Apndice 3

Universidad de Puerto Rico

Recinto de Ro Piedras
Facultad de Ciencias Naturales
Departamento de Biologa
Laboratorio de Biologa General I (Biol. 3101)
Transformacin de bacterias
Objetivos:
Correlacionar la funcin del DNA y el fenotipo del organismo
Identificar y explicar las aplicaciones de la transformacin de bacterias en la medicina,
agricultura y otras industrias
Definir: vectores, plasmidios, enzimas de restriccin, sitios de restriccin, ligasa de DNA
y transformacin, biotecnologa
Practicar la tcnica asptica, de estriado, manejo de microorganismos, y utilizacin de
micropipetas
Realizar la transformacin de bacterias utilizando un plasmidio
Determinar la eficiencia de la transformacin
Introduccin:
En 1928, experimentos realizados por Frederick Griffith proveyeron una de las primeras
evidencias de que el DNA es el material gentico. Esta evidencia est basada en el proceso de
transformacin, que envuelve la capacidad de las bacterias de adquirir segmentos de material
gentico del ambiente y expresarlos. En el presente, la habilidad de las bacterias de ser
transformadas es utilizada para manipular y expresar genes de distintos organismos con la
finalidad de proveer beneficios en la medicina, la agricultura y el ambiente, entre otros. En esto
consiste la biotecnologa, en la aplicacin de principios, organismos y productos biolgicos para
fines prcticos.
Los plasmidios son pedazos pequeos de DNA circular que existen en el citoplasma de
las bacterias. Este material gentico extracromosomal tiene la capacidad de entrar, replicarse y
expresarse en las bacterias. Los cientficos de mltiples disciplinas utilizan estos plasmidios
como vectores (cargadores) que contienen un gen de inters para as facilitar la transmisin y
expresin de ese gen particular en bacterias. El proceso por el cual estos vectores son
introducidos a las bacterias es el proceso de transformacin. En el laboratorio, la
transformacin es inducida mediante un cambio dramtico en temperatura (heat-shock) que
permeabiliza la pared celular de las bacterias. Una vez la transformacin ha ocurrido, se puede
obtener tanto el DNA del plasmidio como los productos de la expresin de los genes en el
plasmidio.
La construccin de molculas de DNA recombinante (i.e., plasmidio + gen de inters) es
posible usando dos tipos de enzimas que ocurren naturalmente, las enzimas de restriccin y la
ligasa de DNA. Las enzimas de restriccin son enzimas que catalizan la hidrlisis de los enlaces
fosfodister entre los nucletidos del DNA en unas secuencias o regiones especficas (sitios de

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restriccin). Los plasmidios que se utilizan como vectores tienen una regin que contiene
mltiples sitios de restriccin (polylinker) para facilitar la insercin del gen de inters (ver
figura 1). La ligasa de DNA, es la misma que forma parte de la maquinaria de replicacin
catalizando la formacin de los enlaces fosfodister entre los nucletidos (ver figura 2). La
identificacin de bacterias transformadas con plasmidios se facilita por la presencia de genes que
confieren resistencia a antibiticos (ej. Ampicilina) y por otras enzimas que estn involucradas
en el metabolismo de ciertas molculas. El plasmidio que utilizaremos en este ejercicio es, pUC
19 (figura 1), y contiene el gen lacZ, el cual codifica para la enzima -galactosidasa. Esta
enzima cataliza la degradacin de lactosa y sus anlogos (ej. X-gal) en presencia de un inductor
(i.e., IPTG). Las bacterias transformados con el plasmidio se pueden identificar por la formacin
de colonias color azul que se produce por la degradacin de X-gal.

Scientific American Books

Figura 1. Mapa del plasmidio pUC19.

Figura 2. Creacin de una molcula de DNA recombinante y sus aplicaciones

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UNIVERSIDAD DE PUERTO RICO
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
BIOLOGIA 3101
Transformacin de Bactrias
Procedimiento
1. Aada 1.5 ml de cultivo de bacterias a los tubos BC y C1
2. centrifugue por 15 segundos
3. Descarte el sobrenadante
4. Ponga los tubos con el pellet en hielo
5. Aada 200 ul de TS a cada tubo
6. Mezcle con la punta de la pipeta
7. Incube por 20 minutos en hielo para hacer las bacterias competentes.
8. Transfiera el contenido del tubo BC al tubo BP.
9. Mantenga el tubo BP y C1 en hielo incubando por 30 minutos.
10. Haga un Heat shock poniendo los tubos en incubacin en un bao
termal por 30 segundos a 42 grados centgrados.
11. Ponga los tubos en hielo por 5 minutos
12. Aada 200ul de LB a cada tubo.
13. Incube los tubos BC o BP y C1 por 1 hora a 37 grados centgrados en
bao con movimiento.
14. Transfiera 10ul de cada tubo a las placas rotuladas BC y C1.
15. Utilice un Loop de inocular para estriar cada placa.
16. Ponga las placas invertidas en la incubadora por 15 horas a 37 grados
centgrados.
17. Vea el crecimiento al prximo da.

Preguntas de discusin:
1. Cul es tu hiptesis en este experimento?

2. Qu dos caractersticas van a poseer las bacterias que sean transformadas?

3. Cul es el propsito del cultivo C? Cmo comparan los resultados tericamente

esperados con tus resultados? Explique.
4. Calcula la eficiencia de la transformacin realizada.

a. Cmo comparan tus resultados al valor esperado de 1 X 109 clulas

transformadas/ g de DNA de plasmidio?

b. Qu factores pueden haber influenciado la eficiencia de la transformacin?

5. RETO: Podras pensar alguna forma en que puedes utilizar el gen de lacZ para
identificar bacterias con plasmidios recombinantes? Ayuda: Ver mapa del plasmidio y
referencias.

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Referencias:
Campbell, N.A., Reece, J.B., Mitchell, L.G. 1999. Biology. Quinta edicin. The Benjamin/
Cummings Publishing Company, Inc., Redwood City, CA.
Perry, J.W., Morton, D., Perry, J.B. 2002. Laboratory manual for Starrs Biology: The Unity
and Diversity of Life and Starrs Biology: Concepts and Applications. Brooks/Cole, Canada.
Invitrogen life technologies. One Shot TOP10F Competent Cells. Versin H 061202 280124.
Watson, J.D., Gilman, M., Witkowski, J., Zoller, M. 1992. Recombinant DNA. Segunda
edicin. Scientific American Books, New York, NY.

ltima revisin: MBS & CNC 7/31/ 2002