UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

TALLER
MULTIDISCIPLINARIO
DE PROCESOS
TECNOLGICOS DE
FRUTOS Y
HORTALIZAS

PRACTICA 2. ESTERILIZACIN
DE MATERIAL Y PREPARACIN
DE MEDIOS DE CULTIVO PARA
ANLISIS MICROBIOLGICO

Dra. Ma. Andrea Trejo Mrquez

I.A. Ma. Guadalupe Prez Loredo
I.A. Selene Pascual Bustamante
En esta prctica se describe el proceso para
la esterilizacin y preparacin de medios
sintticos para el cultivo de mesfilos,
coliformes, hongos y levaduras.
Con esto el alumno conoce y comprende los
mtodos de siembra as como el conteo de
microorganismos, que es importante en el
desarrollo de cualquier producto.

Procesos Tecnolgicos de Frutos y Vegetales

OBJETIVO
Adquirir las habilidades y conocimientos prcticos necesarios para la preparacin del
material, equipo y reactivos necesarios para la realizacin de los anlisis microbiolgicos
bsicos en alimentos que permiten determinar la cantidad de microorganismos presentes
utilizando medios de cultivo especficos para cada tipo (mesfilos totales, hongos y
levaduras y coliformes totales).
GENERALIDADES
Coliformes
La definicin generalmente aceptada para el trmino coliformes describe a estos
microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios
facultativos que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas, aunque algunos
pueden ser fermentadores tardos o no fermentadores, como Citrobacter y Serratia,
respectivamente.
La mayora de los coliformes pueden encontrarse en la flora normal del tracto digestivo
del hombre o animales, por lo cual son expulsados especialmente en las heces, por
ejemplo Escherichia coli. Por esta razn, su presencia constante en la materia fecal, los
coliformes son el grupo ms ampliamente utilizado en la microbiologa de alimentos como
indicador de prcticas higinicas inadecuadas. Como los coliformes tambin pueden vivir
en otros ambientes, se distingue entre coliformes totales y coliformes fecales. Esta
prctica se refiere a coliformes totales.
El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:
La deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricacin de los
alimentos.
La evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto, aunque su presencia no
necesariamente implica un riesgo sanitario, cuando los coliformes son de origen no-fecal.
Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e higinicas en el equipo.
La calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de agua utilizados en las diferentes
reas del procesamiento de alimentos.
La demostracin y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse mediante el
empleo de medios de cultivos lquidos o slidos con caractersticas selectivas o
diferenciales.
Mesfilos aerobios
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la tcnica

comnmente utilizada es la cuenta en placa.

En realidad esta tcnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos
presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades
nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxgeno disponible, etc., hacen

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que el nmero de colonias contadas constituyan una estimacin de la cifra realmente

presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado.
Por otra parte el recuento de termoflicos, psicrflicos y psicotrficos es importante para
predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento.
Para obtener resultados reproducibles y por lo tanto significativos, es de suma
importancia seguir fielmente y controlar cuidadosamente las condiciones.
Esta tcnica puede aplicarse para la estimacin de microorganismos viables en una amplia
variedad de alimentos.
El fundamento de la tcnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio
de eleccin despus de un cierto tiempo y temperatura de incubacin, presuponiendo que
cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio. El mtodo
admite numerosas fuentes de variacin, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la
influencia de varios factores.
Mohos y levaduras.
La contaminacin fngica de un alimento tiene mucha importancia, no tan slo por su
accin deteriorante, que pudre y malogra materias primas y productos manufacturados,
sino tambin por la capacidad de algunos hongos para sintetizar gran variedad de
micotoxinas, para provocar infecciones y, incluso, para provocar reacciones alrgicas en
personas hipersensibles a los antgenos fngicos. Por estos motivos, para conocer la
calidad microbiolgica de un producto, es pertinente realizar un recuento de hongos y
levaduras.
En general, los hongos son microorganismos eucariotas1 pluricelulares filamentosos, no
presentan pigmentos fotosintticos y son quimiohetertrofos aerobios estrictos. A
diferencia de las plantas, presentan un bajo grado de diferenciacin en los tejidos. Poseen
pared celular contiene quitina2 un polisacrido que le da rigidez y es responsable de su
morfologa y en ocasiones celulosa. Algunos hongos presentan cpsula, formada por
polisacridos, con propiedades inmungenas y antifagocitarias. La estructura o cuerpo
vegetativo de un hongo se denomina talo3. El talo est formado por filamentos, o hifas,
de unas 5 de dimetro, que generalmente estn ramificadas.
Las hifas son tubos largos que estn formadas por la pared celular de quitina
(componente mayoritario) y el citoplasma con sus inclusiones y ncleos con la informacin
gentica. En el citoplasma se realiza la actividad bioqumica del hongo.
Las hifas pueden estar separadas en clulas por paredes transversales (septos) en los
hongos superiores (Eumicetos), o carecer de paredes en los hongos inferiores
(Ficomicetos4). El conjunto de hifas se llama micelio. En el micelio se distinguen dos
partes: una que penetra en el medio de cultivo y se extiende por su superficie (micelio

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vegetativo), y otra que se proyecta y contiene las esporas (micelio reproductor o areo).
Los hongos crecen por el extremo de las hifas (crecimiento apical). Una pequea cantidad
de micelio es suficiente para la formacin de un nuevo talo.
Levaduras.
Las levaduras son hongos que crecen generalmente por gemacin, en forma de agregados
sueltos de clulas independientes, que pueden ser globosas, ovoides, cilndricas o
alargadas.
En algunos casos, forman cadenas de clulas alargadas (pseudohifas8), adheridas de
modo suelto (blastospora), semejantes a un micelio, por lo que se les denomina
pseudomicelio.
Algunas especies forman breves extensiones de verdadero micelio, con frecuencia
septado (tabicado). Hay especies de levaduras esporgenas. No existe, por tanto, un lmite
de separacin definido entre levaduras y otros hongos que forman un micelio tpico.
Algunos hongos patgenos para el hombre presentan dimorfismo, pueden existir en la
naturaleza en forma de levadura (forma parasitaria) o en forma filamentosa (forma
saprfita).
Las levaduras, cuando crecen sobre medios slidos, forman colonias de aspecto
caracterstico que recuerdan a las colonias bacterianas. En casi todas las especies de
inters industrial, el modo habitual de reproduccin vegetativa es por gemacin. A
diferencia de los mohos, las levaduras no pueden identificarse solamente por sus
caracteres morfolgicos; se precisa la ayuda de pruebas bioqumicas para la identificacin
especfica.
EQUIPO:
Autoclave.
Parrilla de calentamiento con agitacin.
Mecheros.
Lmparas de alcohol.
Campana de flujo laminar (zona estril)
Incubadora.
Termmetro.
MATERIAL:
1 Embudo
10 Cajas petri estriles
3 Frascos para preparacin de diluciones.

1 Matraz Erlenmeyer de 500 ml

1 Matraz Erlenmeyer de 125 ml
3 Pipetas de 1 ml
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3 Pipeta de 10 ml
1 Vaso de licuadora
1 Probeta graduada 100 ml
1 Esptula.
1 Piseta
1 Cronmetro.
Toallas de papel.
Marcador indeleble.
Algodn

Papel estraza
Papel aluminio
Cinta
para
enmascarar
(masking
tape)
Esptula
Cerillos
Asas microbiolgicas o L de vidrio
Cuchillo
Moscas magnticas para agitacin

MUESTRAS Y REACTIVOS:
Un alimento para determinar la carga microbiolgica
Agar PDA
Agar Nutritivo
Agar Mc Conkey
Acido Tartrico
Agua destilada
Alcohol 96
PROCEDIMIENTO:
PREPARACIN DEL MATERIAL (NOM-109-SSA1-1994)
Todo el material debe estar limpio, estril y libre de sustancias que pudieran
afectar la viabilidad de los resultados.
Para esterilizar el material este se envolver en forma individual con papel de
estraza y se esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 min. o en horno a 170 C
por dos horas.
En caso de emergencia el material se puede esterilizar empapndolo con etanol o
isopropanol al 70% y flamendolos, para ser utilizado inmediatamente.
MTODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA (NOM-092-SSA1-1994)
Fundamento: Consiste en contar las colonias que se desarrollan en el medio de eleccin
despus de un cierto tiempo y temperatura de incubacin. Mesfilos aerobios 35 2 C;
48 2 horas.
AGAR NUTRITIVO (Mesfilos aerobios)
23 g

1 litro de agar

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Preparacin de medio de cultivo

Diluir en un litro de agua y hervir hasta su disolucin.
Esterilizar el medio de cultivo en autoclave a 120 C por 20 minutos
llenar aproximadamente hasta el 50% las cajas con el medio de cultivo lquido
estril.
Dejar solidificar el medio y someterlo a incubacin por 24 horas segn las
condiciones establecidas para la prueba de esterilidad.
MTODO PARA LA CUENTA DE MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES EN PLACA
(NOM-113-SSA1-1994)
Fundamento: El mtodo permite determinar el nmero de microorganismos coliformes
presentes en una muestra, utilizando un medio selectivo en el que se desarrollan bacterias
a 35 2 C; en aproximadamente 24 Horas.
AGAR Mc CONKEY
50 g

1 litro de agar

Preparacin de medio de cultivo.

Diluir en un litro de agua y hervir hasta su disolucin.
Esterilizar el medio de cultivo en autoclave a 120 C por 20 minutos
Llenar aproximadamente hasta el 50% las cajas con el medio de cultivo lquido y
estril.
Dejar solidificar el medio y someterlo a incubacin por 24 horas segn las
condiciones establecidas para la prueba de esterilidad.
MTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS (NOM-111-SSA1-1994)
Fundamento: El mtodo se basa en inocular una cantidad conocida de muestra de prueba
en un medio selectivo especfico, acidificado a un pH de 3.5 e incubado a una temperatura
de 25 1 C por un tiempo de 3 a 5 das dando como resultado el crecimiento de colonias
caractersticas para este tipo de microorganismos.
AGAR PAPA DEXTROSA (PDA)
39 g

1 litro de agar

.
Preparacin de medio de cultivo
Diluir en un litro de agua y hervir hasta su disolucin.
Esterilizar el medio de cultivo en autoclave a 120 C por 20 minutos
Llenar aproximadamente hasta el 50% las cajas con el medio de cultivo lquido y
estril.
Dejar solidificar el medio y someterlo a incubacin por 24 horas segn las
condiciones establecidas para la prueba de esterilidad.

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Para acidificar el medio de cultivo se adiciona acido tartrico al 10 % al agar la relacin es:
14 ml de cido tartrico

1 litros de Agar Papa Dextrosa

cido tartrico al 10% (para prepararlo)

10 g

100 ml de agua

Nota: para preparar el Agar Papa Dextrosa se tienen que pesar 39g de Agar Papa Dextrosa y diluir en 986 ml
o
de agua purificada, calentar hasta la ebullicin y esterilizar a 121 1 C por 15 min.

En el momento en que se vaya a vaciar a las cajas petri se tienen que adicionar primero 14
ml de cido tartrico al 10% al agar papa dextrosa y mezclar ligeramente para poder vaciar
a las cajas petri.
PREPARACIN DE DILUCIONES (NOM-110-SSA1-1994)
La disolucin tiene por objeto obtener una distribucin los ms uniformemente
posible de los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el anlisis.
Existen dos tipos de diluciones utilizadas para el anlisis microbiolgico.
Disoluciones primarias
Disoluciones decimales adicionales
Diluciones decimales

1 ml

1 ml

1 ml

Dilucin
primaria

9 ml agua

10g muestra / 90
ml agua.

-1

10

10-2

10-3

10-3

SIEMBRA DE MUESTRAS
Despus de transcurrido el tiempo para la prueba de esterilidad se evalan las cajas para
comprobar que no exista contaminacin.
Al comprobar la esterilidad de las mismas se procede a la siembra, para lo cual se toman
200 l de muestra sobre el medio con la pipeta, se utiliza una pipeta estril por cada
dilucin y se debe sembrar por lo menos por duplicado cada una de ellas. Cuando no se
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Procesos Tecnolgicos de Frutos y Vegetales

cuenta con suficientes pipetas puede utilizarse la misma pero se inicia la siembra de la
dilucin ms baja a la ms alta.
Posteriormente se distribuye lo ms uniformemente posible utilizando un asa
microbiolgica o L de vidrio la cual debe ser flameada entre una muestra y otra.
Se permite que el medio absorba la muestra y se voltean las cajas, rotulan e ingresan a
incubacin.
Pasado el tiempo de incubacin apropiado a cada tipo de microorganismos se realiza el
conteo para establecer la cantidad de microorganismos presentes en la muestra.

10-2

10-3

10-4

10-1
10-1

10-2

10-3

10-4

Mc conkey

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Nutritivo

PDA

100 l

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CUESTIONARIO:
1) Define que es un medio de cultivo.
2) Qu caractersticas tienen que cumplir los medios de cultivo?
3) Cmo se clasifican los medios de cultivo?
4) Por qu se consideran selectivos algunos medios de cultivo?
5) Qu cantidad de colonias debemos encontrar en una caja para considerar que
los resultados son confiables?
6) Por qu los mtodos de conteo de colonias se consideran indirectos y en qu
hecho se apoya?
7) Cmo se calculan y reportan los resultados de un conteo microbiolgico?

REPORTE POR EQUIPO:

Antecedentes: Breve Informacin relativa al producto con el cual se trabajo, fundamentos
de las tcnicas utilizadas.
Resultados: Tablas que contengan los resultados obtenidos en cada determinacin,
anlisis de estos y discusin con respecto a lo que se encuentra reportado en la
bibliografa, adems con la concordancia sealada en las Normas que aplican para el
producto.
Cuestionario.
Bibliografa consultada.
NOTA: El reporte se entregar a los das de realizada la prctica.

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Procesos Tecnolgicos de Frutos y Vegetales

BIBLIOGRAFA
Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th Arlington,
VA: AOAC.
Kornacki J.L. y Johnson J.L. (2001) Enterobacteriaceae, Coliforms, and Escherichia coli as
Quality and Safety Indicators. In: Compendium of Methods for the Microbiological
Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 69-82.
International

Commission

Microorganisms

in

on

Foods

Microbiological.
6

Chapman

&

Specifications
Hall.

2nd

of
ed.

Foods

(2005)

Disponible

en:

http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
Secretara de Salud (1994). NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparacin y
Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Norma Oficial
Mexicana. Mxico.
Secretara de Salud (1994). NOM-113-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodos para la
cuenta de microorganismos coliformes totales en placa. Norma Oficial Mexicana. Mxico.
Secretara de Salud. (1994). NOM-092-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para la
Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. Norma Oficial Mexicana. Mxico.

Material elaborado como parte del proyecto PAPIME: Elaboracin de materiales educativos para
fortalecer la enseanza en el taller multidisciplinario de ingeniera en alimentos-procesos
tecnolgicos de frutas y hortaliza de la carrera de ingeniera en alimentos (PE 202610).

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