
inhibicin. Estas son: la ACC sintasa que cataliza la formacin del cido 1-aminociclopropano-1carboxilico (ACC) a partir de S-adenosilmetionina
y la ACC oxidasa que cataliza la formacin de etileno a partir de ACC.

La estrategia transgnica utilizada para retardar la
maduracin del fruto es bloquear la actividad de la
enzima ACC sintasa, utilizando la estrategia de
RNA antisentido.
Las plantas transgnicas expresan una versin invertida del gen ACC sintasa, produciendo un RNA
sin sentido que forma un hbrido con el mRNA con
sentido de la ACC sintasa, lo cual bloquea la traduccin (Figura 5.8). Esta tcnica fue aplicada
con xito en tomate donde se observ una gran reduccin en la sntesis de etileno y como consecuencia un retardo en la maduracin del fruto.
METIONINA
S ADENOSILMETIONINA
ACC SINTASA
CIDO 1 AMINO CICLOPROPANO 1 CARBOXLICO
ACC OXIDASA
C2H4
Percepcin por receptor de C 2H4

Seales
Estimula la
sntesis de
etileno
ACC Sintasa
Y ACC oxidasa
Degrada cin de
la pared celular
Produccin de
carotenoides
pigmentados
Celulasa
Poligalacturonasa
pectinesterasa
Produccin de
sabores y aromas
voltiles
Fitoenosintasa
Desaturasa etc.
Figura 5.12 Regulacin gentica de la maduracin del fruto del tomate. Fuente: Hobson y Grierson, 1993
106
CEDAF
5 .6 E j er ci ci o 5. 1 T r ans f o rm a c i n
gent i ca de pl ant as
Objetivos
Desarrollar el concepto de transformacin gentica de plantas.
Identifiar mtodos que permitan detectar la presencia y la expresin de un transgen en un cultivo transgnico.
El siguiente ejercicio busca que los participantes
realicen un anlisis sobre posibles metodologas
que se pueden utilizar para diferenciar plantas
transgnicas de plantas no transgnicas en materiales de una misma especie.
Con este ejercicio se busca que los participantes fijen el concepto de transformacin gentica de
plantas y sus aplicaciones.
Un bioensayo.
Un mtodo inmunolgico.
Un mtodo molecular.
Presentar por escrito sus respuestas.

Motive una discusin con base en las respuestas dadas.
Proporcione informacin de retorno, suministrando a los participantes las respuestas de este
ejercicio.
Recursos necesarios
ocho plantas de tomate en materas o bolsas de
plstico.
Fotocopias con las instrucciones e informacin
de retorno para los participantes.
Tiempo estimado : 60 minutos.
Colocar en cada mesa dos plantas de tomate rotuladas A y B respectivamente.
Con la informacin suministrada en la seccin 5 y

a travs de la identificacin de mtodos biolgicos,
inmunolgicos y moleculares para evaluar la integracin y expresin de genes en materiales transgnicos, los participantes debern construir el
concepto de transformacin gentica de plantas.

Conformen cuatro grupos de trabajo de acuerdo con las instrucciones dadas por el Instructor.
En cada grupo los participantes deben responder

las siguientes preguntas:
Nombre un relator por grupo, el cual presentar

en plenaria las respuestas dadas por el grupo.

La planta A es transgnica, con un gen que le confiere resistencia al cogollero (Tuta absoluta), y la
planta B, es una planta no transgnica.
a. Las plantas A y B son fenotpicamente diferentes?
Explique.
b. Las plantas A y B son genotpicamente diferentes?
Explique.
c. Cmo podra diferenciar las plantas A y B utilizando:
Presentar por escrito las respuestas a las siguientes preguntas:

a. Las plantas A y B son fenotpicamente diferentes?
Explique.
b. Las plantas A y B son genotpicamente diferentes?
Explique.
107
c. Cmo podra diferenciar las plantas A y B utilizando:
Un bioensayo.
Un mtodo inmunolgico.
Un mtodo molecular.
Al final el instructor les proporcionar la informacin de retorno de las respuestas a las preguntas planteadas en este ejercicio.
CEDAF
detectar in situ o a travs de una electroforesis de protenas de un extracto crudo foliar de las plantas A y B.
Despus de una autorradiografa se presentar una "seal" en el extracto crudo de protenas de la planta A, indicando la presencia del producto del transgen.
Un mtodo molecular
Mediante extracciones de DNA genmico de las plantas A y B. Se preparan filtros (Southernblots) con las
digestiones de estos DNAs con una enzima de restriccin. Los filtros son hibridizados con una "sonda"
construda con el transgen incorporado en la planta
transgnica. Despus de una autorradiografa slo en el
DNA de la planta A se presentar una "mancha" (banda) indicacdo la presencia del transgen en la planta A.
Esta "seal" no se presentar en el DNA de la planta B.
Para la pregunta a
No son diferentes fenotpicamente. Lo nico que tiene

diferente la planta A es el transgen que le confiere resistencia al cogollero (Tuta absoluta). La diferencia es fisiolgica no morfolgica.
B e i j e r s be r ge n, A ., H ooyka a s , P .J . 1993. The Vi r ul ence

S ys t e m of A gr oba c t e r i um t ume f a c i e ns. En: Nest er , E.
W ., V e r na , D . P . S . ( e ds .) . A dva nc es i n M ol ecul ar
G e ne t i c s of P l a nt - M i c r obe I nt e r a ct i ons. Kl uwer
A c a de mi c P ubl i s he r s . T he N e t he r l a nd s. P. 37- 49.

Respuestas a las preguntas realizadas en este
ejercicio.
Para la pregunta b
S son genotpicamente diferentes. El genoma de la
planta A presenta un gen adicional, que es el transgen
que le confiere resistencia al cogollero, el cual no est
presente en el genoma de la planta B.
Para la pregunta c
Un bioensayo
Infestando las plantas A y B con larvas del cogollero.
Las plantas sobrevivientes o menos afectadas sern
plantas A (transgnicas). Las plantas afectadas por el
cogollero sern plantas B.
Un mtodo inmunolgico
Si se tienen anticuerpos contra el producto gnico (toxina) marcados con el radioistopo yodo 125, es posible
108
C a l de r n, A . 1990. T c ni c a s b s i c a s de I ngeni er a
G e n t i c a e n P l a nt a s . E n: J a r a mi l l o, J., Agudel o, O.
( e ds .) . L a N ue va B i ot e c nol og a , F undam ent os, Usos y
P e r s pe c t i va s . S e m i na r i o r e a l i z a do e n I CA en M ayo
15- 26 de 1989. I C A , P a l mi r a , C ol ombi a. p. 177- 191.
C a l de r n, A ., R oc a , W . M . y J a yne s , J . 1991. I ngeni er a
G e n t i c a y C ul t i vo de T e j i dos . E n : Roca, W . ,
M r ogi ns ki , L . A . ( e ds .) . C ul t i vo de Tej i dos en l a
A gr i c ul t ur a ,
F unda me nt os
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Apl i caci ones.
P ubl i c a c i n C I A T N o. 151. C I A T , C a li , Col om bi a. p.
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J a me s , C . 1997. G l oba l S t a t us O f T r a ns ge nic cr ops i n 1997.
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W a t s on, J .D ., G i l ma n, M ., W i t kow s ki , J . , y Zol l er , M .
1992. R e c om bi na nt D N A . A s hor t Cour se. Second
e di t i on. S c i e nt i f i c A m e r i c a n B ooks . W . H. Fr eem an
a nd C ompa ny. N e w Y or k. U S A . 626 p.
CEDAF
109
110
Prueba de
transgnesis
Explante o protoplastos
Bombardeo de
partculas o biolsticas
Pruebas
genticas
CO - cultivo
Explante
Transformacin
gentica va Agrobacterium
Mejoramiento
convencional
Ensayos
agronmicos y de
bioseguridad
Mercado
Plantas Transgnicas
medio de seleccin
Construccin
Gentica
Transformacin Gentica de Plantas
CEDAF
utilizados para transformar plantas.
Conocer los dos mtodos ms
transformacin gentica de plantas.
Conocer los fundamentos de la
Objetivos
CEDAF
111
112
El gen introducido es incorporado

de manera estable al genoma vegetal.
apropiado.
clulas vegetales utilizando un mtodo
(genes quimricos) al interior de las
Es la introduc cin de genes modificados
Qu es la transformacin
gentica de plantas?
CEDAF
transgen.
clula vegetal y sta debe regenerar una planta normal que exprese el
El gen introducido debe incorporarse de manera estable al genoma de la
Agrobacterium o mediante el bombardeo de partculas o biolstica).
genoma de las clulas vegetales, utilizando un mtodo apropiado (va
Es la introduccin de genes modificados (genes quimricos) al
Qu es la transformacin
gentica de plantas?
CEDAF
113
114
Las plantas proporcionan el 90% de las

colonias y el 80% de las protenas que
consumimos en nuestras dietas.
Muchas caractersticas de inters

agronmico, presentes en espacies no
re lacionadas, no pueden ser
transformadas por mejoramiento convencional.
Por qu transformar plantas?
CEDAF
Superan las barreras de cruzabilidad

permitiendo la transferencia de genes de inters.
Permiten un mejoramiento dirigido
(transferencia de uno o pocos genes).
Reducen significativamente el tiempo en la
produccin de nuevas variedades.
Reducen significativamente el costo de la
produccin agrcola.
Contribuyen a la proteccin del medio
ambiente, por la disminucin en el uso de agroqumicos.
La Ingeniera Gentica y la
transformacin gentica
de plantas
CEDAF
115
116
CEDAF
CEDAF
Pe r s p e c t i v a s f u t u r a s d e l a
Biotecnologa Vegetal
Seccin 6
117
Seccin 6 .
CEDAF
Perspe c t i v as fu t u r as de l a B i ot e c n ol og a V eg et a l
Tabla de Contenido
Estructura de la Seccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Preguntas orientadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
6.1 Relaciones institucionales y la biotecnologa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
6.2 Costo - beneficio de la biotecnologa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
6.3 Propiedad intelectual y comercializacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
6.4 Produccin de alimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
6.5 Ejercicio 6.1 Perspectivas futuras de la Biotecnologa Vegetal . . . . . . . . . . . . . 125
Bibliografa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
Originales para trasparencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
118
CEDAF
Perspectivas Futuras de La Biotecnologa Vegetal
Bioseguridad
Costo / Beneficio de la
Biotecnologa
Ensayos de Riesgo
Propiedad Intelectual
Patentes
Objetivos
Conocer algunos factores que se consideran podran ser causa de riesgo por la introduccin de cultivos
transgnicos al campo.
Entender por que los cultivos transgnicos son seguros.
Preguntas orientadoras
1. Saban ustedes que en un futuro no muy lejano muchos de los productos como frmacos, vitaminas, vacunas
hormonas, etc., van a ser producidos en plantas las cuales sern utilizadas como bioreactores?
2. Algunos de los participantes nos puede decir que es bioseguridad en biotecnologa?
3. Ustedes piensan que los cultivos transgnicos representan un riesgo para la salud humana, el medio ambiente
o la biodiversidad?
119
In tro d u c ci n
No cabe duda de que estamos entrando al siglo de
la biotecnologa. El mapeo y secuenciacin de genomas est en rpida transicin hacia la genmica
funcional. Esta se refiere al uso de la informacin
de la genmica estructural para identificar funciones y secuencias que permitan descubrir y clonar
fragmentos de DNA grandes en cromosomas artificiales de bacterias (BAC). Por otro lado, cada vez
es ms factible las transformaciones oligognicas,
abriendo as paso a las modificaciones de caracteres complejos (QTLs) de plantas. Debido al inmenso volumen de informacin y de datos que se
generan en los estudios genmicos, se han diseado sistemas electrnicos de manejo y comparacin
de datos para la masificasin de las operaciones
genmicas. As, se produce una convergencia entre la biologa y la computacin, lo que se ha denominado "bioinformtica". De igual manera, la
fsica y la mecnica se han unido para dar paso al
uso de la "robtica" en biotecnologa.
Actualmente se han logrado avances con plantas
modelo. Una de estas plantas es la Arabidopsis,
que es la planta floral con genoma ms pequeo.
La secuenciacin del genoma de Arabidopsis
avanza a una tasa de 200 genes por mes. Una vez se
tenga descifrado todo el genoma de Arabidopsis
(ao 2001), se tendr un catlogo completo de todos los genes que participan en todo el ciclo de
vida de una planta superior. La secuenciacin del
genoma del arroz tambin avanza rpidamente.
En la actualidad se dispone de un buen nmero de
vectores para la transferencia de genes forneos a
la plantas. Los genes transferidos se integran al genoma de la planta donde se expresan y son heredados de una generacin a otra. Aunque en este
momento no es posible la transferencia de genes a
todos los cultivos de importancia econmica, mucha de la investigacin est encaminada en encontrar vectores apropiados para la transformacin
gentica de dichos cultivos.
Existe una gran prioridad por la identificacin de
genes de importancia agronmica y/o econmica
para ser introducidos a los cultivos que son la base
120
CEDAF
de nuestra alimentacin y economa. Tambin es

importante el estudio de la regulacin de la expresin gnica durante el desarrollo de la planta para
saber en que momento se pueden "activar" o "desactivar" genes, en el sitio apropiado de la planta y
en el tiempo preciso. Con este conocimiento es posible modificar algunos procesos de desarrollo de
las plantas tales como: floracin, la formacin de
semilla, el tiempo de formacin del fruto, etc.
Adems es posible manipular los procesos de formacin gamtica para la obtencin de plantas androestriles cuando se desee, o alterar los factores
de la incompatibilidad para lograr la fertilizacin
entre especies no relacionadas.
Los efectos de genes indeseables podrn ser controlados mediante la tcnica de RNA antisentido
como en el caso del bloqueo de la biosntesis del
etileno para retardar la maduracin de los frutos.
A mediano-largo plazo, la biotecnologa ofrece herramientas para un mejor manejo de la agricultura,
con el componente de sostenibilidad. Entre las
aplicaciones ms notables se encuentran:
1. La reduccin de insumos qumicos, por medio de la
generacin de biopesticidas, contribuyendo a estrategias de control biolgico.
2. El mejoramiento de sistemas biolgicos naturales,
como la fijacin biolgica de nitrgeno, el aumento
de la eficiencia del reciclaje de nutrientes en la rizosfera y el desarrollo de variedades tolerantes a
problemas de suelo como toxicidad por aluminio,
deficiencia de fsforo y azufre, tolerancia a sequa y
salinidad.
3. Reforestacin, mediante la multiplicacin masiva de
plantas para la siembra.
4. Recuperacin de aguas y suelos contaminados, por
medio de la bioremediacin (por microorganismos).
Considerando slo a la bioingeniera estamos pasando por una rpida evolucin de los productos
generados, por ejemplo:
1. Entre 1995 - 2001 : Rasgos agronmicos como resistencias a insectos, virus y herbicidas.
2. 2002 - 2005 : Rasgos de calidad de alimentos: aceites
vegetales, carbohidratos (almidn, azcares)
CEDAF
3. 2006 - 2010 : modificacin de la arquitectura y procesos fisiolgicos de la planta (fotosntesis).

4. 2011 - 2020: modificaciones para usar a plantas
como bioreactores para producir productos de alto
valor agregado: frmacos, vitaminas, vacunas, etc.
La transformacin gentica de plantas ofrecen un

gran potencial para la produccin de productos de
importancia para la salud y la economa como:
factores sanguneos, hormonas de crecimiento,
neuropeptidos, biopolmeros, etc. De igual manera, muchos otros productos de la industria de alimentos y farmacutica podrn ser obtenidos a ms
bajo costo.
Ahora que reconocemos que tales perspectivas son
posibles en un futuro muy cercano, es importante
conocer las implicaciones econmicas, sociales y
medio ambientales de la biotecnologa vegetal en
los pases desarrollados y en los pases en desarrollo.
6 .1 R el aci ones i ns t i t uci o n a l e s y l a
B i ot ecnol og a
La biotecnologa moderna ofrece gran potencial
para alterar, controlar y monitorear la gentica de
las plantas. Este poder tecnolgico puede impactar
directa e indirectamente en la agricultura, el comercio, el medio ambiente y la biodiversidad.
Como consecuencia se han generado preocupaciones biolgicas y socioeconmicas en la sociedad,
lo que se ha traducido en regulaciones de la investigacin y desarrollo de la biotecnologa.
6 .1 . 1 B i os eguri dad
Este trmino se refiere a las polticas y mecanismos que se establecen para prevenir posibles riesgos de la tecnologa del DNA recombinante y de la
transformacin gentica de plantas en la salud, el
medio ambiente y la biodiversidad.
En 1975, apenas tres aos despus del descubrimiento de la tecnologa del DNA recombinante,
los cientficos se autoimpusieron regulaciones
para seguir prcticas seguras en la investigacin
gentica molecular. Posteriormente las institucioWilliam M. Roca / Hernando Ramrez
nes oficiales de salud, alimentos, y ambientales, de

varios pases crearon regulaciones para evaluar posibles riesgos de plantas transgnicas, sobretodo al
realizar ensayos de campo.
6.1.2 Evaluacin de riesgo
La evaluacin de riesgo de las plantas transgnicas
no se realiza porque stas sean intrnsecamente peligrosas o riesgosas para la salud, el ambiente, o la
biodiversidad. La razn fundamental para esta
evaluacin reside en la poca experiencia que tenemos en el manejo de las plantas y alimentos transgnicos. Por el contrario la ingeniera gentica, en
contraste al mejoramiento comercial, aumenta
grandemente el factor precisin a lo referente a la
composicin gentica que se usa en la transferencia a nivel de secuencias especficas del gen de inters, el promotor, las secuencias de iniciacin y
terminacin de la lectura y los marcadores de seleccin. A mayor precisin, debemos esperar mayor predictibilidad del resultado de la
recombinacin gentica mediante transformacin,
en contraste a la recombinacin que se obtiene en
el mejoramiento comercial.
Mientras que la evaluacin de riesgo es un paso
cientfico estratgico, el manejo del riesgo es institucional y depende de cada pas. La experiencia
ganada indica que la evaluacin debe estar basada
en la naturaleza del organismo y el ambiente al que
se introduce y el transgen en cuestin, y el grado de
familiaridad que se tiene para cada factor.
Entre los posibles factores a considerar en la evaluacin de riesgo de la introduccin de cultivos
transgnicos al campo, se encuentra:
a. Flujo de transgenes a parentales silvestres,
b. Toxicidad del transgen para humanos y mamferos,
c. Adquisicin de caracteres de maleza,
d. Efectos alergnicos de la planta / alimento transgnico,
e. Creacin de nuevos patgenos por efecto del transgen (por ejemplo, virus),
f. Flujo del transgen a microorganismos del suelo, etc.
121
A continuacin haremos una breve descripcin de

los posibles riesgos ms importantes:
a. Flujo de transgenes a otros cultivos. Cultivos como
el maz, trigo, frjol, etc. han experimentado durante
el curso de su evolucin, hibridizaciones con sus
parientes silvestres ms cercanos. Dado que esos
cultivos son altamente domesticados, es poco posible que un solo trasngen, o unos pocos transgenes,
sean capaces de convertirlos en malezas perniciosas. Se estima que el carcter maleza depende de
por lo menos de la accin conjunta de 6 - 7 genes.
En el caso de cultivos semidomesticados, el anlisis
debera ser ms cuidadoso.
b. Flujo de genes a plantas silvestres. Cuando los cultivos transgnicos crecen muy prximos a parientes
silvestres cercanos, es posible que ocurra la transferencia del transgen por hibridizacin. En algunos
casos, el efecto podra ser un aumento de la agresividad de la maleza, o la adquisicin del razgo o carcter, conferido por el transgen, por parte del
silvestre. La evaluacin del riesgo debe incluir el
anlisis caso por caso del flujo de genes y su posible
efecto o impacto en los silvestres y/ o malezas.
c. Plantas transgnicas conteniendo secuencias de virus. Algunas de las preocupaciones expresadas incluyen:
Las protenas virales podran desencadenar

reacciones alrgicas si se encuentran en los alimentos. Dado que muchos alimentos se consumen estando infectados por virus sin efectos
deletreos en humanos, esta preocupacin se
est descartando.
Plantas resistentes a virus, pueden tener ventaja competitiva en el campo, y ser fuente de genes que se transfieren a malezas. Como se
discuti arriba, debe ser evaluado caso por
caso.
Pueden crearse nuevos virus por recombinacin entre el transgen y el virus que infectan simultneamente la planta. Se conoce que
muchas plantas son infectadas simultneamente con virus mltiples. Sin embargo, en pocos
casos se ha confirmado la recombinacin gentica entre virus diferentes. Pero no hay evidencia que la recombinacin sea ms frecuente en
122
CEDAF
plantas transgnicas que en situaciones tpicas

de infeccin viral.
La protena del virus producida por el cultivo
transgnico podra combinarse con virus naturales y producir cepas ms virulentas. Mientras
que esto puede ser tericamente posible, el riego es demasiado bajo.
Genes virales diferentes a los genes de la capa
proteica. Los genes que codifican por RNAs y
no protenas pero que confieren resistencia,
cientficamente no presentan riesgo. Otros genes virales que decrecen la infeccin de un virus pero que aumenta la de otro, debern ser
mutados para poder recibir aprobacin.
d. Efecto de bioinsecticidas transgnicos en objetivos
no intencionales. Las plantas transgnicas Bt son
las ms relevantes. Las protenas Bt son altamente
especficas en su efecto txico, a nivel del grupo de
insectos, (por ejemplo: lepidopteros) y de su "blanco", en el tracto digestivo de la larva. Algunas de
esas protenas han mostrado efecto negativo en los
insectos benficos. Se ha demostrado tambin que
las protenas Bt se digieren rpidamente en el tracto
humano, por lo que no sera un riesgo para la salud
humana.
e. Adquisicin de resistencia por el insecto plaga. Esta
es una gran preocupacin sobre todo referida al caso
de los genes Bt. Hay dos estrategias que se siguen
para minimizar esta posibilidad :
1. La siembra de cultivos transgnicos intercalados con
no transgnicos en forma de mosaico, de tal manera
que ofrecen plantas "refugio" para los insectos susceptibles y as bajar la presin.
2. Desarrollar construcciones genticas conteniendo
dos o mas genes Bt con sitios de accin diferentes
(receptores diferentes) en las membranas del intestino medio de las larvas del insecto. Estudios realizados han mostrado que la resistencia adquirida por el
insecto en condiciones artificiales es recesiva, lo
cual indica que se requerir doble copia del alelo recesivo para ser efectiva. Las plantas refugio son una
estrategia para retardar la resistencia del insecto a
las toxinas de Bt.
f. Flujo de transgenes a microorganismos. Muy poco
se conoce sobre este tema, lo cual hace difcil la
evaluacin de este riesgo potencial. Se sabe que las
CEDAF
bacterias del suelo pueden obtener DNA de su ambiente y que el DNA puede permanecer adherido a
partculas del suelo, pero esta posibilidad es poco
probable. Cualquier riesgo potencial se elimina haciendo construcciones que no pueden ser usadas por
las bacterias, por ejemplo, construcciones conteniendo intrones. Es an menos probable la transferencia de DNA a hongos del suelo, dado que es
mucho ms difcil.
g. Efectos sobre la biodiversidad. Se refiere principalmente a dos casos:
1. Flujo de transgenes de cultivos transgnicos a malezas o silvestres emparentados. Como se discuti
arriba, este posible riesgo debe ser evaluado caso
por caso, dependiendo de la cercana taxonmica,
cercana del cultivo a sitios de variabilidad nativa,
grado de polinizacin cruzada, duracin de vida del
polen despus de la dehiscencia, sincronizacin de
la floracin, presencia de insectos u otro tipo de vectores, etc.
Es importante tomar en cuenta que este tema es

ms relevante en los trpicos que en reas temperadas. En el trpico, la biodiversidad es mucho
mayor y los cultivos son continuos, debido a que
no se presentan las cuatro estaciones que ocurren
en las reas temperadas.
2. Erosin gentica. La preocupacin va dirigida al hecho de que las variedades transgnicas reemplazaran a las variedades utilizadas por el agricultor,
disminuyendo de esta forma la biodiversidad. Aunque esto es tericamente posible, en la prctica se
espera que las variedades transgnicas sean cultivadas principalmente en reas de agricultura comercial, donde
tradicionalmente se cultivan las
variedades mejoradas y material transgnico. Lo
importante es incentivar a los agricultores para la
conservacin in situ de la biodiversidad.
6 .2 C os t o - benef i ci o de l a
B i ot ecnol og a
Toda tecnologa nueva debe ser evaluada en trminos de sus beneficios y costos. Algunos de los
problemas que se presentaron hace 30 aos con la
llamada Revolucin Verde, debern ser enfrentados una vez ms en el caso de biotecnologa agr-
cola. Dos preguntas pueden hacerse en relacin a

este tema:
1. El transgen incorporado cumplir una funcin importante en el rea geogrfica escogida? Algunas
evidencias demuestran que los genes utilizados
para el control de una plaga en un pas temperado,
no funciona en un pas tropical. Por ejemplo, para el
logro de la resistencia al virus del anillado de la papaya va transformacin gentica, las construcciones tuvieron que ser diseadas con cepas locales del
virus. Un caso similar se present con el control de
larvas de ciertos lepidopteros del algodn.
Tambin se debe tener en cuenta el sistema agrcola de la regin. Por ejemplo, mientras que en ciertos pases temperados el agricultor adquiere la
semilla hbrida cada ao, en algunos pases tropicales slo lo hacen cada tres aos. Una resistencia
transgnica perder su valor en un porcentaje considerable de la semilla hbrida despus del segundo y tercer ao. Esto amerita una mayor inversin
de recursos para encontrar genes mas apropiados y
un sistema ms eficiente de distribucin de la semilla acorde con el lugar.
2. Por cunto tiempo el transgen continuar sirviendo?. Este tema se refiere a la posibilidad de adaptacin de insectos, patgenos, y malezas a los
pesticidas y a las variedades que contienen el transgen. Este punto ya se discuti arriba en relacin al
caso de genes Bt. Lo importante de las estrategias
actuales es lograr la disminucin de los insectos resistentes mediante mtodos y tcnicas de manejo del
cultivo y de la plaga. Es necesario recordar que la
variedad transgnica por si sola muchas veces no es
la solucin, sino que es un componente importante
para ser integrado en sistemas de manejo del cultivo
y de la plaga.
La Tabla 6.1 muestra el aumento significativo de

ensayos de campo con plantas transgnica y el rea
sembrada comercialmente con cultivos transgnicos tanto en pases desarrollados como en desarrollo. Se estima que para el ao 2006, el 60% de los
productos derivados de soya y el 80% de los del
maz tendrn su origen en cultivos transgnicos a
nivel global.
123
CEDAF
Tabla 6.1 Nmero de ensayos de campo con plantas transgnicas y reas sembradas con cultivos transgnicos
comerciales. Fuente: James, C. (1998).
Nmero de ensayos de campo (evaluacin de bioseguridad)
Periodo
No. de pases
No. de cultivos
No. de caracteres
Total nmero de ensayos
1986 - 95
34
56
15,000
1996 - 97
45
60
10
10,000
Total 1986 - 1997
45
60
10
25,000
Area con cultivos comerciales transgnicos (millones de hectreas)
TOTAL
1996
1997
1998
13
30 (*) (**)
* EE.UU. (70%), Canad (15%), Otros (15%)

** Pases en Desarrollo: Argentina (4 millones hectreas), Mxico (1 milln hectreas
6 .3 Pro p i edad i nt el ect ual y

c o m er ci al i z aci n
Desde sus inicios en 1973 - 75 la biotecnologa llam la atencin por su potencial de comercializacin. Lo interesante es que an los experimentos
ms bsicos de laboratorio rpidamente encuentran un camino hacia la productividad y comercializacin. Numerosas compaas de biotecnologa
han sido creadas, sobre todo en los pases desarrollados. La mayora de estas compaas tenan objetivos ms tecnolgicos que comerciales. Las
exitosas compaas pequeas fueron rpidamente
adquiridas por multinacionales dedicadas a la comercializacin de semillas y/o agroqumicos. En
otros casos, estas pequeas compaas reciban jugosos contratos de las multinacionales para la elaboracin de productos o procesos especficos. Los
ltimos aos han sido testigos de asociaciones, adquisiciones, fusiones y compras de muchas de estas compaas biotecnolgicas por parte de
multinacionales de semillas, agroqumicos y frmacos. La motivacin ms importante de estos
procesos ha sido la conquista y colonizacin del
mercado mundial de los productos biotecnolgicos, sobre todo el de semillas y frmacos. Para tener una idea de la importancia econmica de la
industria biotecnolgica, vale la pena mencionar
que en 1998 el monto total de estas transaciones a
nivel global fue de 8 mil millones de dlares.
124
Una forma de asegurar el acceso a la tecnologa y a

productos para su comercializacin ha sido a travs de arreglos de propiedad intelectual. A parte
del clsico registro de variedades para asegurar el
derecho de obtentor (UPOV), la biotecnologa ha
generado una ola de patentamiento de genes, secuencias, mapas genmicos, sondas, tecnologas,
y otros procesos. En pases como EE.UU., slo
hasta ahora fue posible el patentamiento de plantas
transgnicas. Se estima que cada mes se registran
entre 50 - 100 nuevas patentes en biotecnologa a
nivel global.
6 . 3 . 1 P a te n te s
Entre 1992 - 96 , el 35% de todas las patentes haban sido registradas en EE.UU., y un porcentaje
igual en el Japn. Seguido se encuentran Europa
(18%), Rusia (6%), y el resto del mundo (6%), con
China y Corea como las ms importantes.
La carrera de patentamiento y otras formas de proteccin de la propiedad intelectual ha trado consigo cambios importantes en las estrategias de
investigacin, sobre todo en biotecnologa: Por
ejemplo, antes de iniciar un trabajo de transformacin gentica, es necesario determinar el nmero
de patentes y derechos distintos que existen en los
diferentes pases al igual que de los procesos del
plan de investigacin. Es necesario llegar a arreglos con los dueos de las patentes para obtener la
CEDAF
libertad de operacin necesaria. Otro aspecto es el

que se refiere a las patentes que confieren derecho
sobre toda la estructura gentica de la variedad,
sobre todos los genes que se aslen y an aquellas
que confieren derechos genticos sobre una metodologa y su aplicacin. Sin embargo, ya existen
casos de revisin por parte del poder judicial de
aquellas patentes genricas. El desafo que presenta el patentamiento en biotecnologa es promover
la innovacin a travs de la incentivacin del innovador y evitando monopolios, para facilitar innovaciones futuras. Para lograr este objetivo, el
Estado debe cumplir un papel importante evitando
la propiedad intelectual de procesos fundamentales, permitiendo solamente la propiedad intelectual de procesos y productos finales, con el fin de
incentivar la innovacin futura. El aumento sustancial de la inversin en fitomejoramiento y biotecnologa depende mucho de las campaas
promocionales que motiven la cooperacin entre el
sector pblico y privado.
6 .4 P r oducci n de al i m en t o s
La seguridad alimentaria depende del desarrollo
social, econmico y tecnolgico de un pas o regin. Por lo tanto, el papel de la biotecnologa, as
como el de otras tecnologas de punta, debe ser visualizado en el contexto de dicha realidad. Es necesario tener en cuenta la posicin del pas en el
contexto de la economa regional y global, el desarrollo de su exportacin/importacin de productos
agrcolas, la importancia de la pequea, mediana y
grande agricultura en la economa del pas, la capacidad de investigacin y el potencial tecnolgico
de este, la existencia de instituciones y normas/regulaciones para estimular el desarrollo tecnolgico. De esta forma, pases con una tecnologa fuerte
pueden utilizar la biotecnologa para aumentar su
agricultura hacia la diversificacin de productos, si
es un pas buen agroexportador, o pueden aumentar su agricultura hacia la autosuficiencia, si se trata de un pas agro importador.
6 . 5 E j e rc i c i o 6 . 1 P e r s p e c t i v a s f u t u r a s
de la Biotecnologa Vegetal
Objetivos
Elaborar el concepto de bioseguridad.

Identificar algunos factores que deben ser considerados en la evaluacin de riesgo cuando los
cultivos transgnicos son introducidos al campo.
Con este ejercicio se pretende que los participantes
asimilen el concepto de bioseguridad a travs de la
identificacin de algunos factores que deben ser
considerados en la evaluacin de riesgo debido a la
introduccin de cultivos transgnicos al campo.
Suministre informacin general sobre los objetivos del ejercicio.

Colocar en cada mesa, una planta de tomate.
Conforme cuatro grupos de trabajo y ubique
En cada grupo de trabajo los participantes deben
identificar factores que ellos consideren deben
ser tenidos en cuenta en la evaluacin de riesgo
cuando cultivos transgnicos de tomate son introducidos al campo.
Elaborar una lista de los factores que fueron considerados para la evaluacin de riesgo en cultivos transgnicos de tomate.
dadas.
Proporcionar la informacin de retorno, con la
lista de algunos factores que deben ser considerados para la evaluacin de riesgo para el cultivo
transgnico de este ejercicio.
Recursos necesarios

125
CEDAF
Cuatro plantas de tomate en materas o bolsas de

plstico.
Fotocopia de las instrucciones e informacin de
retorno.
Los participantes tendrn la oportunidad de construir el concepto de bioseguridad de acuerdo a la informacin suministrada en la Seccin 6 y mediante
la identificacin de algunos factores que deben ser
considerados para la evaluacin de riesgo cuando se
liberan al campo plantas transgnicas de tomate.
Instrucciones
J a me s , C . 1998. G l oba l R e vi e w of Com m er ci al i zed
T r a ns ge ni c C r ops . 1998. I S A A A B r i e fs No 8. I SAAA
I t ha c a , N .Y .
P e r s l e y, G . J ., G i ddi ngs , L . V ., a nd J um a, C. 1992.
B i os a f e t y: T he S a f e A ppl i c a t i on of B iot echnol ogy i n
A gr i c ul t ur e a nd t he E nvi r onme nt . The W or l d
B a nk/ I nt e r na t i ona l S e r vi c e f or N a t i onal Agr i cul t ur al
R e s e a r c h ( i s na r ) .
K r a t t i ge r , A . F ., a nd R os e ma r i n, A . ( e ds .) . 1 994. Bi osaf er y
f or S us t a i na bl e A gr i c ul t ur e : S ha r i ng Bi ot echnol ogy
R e gul a t or y E xpe r i e nc e s of t he W e s t er n Hem i spher e
I nt e r na t i ona l S e r vi c e f or t he A c qui si t i on of Agr i bi ot e c h A ppl i c a t i ons ( I S A A A ) : I t ha c a and St ockhol m
E nvi r onme nt I ns t i t ut e ( S E I ) . S t oc kh ol m . Sweden.
278 p.

a las instrucciones dadas por el instructor.
Nombren un relator por grupo, el cual presentar
en plenaria los resultados obtenidos por el grupo.
Realizar un listado de los factores que ustedes
piensen deben ser considerados en la evaluacin
de riesgo cuando cultivos transgnicos de tomate son introducidos al campo.
Al final del ejercicio, el instructor le proporcionar la informacin de retorno.
Cultivo transgnico
Tomate
126
Factores de riesgo en la evaluacin

1 Flujo del transgen a parientes silvestres.
2 Toxicidad del transgen para la salud humana y animal.
3 Efectos alergnicos de la planta transgnica usada como alimento.
4 Flujo del transgen a microorganismos.
5 Flujo de polen (vectores), viabilidad del polen.
CEDAF
Ori g i n a l e s pa r a t r a sp a r e nc i a s
127
128
Ensayos de Riesgo
Bioseguridad
Costo / Beneficio de la
Biotecnologa
Patentes
Propiedad Intelectual
Perspectivas Futuras de La Biotecnologa Vegetal
CEDAF
Entender por que los cultivos transgnicos son seguros.
Conocer algunos factores que se consideran podran ser causa de riesgo

por la introduccin de cultivos transgnicos al campo.
Objetivos
CEDAF
129
130
Son las polticas y mecanismos que se establecen para prevenir posibles

riesgos de la tecnologa del DNA recombinante y de la transformacin gentica
de plantas en la salud, el medio ambiente y la biodiversidad.
Qu es biodiversidad?
CEDAF
Se realiza para ganar experiencia en el manejo de este tipo de cultivos.
Se realiza, no , porque las plantas transgnicas sean

peligrosas o riesgosas para la salud, el ambiente o la biodiversidad.
Por qu se realiza la evaluacin de riesgo?
CEDAF
131
132
Erosin gentica.
Flujo de genes a microorganismos.
Desarrollo de resistencia del insecto plaga al bioinsecticida del transgen.
Efecto de bioinsecticidas transgnicos con objetivos no intencionados.
Flujo de genes de cultivos transgnicos a malezas.

Flujo de genes de cultivos transgnicos a plantas silvestres.
Flujo de genes de cultivos transgnicos a otros cultivos.
Evaluacin de algunos factores de riesgo
CEDAF
CEDAF
Anexos
133
CEDAF
Anexos
Anexo 1. Evaluacin final de conocimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
Anexo 2. Evaluacin final de conocimientos - Informacin de retorno . . . . . . . . . . 138
Anexo 3. Evaluacin del evento de capacitacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
Anexo 4. Evaluacin del desempeo del instructor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
Anexo 5. Evaluacin de los materiales de capacitacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
Anexo 6. La Biotecnologa Vegetal en la Repblica Dominicana . . . . . . . . . . . . . . 146
Anexo 7. Glosario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149
134
CEDAF
Anexo 1. Evaluacin final de conocimientos

1. Defina en forma amplia el concepto de biotecnologa.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
2. En el siguiente cuadro colocar las principales diferencias entre biotecnologa de primera, segunda y tercera generacin.
Biotecnologa
Caractersticas
De primera generacin
De segunda generacin
De tercera generacin
3. Qu eventos claves permitieron el desarrollo de la biotecnologa vegetal?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
4.
La totipotencia es la capacidad que tienen las clulas somticas vegetales de regenerar una planta completa cuando
son cultivadas en medios y condiciones adecuados. Explique como fue demostrado este fenmeno.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
5. En el cultivo in vitro de clulas, tejidos y rganos vegetales generalmente se siguen cuatro pasos fundamentales. Explique cuales son.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
6. La aplicacin del cultivo de tejidos vegetales se da bsicamente en tres reas. Explique cules son.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
135
CEDAF
7. Qu es la ingeniara gentica?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
8. Cules son las cuatro etapas bsicas para la clonacin de genes?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
9. Escriba el dogma central de la biologa
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
10. Defina que es un gen.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
11. Qu entiende usted por genoma?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
12. Qu estrategias se utilizan para el estudio de la variabilidad gentica de una especie?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
13. Qu propiedades deben reunir un marcador molecular para que sea til?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
136
CEDAF
14. Cules son los usos ms importantes de los marcadores moleculares en el mejoramiento gentico de plantas?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
15. Qu es una planta transgnica?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
16. Si usted esta interesado en transformar tomate (especie dicotiledonea), que sistema de transformacin eligira? Explique.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
17. En la siguiente tabla presente tres ejemplos de cultivos transgnicos, indicando el tipo de gen introducido y la funcin
de este gen en el cultivo transgnico.
Cultivo transgnico
Gen introducido
Caractersticas del cultivo transgnico
1
2
3
18. Qu es bioseguridad?
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
19. Un tomate transgnico al cual se le ha introducido el gen Bt para conferirle resistencia a un insecto plaga, ser nocivo para la salud humana? Explique su respuesta.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________
137
CEDAF
Anexo 2. Evaluacin final de conocimientos - Informacin de retorno

A continuacin se presentan posibles respuesta a las preguntas formuladas en la evaluacin final de conocimientos, estas pueden ser ampliadas por el instructor.
Respuestas
Para la pregunta 1
Biotecnologa es la aplicacin de los principios cientficos y de ingeniera para el procesamiento de materiales por medio de agentes biolgicos con el objetivo de producir bienes y servicios, en donde los agentes
biolgicos se refieren principalmente a microorganismos, clulas de animales y plantas, enzimas y material gentico aislado y clonado.
Para la pregunta 2
Biotecnologa
Caractersticas
De primera generacin
Se bas en la fermentacin como proceso bsico para la produccin de

bebidas, alimentos y combustibles.
Practica esencialmente emprica y en pequea escala.
Haba poco conocimiento cientfico y de ingeniera.
De segunda generacin
Usa el conocimiento cientfico y de ingeniera.

Procesos a escala industrial.
Procesos basados en aplicacin integrado de microbiologa, bioqumica e
ingeniera qumica.
Incluye: uso de fermentadores para la produccin de frmacos, combustibles
y alimentos y procesamiento de desechos.
Tambin incluye: la tcnica de inmovilizacin de enzimas y tcnicas de cultivo
de tejidos vegetales y animales.
De tercera generacin
Tambin llamada: Nueva biotecnologa.

Se inicia con el descubrimiento del DNA recombinante.
Se basa en la biologa molecular.
Dio origen a las empresas biotecnolgicas que explotan la ingeniera gentica
para cortar y confeccionar genes que son colocados en microorganismos
para que fabriquen por encargo productos qumicos y farmacuticos de
inters.
Para la pregunta 3
Los eventos claves que permitieron el desarrollo de la biotecnologa vegetal fueron:
a. El desarrollo de cultivo in vitro.
b. El descubrimiento de DNA recombinante.
c. El desarrollo de los marcadores moleculares y el desarrollo de los sistemas de transformacin gentica de
plantas.
138
CEDAF
Para la pregunta 4
La totipotencia de las clulas somticas vegetales fue demostrada por Steward y colaboradores en 1958
quienes describieron el desarrollo de una planta de zanahoria a partir de clulas somticas del floema de la
raz de zanahoria.
Para la pregunta 5
Para cultivar in vitro clulas, tejidos y rganos vegetales se deben seguir los siguientes pasos:
a. Seleccionar y separar de la planta el explante que se desea cultivar.
b. Desinfectar el explante.
c. Sembrar el explante en un medio de cultivo apropiado.
d. Cultivar el explante en condiciones ambientales controladas.
Para la pregunta 6
La aplicacin del cultivo de tejidos vegetales se da bsicamente en tres reas:
a. La micropropagacin.
b. La contribucin del cultivo in vitro en el mejoramiento vegetal.
c. La produccin de metabolitos secundarios.
Para la pregunta 7
La ingeniera gentica, es el trmico ms utilizado para referirse al conjunto de tcnicas involucradas en la
manipulacin del material gentico (DNA y RNA), y est basada en la tecnologa del DNA recombinante.
La tecnologa del DNA recombinante bsicamente consiste en aislar segmentos especficos de DNA (genes) e introducirlos en vectores especiales (plsmidos) para formar molculas de DNA recombinante.
Para la pregunta 8
Las cuatro etapas bsicas para la clonacin de genes son:
a. Generacin de fragmentos de DNA.
b. Unin de los fragmentos a un vector molecular.
c. Introduccin del vector a una clula hospedante, para la amplificacin.
d. Seleccin de una secuencia especfica.
Para la pregunta 9
Transcripcin
Replicacin
D NA
Traduccin
mRNA
PRO TEINA
Transcripcin
Reversa
139
CEDAF
Para la pregunta 10
Un gen es un segmento de DNA que presenta una secuencia especfica de pares de bases el cual contiene
informacin para una caracterstica gentica del individuo.
Para la pregunta 11
Genoma es el contenido gentico total de un organismo. En las plantas el genoma est constituido por el
contenido gentico nuclear y organelar (mitocondrias y cloroplastos). Sin embargo, el trmino genoma
casi siempre se utiliza para referirse a la informacin gentica presente slo en el genoma nuclear.
Para la pregunta 12
La variabilidad gentica de una especie puede ser detectada de diferentes maneras:
a. Usando marcadores morfolgicos y marcadores bioqumicos (isoenzimas) que son productos de la expresin de
los genes y
b. Usando marcadores moleculares, que permiten detectar diferencias entre individuos directamente a nivel de las
secuencias del DNA de su genoma.
Para la pregunta 13
Para que un marcador molecular sea til debe reunir las siguientes propiedades:
a. Que sea altamente polimrfico, es decir, que permita diferenciar claramente, dos individuos.
b. Que sea codominante, para poder discriminar un individuo homocigoto de un heterocigoto.
c. Que est distribuido a travs del genoma.
d. Que no presente efecto pleiotrpico, es decir, que no afecte ms de una caracterstica.
e. Que sea de fcil y rpida ejecucin.
f. Que tenga alta reproducibilidad.
Para la pregunta 14
Los usos ms importantes de los marcadores moleculares en el mejoramiento gentico de plantas son:
a. En la evaluacin de germoplasma:
b. Caracterizacin y anlisis de la variabilidad gentica, identificacin de acervos genticos y de parentales para el
mejoramiento gentico.
c. En mapeo de genes cualitativos y cuantitativos (QTLs).
d. En estrategias de fitomejoramiento:
e. Seleccin asistida por marcadores moleculares, identificacin y transferencia de QTLs de germoplasma
silvestre.
f. Mejoramiento asistido por marcadores moleculares.
g. Clonacin de genes con base a mapas genticos.
Para la pregunta 15
Una planta transgnica es una planta a la cual se le ha introducido un gen modificado (un gen quimrico),
utilizando un mtodo apropiado de transformacin: mediante: ya sea , va Agrobacterium tumefaciens o
140
CEDAF
mediante el bombardeo de partculas o biolstica. El gen introducido es integrado en forma estable en el

genoma de la planta; es expresado y heredado de una generacin a otra.
Para la pregunta 16
Las especies dicotiledneas como tomate son susceptibles a varias cepas de Agrobacterium tumefaciens.
Plsmidos Ti modificados de estas cepas pueden ser utilizados como vectores para transformar este cultivo y en la prctica sta es la va elegida para transformar tomate.
Para la pregunta 17
Cultivo transgnico
Gen introducido
Caractersticas del cultivo

transgnico
EPSP Sintasa
Resistencia al herbicida
glifosato
Soya
Tomate
ACC Sintasa Antisentido
Retarda la maduracin del

fruto
Tabaco
Protena de la cubierta o
cpsula del virus TMV
Resistencia al virus del

mosaico del tabaco (TMV)
Para la pregunta 18
Bioseguridad: Se refiere a las polticas y mecanismos que se establecen para prevenir posibles riesgos de
la tecnologa del DNA recombinante y de la transformacin gentica de plantas en la salud, el medio ambiente y la biodiversidad. Las instituciones oficiales de salud, alimento y ambiental de varios pases, han
creado regulaciones para evaluar posibles riesgos de las plantas transgnicas, sobre todo al realizar ensayos de campo.
Para la pregunta 19
Un tomate transgnico al que se le ha introducido el gen Bt de Bacillus thuringiensis expresa una deltaendotoxina que es altamente especfica en su efecto txico slo contra insectos lepidpteros. Se ha demostrado que estas toxinas no actan en insectos benficos y son digeridas en el tracto digestivo de los humanos, por lo que no representa ningn riesgo consumir tomate transgnico con Bt.
141
CEDAF
Anexo 3. Evaluacin del evento de capacitacin

Apreciado participante:
Deseamos conocer sus opiniones sobre las actividades realizadas el da de hoy. No necesita firmar este
formulario; de la sinceridad en sus respuestas depende en gran parte el mejoramiento de esta actividad.
La evaluacin incluye dos componentes:
a) La escala 0 a 3 sirve para que usted asigne un valor a cada uno de los aspectos que se evalan:
0 = Malo, inadecuado
1 = Regular, deficiente
2 = Bueno, aceptable
3 = Muy bueno, altamente satisfactorio

b) Debajo de cada pregunta hay un espacio para comentarios de acuerdo con el puntaje asignado.
Refirase a los aspectos positivos y negativos y deje en blanco los aspectos que no aplican en el caso
de las actividades realizadas el da de hoy.
1.0 Evale el (los) objetivo (s) que se esperaba lograr el da de hoy.
1.1 Correspondi o correspondieron a las necesidades
institucionales y personales y las expectativas que usted traa?
Comentarios:
__________________________________________________________________________________
Cree que se logr o se lograron los objetivos propuestos?
Comentarios:
__________________________________________________________________________________
2.0 Evalel as estrategias metodolgicas empleadas:
2.1 Exposiciones de los instructores
2.2 Trabajos de grupo
2.3 Cantidad y calidad de los materiales entregados
2.4 Ejercicios realizados en el sitio del evento
2.5 Prcticas de campo
2.6 El tiempo dedicado a las diferentes actividades
Comentarios:
__________________________________________________________________________________
142
CEDAF
3.0 Evale la coordinacin de las actividades

3.1 Informacin preliminar recibida por los participantes
3.2 Cumplimiento del horario de esta actividad
3.3 Manera en que se dirigieron las actividades
3.4 Apoyo logstico disponible (espacios, equipos, etc.)
3.5 Alojamiento (en caso de que aplique)
3.6 Alimentacin (en caso de que aplique)
Comentarios:
__________________________________________________________________________________
4.0 Evale la aplicabilidad (utilidad) de lo aprendido en su

trabajo actual o futuro.
Comentarios:
__________________________________________________________________________________
5.0 Qu actividades realizar en el corto plazo en su institucin para aplicar o transferir lo aprendido
en este da?
__________________________________________________________________________________
6.0 Estara interesado en que esta capacitacin se llevara a cabo en su institucin? En qu forma?
__________________________________________________________________________________
Gracias por sus respuestas y comentarios!
143
CEDAF
Anexo 4. Evaluacin del desempeo del instructor

Fecha:______________________________
Nombre del Instructor:_________________________________________________
Temas desarrollados:___________________________________________________
Instrucciones
Marque con una (X) el nmero que corresponda segn lo que haya apreciado del instructor en el
desarrollo de los temas.
La escala evaluativa es la siguiente: 4= Muy bien
3= Bien
2= Regular
1= Mal
Exprese con sinceridad sus opiniones, no requiere firmar, los resultados sern utilizados para el
mejoramiento en prximos eventos.
1.Organizacin y claridad del instructor
a. Present los objetivos de la actividad
b. Explic la metodologa a seguir
c. Tuvo claridad en las explicaciones
d. Present ayudas didcticas que permitieran la comprensin
e. Los contenidos facilitaron el aprendizaje
a. Mostr seguridad en su exposicin
b. Respondi las preguntas a satisfaccin
c. Relacion la teora con la prctica
d. Present ejemplos para ilustrar temas
a.Inspir confianza al grupo
b. Demostr inters en el aprendizaje de los alumnos
c. Formul preguntas a los participantes
d. Escuch con atencin a los participantes
e. Proporcion informacin de retorno
a. Las prcticas estuvieron orientadas hacia los objetivos propuestos
b. Eligi los sitios adecuados para su realizacin
c. Evalu la sesin prctica
d.Proporcion informacin de retorno
2. Dominio del tema
3. Interaccin del grupo
4. Direccin de las prcticas
144
CEDAF
Anexo 5. Evaluacin de los materiales de capacitacin

La evaluacin del material puede hacerse con la participacin de:
Expertos en el contenido (cientficos, investigadores)
Expertos en comunicacin
Tcnicos, facilitadores de procesos, profesores, etc.
Productores, agricultores, miembros de organizaciones comunitarias, etc.
Para este efecto, los evaluadores pueden usar un formato como el siguiente:
Calidad del Contenido
Si
No
Si
No
Si
No
La informacin que se presenta es tcnicamente vlida en el contexto en que se utiliza

El contenido est dividido en segmentos que siguen un proceso claro y ordenado
El contenido se presenta objetivamente, es decir respetando principios y mtodos vlidos
El contenido es adecuado para el nivel de la audiencia (ver usuarios de la Gua)
El contenido est actualizado desde el punto de vista cientfico-tcnico
Calidad de la Produccin
La calidad de la impresin es excelente
Las imgenes (dibujos, grficas, cuadros) son claras
Las ilustraciones apoyan el mensaje escrito
Los iconos estn bien seleccionados (de acuerdo con el significado del texto)
La distribucin de la informacin (diagramacin) en cada pgina es adecuada
Los dibujos y fotografas reflejan bien situaciones reales
Hay una buena correspondencia entre imgenes y textos
Calidad instruccional
Los objetivos estn claramente establecidos
El material favorece la participacin de la audiencia en la capacitacin
La relacin objetivos-contenidos es excelente: el contenido refleja lo que se propone en los
objetivos
El material facilita los procesos de enseanza y aprendizaje
Los ejercicios y prcticas son novedosos
Los ejercicios y prcticas ayudan en la comprensin de los temas.
145
CEDAF
Anexo 6. La Biotecnologa Vegetal en la Repblica Dominicana

Por: Bienvenido Cabral E., Ph.D.
Para: Centro para el Desarrollo Agropecuario y Forestal (CEDAF)
Un anlisis del programa agropecuario de la Repblica Dominicana muestra que las oportunidades ofrecidas por la Biotecnologa Vegetal al pas son obviamente prometedoras.
Segn datos del Plan Nacional de Alimentacin y Nutricin (PLANAN), publicado en Santo Domingo,
D. N., por la Secretara de Estado de Agricultura (SEA), en enero de 1998, la agropecuaria dominicana tena el potencial de proveer ms de una tercera parte de divisas por concepto de exportacin y bienes, y ms
del 60% de los alimentos del consumo interno.
Los principales cultivos de exportacin continan siendo la caa de azcar, el caf, el cacao y el tabaco,
los que ocupan ms del 50% del volumen de las explotaciones; por otro lado, las pequeas y medianas fincas proporcionan al pas su seguridad alimentaria, siendo los principales cultivos caf, cacao, arroz, tabaco, musceas, habichuelas, as como tambin en algunas reas de hortalizas, papas, races.
Los problemas fitosanitarios afectan considerablemente la produccin de los cultivos en la Repblica
Dominicana. El ataque de plagas, enfermedades fungosas, bacterianas y las causadas por virus, reducen
sustancialmente la produccin siendo esto un peligro para la seguridad alimentaria de los dominicanos.
Adems, hay que destacar que en la mayora de los casos se emplean variedades tradicionales con muy
bajos niveles de productividad y resistencia a los factores antes mencionados. Tal es el caso de la Broca y
la Roya en el caf, las Sigatokas amarilla y negras en las musceas, el caro y la Pyricularia en el arroz y
las virosis en los cultivos de tabaco, habichuelas y races comestibles Por otra parte, es oportuno reconocer que la baja productividad de la agricultura dominicana est asociada en gran medida con problemas
climticos y de suelos, siendo particularmente importantes las sequas, las cuales ocasionan daos considerables en los cultivos.
En la solucin de estos problemas debe jugar un papel la poltica que se adopte de generacin y transferencia de tecnologa, la cual debe considerar la reorganizacin del sistema de investigacin, validacin y
transferencia de tecnologa, enfatizando la investigacin en rubros que integran la canasta familiar en el
mercado local, tales como pltano, arroz, habichuela y otros cultivos competitivos en el mercado internacional.
El rol y el aporte de la Biotecnologa Vegetal al desarrollo de este proceso son prioritarios, sobre todo en
los actuales tiempos cuando se demanda una mayor productividad y competitividad de la agricultura dominicana, ante los procesos de apertura y las nuevas reglas del mercado internacional.
Dado que en el mejoramiento gentico convencional los ciclos de cultivo son amplios y se requieren de
grandes extensiones de terreno para su evaluacin, es necesario incorporar tcnicas como las de cultivo in
146
CEDAF
vitro e ingeniera gentica, para reducir el tiempo y el espacio necesarios para la obtencin de mejores variedades.
Como sabemos, la Biotecnologa Vegetal ofrece la posibilidad de producir variedades ms tolerantes a
condiciones desfavorables que tericamente permitiran ampliar la superficie cultivable, elevar los rendimientos y disminuir las prdidas producidas por enfermedades, plagas y estrs. Sin embargo, de la teora
a la prctica existe un camino muy largo y con muchos obstculos. El desarrollo de la Biotecnologa Vegetal en la Repblica Dominicana requiere de un mayor apoyo que permita incrementar la infraestructura
material y humana; y disponer de financiamiento seguro y adecuado.
En trminos generales, podemos considerar que el pas tiene en la actualidad un potencial para desarrollar
y explotar la Biotecnologa Vegetal. En el pas existen cinco laboratorios que trabajan con tcnicas de
biotecnolgicas. En la mayora de stos sus actividades se restringen al cultivo de tejidos con nfasis en la
micropropagacin vegetativa comercial y, prcticamente, no se han dado los pasos para aprovechar otras
aplicaciones y tcnicas para al mejoramiento gentico vegetal. Tampoco se han explorado a profundidad
otras oportunidades como son la produccin de metabolitos secundarios muy demandados por la industria
farmacutica y la perfumera, entre otros.
Por otro lado, ninguno de los laboratorios existentes cuentan con la infraestructura y equipos necesarios
para la implementacin de la tecnologa del DNA recombinante, las tcnicas de los marcadores moleculares y la transformacin gentica de plantas.
Sin embargo hay que reconocer que en el rea de cultivo de tejidos ya contamos con algunos avances. En
el Laboratorio Nacional de Biotecnologa Vegetal de la SEA, se han desarrollado tcnicas avanzadas de
reproduccin mediante el sistema de vitro, que han contribuido a la produccin de plantas de mayor sanidad y a disminuir los costos en la produccin.
Este laboratorio aporta al pas cerca de algunos 600,000 plantas/ao, principalmente de pltanos y papas,
que son cultivos en los cuales se concentra la demanda de los productores. Las necesidades de material
de siembra para estos cultivos no son abastecidas, ya que sta se sita por los dos millones de plantas por
ao. Otras especies multiplicadas son: yuca, ame, pia, algunos vegetales y caf. El laboratorio desarrolla varios trabajos de inters como son los de multiplicacin de variedades de caf tolerantes a Roya, nuevas variedades de ajo adaptadas a zonas bajas, rescate de germoplasma de pia, produccin de material
de propagacin de fresas, entre otros. En el cultivo de caf se ensayan tcnicas de embriognesis somtica, lo que representa una gran perspectiva.
El pas dispone de uno de los laboratorios de Biotecnologa Vegetal ms grandes del rea del Caribe (Luoma Vitrolab), el cual, segn el nivel de demanda, ha logrado producir cerca de 5 millones de plntulas de
musceas por ao.
En este laboratorio privado se han aplicado las tcnicas de cultivos de tejidos para la multiplicacin de un
gran nmero de cultivos alimenticios as como especies forestales, frutales y ornamentales y, ms an,
han logrado realizar la regeneracin de las plantas no slo mediante el cultivo de meristemos, sino tamWilliam M. Roca / Hernando Ramrez
147
CEDAF
bin va organognesis y embriognesis somtica. Adems, han practicado el cultivo de sus suspensiones
celulares.
Este laboratorio cuenta con un alto potencial investigativo y productivo, pero en la actualidad slo se dedica exclusivamente a la micropropagacin clonal de plantas de especies ornamentales, como orqudeas,
crisantemos, ster, gladiolos, anthurium, lilium, claveles, rosas y otros. Segn sus directivos le resulta imposible competir con los costos de produccin del laboratorio estatal en la multiplicacin de otros rubros.
Existe otro laboratorio privado en el pas que se dedica exclusivamente a la produccin en gran escala de
orqudeas para la exportacin. Los que pertenecen al Instituto Superior de Agricultura (ISA) y a la Universidad Autnoma de Santo Domingo (UASD) realizan tareas de micropropagacin de plantas en menor
escala y no son empleados a plenitud en las funciones de investigacin y enseanza como es de esperar.
Esto quiz ocurre porque todava en el pas no existe ningn pregrado o postgrado en el rea de agrobiotecnologa. Tan solo ahora una universidad del pas, el Instituto Superior de Agricultura (ISA), ha tomado
la iniciativa de incluir en el pensum de las carreras de Ingeniera Agronmica e Ingeniera en Manejo de
Recursos Naturales la asignatura biotecnologa vegetal. Por otra parte, el Comit Interinstitucional del
Programa de Postgrados Tecnolgicos de las Amricas, en coordinacin con el INDOTEC y el CEDAF,
ha discutido la posibilidad de un proyecto de postgrado en biotecnologa. Uno de los problemas que enfrentar este proyecto podra ser el de la insuficiencia de recursos humanos locales en esta rea. En la actualidad existen en el pas solamente tres especialistas en Biotecnologa Vegetal que poseen grado
cientfico de Ph.D., dos con el grado de M.Sc. y un nmero muy reducido de tcnicos con cursos realizados en esta rea.
No obstante esto ltimo, debemos insistir que las investigaciones en esta importante rea cientfico-tcnica slo se manifestarn cuando tengan la prioridad y el apoyo de los sectores vinculados a la administracin del desarrollo agropecuario nacional, tanto privado como estatal; de lo contrario, el potencial de la
biotecnologa vegetal permanecer latente en la Repblica Dominicana.
148
CEDAF
Anexo 7. Glosario
cido nucleico:
Polmero de nucleotidos (ver DNA y RNA).
Aminocido
Unidades estructurales que forman las protenas. Se encuentran unidos en una secuencia ordenada, lo que
determina la estructura primaria, secundaria, y terciaria de la protena.
Anteras
Parte masculina de una flor, en la cual se produce el polen. Porcin del estambre que contiene el polen ordinariamente bilocular.
Antibitico
Sustancia producido por un organismo viviente que es txica para otros organismos.
Anticodn
Triplete de nucletidos en la molcula del RNA de transferencia (tRNA) que es complementario con el
codn en el RNA mensajero. (mRNA), durante la sntesis de protenas.
Autorradiografa
Tcnica que permite la deteccin de molculas marcadas radioactivamente, al superponer la muestra con
una pelcula fotogrfica.
Bacterias
Grupo de microorganismos unicelulares procariontes, es decir, sin membrana nuclear ni organelos definidos.
Bacterifago
Tambin llamado fago. Son virus que infectan clulas bacterianas provocando normalmente su lisis y obtenindose una nueva progenie de virus. Algunos, como el fago lambda son muy utilizados en experimentos de DNA recombinante.
Base nitrogenada
Molcula orgnica de naturaleza purnica o pirimidnica que forma parte de los cidos nucleicos. Principalmente son cinco: adenina, guanina, timina, citosina y uracilo. Esta ltima se encuentra slo en el RNA.
Beta-Galactosidasa
Enzima que cataliza la hidrlisis de la lactosa en glucosa y galactosa.
149
CEDAF
Biotecnologa
Conjunto de procesos industriales y de tecnologas, que implican el uso de sistemas biolgicos. Algunos
de estos procesos utilizan microorganismos manipulados genticamente (ingeniera gentica).
Callo
Conjunto de clulas vegetales provenientes de una sola clula vegetal inicial.
Cpside
Cubierta proteica externa de un virus. Posee una estructura altamente regular, que encierra el cido nucleico del virus.
Clula
Unidad fundamental de la vida; el organismo ms pequeo capaz de reproduccin independiente.
Clon
En general, grupo de organismos genticamente idnticos debido a que han sido producidos por algn
tipo de reproduccin asexual. Poblacin de clulas que desciende de una sola clula madre.
Clonaje
Originalmente se refera al proceso por el cual se obtiene un grupo de clulas idnticas de una sola clula
(cln). El trmino se ha extendido al proceso de obtener muchas copias de un gen a partir de una sola copia.
Cloroplasto
Organelo presente en las clulas vegetales, donde se produce la fotosntesis.
Cdigo gentico
Relacin entre la secuencia de nucletidos en el DNA o el RNA y la secuencia de aminocidos de una protena. Cada triplete o conjunto de tres nucletidos en el cido nucleico determina un aminocido especfico. Por tanto, segn la composicin y frecuencia de nucletidos, se obtendrn diferentes composiciones y
frecuencias de aminocidos, es decir, diferentes protenas.
Codn
Secuencia de tres nucletidos en el mRNA, que codifica un aminocido o la terminacin de una cadena
polipeptdica.
Colonia
Grupo de clulas contiguas, normalmente derivadas de una misma clula original, que crecen en una superficie slida.
150
CEDAF
Crecimiento
Incremento en la masa (peso seco y/o tamao) de un organismo que acompaa los procesos de desarrollo,
diferenciacin y morfognesis. El crecimiento usualmente involucra divisin y expansin celular.
Cromosoma
Estructura compuesta por cidos nucleicos, en la que se encuentran los genes dispuestos en orden lineal.
Su nmero es variable segn la especie de que se trate, pero siempre es constante en una especie dada.
Cultivo celular
Crecimiento in vitro de clulas aisladas de organismos pluriclulares, animales o vegetales.
Cultivo en suspensin
Cultivo de clulas, tejidos u rganos sumergidos en un medio nutritivo lquido que requiere agitacin.
Deleccin
Prdida de un segmento de DNA. Puede variar desde solamente un nucletido hasta un conjunto de genes.
DNA (cido desoxirribonucleico)
Es la forma molecular en la que se guarda y transmite la informacin biolgica hereditaria.
Desoxirribonucletido
Se obtiene al unirse un grupo fosfato a la pentosa de un desoxirribunuclesido.
Diferenciacin
Fase de crecimiento durante la cual las clulas no especializadas se especializan en funciones particulares
(por ejemplo, el meristemo).
Dogma central
La relacin entre DNA, RNA y protena. El DNA sirve como molde tanto para su autorreplicacin como
para la sntesis del RNA. El RNA, a su vez es el molde de la sntesis de protena.
Endonucleasa
Enzima que produce cortes internos en el DNA.
Enzima
Protena funcional que cataliza una reaccin qumica especfica, pero sin intervenir en ella. Es un catalizador biolgico. Es especfico, es decir, es un catalizador solo de una reaccin o de un tipo de reacciones.
151
CEDAF
Son endonucleasas capaces de reconocer y cortar mleculas de DNA de doble cadena en sitios especficos
y que intervienen en el sistema de restriccin-modificacin del DNA de algunas bacterias.
Embriognesis
Capacidad de las plantas con flores para producir embriones. No se reduce el desarrollo del huevo fertilizado, sino que tambin puede ser inducido en cultivo de tejidos vegetales. (Embriognesis somtica).
Escherichia coli
Bacteria del intestino humano. Durante muchos aos fue el nico hospedero utilizado en los experimentos de ingeniera gentica.
Exn
Secuencia de bases del DNA eucariptico que se transcribe a mRNA y que codifica una protena.
Expresin gentica
Sntesis de protena a partir de un gen determinado (gen expresado), mediante transcripcin y traduccin.
Extremos cohesivos
Cortes "escalanados" en el DNA de doble cadena, dando lugar a terminales de cadena sencilla complementarios entre s. Permiten la circularizacin de la molcula de DNA de doble cadena.
Fenotipo
Conjunto de caractersticas visibles de un organismo como consecuencia de la interaccin del genotipo y
del medio ambiente.
Fermentacin
Proceso de transformacin, mediante enzimas o microorganismos. Se utiliza a escala industrial para la
obtencin de productos como alcoholes, cidos orgnicos, etc.
Gen
1.
Unidad bsica de la herencia. 2. Secuencia de DNA que codifica una protena especfica.
Genoma
Conjunto cromosmico bsico de un organismo. La suma total de sus genes.
Genotipo
Dotacin gentica de un organismo.
152
CEDAF
Haploide
Designa a cualquier ncleo clula u organismo que posee un juego simple de cromosomas impares. Nmero n o nmero reducido de cromosomas tpico de la mayora de los gametofitos.
Heterocigoto
Designa a un ncleo, clula u organismo diploide que contiene dos alelos diferentes por cada gen.
Hbrido
Producto de dos padres genticamente diferentes. Primera generacin de la descendencia de una cruza entre dos individuos que difieren en uno o ms genes. Progenie de una cruza entre especies del mismo gnero o de gneros distintos.
In vitro
Designa a los procesos biolgicos o a las investigaciones que se realizan fuera de los organismos vivos,
tradicionalmente en tubos de ensayo.
Informacin gentica
La informacin contenida en la secuencia de nucletidos del DNA o RNA.
Ingeniera gentica
Tecnologa usada a nivel de laboratorio para alterar el aparato heriditario de una clula viva, de forma que
pueda producir ms o diferentes productos o desarrollar funciones diferentes. Estas clulas, manipuladas
genticamente, pueden utilizarse en la produccin industrial.
Insercin
Mutacin producida al intercalar una o varias bases nitrogenadas en la secuencia de una cadena de DNA.
Intrn
Secuencia de bases presentes en el DNA que aunque se transcribe no aparece en el mRNA final.
Nucletido
Unidad fundamental de los cidos nucleicos. Consta de una de las bases nitrogenadas unida a un grupo
pentosa-fosfato.
mRNA (RNA mensajero)
RNA formado a partir del DNA y que sirve como molde para la sntesis de protenas.
Marcador gentico
Mutacin gentica con un efecto observable sobre el organismo, lo que permite localizar su posicin dentro del cromosoma y seguir su transmisin.
153
CEDAF
Mapa gentico
Colocacin ordenada de los genes en un cromosoma, segn se deduce de los experimentos de recombinacin gentica.
Medio nutritivo
Medio de cultivo empleado para iniciar, desarrollar o enraizar diferentes inculos; est formulado con
macro y micronutrientes azcar y reguladores de crecimiento.
Meristemo apical
Meristemo que se encuentra en el pice de un brote o raz.
Mutacin
Cambio en la cantidad o estructura del DNA en los cromosomas, pudiendo ser gnica o cromosmica.
Una mutacin gnica consiste en el cambio de un gen de una forma allica a otra; los cambios cromosmicos consisten en duplicaciones, inversiones, intercambios, etc.
Organognesis
Formacin de rganos (la caulognesis es la iniciacin de brotes y la rizognesis es la iniciacin de races).
Plsmido
Material heridatario extracromosmico. Es una molcula de DNA circular con replicacin independiente.
Gracias a su pequeo tamao y simplicidad se usan frecuentemente en experimentos con DNA recombinante, sectores de DNA extraos y como vectores para la insercin de estos DNAs extraos en otros organismos.
Polinucletido
Secuencia lineal de nucletidos.
Promotor
Regin del DNA a la que se une la enzima RNA polimerasa para iniciar la transcripcin.
Primordio
Grupo de clulas destinado a transformarse en una estructura particular, como lo es el primordio foliar,
que va a dar origen a las hojas.
Proliferacin
Crecimiento por multiplicacin rpida de nuevas clulas.
Protena
Polmero lineal de aminocidos. Las protenas son el producto de la expresin gentica.
154
CEDAF
rRNA (RNA ribosmico)

RNA componente de los ribozomas. Distinto del mRNA y tRNA. Su funcin es la de mantener la unin
entre el mRNA y el tRNA durante la sntesis de protenas.
Recombinacin
Proceso de intercambio de material gentico.
Recombinante
Clula o cln de clulas resultante de una recombinacin.
Replicacin del DNA
Mecanismo por el cual se producen copias exactas de un DNA que se toma como molde. Este mecanismo
implica la separacin de las dos cadenas de DNA y la construccin a partir de cada una de ellas, de una
nueva cadena complementaria, mediante el apareamiento de bases.
RNA (cido ribonucleco)
Polmero de ribonucletidos. En sus tres formas de mRNA, tRNA y rRNA, transforma el mensaje contenido en el DNA en una secuencia de aminocidos, es decir, en protenas.
Subcultivo
Transferencia del inculo a medio fresco.
tRNA (RNA de transferencia)
RNA capaz de combinarse con un aminocido especfico. Cada especie de tRNA tiene un triplete de nucletidos (anticodn) que interacciona con un triplete complementario (codn) en el mRNA.
Totipotencialidad
Es el fenmeno por el cual las clulas somticas provenientes de diferentes partes de la planta, dadas las
condiciones apropiadas, pueden desarrollarse en una planta completa.
Traduccin
Sntesis de una protena, cuya secuencia de aminocidos esta especificada por los tripletes de nucletidos
del mRNA.
Transcripcin
Sntesis del RNA a partir de un DNA molde, basndose en la complementariedad de bases.
Transcriptasa inversa
Enzima capaz de catalizar la sntesis de DNA a partir de RNA. Slo se ha encontrado en los retrovirus.
155
CEDAF
Transformacin gentica
Mecanismo por el que se introduce un fragmento de DNA en el interior de una clula. Gracias a este nuevo fragmento la clula receptora puede adquirir nuevas funciones.
Vector gentico
Vehculo para la transmisin de un fragmento de DNA de una clula a otra. En gentica molecular, los
vectores ms utilizados son plsmidos y virus, que pueden llevar un DNA extrao a una clula receptora u
hospedante.
Virus
Agente, de menor tamao que una bacteria, que causa enfermedades infecciosas y que necesita una clula
intacta para su replicacin. Contiene DNA o RNA como material hereditario, rodeado por una cubierta
proteica.
Yema (botn)
Pequeo abultamiento en el tallo de una planta; da origen a una rama, a una flor o a varias hojas.
156

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Actualizacin Profesional en Manejo de Recursos

Naturales, Agricultura Sostenible y Pobreza Rural

Centro para el Desarrollo Agropecuario y Forestal, Inc.

Octubre del 2000

William M. Roca / Hernando Ramrez

Seccin 1 Una Introduccin a la Biotecnologa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Seccin 2 Cultivo de Tejidos Vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

William M. Roca / Hernando Ramrez

Seccin 3 Tecnologa del DNA Recombinante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

Seccin 4 Marcadores Moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

William M. Roca / Hernando Ramrez

Seccin 5 Transformacin Gentica de Plantas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

Seccin 6 Perspectivas Futuras de la Biotecnologa Vegetal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

William M. Roca / Hernando Ramrez

William M. Roca / Hernando Ramrez

William M. Roca / Hernando Ramrez

William M. Roca / Hernando Ramrez

William M. Roca / Hernando Ramrez

La biotecnologa vegetal comprende una serie de tcnicas que incluyen:

William M. Roca / Hernando Ramrez

Elabore una definicin de lo que usted considera es biotecnologa.

Defina qu es el cultivo de tejidos vegetales

Qu aplicacin prctica le vera usted a esta tcnica?

Qu conoce usted de la ingeniera gentica?

Qu entiende por marcador molecular?

Qu son plantas transgnicas?

Qu entiende usted por bioseguridad en biotecnologa?

William M. Roca / Hernando Ramrez

Entender por qu los cultivos transgnicos son seguros.

William M. Roca / Hernando Ramrez

Est r u c tura general

Marc ado re s y Mapas

Ca ra cte riza cin de la biodive rs ida d

Clona cin y modifica cin

Ing e nie ra Ge n tic a

Marc ado re s y Mapas Mo le c ular

P la nta s Tra ns g nica s

Ens ayo s de Evaluac i n

William M. Roca / Hernando Ramrez

William M. Roca / Hernando Ramrez

Marcadores y Mapas Molecular

William M. Roca / Hernando Ramrez

William M. Roca / Hernando Ramrez

Presentar a los participantes

- Perspectivas futuras de la Biotecnologa vegetal

- Transformacin gentica de plantas

- Tecnologa del DNA recombinante

- Cultivos de tejidos vegetales

- Una introduccin a la biotecnologa

William M. Roca / Hernando Ramrez

William M. Roca / Hernando Ramrez

Seccin 1 . Una In t r odu c c i n a l a B i ot e c n ol og a

William M. Roca / Hernando Ramrez

Prc tic a e mpric a

William M. Roca / Hernando Ramrez

seleccin), bioqumica e ingeniera qumica. Esta

William M. Roca / Hernando Ramrez

Los eventos ms importantes del desarrollo de la

William M. Roca / Hernando Ramrez

> 1973 -1974

William M. Roca / Hernando Ramrez

Un aspecto importante de la nueva biotecnologa

capacidad para superar ciertos lmites naturales

Las aplicaciones a corto plazo de la nueva biotecnologa en la agricultura incluyen: el manejo y