31482880

ESTUDIO DE PROCESOS PARA LA SOLUBILIZACIN Y
PRECIPITACIN DE IONES METLICOS CONTAMINANTES

MEDIANTE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES Y SULFATOREDUCTORAS
UNIVERSIDAD DE CDIZ
FACULTAD DE CIENCIAS
Departamento de Ingeniera Qumica, Tecnologa de Alimentos y
Tecnologas del Medio Ambiente
Gema Cabrera Revuelta

Mayo, 2005
ESTUDIO DE PROCESOS PARA LA SOLUBILIZACIN Y

PRECIPITACIN DE IONES METLICOS CONTAMINANTES
MEDIANTE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES Y SULFATOREDUCTORAS
Memoria presentada por la Licenciada Gema Cabrera Revuelta para optar al grado
de Doctor por la Universidad de Cdiz
Fdo: Gema Cabrera Revuelta

Puerto Real, Mayo de 2005
La presente Tesis Doctoral ha sido co-dirigida por los Doctores D. Domingo Cantero
Moreno, Catedrtico de Ingeniera Qumica y D. Jose Manuel Gmez Montes de Oca,
Profesor Titular de Ingeniera Qumica de la Universidad de Cdiz, y cumple los
requisitos exigidos por la legislacin vigente.
Fdo: Dr. D. Domingo Cantero

Moreno
Fdo: Dr. D. Jos Manuel Gmez Montes

de Oca
Fdo.: Dr. D. Jos Mara Quiroga Alonso

Director del Dpto. de Ingeniera Qumica, Tecnologa de Alimentos y Tecnologas del
Medio Ambiente
Universidad de Cdiz
Despus de este largo camino siento la necesidad de dar las gracias a

todas las personas que de alguna manera han contribuido para que esto
sea posible:
-
Al Prof. Domingo Cantero Moreno, por brindarme la oportunidad de

pertenecer a su grupo de investigacin y permitirme estrenar la lnea
de Biorremediacin. Su experiencia y su capacidad de crtica me
han ayudado a creer en mi trabajo.
Al Prof. Jos Manuel Gmez Montes de Oca, por su entrega, su

confianza, su disponibilidad y su eficacia, en realidad es difcil
destacar slo algunas de sus cualidades. Gracias Tete, por tu calidad
humana y por saberme hacer poner los pies en la tierra. Tengo suerte
de trabajar contigo.
Al Prof. Edgardo Donati, le agradezco su acogida, su disponibilidad y

todo lo que he aprendido durante las estancias que realic en su
pas, vos sabs que es mucho. Gracias por haberme dado la
oportunidad de conocer y trabajar con tus chicas, a ellas gracias
tambin.
A mis compaeros del departamento, cada acontecimiento que

ocurre es, sin duda, fruto del trabajo de todos. Gracias por lo que me
aportis da a da.
A mis padres,
a mis hermanos
y a Elsa
A Jose,
por todo lo que me quieres,
por todo lo que te quiero.
Querer es poder
INDICE
A.-INTRODUCCIN....
B.-ANTECEDENTES.......
CONTAMINACIN POR METALES PESADOS.....

1.1 METALES PESADOS: TOXICIDAD Y TCNICAS DE
REMEDIACIN
1.1.1 TCNICAS DE REMEDIACIN...
12
1.1.1.1
Tcnicas de contencin....
13
1.1.1.2
Tcnicas ex-situ..
14
1.1.1.3
Tcnicas in-situ...
15
1.2 MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS
16
1.2.1 TCNICAS DE BIORREMEDIACIN..
18
1.2.1.1
Tcnicas de movilizacin...
18
1.2.1.2
Tcnicas de inmovilizacin....
20
1.3 RESIDUOS DE LA INDUSTRIA DE GALVANIZADO.
21
1.4 CARACTERSTICAS Y TOXICIDAD DE LOS METALES
ESTUDIADOS
26
1.4.1 CROMO.
27
1.4.1.1
Caractersticas..
27
1.4.1.2
Toxicidad.
29
1.1.2. NQUEL..
30
1.1.2.1.
Caractersticas...
30
1.1.2.2.
Toxicidad.
32
1.4.2 ZINC
34
1.1.3.1.
Caractersticas..
34
1.4.2.1
Toxicidad.
35
1.5 LEGISLACIN SOBRE METALES PESADOS.
36
BIOLIXIVIACIN CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES..
43
2.1. BIOLIXIVIACIN DE MINERALES.
44
INDICE
2.2. BACTERIAS AZUFRE OXIDANTES..
45
2.1.1 CARACTERSTICAS DE Acidithiobacillus ferrooxidans Y

Acidithiobacillus thiooxidans...
46
2.2 MECANISMOS INVOLUCRADOS EN LA BIOLIXIVIACIN DE

MINERALES SULFURO...
49
2.2.1 MECANISMO DIRECTO...
49
2.2.2 MECANISMO INDIRECTO...
50
2.2.3 DISCUSIN DE LOS MECANISMOS..
52
2.3FUNCIN DE LAS BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN LA

LIXIVIACIN DE MINERALES SULFURO..
55
2.4 ADHESIN BACTERIA-MINERAL...
56
2.5FACTORES QUE INFLUYEN EN LA BIOLIXIVIACIN.
59
2.6TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS DE LAS BACTERIAS

AZUFRE-OXIDANTES...
61
2.7 APLICACIONES DE LA BIOLIXIVIACIN CON BACTERIAS

AZUFRE-OXIDANTES......
66
2.7.1 BIOLIXIVIACIN DE MINERALES...
66
2.7.2 BIOLIXIVIACIN DE LODOS......
70
2.7.3 BIOLIXIVIACIN DE SUELOS..
75
2.7.4 BIOLIXIVIACIN DE OTROS RESIDUOS...
77
2.7.5 APLICACIONES INDUSTRIALES..
78
2.8 REDUCCIN DEL Cr(VI) POR LA ACCIN DE LAS BACTERIAS

3
AZUFRE-OXIDANTES...
81
BIOPRECIPITACIN CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS..
84
3.1 PRECIPITACION DE METALES DISUELTOS...
84
3.2 BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS...
85
3.2.1 CARACTERSTICAS...
88
3.2.2 GNERO Desulfovibrio...
89
3.2.3 METABOLISMO DE LAS BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS.
90
INDICE
3.2.4 METABOLISMO DEL GNERO Desulfovibrio..
91
3.3 FUNCION DE LAS BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN LA

BIOPRECIPITACIN DE METALES...
93
3.3.1 ADHESIN BACTERIA-MINERAL....
94
3.4 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA REDUCCION DE SULFATO.
94
3.5 TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS....
98
3.6 APLICACIN DE LA BIOPRECIPITACIN DE METALES POR

BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS.
102
3.7 INTEGRACIN DE PROCESOS DE BACTERIAS AZUFREOXIDANTES Y BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS..
106
INMOVILIZACIN DE CELULAS..
109
4.1 EMPLEO DE LA INMOVILIZACIN...
109
4.2 MTODOS DE INMOVILIZACIN.....
109
4.2.1 ADHESIN.....
110
4.2.2 ATRAPAMIENTO...
111
4.3 INMOVILIZACION DE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES..
112
4.4 INMOVILIZACION SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO...
113
C.-MATERIAL Y MTODOS....
117
MATERIAL Y MTODOS.
119
1.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS...
119
1.1.1 BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES....
119
1.1.1.1
Caractersticas..
119
1.1.1.2
Mantenimiento de las cepas
119
1.1.2 BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS
122
1.1.2.1
Caractersticas..
122
1.1.2.2
Mantenimiento de las cepas
123
1.2 MTODOS DE ANLISIS.
127
1.2.1 pH Y POTENCIAL REDOX...
127
INDICE
1.2.2 CONCENTRACIN CELULAR...
127
1.2.2.1
Bacterias en suspensin.
127
1.2.2.2
Bacterias inmovilizadas..
128
1.2.3 CONCENTRACIN DE PROTONES.
129
1.2.4 CONCENTRACION DE SULFATO.
129
1.2.5 CONCENTRACION DE IONES METLICOS
130
1.2.6 CONCENTRACION DE CROMO HEXAVALENTE..
131
1.2.7 PREPARACIN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPA
ELECTRNICA..
131
1.2.8 DIGESTIN DE COMPUESTOS INSOLUBLES DE METAL........
132
PROTOCOLOS EXPERIMENTALES..
133
2.1 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)

CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO
134
2.2 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)

CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO...
136
2.2.1 REACTOR DE At. thiooxidans...
137
2.2.2 SOLUBILIZACIN DE METALES PRESENTES EN ARENA
137
2.3 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIN DE Cr(VI) CON

BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO....
138
2.4 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIN DE Cr(VI) Y

SOLUBILIZACIN DEL Cr(III) CON BACTERIAS AZUFREOXIDANTES EN CONTINUO
139
2.4.1 REACTOR DE At. thiooxidans...
139
2.4.2 COLUMNA CON RESIDUO DE CROMO
140
2.5 PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II)

CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN DISCONTINUO
141
2.6PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)

CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN CONTINUO
142
2.6.1 REACTOR DE Desulfovibrio sp.
143
INDICE
2.6.2 REACTOR DE PRECIPITACIN..
144
2.7PROTOCOLO PARA LA INMOVILIZACIN DE At. ferrooxidans

Y At. thiooxidans SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO...
145
2.8 PROTOCOLO PARA LA INTEGRACIN DE LOS PROCESOS DE

SOLUBILIZACIN Y PRECIPITACIN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II) EN
CONTINUO..
147
D.-RESULTADOS..............
149
151
SOLUBILIZACIN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)..

1.1 SOLUBILIZACIN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS
AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO....
151
1.2 SOLUBILIZACIN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON At. thiooxidans

EN CONTINUO....
168
REDUCCION DEL Cr(VI).. 174

2.1 EXPERIENCIAS DE REDUCCIN DEL Cr(VI) EN DISCONTINUO....
174
2.2 REDUCCIN DE Cr(VI) Y SOLUBILIZACIN DE Cr(III) CON
BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO....
181
PRECIPITACIN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II)
187
3.1 ESTUDIO DE TOLERANCIA Y PRECIPITACIN DE Cr(III), Ni(II) y

Zn(II) CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN
DISCONTINUO.
187
3.1.1 ESTUDIO CON Cr(III)...
187
3.1.2 ESTUDIO CON Cr(VI)..
191
3.1.3 ESTUDIO CON Cr(III) y Cr(VI)...
193
3.1.4 ESTUDIO CON Ni(II).
195
3.1.5 ESTUDIO CON Zn (II)...
199
3.1.6 ESTUDIO CON Cr(III), Ni(II) y Zn(II)...
203
3.2 PRECIPITACIN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS

SULFATO-REDUCTORAS EN CONTINUO
210
INDICE
4
INTEGRACIN DE LOS PROCESOS..
214
4.1 INMOVILIZACIN DE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES SOBRE

ESPUMA DE POLIURETANO..
214
4.2 INTEGRACIN DE LOS PROCESOS DE SOLUBILIZACIN Y

PRECIPITACIN EN CONTINUO.
219
4.3 COMPARACIN CON OTRO PROCESO..
226
E.-CONCLUSIONES.....
231
F.-BIBLIOGRAFA.....
235
A.-INTRODUCCIN
INTRODUCCION
En el ltimo siglo, se ha generado un aumento considerable del
contenido de metales pesados en el medio ambiente provocado,
principalmente, por el gran nmero de procesos industriales que emplean
como materias primas los metales, as como por las explotaciones mineras y
sus industrias derivadas. Por este motivo, el estudio de tcnicas que traten
de reducir la contaminacin causada por stos constituye un tema de gran
actualidad. Normalmente estos metales se encuentran presentes en aguas
y suelos y, en ocasiones, en forma de pequeas partculas dispersas en el
aire. Hoy en da, el tratamiento de medios contaminados con iones
metlicos, como efluentes industriales, lodos, sedimentos y suelos, puede
llevarse a cabo mediante distintas tcnicas tales como precipitacin,
intercambio inico, filtracin por membrana o mtodos electroqumicos. Sin
embargo, estos tratamientos estn restringidos por problemas tcnicos y
econmicos; provocando la aparicin de otras tcnicas alternativas que
involucran bioprocesos.
En ocasiones, los iones metlicos se encuentran en los medios
contaminados
en
formas
insolubles.
La
accin
de
determinados
microorganismos permite la transformacin de compuestos insolubles a otros

solubles, de modo que los iones pasan a solucin acuosa. A esta operacin
de solubilizacin de iones mediante microorganismos se le conoce con el
nombre de biolixiviacin. Las bacterias azufre-oxidantes del gnero
Acidithiobacillus
(en
concreto
Acidithiobacillus
ferrooxidans
Acidithiobacillus thiooxidans) son conocidas por su capacidad para

solubilizar iones metlicos a partir de sulfuros y xidos complejos dando lugar
a otras formas solubles como los sulfatos.
Por otra parte, cuando los metales se presentan en formas solubles en
los medios contaminados de forma natural, o como consecuencia de
procesos qumicos o biolgicos, podra ocurrir que debido a su movilidad las
INTRODUCCION
especies metlicas pasen de capas superficiales a capas ms internas y, en
consecuencia a los posibles acuferos. Una de las vas para evitar la
movilizacin de los metales presentes en un medio es la bioprecipitacin de
dichos iones. Algunas especies microbianas tienen la capacidad de oxidar
o reducir ciertos iones, de manera que modifican la solubilidad de las
especies metlicas provocando su precipitacin y, por tanto, su separacin
y posterior eliminacin del medio. Las bacterias sulfato-reductoras, entre las
que se encuentra el gnero Desulfovibrio, tienen la habilidad de precipitar
iones metlicos a partir de formas metlicas solubles.
Habitualmente el contacto directo entre la biomasa y la solucin que
contiene los iones metlicos no es sencillo y presenta algunos problemas
tcnicos. La inmovilizacin previa de la biomasa en estructuras slidas
proporciona el tamao, la rigidez y la porosidad necesarios para realizar
este tipo de procesos. Esta tcnica, adems, facilita la recuperacin de los
iones metlicos y la reactivacin de la biomasa para su reutilizacin.
El presente trabajo se realiz con el objeto de estudiar los procesos
que permiten la solubilizacin y precipitacin de metales pesados presentes
en medios contaminados empleando la capacidad de las bacterias azufreoxidantes y sulfato-reductoras para tolerar la presencia de iones metlicos y
llevar a cabo estos procesos.
Para ello, en primer lugar, se seleccionaron los metales a estudiar:
cromo, nquel y zinc. Estos metales se encuentran presentes de forma
comn en los residuos de las plantas de tratamiento de superficies y en los
efluentes o lodos de industrias relacionadas con la minera. Debido a su
toxicidad y a su presencia en variedad de medios contaminados parece de
inters tomarlos como referencia en el estudio de bioprocesos que permitan
la disminucin o eliminacin de estas especies metlicas en dichos medios.
INTRODUCCION
El estudio de la solubilizacin de estos metales por la accin de las
bacterias azufre-oxidantes se realiz en discontinuo para determinar de esta
forma la viabilidad del proceso y la tolerancia de At. ferrooxidans y At.
thiooxidans a los distintos metales. El estudio se llev a cabo en distintas
condiciones y los resultados obtenidos permitieron desarrollar un proceso de
solubilizacin de dichos metales en forma continua, donde compuestos
insolubles de stos metales se encontraban soportados en arena.
Las bacterias azufre-oxidantes tienen adems la capacidad de
generar compuestos reductores a partir de la oxidacin de azufre
elemental, esta propiedad les permite reducir el cromo hexavalente a
cromo trivalente, menos txico. Por tanto, debido a la evidente presencia
del Cr(VI) en distintos tipos de residuos, se consider de inters el estudio de
la reduccin de ste ion por parte de las bacterias azufre-oxidantes en
rgimen discontinuo y continuo.
El estudio de la bioprecipitacin de metales en solucin con las
bacterias sulfato-reductoras (Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp.) se
realiz de forma discontinua empleando varias concentraciones de los
iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II). El estudio se realiz determinando la precipitacin
de cada metal individualmente y, posteriormente, se estudi dicho proceso
con una combinacin de todos los metales. El desarrollo del proceso de
precipitacin en continuo persigui una mayor disminucin de la movilidad
de cada uno de los metales en solucin en un medio acuoso.
Con el fin de integrar ambos procesos de una forma efectiva se
decidi inmovilizar previamente las bacterias azufre-oxidantes sobre espuma
de poliuretano. Para ello, se estudi previamente la dinmica de
inmovilizacin de cada una de las bacterias para determinar cual de ellas
podra resultar ms ventajosa.
INTRODUCCION
Finalmente la integracin de los procesos de solubilizacin y
precipitacin en continuo estudiados permiti evaluar la transformacin y la
disminucin del contenido metlico de un residuo contaminado con cromo,
nquel y zinc.
En definitiva, el objetivo general del presente trabajo fue el
estudio de los procesos de solubilizacin con bacterias azufreoxidantes y de precipitacin con bacterias sulfato-reductoras para el
tratamiento de residuos contaminados por metales pesados. Este
objetivo general se concret en los siguientes objetivos especficos
desarrollados en el trabajo realizado:
- Estudio de la solubilizacin de compuestos insolubles de cromo,
nquel y zinc mediante la accin de las bacterias azufre-oxidantes,
At. ferrooxidans y At. thiooxidans, en rgimen discontinuo y
continuo.
- Estudio de la reduccin de Cr(VI) a Cr(III) por parte de las bacterias
azufre-oxidantes en rgimen discontinuo y continuo.
- Estudio de la precipitacin de iones metlicos (Cr(III), Ni(II) y Zn(II))
mediante
el
empleo
de
las
bacterias
sulfato-reductoras,
Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp., en rgimen discontinuo y

continuo.
- Estudio de la integracin de los procesos de solubilizacin y
precipitacin de metales pesados en rgimen continuo.
B.-ANTECEDENTES
ANTECEDENTES
1 CONTAMINACIN POR METALES PESADOS

1.1 METALES PESADOS: TOXICIDAD Y TCNICAS DE
REMEDIACIN
Los metales se encuentran de forma habitual formando parte de
depsitos minerales los cuales son procesados fsica y qumicamente para la
obtencin de metales puros. Esta actividad ha sido desarrollada a lo largo
de los siglos debido al elevado inters que representan estos elementos o
sus compuestos por su extensa aplicacin en un gran nmero de industrias
(construccin, aeronutica, automovilstica). En la tabla 1 se recogen las
aplicaciones ms importantes de algunos de los metales ms comunes.
Metal
Aplicaciones ms comunes
Referencia
Ag
Fotografa, joyera
Gordon(2001)
Au
Joyera, electrnica, lminas
Gordon(2001)
Cd
Co
Cr
Cu
Ni
Galvanizado, bateras, pigmentos de plsticos y

pinturas
Imanes, superaleaciones
Acero inoxidable, materiales refractarios, curtido de
pieles
Sistemas elctricos, tuberas, equipos de calefaccin,
aleaciones
Aceros, aleaciones para monedas, utensilios de
cocina
Beveridge y Doyle(1989)
Gordon(2001)
Gordon(2001)
Pb
Bateras, cables, pigmentos y aleaciones.
Pt
Joyera, catalizadores, electrnica
Gordon(2001)
Zn
Aleaciones, galvanizado, gomas, papel, productos

cosmticos y farmacuticos, pinturas.
Mulligan y col.(2001)
Tabla 1: Principales aplicaciones de algunos metales pesados
Estos elementos han sido extrados y utilizados ampliamente por el

hombre desde la antigedad pero en las ltimas dcadas la rpida
ANTECEDENTES
expansin de la industria, el incremento de las actividades domsticas y el
carcter consumista de la sociedad actual han dado lugar a un aumento
desorbitado de la cantidad de metal emitida al medio ambiente. Los
metales se introducen en el medio ambiente como residuos procedentes de
la actividad minera o de otras fuentes como son la combustin del petrleo,
procesos industriales, restos de pesticidas y residuos domsticos, entre otros.
Los metales pesados se acumulan mayoritariamente en suelos y
sedimentos
cercanos
zonas
industriales
mineras.
Los
efluentes
procedentes de estas zonas son habitualmente sometidos a tratamientos de

depuracin de aguas pero una vez que vuelven al medio natural persisten
en l, no pueden ser biodegradados y pueden adems participar de un
gran nmero de reacciones que lo pueden hacer ms o menos txico. En
general, pueden quedar adsorbidos en el suelo, incorporarse a ros y lagos,
lixiviar hasta acceder a aguas subterrneas o expandirse en la atmsfera. La
movilidad de estos metales de un medio a otro ocurre mediante procesos
fsicos, qumicos o biolgicos (Figura 1). La exposicin a los metales pesados
a travs del agua y los alimentos da lugar a la acumulacin de stos en
microorganismos, plantas, animales y
seres humanos lo que puede
desembocar en la alteracin o extincin de estos seres vivos (Mulligan y col.,

2001).
10
ANTECEDENTES
n
ci
ala in
Inh sorc n
Ab esti
Ing
te
sin
De
co
nd
en
n
ci
gra
Pr
e
cip
ita
c i
n
Desintegracin
Reacciones
qumicas y
biolgicas
n
ci
olu
Reacciones
qumicas y
biolgicas
sedimento
suelo
Me
teo
riza
ci
n
rocas
Sedimentacin
Ev
ap
or
ac
in
sac
in
hidrosfera
biosfera
Desintegracin
ev
ap
ora
ci
n
atmsfera
e
im
ed
n
c i
nta
Figura 1: Procesos de movilizacin de los metales en el medio ambiente (Board, 1996).
Los metales pesados se pueden definir como aquellos metales con

una densidad por encima de 5 g/cm3, de forma que los elementos de
transicin desde el vanadio hasta el semi-metal arsnico, del circonio al
bismuto y del lantano al polonio se consideran metales pesados junto con el
grupo de los lantnidos y los actnidos (Nies, 1999) que no son considerados
como tales por otros autores (Beveridge y Doyle, 1989). De cualquier modo,
la definicin de metal pesado est asociada a aquellos metales que en
pequea concentracin resultan nocivos para los seres vivos.
De los 90 elementos que existen de forma natural en la Tierra, 21 son
no-metales, 16 son metales ligeros y los 53 restantes incluyendo el arsnico
son metales pesados. La mayora de los metales pesados son elementos de
transicin con orbitales d incompletos, que dan lugar a cationes con la
habilidad de formar compuestos complejos susceptibles de actuar en
reacciones redox y variar de este modo su movilidad en el medio en que se
11
ANTECEDENTES
encuentran o interaccionar con otros compuestos que se encuentren en l.
Habitualmente estos cationes juegan un importante papel como elementos
traza en complejas reacciones bioqumicas.
Sin embargo, a elevadas concentraciones los metales pesados
forman compuestos complejos no especficos en las clulas que pueden
producir efectos txicos. Algunos cationes de metales pesados como Hg(II),
Cd(II) y Ag(I) forman fuertes complejos que lo hacen demasiado txicos
para cualquier funcin fisiolgica. Incluso algunos elementos traza bsicos
en la alimentacin, como el zinc, el nquel o el cobre, se convierten en
txicos a mayores concentraciones.
Entre los mecanismos moleculares que determinan la toxicidad de los
metales pesados se encuentran (Caizares-Villanueva, 2000):
desplazamiento de iones metlicos esenciales de molculas y

bloqueo de sus grupos funcionales.
modificacin de la conformacin activa de biomolculas

(enzimas, polinucletidos).
ruptura de la integridad de biomolculas.
modificacin de otros agentes biolgicamente activos.
1.1.1 TCNICAS DE REMEDIACIN

En vista de la extensin de los metales pesados en el medio
ambiente, en los ltimos tiempos se han venido desarrollando una serie de
tcnicas que tratan de reducir su contenido o, mejor dicho, transformarlos
en formas ms estables que no accedan con tanta facilidad a ciclos
biolgicos.
Entre ellos se distinguen las tcnicas de contencin que tratan de
retener fsicamente los contaminantes de modo que queden depositados
12
ANTECEDENTES
de forma controlada; las tcnicas ex-situ que emplean transformaciones
fsicas, qumicas o biolgicas para modificar la toxicidad o disponibilidad de
los contaminantes, pero tratndolos fuera de su ubicacin original; y las
tcnicas in-situ que se basan en la transformacin de los contaminantes
presentes en el medio sin modificar su ubicacin, habitualmente se
aprovechan propiedades de los microorganismos o las plantas para tratar
de reducir la contaminacin propia del medio
1.1.1.1 Tcnicas de contencin

- Aislamiento y contencin: Los medios contaminados se aslan y se
confinan para prevenir posteriores movimientos, reducir la permeabilidad
del residuo e incrementar la capacidad de resistencia al residuo. Las
barreras fsicas se realizan de acero, cemento, bentonita o ladrillo en capas
horizontales y/o verticales dispuestas de forma que eviten las infiltraciones.
- Solidificacin/estabilizacin: Estas tcnicas no implican barreras
fsicas. La solidificacin consiste en la encapsulacin de los contaminantes
en una matriz slida y la estabilizacin incluye la adicin de un compuesto
(polmeros orgnicos y silicatos) que reacciona con el contaminante
reduciendo su movilidad. Estos tratamientos se hacen complejos in-situ
debido a la dificultad de mezcla de los componentes adicionados.
- Vitrificacin: Es un proceso de solidificacin/estabilizacin que
requiere el aporte de energa trmica. Esto implica la insercin de
electrodos en el medio contaminado transmitindose una corriente que
desplaza los iones metlicos y la posterior solidificacin cuando el medio se
enfra.
1.1.1.2 Tcnicas ex-situ

- Separacin mecnica: El objetivo de estos procesos de seleccin
del tamao de partcula es eliminar contaminantes que por su tamao se
13
ANTECEDENTES
puedan distinguir de otras menos contaminantes. Para determinar si estos
procesos son adecuados resulta esencial caracterizar los tamaos de
partcula y el nivel de contaminacin de cada fraccin. Para la separacin
fsica se emplean hidrociclones, tanques de sedimentacin, columnas de
lecho fluidizado, flotacin o separacin magntica.
- Separacin pirometalrgica: Este tipo de procesos emplea hornos a
alta temperatura (200-700C) para volatilizar los metales presentes en suelos
contaminados y, posteriormente, los metales se recuperan o inmovilizan. Se
aplica actualmente al mercurio ya que ste es fcil de convertir a su forma
metlica a altas temperaturas. Otros metales como el arsnico, cromo,
cadmio y plomo requieren de un pretratamiento.
- Tratamientos qumicos: Los tratamientos qumicos por mecanismos
reductores u oxidantes se emplean para reducir la toxicidad o la movilidad
de los metales contaminantes. Se emplean habitualmente en el tratamiento
de aguas residuales. Las reacciones de oxidacin, que pueden disminuir la
toxicidad, precipitando o solubilizando metales, implican la adicin de
permanganato potsico, perxido de hidrgeno, hipoclorito o cloro
gaseoso. Las reacciones de neutralizacin se emplean para ajustar el pH de
suelos cidos o bsicos. Las reacciones de reduccin se inducen por la
adicin de compuestos alcalinos como sodio, dixido de azufre, sales de
sulfito
sulfato
ferroso.
Esta
tcnica
se
emplea
veces
como
pretratamiento de otras como la solidificacin/estabilizacin. Por otra parte,

al tratarse de reacciones no especficas se corre el riesgo de que otros
metales se transformen en formas ms txicas o ms mviles.
1.1.1.3 Tcnicas in-situ

- Barreras permeables: Son barreras que contienen una sustancia
reactiva (fsica, qumica o biolgica o una combinacin de ellas) que est
dispuesta para reducir la movilidad de metales presentes en aguas
14
ANTECEDENTES
subterrneas cercanas a lugares contaminados. Hasta el momento se han
empleado como material zeolita, hidroxiapatita, hierro elemental y piedra
caliza
- Tcnicas de electrocintica: Estos procesos implican el paso de una
corriente elctrica de baja intensidad entre un ctodo y un nodo
introducidos en el medio contaminado, los iones y pequeas partculas
cargadas se transportan entre los electrodos. Un gradiente elctrico inicia el
movimiento por electromigracin (movimiento de las especies qumicas
cargados),
electrosmosis
(movimiento
del
fluido),
electroforsis
(movimiento de partculas cargadas) o electrolisis (reaccin qumica

producida por un campo elctrico).
-
Tcnicas
de
biorremediacin:
Estos
procesos
bioqumicos
aprovechan la capacidad de los microorganismos de tolerar elevadas

concentraciones de metales pesados y de transformar las especies
metlicas en funcin del estado de oxidacin en que se encuentran y de
las condiciones que existan en el medio. Los procesos ms conocidos son la
biolixiviacin, solubilizacin de un metal en estado insoluble en forma de
xidos
sulfuros,
permitiendo
su
extraccin;
la
bioprecipitacin,
precipitacin de un metal que se encuentra soluble y mvil en el medio

favoreciendo su deposicin y separacin, y la biosorcin, retencin de
metales por interaccin fisicoqumica del metal con componentes de la
superficie celular.
- Fitoremediacin: Estos procesos aprovechan la habilidad de
algunas plantas de acumular metales pesados en sus races, ramas y hojas
mediante mecanismos de adsorcin o por la excrecin de componentes
que pueden variar las condiciones del suelo dando lugar a la formacin de
complejos metlicos. La eleccin del mtodo ms adecuado depende de
las condiciones climticas y de la biodisponilidad del metal en el suelo. Estas
15
ANTECEDENTES
tcnicas tienen el inconveniente de requerir un tiempo elevado para la
obtencin de resultados, habitualmente se emplean plantas que se
caracterizan por un rpido crecimiento. (Mulligan y col., 2001)
1.2 MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS

Algunos metales son esenciales para los microorganismos mientras
que otros son txicos incluso en pequea cantidad. La habilidad para
crecer a altas concentraciones de metal se ha encontrado en muchos
microorganismos (Nies, 1999) y puede ser el resultado de mecanismos
intrnsecos o inducidos (Ledin, 2000). Gadd (1992) defini tolerancia como la
habilidad para soportar la presencia de metales txicos por medio de
propiedades intrnsecas y resistencia como la habilidad para sobrevivir en
presencia de metales txicos por medio de mecanismos de disminucin de
toxicidad producidos como respuesta directa a la presencia de metal. As,
muchos microorganismos se han adaptado adecuadamente a la presencia
de metales mediante sistemas de resistencia cromosmicos. Las mejoras en
las tcnicas de manipulacin gentica pueden aumentar la resistencia a los
metales de gran nmero de microorganismos hacindolos susceptibles de
ser
aplicados
para
la
remediacin
mayor
escala
de
medios
contaminados (Bruins y col., 2000).

Existe una gran diversidad de formas por las que los microorganismos
pueden interaccionar con los metales y variar su toxicidad (figura 2),
principalmente:
16
ANTECEDENTES
Membrana celular/espacio periplasmtico
Adsorcin/Intercambio inico
Reacciones redox/Transformaciones
Precipitacin
Difusin y transporte
Pared celular
Adsorcin/Intercambio inico
Unin covalente
Atrapamiento de partculas
Reacciones redox
Precipitacin
Intracelular
Metalotioninas
Pptidos de metal gamma-glutamilcistena
Enlazamiento no especfico/Quelacin
Compartimentalizacin en organelos
Reacciones redox/Transformaciones
Materiales asociados a clulas

(Polisacridos, cpsulas)
Intercambio inico
Atrapamiento de particulas
Enlazamientono especfico
Precipitacin
Reacciones extracelulares
Precipitacin por productos excretados
Formacin de complejos y quelacin
Siderforos
Figura 2: Procesos que contribuyen a la captacin microbiana y disminucin de la toxicidad

de metales. (Gadd y White, 1993).
Transformacin mediante procesos redox, alquilacin, etc.

modificando la movilidad y toxicidad de los metales.
Acumulacin de metales, que puede ser por un metabolismo

independiente
(acumulacin
pasiva), sorcin
por un
metabolismo dependiente que implica transporte intracelular

(acumulacin
activa),
consumo.
Pueden
ocurrir
ambos
mecanismos en el mismo organismo.
Produccin o eliminacin de sustancias, como compuestos

orgnicos que varan la movilidad de los metales, o sulfuros
que reducen la movilidad de stos.
Participacin en el ciclo del carbn, influyendo en la cantidad

y caractersticas de la materia orgnica, lo cual puede variar
en la movilidad de ciertos metales, ya que los compuestos
17
ANTECEDENTES
orgnicos
formacin
podran
de
formar
complejos
enlace
con
los
metales.
La
organo-metlicos
modifica
la
especiacin de los metales.
Modificacin de la movilidad de los metales de forma

indirecta por cambios en el pH, potencial redox, etc.
consecuencia de su propio metabolismo.
1.2.1 TCNICAS DE BIORREMEDIACIN

Los avances tecnolgicos desarrollados actualmente para la
remediacin de medios contaminados por metales pesados consisten en el
uso selectivo y la mejora de procesos naturales para el tratamiento de
residuos particulares. Las distintas interacciones entre microorganismo y
metal han dado lugar al desarrollo de distintos bioprocesos, algunos de los
cuales, se describen a continuacin. La descripcin de estos bioprocesos
(Figura 3) se puede realizar atendiendo a si movilizan o inmovilizan las
especies metlicas presentes en el medio contaminado (CaizaresVillanueva, 2000).
1.2.1.1 Tcnicas de movilizacin

Biolixiviacin
Los procesos de biolixiviacin estn basados en la habilidad de
ciertos microorganismos (bacterias, hongos) para transformar compuestos
slidos dando lugar a elementos solubles y extrables, los cuales pueden ser
recuperados (Krebs y col., 1997). Esta capacidad implica principalmente:
reacciones redox.
formacin de cidos orgnicos e inorgnicos.
excrecin de agentes complejantes.
18
ANTECEDENTES
MOVILIZACIN
INMOVILIZACIN
M-org
M
org
Eliminacin/produccin
de sustancias
movilizadoras de metal
Acumulacin de metales
M activa
M pasiva
Fe(II)
U (ox)
Reduccin de metal
Reduccin de metal
U (red)
Fe(III)
Fe(II)
oxidacin de metal
Oxidacin de azufre
Fe(III)
descenso de pH
Biodegradacin
de compuestos
organo-metlicos
Movilizacin de metal
M
sulfuro
Reduccin de azufre
aumento de pH
Inmovilizacin de metal
M-org
Figura 3: Interacciones entre metales y microorganismos (Ledin, 2000)
Existe una gran diversidad de microorganismos de los que se conoce

su capacidad de lixiviar metales, entre ellos hay auttrofos, de cmo los
microorganismos del gnero Thiobacillus, y hetertrofos, como especies del
gnero Aspergillus y Penicillium, entre otros. La lixiviacin de minerales con
sulfuro se basa en la actividad de bacterias quimiolitotrfas, principalmente
Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans, las cuales
convierten los sulfuros metlicos insolubles en sulfatos metlicos solubles
mediante una reaccin de oxidacin. La lixiviacin de minerales sulfurados
por la accin de este tipo de bacterias con el objetivo de la extraccin de
metales valiosos es una bioindustria ya establecida, sin embargo, hasta
hace unos aos no se han comenzado a dar aplicaciones de la lixiviacin
dirigidas a la reduccin de la contaminacin de suelos y otras matrices
contaminadas con metales pesados. La lixiviacin de minerales no sulfurosos
(xidos, carbonatos o silicatos) se lleva a cabo por bacterias y hongos
19
ANTECEDENTES
hetertrofos que excretan cidos orgnicos o agentes quelantes o
complejantes que disuelven el metal presente en el medio. La biolixiviacin
representa una tecnologa limpia con bajo coste econmico y bajo
requerimiento energtico (Bosecker, 1997, Krebs y col., 1997)
1.2.1.2 Tcnicas de inmovilizacin

Bioacumulacin
Este tipo de tcnicas se basan en la capacidad de algunos
microorganismos para interaccionar con especies metlicas por medio de
su superficie celular. Los microorganismos ms adecuados para este tipo de
procesos son aquellos que tienen una relacin rea superficial/volumen
elevada para garantizar una superficie de contacto suficiente y poder as
interaccionar con el metal que se encuentra en sus alrededores.
La bioacumulacin puede ser pasiva, llamada entonces biosorcin, y
depende principalmente de las propiedades de superficie como la carga,
la orientacin de los grupos funcionales sobre la superficie celular y de la
especiacin del metal y su estado qumico en la fase acuosa. La
bioacumulacin consta bsicamente de dos etapas, primero ocurre la
interaccin electrosttica entre los iones metlicos y los grupos reactivos
dispuestos sobre la superficie celular y, segundo, estos lugares se comportan
como ncleos de deposicin de ms metales. Actualmente se han
desarrollado procesos de biosorcin con biomasa viva y muerta (CaizaresVillanueva, 2000).
Pero, adems, los microorganismos tienen mecanismos de consumo o
acumulacin de metales esenciales para su metabolismo y, en ocasiones,
pueden desarrollar esta capacidad para acumular metales no esenciales
en su interior. La bioacumulacin activa o bioacumulacin intracelular
requiere que se produzcan reacciones o componentes metablicos por
20
ANTECEDENTES
parte de la clula, para ello necesitan de una fuente de energa. El
mecanismo intracelular se realiza mediante un sistema de transporte
especfico que permite inmovilizar el metal en el interior de la clula. La
bioacumulacin pasiva y activa puede darse de forma simultnea en un
mismo microorganismo (Ledin, 2000).
Bioprecipitacin
Los microorganismos pueden inmovilizar de forma efectiva ciertos
metales pesados a travs de su capacidad para reducir esos elementos a
estados de oxidacin menores que los transforman en especies metlicas
menos activas, es decir, de menor movilidad. A veces este fenmeno est
muy ligado al de biosorcin (Valls y Lorenzo, 2002). Uno de los mejores
ejemplos de este tipo de procesos lo representa la produccin de sulfuro de
hidrgeno por parte de bacterias sulfato-reductoras, el cual reacciona con
metales pesados en forma soluble para transformarlos en compuestos
sulfuro, insolubles. Las bacterias del gnero Citrobacter tiene la capacidad
de precipitar metales pesados en forma de fosfatos (Beveridge y Doyle,
1989).
1.3 RESIDUOS DE LA INDUSTRIA DE GALVANIZADO

Una de las mayores fuentes de contaminacin por metales pesados
la constituyen los residuos (emisiones, efluentes, lodos, etc.) procedentes de
las industrias. Como ejemplo de los residuos a tratar por los procesos
propuestos
en
esta
memoria
podemos
considerar
los
residuos
de
galvanizado. Las industrias dedicadas al galvanizado de piezas metlicas

destacan por su elevado contenido en este tipo de elementos. La
legislacin actual establece los lmites de vertido de los residuos
procedentes de este tipo de industrias por la toxicidad que suponen para el
medio ambiente. Como mtodos prioritarios para la disminucin del
21
ANTECEDENTES
contenido metlico en estos residuos se han comenzado a tomar medidas
en el proceso de fabricacin tales como la separacin de efluentes o la
sustitucin de compuestos por otros menos nocivos.
Los mtodos galvnicos o de recubrimiento electroltico consisten en
depositar por va electroqumica finas capas de metal sobre la superficie
sumergida en una solucin hdrica con iones metlicos, electrolitos, al hacer
pasar una corriente (Figura 4). El objetivo es aportarle propiedades de
resistencia mecnica, conductoras o decorativas. El balance general de
este tipo de procesos se recoge en la figura 4. No obstante, es evidente que
en funcin del recubrimiento electroltico que se utilice se van a generar
distintos de residuos. As se pueden distinguir:
RECUBRIMIENTO ELECTROLTICO
e-
e-
nodo
Ctodo
Electrolito
M+n
Recubrimiento de M
Figura 4: Esquema de un bao de recubrimiento electroltico.
22
ANTECEDENTES
Pieza metlica
Agua residual de
enjuague
Agua
Electrodos
contaminados o
usados
Sales metlicas
Aditivos
nodos
Recubrimiento electroltico
Material auxiliar
(filtros, carbn activo).
Lodos andicos o
de limpieza
Material auxiliar
usado
Electricidad
Emisiones
Pieza recubierta
Figura 5: Diagrama de balance de materiales para las operaciones de recubrimiento

electroltico
Cobrizado: Los baos de cobre pueden ser cidos (sulfato de cobre)

o alcalinos (cianuro de cobre). Los cidos requieren un mayor control pero
se prefieren a los cianurados por su toxicidad para el medio ambiente y la
salud.
Niquelado: En el galvanizado con nquel se pueden utilizar baos de
sulfamatos o baos Watts con sulfatos de nquel. La mezcla con otros
componentes del proceso puede generar complejos de nquel muy estables
y difciles de tratar.
Cromado: los baos de cromado emplean cromo trivalente y
hexavelente. Debido a la elevada toxicidad del cromo (VI) sobre los seres
vivos, se realiza un control ms exhaustivo de los residuos emitidos en esta
etapa y, generalmente, se someten sus aguas residuales a procesos con
bisulfito de sodio para reducir el Cr(VI) a Cr(III), menos txico.
Zincado: Los baos de zinc pueden ser cianurados (alcalinos) y
existen otros (cidos) basados en potasio y amonio. Los baos cianurados,
23
ANTECEDENTES
por la toxicidad que representan, estn comenzando a ser sustituidos por
otros compuestos como sales de sodio.
Actualmente, los residuos de galvanizado se suelen derivar a:
confinamiento controlado
reciclaje/reutilizacin
almacenamiento temporal en la planta
relleno sanitario
tratamiento fisicoqumico
drenaje municipal
Durante los ltimos aos, se han tomado las siguientes medidas para
reducir la contaminacin por metales pesados en este tipo de plantas:
Enjuagues de recuperacin y prolongacin del escurrido: la pieza
recubierta se enjuaga y se trata de recuperar, aumentando la eficacia del
escurrido, el metal implicado en esa etapa para volver a emplearlo en el
bao electroltico.
Sustitucin de los compuestos metlicos ms dainos: los baos
cianurados de zinc se sustituyen por baos neutros de cloruro de zinc o
baos cidos de sulfato, cloruro o fluoroboratos de zinc. Los baos
cianurados de cobre se sustituyen por baos cidos de sulfato o
fluoroborato de cobre. Adems se comienza a sustituir el cromo
hexavalente por cromo trivalente en el proceso de cromado, aunque esto
supone mayor coste y mantenimiento.
Eliminacin de compuestos quelantes: en algunos baos de
recubrimiento electroltico se emplean este tipo de compuestos para
controlar la concentracin de iones libres en la solucin pero pueden inhibir
24
ANTECEDENTES
la precipitacin de los metales, por ello la tendencia es no emplearlos para
favorecer el tratamiento posterior de los lodos con metales.
Recuperacin de metales y sales metlicas de los baos mediante
procesos de:
smosis inversa
Electrodilisis
Precipitacin y separacin.
Separacin electroltica.
Evaporacin
Intercambio inico
Entre los factores que determinan si la recuperacin del metal es

econmicamente justificable se incluyen el volumen de residuo que
contiene el metal, su concentracin, el potencial para reutilizar el metal una
vez recuperado y los costos de tratamiento y deposicin. Algunas de las
caractersticas ms relevantes de estos procesos se recogen en la tabla 2.
Habitualmente, los mtodos convencionales para eliminar los metales
pesados de los efluentes industriales resultan muy costosos. La necesidad de
encontrar procesos ms econmicos hace atractivos a los procesos
biolgicos que pueden reducir el contenido de estos contaminantes de
forma eficaz y sin implicar elevados costes (Atkinson y col, 1996). En este
sentido, se vienen desarrollando algunos trabajos que van desde la
utilizacin de corteza de rbol cuyos componentes actan como agentes
quelantes sobre los metales pesados (Gaballah y Kilbertus, 1998), el uso de
subproductos de algunas industrias (barros, cenizas, etc.) u otros soportes
(arena, silica, etc.) para actuar como base para procesos de adsorcin
(Santos y Oliveira, 2003, Ciccu y col., 2003), el empleo de bacterias, hongos
25
ANTECEDENTES
o algas como biosorbentes (Atkinson y col., 1996, Malik, 2004) o el desarrollo
de procesos con otros microorganismos para la solubilizacin de los metales
presentes en un residuo industrial (Bosecker, 2001).
Tcnica
Intercambio
inico
smosis inversa o
electrodilisis
Objetivo
Recuperacin
del electrolito
Recuperacin del
electrolito y el
agua desionizada
Requisitos
Costos
Relacin
costo/
beneficio
Aplicacin
Limitantes
equipo de
intercambio
inico, agua
desionizada,
energa electrica
Alto
Separacin
electroltica
Recuperacin
interna de
metales en
enjuagues o
soluciones
concentradas
Evaporacin
Concentracin
de los enjuagues
para retornarlos
al bao
Energa elctrica,
membranas
Equipo de
electrolisis,
energa
elctrica
Equipo de
evaporacin
atmosfrica,
energa
Alto
Bajo-medio
alto
Regular-/mala
Buena
Buena
Regular -mala
Recuperacin
de metales
presentes como
electrolitos
Recuperacin de
metales en el
primer enjuague
de cascada
Recuperacin
de metales en
enjuagues de
recuperacin o
de cascada
Recuperacin d
metales en
baos calientes
Uso de agua
desionizada.
Resistencia de las
membranas a
cambios en el pH
y la temperatura.
No aplicable al
cromo
Solo para
soluciones
concentradas.
No aplicable al
cromo
Baos calientes
sin tensioactivos
Es recomendable
el agua
desionizada
Exige alto control

de proceso.
No se puede usar
para algunos
electrolitos
Tabla 2: Principales caractersticas de algunos de los tratamientos empleados para recuperar

metales en las plantas de galvanizado (GTZ, 1998)
1.4 CARACTERSTICAS Y TOXICIDAD DE LOS METALES

ESTUDIADOS
Existe un gran nmero de metales que se encuentran de forma
habitual
en
los
medios
contaminados
por
la
actividad
industrial,
principalmente. De todos ellos, se han seleccionado para el estudio de su

posible eliminacin o reduccin por medio de la actividad bacteriana, los
26
ANTECEDENTES
iones cromo (III), niquel (II) y zinc(II). Estos iones se encuentran a distintas
concentraciones en los efluentes industriales y existe una legislacin que
detalla los niveles mximos permitidos en el medio ambiente.
1.4.1 CROMO
1.4.1.1 Caractersticas
El cromo es un metal de color blanco plateado, duro y quebradizo,
relativamente suave y dctil cuando se encuentra en estado puro y no est
tensionado. No se encuentra en estado elemental en la naturaleza. Su
mineral ms importante por abundancia es la cromita (FeCr2O4 o FeO
Cr2O3). El cromo puro se obtiene por reduccin del xido de cromo(III) con
aluminio (procedimiento aluminotrmico), mediante electrolsis o a partir de
ioduro crmico. Sus caractersticas ms relevantes y las de sus compuestos
ms comunes se recogen en la tabla 3. (Pgina web 1)
Existen cuatro istopos naturales del cromo:
50Cr, 52Cr, 53Cr
54Cr.
Se
han producido otros mediante reacciones radioqumicas de los cuales el

ms importante es el 51Cr.
El cromo galvanizado y pulido es de color blanco azulado brillante y
su poder reflejante es el 77% del de la plata.
El cromo forma fundamentalmente compuestos con el oxgeno: xido
de cromo (II) (CrO), xido de cromo(III) (Cr2O3) y xido de cromo (VI) (CrO3).
Se conocen tambin los perxidos, cido percrmico y percromatos y son
muy comunes los halogenuros.
27
ANTECEDENTES
Nombre
Cromo
Smbolo
Cr
N atmico
24
Masa atmica (g/mol)
51,996
Valencia
2, 3, 4, 5, 6
Aspecto
metal blanco-azul plateado
N CAS
7440-47-3
Punto de ebullicin (C)
2665
Punto de fusin (C)
1857
Densidad (g/ml) a 20C
7,19
Solvlisis
en H2SO4 y HCl diluidos
Presin vapor (Pa, 844C)
10-6
Configuracin electrnica
[Ar] 3d54s1
Electronegatividad
1,66
1er
6,80
Pot. de ionizacin (eV)
Radio atmico ()
1,27
Radio covalente ()
1,27
Radio inico () (e.o +3)
0,69
Tabla 3a: Datos generales y caractersticas fisico-qumicas del cromo.

Nombre
Dicromato de sodio (dihid)
xido de cromo(VI)
Frmula
Na2Cr2O72H2O
CrO3
Masa molecular (g/mol)
298 (anhidro 261,98)
99,99
Aspecto
agujas anaranjadas-rojas
Cristales rojo oscuro
N CAS
7789-12-0
1333-82-0
> 400 C descomposicin
No destilable
Punto de fusin (C)
357C (>86 sal anhidra)
198C
Densidad (g/ml)
2,35-2,52
2,7
Solvlisis
73,18% en H2O a 20C
1660 g/l a 20C
Tabla 3b: Caractersticas de algunos compuestos comunes de cromo (VI)
Sus propiedades mecnicas, dureza y resistencia a la tensin, le

proporcionan una gran variedad de aplicaciones. El cromo tiene una
capacidad relativamente baja de forjado, enrrollamiento y propiedades de
28
ANTECEDENTES
manejo, pero cuando se encuentra libre de oxgeno, hidrgeno, carbono y
nitrgeno es muy dctil y se puede forjar y manejar.
Las principales aplicaciones del cromo son: su uso como catalizador
en la sntesis del amoniaco, en la fabricacin de aceros de cromo y aceros
inoxidables, en aleaciones con cromo y en el cromado galvnico. Los
compuestos orgnicos del cromo se emplean como pigmentos para
pinturas y las sales de cromo(VI) se emplean para la preservacin de la
madera y el curtido de cueros (Pais y Benton, 2000).
1.4.1.2 Toxicidad
El cromo es un elemento natural que se encuentra en rocas,
animales, plantas, suelos y en polvos y gases volcnicos. Las formas ms
comunes en el medio ambiente son Cr elemental, Cr(III) y Cr(VI). No se
asocia un olor o sabor caracterstico a este tipo de compuestos.
El cromo (III) aparece de forma natural en el ambiente y es un
elemento nutritivo esencial ya que interviene en algunos procesos
metablicos. El cromo elemental y el cromo (VI) se producen generalmente
por procesos industriales.
Resultado de las actividades industriales, el cromo en sus distintas
formas entra en contacto con el medio natural, es decir, con el aire, agua,
suelo y, consecuentemente, en la cadena alimenticia.
Agua: En los sistemas acuticos, la toxicidad de los compuestos
solubles de cromo vara segn la temperatura, pH, dureza del agua y
organismos que la pueblan. Los compuestos de cromo (VI) se disuelven con
facilidad, pero en condiciones naturales y en presencia de materia
orgnica oxidable, se reducen rpidamente a compuestos de cromo (III)
ms estables y menos hidrosolubles.
29
ANTECEDENTES
Suelo: La movilidad del cromo se evala considerando la capacidad
de adsorcin y reduccin de los suelos y sedimentos. Los hidrxidos de
cromo (III), una vez sedimentados, difcilmente vuelven a movilizarse, ya que
la oxidacin a cromo (VI) no ocurre de forma natural. El cromo (VI) resulta
txico aun en concentraciones muy bajas, siendo el pH del suelo un factor
muy influyente. El uso de fosfatos incrementa la entrada de cromo en el
suelo.
Cadena alimentaria: Los compuestos de cromo (III) asimilados junto
con los alimentos resultan relativamente inocuos, sin embargo, los de cromo
(VI) son altamente txicos. Los animales y seres humanos incorporan al
organismo cantidades relativamente bajas de cromo por inhalacin. La
mayor entrada de cromo se produce por el agua o los alimentos que se
ingieren, la resorcin en el intestino depende de la forma en que se
encuentre este metal. Se asimilan el 20-25% del cromo de complejos
orgnicos y un 0,5% del cromo inorgnico. La gran parte del cromo que se
encuentra en el medio ambiente se atribuye a emisiones industriales. Las
emisiones naturales hacia la atmsfera son de unas 58000 t/a y las de origen
industrial cerca de las 100000 t/a.
Riesgos sobre la salud humana: Respirar niveles altos de cromo (VI)
provoca irritacin y hemorragias nasales y lceras y perforaciones en el
tabique nasal. Los efectos agudos que puede provocar el contacto con
derivados del cromo hexavalente son fuerte irritacin de la piel e incluso
quemaduras, as como alteraciones hepticas y renales. Como efectos
crnicos se conocen la dermatitis alrgica de contacto y el cncer de
pulmn (OIT, 2001).
30
ANTECEDENTES
1.1.2.NIQUEL
1.1.2.1.Caractersticas
El nquel es un metal blanco plateado. Es duro, maleable, dctil, algo
ferromagntico y buen conductor del calor y de la electricidad. Este metal
es estable al aire y al agua y no se suele encontrar de forma libre en la
naturaleza pero es muy comn encontrarlo de forma elemental en los
meteoritos (5-20%) y se cree que hay gran cantidad de este elemento en el
ncleo terrestre. Los minerales ms comunes de este metal son la pirrotina
(pirita de cobre [CuFeS2], pentlandita [NiS]), garnierita [(Ni,Mg)3H4Si2O11],
millerita [NiS], niquelina [NiAs] y algunos ms.
Existen cinco istopos naturales del nquel:
58Ni, 60Ni, 61Ni, 62Ni
64Ni.
Adems se han identificado siete istopos radiactivos. En la tabla 4 se

resumen las principales caractersticas del nquel y algunos de sus
compuestos.
Los compuestos ms comunes del nquel son: el tetracarbonilo de
nquel [Ni(CO4)], lquido incoloro sumamente venenoso, el xido de nquel
[NiO] , el cloruro de nquel [NiCl2] y el sulfato de nquel [NiSO4].
Entre las aplicaciones principales del nquel destacan su uso
formando parte de aleaciones, forma aleaciones con casi todos los
metales, en tcnicas de niquelado para recubrimiento de metales como
proteccin
la
corrosin,
fabricacin
de
monedas
blindajes,
catalizadores, bateras de nquel-cadmio y pigmentos para pinturas entre

otras (Pais y Benton, 2000).
31
ANTECEDENTES
Nombre
Nquel
Smbolo
Ni
N atmico
28
Masa atmica (g/mol)
58,71
Valencia
2, 3
Aspecto
Blanco plateado
N CAS
7440-02-0
2730
Punto de fusin (C)
1455
8,9
Solvlisis
en H2SO4 y HCl diluidos
Presin vapor (Pa, 20C)
[Ar] 3d84s2
Electronegatividad
1,8
1er
7,68
Pot. de ionizacin (eV)
Radio atmico ()
1,24
Radio covalente ()
1,21
0,78
Tabla 4a: Datos generales y caractersticas fisico-qumicas del nquel.

Nombre
Tetracarbonilo de nquel
cloruro de nquel
Frmula
Ni(CO4)
NiCl2(6H2O)
170,75
129,6
Aspecto
Lquido incoloro
Cristales amarillo plido
N CAS
13463-39-3
7718-54-9
42,2
Punto de fusin (C)
-19,3
987
Densidad (g/ml)
1,31
3,55
Solvlisis
Disolventes orgnicos
En agua: 1170 g/l
Tabla 4b: Caractersticas de algunos compuestos comunes de nquel.
1.1.2.2.Toxicidad
El nquel es liberado al aire por las plantas de produccin de energa
y las incineradoras de basuras y es, posteriormente, depositado en el suelo.
Tambin puede llegar al medio ambiente en las aguas residuales. La mayor
32
ANTECEDENTES
parte de los compuestos de nquel liberados al ambiente se absorben por
los sedimentos o partculas del suelo donde el nquel es finalmente
inmovilizado.
Agua: En los sistemas acuticos el nquel, habitualmente, se
encuentra en estado de oxidacin (II), la forma en que se encuentra en el
agua depende del pH. Los compuestos de nquel ingresan en el agua
generalmente de modo antropognico y se pueden encontrar sales
solubles, xidos insolubles o polvo de nquel metlico.
Aire: El nquel en el aire se encuentra en forma de aerosol. En el aire la
forma metlica es estable. Con respecto a las emisiones, las mayores
corresponden a sulfatos, xidos simples y xidos complejos de nquel y, en
menor medida, el polvo de nquel metlico.
Suelo: Se suele encontrar como mineral cristalino inorgnico, en
complejos quelados o como in libre. El comportamiento de estos
compuestos en el suelo depende de su naturaleza y, principalmente, del
tipo de suelo. Generalmente la disminucin del pH incrementa la desorcin
y, por tanto, aumenta el contenido de nquel en solucin en el suelo.
Cadena alimentaria: Numerosas plantas acumulan nquel que toman,
principalmente, del suelo a travs de su sistema radicular, lo cual hace que
la ingestin de nquel por el ser humano se pueda deber al consumo de
vegetales. Para muchas plantas el nquel constituye un nutriente importante
para el crecimiento vegetal.
Riesgos sobre la salud humana: El metal y sus compuestos inorgnicos
se pueden considerar inocuos pero el contacto permanente con la piel
puede provocar la sarna del nquel. Los compuestos orgnicos, como el
tetracarbonilo de nquel son extremadamente txicos. Los riesgos principales
derivados de la exposicin continuada a compuestos de nquel son:
33
ANTECEDENTES
alergias, rinitis, sinusitis, enfermedades respiratorias y cncer (cavidades
nasales, pulmn) (OIT, 2001).
1.4.2 ZINC
1.1.3.1.Caractersticas
El zinc puro y recientemente pulido es de color blanco azulado y
brillante, es dctil y maleable pudindose enrollar y tensar pero cantidades
pequeas de otros metales pueden volverlo quebradizo. Es buen conductor
del calor y de la electricidad. El zinc puro no es ferromagntico. Los
minerales de zinc son muy comunes y se suelen encontrar acompaados de
otros metales (plomo, cadmio, hierro, cobre), entre ellos destacan: la
blenda (esfarelita) [ZnS], la wurzita [ZnS], la smithsonita o calamina [ZnCO3],
la hemimorfita y willemita (silicatos de zinc) y la cincita [ZnO] (Tabla 5).
Se conocen un gran nmero de istopos del zinc de los cuales los
cinco ms estables son: 64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn y 70Zn.
El zinc normalmente forma los compuestos en estado divalente, los
ms importantes son: el xido de zinc [ZnO] que se emplea como pigmento
blanco, relleno de materiales de caucho, farmacia, cosmtica, tintas y
equipos elctricos; el sulfuro de zinc [ZnS] que se emplea como fluorescente
en seales, televisiones, radioscopia y pinturas, y el sulfato de zinc [ZnSO4] til
en la fabricacin de pinturas, tratamiento de maderas y obtencin de zinc
hidroltico.
Las aplicaciones del zinc ms importantes son su uso en aleaciones,
sobretodo con aluminio y cobre que aumentan su solidez, su empleo como
proteccin superficial de otros metales en chapas y alambres de hierro,
cubos y techados y el agregado de magnesio es muy empleado en la
industria del automvil (Pais y Benton, 2000).
34
ANTECEDENTES
Nombre
Zinc, cinc
Smbolo
Zn
N atmico
30
Masa atmica (g/mol)
65,38
Valencia
+2
Aspecto
Blanco-azulado brillante
N CAS
7440-66-6
907
Punto de fusin (C)
419,5
7,14
Solvlisis
En cidos y bases
Presin vapor (Pa, 103,3C)
1,3 x 10-7
[Ar] 3d104s2
Electronegatividad
1,6
1er Pot. de ionizacin (eV)
9,42
Radio atmico ()
1,38
Radio covalente ()
1,31
0,74
Tabla 5a: Datos generales y caractersticas fisico-qumicas del zinc.

Nombre
xido de zinc
Sulfato de zinc
Frmula
ZnO
ZnSO4
81,37
161,43
Aspecto
Cristales o polvo blanco
Cristales incloros
N CAS
1314-13-2
7733-02-0
Punto de fusin (C)
1975
>600
Densidad (g/ml)
5,6
Solvlisis
En agua: 1,6 x
3,54
103
Tabla 5b: Caractersticas de algunos compuestos comunes de zinc
1.4.2.1 Toxicidad
El zinc se encuentra de forma natural en el aire, el agua y el suelo
pero
actualmente
las
concentraciones
estn
aumentando
por
las
35
ANTECEDENTES
actividades industriales como la minera, la combustin del carbn y los
residuos y el procesado del acero.
Agua: La presencia de zinc en el agua se debe principalmente a los
vertidos de aguas residuales que no son depuradas de forma satisfactoria, lo
cual puede provocar el aumento de la acidez del suelo. Este metal
permanece estable en agua dulce y salada debido a la capa de xido que
lo recubre. En polvo, debido a la gran superficie de contacto, es muy
reactivo, creando peligro de explosin.
Suelo: Se puede detectar acumulacin de zinc en suelos hasta un
radio de varios kilmetros de distancia de las plantas metalrgicas y en las
cercanas inmediatas no es posible la explotacin agrcola. La presencia de
zinc afecta a las plantas y puede interrumpir la actividad biolgica en los
suelos, dificultando la descomposicin orgnica.
Cadena alimentaria: En suelos ricos en zinc slo un nmero limitado
de plantas tiene la capacidad de sobrevivir ya que la presencia de este
metal produce necrosis, clorosis e inhibe el crecimiento. Algunos peces
pueden acumular zinc cuando viven en cursos contaminados de agua. La
acumulacin de zinc en seres vivos y plantas afecta claramente a la
cadena alimentaria.
Riesgos sobre la salud humana: El zinc es nutriente esencial para los
humanos y los animales (cofactor enzimtico) su deficiencia provoca
problemas en el crecimiento y la madurez y anemia. En contraposicin un
exceso de zinc produce lceras de estomago, irritacin de la piel, vmitos,
daos en el pncreas, disturbios en el metabolismo de las protenas y
arteriosclerosis. La exposicin continuada en el ambiente de trabajo
produce la fiebre o los escalofros del zinc (OIT, 2001).
36
ANTECEDENTES
1.5 LEGISLACIN SOBRE METALES PESADOS

Los metales pesados son considerados como residuos txicos y
peligrosos por la ley 20/1986, de 14 de Mayo, Bsica de Residuos Txicos y
Peligrosos. Dicha ley fue modificada por el Real Decreto 952/1997, de 20 de
junio, y en ella se exponen la clasificacin de residuos, los modos de gestin
y las obligaciones del productor de residuos.
La generacin de residuos con presencia de metales pesados
proviene de muchas y diversas fuentes. La orden del Ministerio de Medio
Ambiente MAM/304/2002, de 8 de Febrero, publica las operaciones de
valorizacin y eliminacin de residuos y la lista europea de residuos.
En la tabla 6 se recopilan los principales residuos que contienen
metales pesados obtenidos a partir de la clasificacin europea de residuos
procedente de la decisin 2000/532/CE de 3 de Mayo de 2000. Por otra
parte esta orden presenta un listado de las operaciones de eliminacin y
valorizacin de residuos, entre ellas se consideran algunas de las
actividades relacionadas con el tipo de residuos que se tratan en este
estudio (tabla 7).
Resulta complicado establecer unos valores lmite de metales
pesados
en
suelos,
lodos,
aguas
sedimentos,
ya
que
estas
concentraciones dependen del tipo de residuo en que se encuentren y de

la legislacin propia de cada estado o comunidad autnoma.
Ya que el residuo a tratar bajo el proceso estudiado en el presente
trabajo se constituye de una matriz slida en la que se encuentran
inmovilizados los metales pesados, podemos hacer referencia a la
legislacin existente respecto a la aplicacin de lodos a suelos.
37
ANTECEDENTES
01 Residuos de la prospeccin, extraccin de minas y canteras y tratamientos fsicos y qumicos de
minerales
010101
Residuos de la extraccin de minerales metlicos
010304
Estriles que generan cido procedentes de la transformacin de sulfuros
010307
Otros residuos que contienen sustancias peligrosas

transformacin fsica y qumica de minerales metlicos.
procedentes
de
la
04 Residuos de las industrias del cuero, de la piel y textil

040104
Residuos lquidos de curticin que contienen cromo
040106
Lodos, en particular los procedentes del tratamiento in situ de efluentes, que

contienen cromo.
040108
Residuos de piel curtida (serrajes, rebajaduras, recortes, polvo de esmerilado) que

contienen cromo.
06 Residuos de procesos qumicos inorgnicos

060313
Sales slidas y soluciones que contienen metales pesados
060315
xidos metlicos que contienen metales pesados
060405
Residuos que contienen otros metales pesados
060502
Lodos de tratamiento in situ de efluentes que contienen sustancias peligrosas
10 Residuos de procesos trmicos

1005
Residuos de la termometalurgia del zinc
1006
Residuos de la termometalurgia del cobre
1008
Residuos de la termometalurgia de otros metales no frreos
11 Residuos del tratamiento qumico de superficie y del recubrimiento de metales y otros materiales;
residuos de la hidrometalurgia no frrea
110109
Lodos y tortas de filtracin que contienen sustancias peligrosas
110111
Lquidos acuosos de enjuague que contiene sustancias peligrosas
110202
Lodos de la hidrometalurgia del zinc
110502
Cenizas de zinc
12 Residuos del moldeado y tratamiento fsico y mecnico de superficies de metales y plsticos

120103
Limaduras y virutas de metales no frreos.
38
ANTECEDENTES
120118
Lodos metlicos que contienen aceites
16 Residuos no especificados en otros capitulos

160118
Metales no frreos
160601
Bateras de plomo
160602
Acumuladores de Ni-Cd
160802
Catalizadores usados que contienen metales de transicin peligrosos o compuestos

de metales de transicin peligrosos
17 Residuos de la construccin y demolicin

19 Residuos de las instalaciones para el tratamiento de residuos de las plantas externas de tratamiento
de aguas residuales y de la preparacin de agua para consumo humano y de agua para uso industrial
1903
Residuos estabilizados/solidificados
1904
Residuos vitrificados y residuos de la vitrificacin
1905
Residuos del tratamiento aerbico de residuos slidos
190702
Lixiviados de vertedero que contienen sustancias peligrosas
190805
Lodos del tratamiento de aguas residuales urbanas
190808
Residuos procedentes de sistemas de membranas que contienen metales pesados
190811
Lodos procedentes del tratamiento biolgico de aguas residuales industriales, que

contienen sustancias peligrosas
190813
Lodos procedentes de otros tratamientos de aguas residuales industriales, que

contienen sustancias peligrosas
1910
Residuos procedentes del fragmentado de residuos que contienen metales
191202
Metales frreos
191301
Residuos slidos, de la recuperacin de suelos, que contienen sustancias peligrosas
20 Residuos municipales incluidas las fracciones recogidas selectivamente

200133
Bateras y acumuladores especificados en los cdigos 160601, 160602 160603 y

bateras y acumuladores sin clasificar que contienen esas bateras
200140
Metales
Tabla 6: Clasificacin de residuos que contienen metales pesados
39
ANTECEDENTES
cdigo
D2
Tratamiento en medio terrestre (biodegradacin

residuos lquidos o lodos en el suelo)
D8
Tratamiento biolgico que da como resultado compuestos

o mezclas que puedan eliminarse por un procedimiento
autorizado
R4
Reciclado o recuperacin de metales y de compuestos

metlicos
Operaciones de
eliminacin
Operaciones de
valorizacin
Operacion
de
Tabla 7: Operaciones relacionadas con el trabajo desarrollado.
La directiva 86/278/CEE, de 12 de junio, se refiere a la proteccin del

medio ambiente y, en particular, de los suelos, en la utilizacin de los lodos
de depuradora en agricultura.
Esta ley tiene por objeto regular el uso de lodos para evitar efectos
nocivos sobre suelos, plantas, animales y seres humanos y fomentar su
correcto uso. En ella se considera:
que los lodos pueden tener propiedades agronmicas tiles, lo

que conlleva a su valorizacin en la agricultura.
que ciertos metales pesados pueden ser txicos para las

plantas y para el ser humano por su presencia en las cosechas.
que es necesario fijar valores lmite para dichos elementos en

el suelo.
que es necesario prohibir la utilizacin de lodos con metales

pesados cuando la concentracin de stos supera los valores
lmite.
Para ello, se establecen los niveles permitidos de ciertos metales para

tres condiciones diferentes:
valores lmite de concentraciones de metales pesados en los

suelos que reciben lodos.
40
ANTECEDENTES
valores lmite de concentraciones de metales pesados en los

lodos.
valores de las cantidades mximas anuales de metales

pesados que pueden ser introducidos en los suelos destinados
a la agricultura.
Dichos valores se recogen en la tabla 8. En esta directiva queda

pendiente el establecimiento de los valores lmite para el cromo.
Valores lmite de metales
pesados en suelos
tratados con lodos
(mg/kg mat. seca)
Valores lmite de
metales pesados en
lodos
(mg/kg mat. seca)
Cantidades
mximas anuales
(g/ha/ao)
Cd
1-3
20-40
150
Cu
50-140
1000-1750
12000
Hg
1-1,5
16-25
100
Ni
30-75
300-400
3000
Pb
50-300
750-1200
15000
Zn
150-300
2500-4000
30000
Tabla 8: Valores lmite de concentraciones de metales pesados recogidos en la directiva

86/278/CEE
En el borrador para una nueva Directiva relativa a la aplicacin de

lodos en el suelo (Bruselas 12/01/2000) se definen los tipos de lodos y se
presentan valores lmite de concentracin de metales pesados algo ms
restrictivos y en funcin del pH del suelo.
En dicho trabajo adems:
se exige comprobar mediante un test si es posible que el Cr(III)

se oxide a Cr(VI) y si es as, se prohbe el uso de lodos que
produzcan mas de 1 M de Cr(VI).
41
ANTECEDENTES
se establecen los valores lmite para concentraciones de

compuestos orgnicos y dioxinas
La legislacin espaola, en el Real Decreto 1310/1990 regula la

utilizacin de lodos de depuracin en el sector agrario y traspone al
derecho espaol la Directiva de la UE 86/278/CEE. En ella se presentan los
valores lmite de concentracin de metales pesados, incluyendo el cromo,
en suelos tratados con lodos, en lodos para ser utilizados con fines agrcolas
y las cantidades mximas anuales aplicables de lodos en suelos (tabla 9)
pesados en suelos tratados
con lodos (mg/kg mat. seca)
Suelo pH<7
Suelo pH>7

pesados en lodos
(mg/kg mat. seca)
Suelo pH<7
Cantidades
mximas
anuales
(g/ha/ao)
Suelo pH>7
Cd
20
40
150
Cu
50
210
1000
1750
12000
Ni
30
112
300
400
100
Pb
50
300
750
1200
3000
Zn
150
450
2500
4000
15000
Hg
1,5
16
2,5
Cr
100
150
1000
1500
30000
Tabla 9: Valores lmite de concentraciones de metales pesados recogidos en el Real Decreto

1310/1990
El tratamiento de residuos slidos que contienen metales pesados

puede dar lugar a la movilidad de estos elementos y su paso a medios
lquidos. Por tanto, resulta de inters conocer los valores lmite de vertido de
los metales pesados.
42
ANTECEDENTES
La ley 29/1985, de 2 de Agosto, ley de Aguas, modificada
principalmente por la Ley 46/1999, de 13 de Diciembre, recoge los valores
lmite de diversos parmetros en los vertidos de agua residuales. Los
principales metales pesados se recogen en la tabla 10.
Elemento
Valores lmite (mg/l)
Cadmio
0,1-0,5
Cobre
0,2-10
Cromo (III)
2-4
Cromo (IV)
0,2-0,5
Niquel
2-10
Mercurio
0,05-0,1
Plomo
0,2-0,5
Zinc
3-20
Tabla 10: Valores lmite de concentracin de metales pesados (mg/l) permitidos en vertidos
de aguas residuales para efluentes con pH 5,5-9,5.
43
ANTECEDENTES
2 BIOLIXIVIACIN
CON
BACTERIAS
AZUFRE-
OXIDANTES
2.1.BIOLIXIVIACIN DE MINERALES
Los metales valiosos han sido obtenidos a partir de minerales por
lixiviacin desde hace cientos de aos. Este proceso se crey que era una
reaccin qumica mediada por la presencia de oxgeno y agua hasta 1947,
cuando fue demostrada la catlisis bacteriana de la oxidacin del hierro y
la formacin de cido sulfrico en las aguas de mina (Colmer y Hinkle, 1947)
En la actualidad, el uso de microorganismos para extraer metales a
partir de minerales, denominado como biominera, es bien conocido. Los
microorganismos participan en la deposicin y solubilizacin de metales
pesados
de
la
corteza
terrestre
desde
siempre
esta
actividad
mayoritariamente ha estado ligada al ciclo del hierro y del azufre. El uso de

microorganismos en el procesado de minerales tiene algunas ventajas sobre
los mtodos fisicoqumicos tradicionales: son compatibles con el medio
ambiente, no requieren un elevado costo energtico y son tiles en la
recuperacin de minerales de baja ley (Rawlings, 2002).
La biominera incluye trminos como biolixiviacin y biooxidacin. La
biolixiviacin consiste en la conversin de un metal formando parte de un
compuesto insoluble mediante un proceso de oxidacin que lo transforma
en una forma soluble, permitiendo as la extraccin del metal en el medio
acuoso. La biooxidacin se refiere a los procesos en los cuales la
recuperacin de un metal es facilitada por la descomposicin microbiana
del mineral, pero el metal extrado no es solubilizado. Un ejemplo es la
recuperacin de oro a partir de la arsenopirita, la oxidacin se produce
44
ANTECEDENTES
sobre otros compuestos del mineral que acompaan al oro, permitiendo la
liberacin de ste que es posteriormente extrado por cianurizacin.
La aplicacin de procesos basados en la biolixiviacin permite la
obtencin de metales a partir de minerales de forma natural pero tambin
a partir de residuos industriales que no pueden ser manejados por tcnicas
convencionales. No obstante, los procesos de biolixiviacin slo han
tomado importancia recientemente en algunas industrias minerales,
mientras que la lixiviacin hidrometalrgica qumica en condiciones cidas
ha sido muy desarrollada (Krebs y col., 1997).
Una variedad de microorganismos catalizan la lixiviacin de minerales
a partir de depsitos minerales y pilas en las minas. Entre ellos, las especies
auttrofas Thiobacillus y las especies hetertrofas Aspergillus y Penicillium son
las ms estudiadas. Krebs y col. (1997), recoge una seleccin de los
microorganismos conocidos por su capacidad potencial para la lixiviacin.
2.2. BACTERIAS AZUFRE OXIDANTES

Los microorganismos ms activos en la biolixiviacin de minerales
sulfurados son las bacterias que pertenecen al gnero Thiobacillus, aunque
tambin se conocen especies de otros gneros (Acidianus, Sulfolobus,
Leptospirillum) que actan sobre este tipo de minerales.
La lixiviacin bacteriana es llevada a cabo en los ambientes cidos,
a valores de pH entre 1,5-3, a los cuales la mayora de los iones metlicos se
mantienen en solucin. En estas condiciones las especies acidfilas
Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans son las de mayor
importancia. Otros miembros de este gnero son tambin capaces de
oxidar azufre y sulfuros pero slo crecen a valores de pH mayores a los
cuales no todos los iones metlicos se mantienen disueltos.
45
ANTECEDENTES
Como resultado del anlisis de la secuencia 16S rARN (ARN
ribosomial) se incluyen desde el ao 2000 dentro del gnero Thiobacillus las
bacterias azufre-oxidantes pertenecientes a las divisiones
de las
Proteobacterias. Con lo cual, el gnero Thiobacillus fue subdividido en un

nuevo gnero, Acidithiobacillus (At.), para acomodar a los miembros
altamente
acidfilos
que
componan
el
gnero.
ste
incluye
At.
ferrooxidans, At. thiooxidans y At. caldus (anteriormente conocidos como

Thiobacillus ferrooxidans, thiooxidans y caldus, respectivamente)(Nelly y
Wood, 2000).
2.1.1 CARACTERSTICAS DE Acidithiobacillus ferrooxidans Y

Acidithiobacillus thiooxidans.
Son bacterias gram-negativas, de forma cilndrica no esporulada y
que habitualmente se encuentran de forma natural en las aguas cidas de
minas (Johnson y Hallberg, 2003; Dopson y col., 2003). Sus caractersticas
ms destacables son (Nemati y col., 1998; Bosecker, 1997; Norris, 1990):
Quimiolitotrfas: obtienen la energa necesaria para su

metabolismo a partir de compuestos reducidos o parcialmente
reducidos de azufre siendo el producto final de la oxidacin el
sulfato.
Auttrofas: la fuente de carbono para la sntesis de nuevo

material celular la obtienen mediante la fijacin de dixido de
carbono atmosfrico. Requieren de otros nutrientes como N y P
junto con algunos elementos traza.
Aerobias: el oxgeno es el principal aceptor de electrones.
Mesfilas: su ptimo de temperatura se encuentra en torno a

30C aunque el rango de temperaturas es muy amplio debido
a la gran diversidad de las distintas cepas de estas especies.
46
ANTECEDENTES
Acidfilas: viven en ambientes cidos (pH<6).
A pesar de su similitud estas bacterias difieren en otras caractersticas

muy relevantes que se describen a continuacin y algunas de las cuales se
recogen en la Tabla 11.
Caracterstica
Acidithiobacillus ferrooxidans
Acidithiobacillus thiooxidans
0,5 x 1-1,5 m
0,3 x 1-1,2 m
15-37 C
10-37 C
Temperatura ptima
30 C
30 C
Rango de pH
1,4-6
0,5-6
2,0
2,0-3,5
Fuente de energa
Fe2+,S0, S2-, S2O32-, UO22+
S0, S2O32-, S4O62-
Fuente de carbono
CO2
CO2
Fuente de nitrgeno
NH4+
NH4+
O2, Fe3+
O2
Tamao
Rango de temperatura
pH ptimo
Aceptores electrnicos
Tabla 11: Principales caractersticas de Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus

thiooxidans.
Acidithiobacillus ferrooxidans: es el protagonista en los procesos de

biolixiviacin (Norris, 1990; Bosecker, 1997). Esta bacteria fue aislada por
primera vez en 1947 por Colmer y Hinkle de un drenaje cido de minas.
Morfolgicamente es muy similar a At. thiooxidans pero la principal
caracterstica que las diferencia es su capacidad para derivar la energa
tambin de compuestos del in ferroso, por lo que es una bacteria hierrooxidante y esta capacidad la hace partcipe en los distintos mecanismos
implicados en la lixiviacin de minerales ya que regenera el frrico, que es
un importante agente lixiviante. At. ferrooxidans adems no es aerobio
estricto, y es capaz de crecer anaerobiamente en sustratos de azufre bajo
ciertas condiciones empleando Fe(III) como aceptor de electrones (Das y
col., 1992; Pronk y col.; 1992, Leduc y Ferroni, 1994)
Acidithiobacillus thiooxidans: fue aislado por primera vez en 1922 por
Walksman y Joffe, tienen forma de varilla corta, su longitud no supera el
47
ANTECEDENTES
micrn y eventualmente poseen un flagelo polar que les confiere una
movilidad superior a la observada en At. ferrooxidans. Obtienen la energa
necesaria para su metabolismo nicamente a partir de azufre elemental o
de compuestos reducidos de azufre (sulfuros, tiosulfatos). La principal
diferencia con At. ferrooxidans es su menor contenido en GC (guaninacitosina) en su ADN y su imposibilidad para oxidar hierro, lo cual no le
permite la lixiviacin por el mecanismo indirecto, ya que sta involucra la
presencia de Fe(III) y, como consecuencia, no solubiliza algunos minerales
como la pirita y la calcopirita (Norris, 1990).
En la oxidacin de los compuestos de azufre, donde el oxgeno
molecular es el ltimo aceptor de electrones, se forman una serie de
especies
intermedias
(sulfito,
tiosulfato)
que
tienen
diversidad
de
aplicaciones por sus caractersticas reductoras (Donati y Curutchet, 1995).

En presencia de la bacteria, la oxidacin se completa hasta la formacin
de cido sulfrico, lo que provoca una disminucin del pH en el medio que
puede alcanzar valores incluso menores de 1 (Imai, 1978).
La
elevada
produccin
de
cido
partir
de
una
fuente
relativamente barata, el azufre elemental, permite su uso como agente

lixiviante en variedad de situaciones (Imai, 1978; Schrter y Sand, 1992):
descomposicin de rocas, solubilizacin de fsforo procedente de rocas
fosfticas (Donati y Curutchet, 1995) y lixiviacin de metales a partir de
sulfuros minerales (Suzuki, 2001; Gmez y col., 1999).
En cultivo mixto con otras bacterias acidfilas hierro-oxidantes (At.
ferrooxidans o Leptospirillum ferrooxidans) pueden contribuir en la disolucin
de concentrados minerales a travs de la oxidacin del azufre depositado
sobre la superficie mineral que impide el ataque del Fe(III) regenerado por
las bacterias hierro-oxidantes (Sasaki y col., 1998, Giaveno y Donati, 2000,
Falco y col., 2003)
48
ANTECEDENTES
2.2 MECANISMOS
INVOLUCRADOS
EN
BIOLIXIVIACIN DE MINERALES SULFURO.
LA
En los ltimos aos se ha profundizado en el estudio de los

mecanismos involucrados en la biolixiviacin de sulfuros minerales llevada a
cabo por las bacterias azufre-oxidantes
Actualmente existen aplicaciones de estos procesos implantados
comercialmente, como son la recuperacin de cobre, uranio y oro
(Bosecker, 1997; Rohwerder y col., 2003; Suzuki, 2001). Por ello, es importante
conocer los mecanismos que rigen la relacin bacteria-mineral.
La biolixiviacin de minerales sulfuro con bacterias del gnero
Acidithiobacillus ocurre a travs de dos mecanismos: directo e indirecto.
Existe gran diversidad de trabajos que discuten la existencia o no de stos o
que tratan de describir las reacciones o compuestos involucrados en cada
uno de ellos (Suzuki, 2001; Sand y col., 2001; Crundwell, 2003)
2.2.1 MECANISMO DIRECTO

Para que ocurra lixiviacin bacteriana por mecanismo directo debe
existir un contacto directo entre la bacteria y la superficie del sulfuro mineral.
La oxidacin a sulfato tiene lugar mediante una serie de etapas catalizadas
enzimaticamente, que se puede resumir en la siguiente reaccin.
bacteria
MeS + O2
MeSO4
[1]
Donde MeS representa un sulfuro mineral.

En el caso de la pirita, el mecanismo es distinto y se necesita la
intervencin de bacterias hierro-oxidantes, la pirita es oxidada a sulfato
frrico de acuerdo con las reacciones:
bacteria
4FeS 2 + 14O2 + 4H2 O
4FeSO4 + 4H2 SO4
[2]
49
ANTECEDENTES
bacteria
4FeSO4 + O2 + 2H2 SO4
2Fe2(SO4 )3 + 2H2O
[3]
que se pueden resumir en la reaccin:

bacteria
4FeS2 + 15O2 + 2H2O
2Fe2(SO4 )3 + 2H2 SO4
[4]
Existen trabajos de Torma (1971 y 1977) que describen la oxidacin de

algunos minerales sulfuro no ferrosos por parte de At. ferrooxidans: covelita
(CuS), calcocita (Cu2S), esfalerita (ZnS), galena (PbS), antimonita (Sb2S3),
cobaltita (CoS) y millerita (NiS). Las cuales seguirian una reaccin similar a la
descrita en la reaccin [1].
Existen evidencias de que la bacteria tiene que estar en ntimo
contacto con la superficie mineral. El mecanismo de adhesin y el inicio de
la solubilizacin del metal no estn an completamente comprendidos. Si
resulta obvio que la bacteria no se adhiere en cualquier lugar de la
superficie mineral sino que lo hace en lugares especficos de imperfecciones
del cristal y que la solubilizacin del metal es debida a interacciones
electroqumicas.
2.2.2 MECANISMO INDIRECTO

En este mecanismo la bacteria genera un agente lixiviante que oxida
qumicamente al sulfuro mineral. En soluciones cidas este lixiviante es el in
frrico y la solubilizacin del metal se puede describir por la reaccin:
MeS + Fe2(SO4 )3 MeSO4 + 2FeSO4 + S o
[5]
Para mantener suficiente hierro en solucin la oxidacin qumica del

sulfuro metlico debe ocurrir en ambientes cidos, pH inferior a 5. La
cantidad de ferroso formada por la reaccin [5] puede ser regenerada por
la accin de las bacterias hierro-oxidantes (At. ferrooxidans o Leptospirillum
ferrooxidans) que oxidan el ferroso dando lugar a frrico, el cual puede
50
ANTECEDENTES
actuar de nuevo como lixiviante. En este mecanismo la bacteria no
necesita estar en contacto con la superficie mineral. Las bacterias slo
tienen una funcin cataltica ya que aceleran la reoxidacin de ferroso, que
sera mucho ms lenta en ausencia de bacteria. Lacey y Lawson(1970)
muestran que en el rango de pH 2-3, la oxidacin bacteriana de ferroso es
aproximadamente 105-106 veces ms rpida que la oxidacin qumica.
El azufre formado de forma simultnea en la reaccin [5] puede ser
oxidado a cido sulfrico por accin de las bacterias azufre-oxidantes,
reaccin [6], en este caso la reaccin es mucho ms rpida para At.
thiooxidans que para At. ferrooxidans.
bacteria
2 S0 + 3O2 + 2H2O
2H2 SO4
[6]
Un ejemplo bien conocido del proceso de biolixiviacin indirecta es

la extraccin de uranio de minerales; el uranio tetravalente, insoluble, es
oxidado a uranio hexavalente, soluble en agua.
UIV O2 + Fe2(SO4 )3 UIV O2 SO4 + 2FeSO4
[7]
El lixiviante puede ser generado por At. ferrooxidans por oxidacin de

la pirita [4] que est frecuentemente asociada a los minerales de uranio.
Adems del mecanismo indirecto hay evidencias de que esta bacteria
puede oxidar UIV a UVI enzimticamente y empleando parte de la energa
de esta reaccin para la asimilacin del CO2.
Aunque, de forma clsica, la biolixiviacin est basada en la
interaccin de procesos de oxidacin qumicos y biolgicos, se le debe
atribuir una importancia particular al ciclo de ferroso a frrico. En la
naturaleza y en las aplicaciones tcnicas ambos mecanismos, directo e
indirecto, ocurren simultneamente.
51
ANTECEDENTES
2.2.3 DISCUSIN DE LOS MECANISMOS

Como ya se ha referido, existe un debate acerca de la interaccin
de las bacterias hierro-oxidantes y azufre-oxidantes y los minerales sulfuro.
Los defensores del mecanismo directo argumentan que la bacteria posee
un mecanismo biolgico especfico para degradar el mineral y obtener as
energa directamente del mineral. Por otra parte, los autores que se
decantan por el mecanismo indirecto sostienen que son los iones frricos en
solucin los que disuelven el mineral y que la bacteria gana la energa
necesaria para su metabolismo de la regeneracin de los iones frricos
(Crundwell, 2003). El mecanismo directo indudablemente ocurre pero
algunos creen que no es la ruta predominante. Existen argumentos en la
bibliografa que tratan de demostrar la existencia de este mecanismo,
basados en la estequiometra, la adhesin bacteriana o mediciones sobre
la superficie mineral (Hansford y Drossou, 1988) que no pueden resolver el
debate. Crundwell (2003) deduce que la cintica de cada uno de las vas
propuestas parece ser el factor crtico y plantea su demostracin a partir de
un estudio cintico
Sin
embargo,
recientes
publicaciones
realizadas
por
Sand
colaboradores (Sand y col., 1995: Schippers y col., 1996; Sand y col., 1996 y
2001; Rohwerder y col., 2003; Kinzler y col., 2003) dudan sobre la existencia
del mecanismo directo. Estos investigadores defienden que las bacterias
pueden realizar la disolucin del sulfuro por mecanismos de contacto o nocontacto. El mecanismo de no-contacto asume que la bacteria slo oxida
los iones Fe(II) a Fe(III) el cual, posteriormente, ataca al sulfuro mineral y es
reducido de nuevo a Fe(II). El mecanismo de contacto requiere la adhesin
de la bacteria a la superficie del sulfuro y el mecanismo primario para la
adhesin a la pirita es de tipo electrosttico. En el caso de At. ferrooxidans,
exopolmeros de la pared celular contienen iones Fe(III) formando complejos
52
ANTECEDENTES
con dos tipos de residuos de cido urnico, la carga positiva resultante se
adhiere a la carga negativa de la pirita. As, la primera funcin del frrico es
la adhesin, seguida de su funcin como lixiviante del sulfuro al igual que en
el mecanismo de no-contacto.
La principal caracterstica del modelo que describen es que los iones
Fe(III) y/o los protones son los nicos agentes (qumicos) que disuelven un
mineral sulfuro. El mecanismo es estrictamente indirecto y la bacteria tiene
la funcin de regenerar los iones Fe(III) y/o H+ y concentrarlos en la interfase
mineral/agua o mineral/bacteria para aumentar el ataque del lixiviante y
as la degradacin. El factor determinante es la capa de exopolmeros ya
que en ella tienen lugar los procesos qumicos que disuelven el mineral.
Basndose en esto, diferencian dos mecanismos de lixiviacin: va
tiosulfato y va polisulfuros. En general, la disolucin es alcanzada por
combinacin de procesos de ataque de protones y oxidacin. La va de
lixiviacin depende de la especie mineral, el criterio relevante es la
reactividad del sulfuro con los protones, es decir, su solubilidad en cido.
Esta propiedad est directamente relacionada con la configuracin
electrnica. Los sulfuros metlicos cuya banda de valencia es derivada slo
de orbitales del tomo metlico del sulfuro no pueden ser atacados por
protones (sulfuros no solubles en cido). Estos sulfuros se disuelven va
tiosulfato, pertenecen a este grupo la pirita (FeS2), molibdenita (MoS2) y
tungstenita
(WS2).
Aquellos
sulfuros
cuya
banda
de
valencia
est
conformada por orbitales del tomo metlico y del sulfuro pueden ser
atacados por protones (son ms o menos solubles en cido) y lixivian via
polisulfuro. En este grupo estn la esfalerita (ZnS), galena (PbS), arsenopirita
(FeAsS), calcopirita (CuFeS2) y hauerita (MnS2).
La descripcin de estos mecanismos se esquematiza en la figura 6 y
se puede describir como:
53
ANTECEDENTES
A. Va tiosulfato
B. Va polisulfuro
Fe3+
Af, Lf
Fe3+
O2
Af, Lf
MS
Fe2+
H+
O2
MS
Fe2+
M2+ + S2O32(Af, At )
M2+ + H2S+ (H2S2)
Fe3+, O2
(Af, At )
SnO62- , S6
H2Sn2- ,
Fe3+, O2
(Af, At)
Fe3+, O2
S6
Af, At
SO42- + H+
Fe3+, O2
SO42- + H+
Figura 6: Esquema comparativo de los mecanismos de ataque indirecto propuestos por Sand.
(A) Via tiosulfato y (B) Va polisulfuro. (Rohwerder y col., 2003)
Los reactivos recuadrados indican que son los productos mayoritarios del proceso. El nombre de las
bacterias aparece entre parntesis cuando la reaccin no es slo llevada a cabo por las bacterias sino
tambin de forma abitica.
Via tiosulfato: El in frrico ataca al mineral sulfuro mediante la

extraccin de un electrn reducindose a ferroso y obtenindose del
mineral el catin metlico y compuestos de azufre intermedios solubles en
agua. Las bacterias hierro-oxidantes (At. ferrooxidans (Af) y Leptospirillum
ferrooxidans (Lf)) catalizan el reciclado del in frrico en condiciones
cidas. El primer compuesto de azufre liberado es el tiosulfato que es
oxidado por las bacterias azufre-oxidantes va tetrationato y otros
politionatos
para
dar
finalmente
sulfato.
Tambin
puede
darse
la
acumulacin de azufre sino existen bacterias azufre-oxidantes. Para la

extraccin del electrn se concluye que solo las bacterias oxidantes de
ferroso pueden lixiviar sulfuros no solubles en cido en condiciones cidas.
54
ANTECEDENTES
Va polisulfuros: En el caso de los sulfuros solubles en cido la
disolucin se realiza por la accin combinada de la extraccin de
electrones por iones frricos y el ataque del protn, es decir, el enlace del
protn a la parte sulfuro del mineral mediante los electrones de la banda de
valencia. La unin metal-sulfuro en el mineral puede ser rota por el ataque
del protn, despus de que dos protones se hayan unido se libera sulfuro de
hidrgeno. A su vez, el frrico puede oxidar el azufre del mineral liberando
catin sulfuro que dimeriza espontneamente a disulfuro(H2S2) y se oxida,
posteriormente, va polisulfuro y radicales polisulfuro a azufre elemental. La
accin oxidante del in frrico no es prerrequisito para la va polisulfuro, ya
que, en este caso, la unin metal-sulfuro puede ser rota por el ataque de
protones, as que los sulfuros metlicos solubles en cido pueden ser
disueltos por la actividad de las bacterias azufre-oxidantes. En ausencia de
Fe(III), estas bacterias oxidan el sulfuro de hidrgeno liberado del ataque del
protn al mineral a azufre elemental y luego a cido sulfrico, regenerando
as los protones previamente consumidos por la disolucin del mineral.
2.3 FUNCIN DE LAS BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES

EN LA LIXIVIACIN DE MINERALES SULFURO.
En las dos rutas descritas, las bacterias hierro-oxidantes tienen un
papel primordial en la regeneracin de Fe(III), que es el principal agente
lixiviante en este tipo de ambientes cidos. Los microorganismos oxidantes
de ferroso controlan el potencial redox de stos ambientes, el cual se
determina principalmente por la relacin Fe(III)/Fe(II) en solucin.
Por su parte, las bacterias oxidantes de azufre contribuyen a la
transformacin de los compuestos intermedios de azufre a cido sulfrico,
fuente de protones (Schippers y Sand, 1999; Schippers y col., 1999). En el
caso del azufre elemental esta transformacin es llevada a cabo
55
ANTECEDENTES
exclusivamente por las bacterias ya que esta especie es inerte a la
oxidacin abitica en medios cidos. Esto hace que en ausencia o estado
de inhibicin de estas bacterias el azufre elemental se acumule en el curso
del proceso de disolucin del mineral sulfuro. El azufre elemental puede
estar suspendido, en forma de agregados o cristales libres, o formando una
capa sobre la superficie del mineral (Fowler y col., 1999; Mustin y col., 1993).
En este ltimo caso, las propiedades electroqumicas de la superficie mineral
podran cambiar y/o formarse una barrera que reducira la velocidad de
difusin de los iones lixiviantes y el oxgeno para interaccionar con el
mineral, lo cual influye negativamente en la velocidad de lixiviacin.
Las bacterias azufre-oxidantes tienen entonces una doble funcin en
la lixiviacin de minerales sulfuro:
la produccin de cido sulfrico a partir de compuestos de

azufre reducido para la regeneracin de los protones
consumidos en la etapa inicial de la lixiviacin (va polisulfuros).
la eliminacin del azufre acumulado sobre la superficie

mineral.
2.4 ADHESIN BACTERIA-MINERAL

La mayora de las bacterias lixiviantes crecen adheridas a la
superficie de los minerales sulfuro. Se conoce que el proceso de adhesin es
predominantemente mediado por la presencia de sustancias polimricas
extracelulares, conocidas como EPS (del ingls extracellular polymeric
substances) (Sand y col., 2001, Gehrke y col., 1995). Hay suficientes
evidencias que demuestran la funcin de una capa orgnica en la
interaccin bacteria-sustrato. Estas pelculas han sido observadas en clulas
de At. ferrooxidans crecidas en pirita y para comprender su funcin en los
procesos de biolixiviacin se ha estudiado su composicin en este sistema
56
ANTECEDENTES
(Gehrke y col., 1995). Para llevar a cabo la lixiviacin de la pirita, las clulas
de At. ferrooxidans atacan la superficie mineral por medio de sustancias
exopolimricas excretadas (lipopolisacridos) y oxidan el mineral a cido
sulfrico e iones frrico. El ataque primario a la pirita (pH 2) es mediado por
un complejo exopolmero-Fe(III). Se cree que la especie de hierro se une a
subunidades de cido glucurnico, este complejo tiene una carga neta
positiva que interacciona electrostticamente con la carga negativa de la
superficie del sustrato, pirita. La figura 7 representa un modelo de
mecanismo de lixiviacin de la pirita por adhesin de clulas de At.
ferrooxidans.
membrana externa
Medio de lixiviacin
espacio periplasmtico
(O2, Fe3+, Fe2+, SO42-)
membrana citoplasmtica
glbulos de azufre
bacteria
EPS
S2O32Fe2+
Fe3+
pirita
Figura 7: Representacin de lixiviacin por mecanismo de contacto catalizada por una

clula de At. ferrooxidans. La clula queda embebida en la capa de EPS adhirindose a la
pirita por interaccin electrosttica. Durante la oxidacin de tiosulfato y tetrationatos puede
formar agregados de azufre elemental y politionatos en el espacio periplasmtico (glbulos
de azufre) (Rohwerder y col., 2003)
57
ANTECEDENTES
La capa de exopolmeros formando complejos con Fe(III) constituye
un lugar de reaccin en el cual el proceso de disolucin tiene lugar (Fowler
y col., 1999; Tributsch, 1999). Este puede ser interpretado como un
compartimento donde algunas condiciones especiales, aunque todava no
bien conocidas, prevalecen (pH, potencial redox, concentracin de iones,
etc.) (Sand y col., 1999). Existen estudios dirigidos a determinar la correlacin
entre la cantidad de iones frrico que se encuentran dentro de la capa
formada por los EPS y la actividad oxidativa de At. ferrooxidans (Kinzler y
col., 2003). Otros estudios tratan de demostrar la importancia de este tipo de
compuestos realizando estudios con bacterias At. ferrooxidans a las cuales
se les ha desprendido la capa de sustancias exopolimricas. Se observa una
disminucin de la capacidad oxidativa pero en pocas horas la capa de EPS
es producida de nuevo. La adicin de compuestos exocelulares a las
clulas previamente desprendidas de ellos tambin regenera la capacidad
oxidativa en poco tiempo, alcanzando niveles de lixiviacin similares a los
obtenidos con las clulas sin tratar (sin modificar sus EPS) (Sand y col., 2001).
Las clulas que crecen sobre azufre, sin hierro, exhiben una
composicin diferente de sus exopolmeros, constituyen una superficie
fuertemente hidrofbica y no atacan la pirita. En el estudio de sus EPS no se
ha detectado la presencia de acido glucurnico ni frrico pero si un
aumento del fosfato. Por tanto, es evidente que el sustrato influye en la
estructura qumica de los exopolmeros, aunque no todos los mecanismos
de regulacin estn an clarificados.
Considerando las propiedades de superficie de la bacteria, la
adhesin al azufre se piensa que est regida por fuerzas de atraccin de
carcter hidrfobo (Van de Waals), mientras que la adhesin a la pirita es
debida a fuerzas electrostticas.
58
ANTECEDENTES
En ausencia de iones Fe(III) At. ferrooxidans acta del mismo modo
que At. thiooxidans, por oxidacin del azufre. El conocido como mecanismo
directo de lixiviacin de sulfuros metlicos puede no ser ms que la
oxidacin biolgica del azufre elemental formado qumicamente para dar
sulfato.
2.5 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA BIOLIXIVIACIN

La efectividad de la biolixiviacin depende en gran medida de la
eficiencia de los microorganismos y de la composicin qumica y
mineralgica del mineral a ser lixiviado. La extraccin mxima de metal
puede
ser
alcanzada
slo
cuando
las
condiciones
de
lixiviacin
corresponden a las condiciones ptimas de crecimiento de la bacteria.

Entre los factores que intervienen en este proceso destacan:
Nutrientes: Los microorganismos que se emplean para la extraccin
de metales de minerales sulfuro son bacterias quimiolitotrfas, con lo cual,
slo requieren compuestos inorgnicos para su crecimiento. En general, los
nutrientes minerales son obtenidos del medio ambiente y a partir del mineral
lixiviado. Para un crecimiento ptimo es necesaria la presencia de la
cantidad adecuada de hierro, azufre y sales de amonio, fosfato y
magnesio.
O2 y CO2: Para el adecuado crecimiento y actividad oxidativa se
requiere suplemento de oxgeno. En el laboratorio puede ser obtenido por
aireacin o agitacin. A mayor escala, como en las acumulaciones al aire
libre de mineral (dump o heap leaching) el suministro del oxgeno requerido
puede tener ciertas dificultades. El dixido de carbono es la nica fuente de
carbono requerida pero normalmente no es necesaria una adicin externa
de CO2.
59
ANTECEDENTES
pH: es importante el correcto ajuste del pH al valor ptimo para el
crecimiento de la bacteria y su capacidad de solubilizacin. El pH ptimo,
as como el rango de pH, en el que la bacteria trabaja con efectividad
vara de una cepa a otra, por tanto, es importante conocerlos por medio de
la literatura o mediante trabajos experimentales.
Temperatura: El ptimo de temperatura para el crecimiento y la
lixiviacin de las bacterias azufre-oxidantes se encuentra en torno a 30C,
aunque al igual que para el pH existe una gran variabilidad en funcin de la
cepa empleada y del pH al que se encuentre el medio.
Sustrato mineral: La composicin mineralgica del sustrato a lixiviar es
de gran importancia. Un alto contenido en carbonato del mineral puede
aumentar el pH del lquido lixiviado inhibiendo o suprimiendo la actividad
bacteriana. Los bajos valores de pH necesarios para la lixiviacin pueden ser
alcanzados por un aporte externo pero esto puede provocar la formacin o
precipitacin de algunos compuestos (yeso) y afectar al coste del proceso.
La velocidad de lixiviacin depende tambin de la superficie total del
sustrato. Una disminucin del tamao de partcula se traduce en un
aumento del rea superficial dando lugar a una mayor cantidad de metal
producido para una masa igual de mineral.
Metales pesados: La lixiviacin de sulfuros metlicos da lugar al
incremento de la concentracin de metales disueltos en el lixiviado. En
general, las bacterias lixiviantes, y entre ellas las azufre-oxidantes, tienen la
capacidad de tolerar concentraciones relativamente elevadas de metales
pesados (De y col., 1997). Diferentes cepas de una misma especie
presentan sensibilidades muy diferentes a un mismo metal. Por ello, es
importante conocer la tolerancia de las bacterias que se van a emplear en
un proceso de lixiviacin a los metales concretos que se encuentran en el
mineral.
Con
bastante
frecuencia,
estos
microorganismos
tambin
60
ANTECEDENTES
presentan la capacidad de adaptarse a niveles mayores de un metal por
continuos subcultivos a concentraciones incrementadas gradualmente del
metal a estudiar (Novo y col., 2000; Boyer y col., 1998; Baillet y col., 1997 y
1998).
Agentes surfactantes y extractantes orgnicos: estos compuestos
empleados como disolventes en la extraccin generalmente tiene efectos
inhibitorios sobre la lixiviacin bacteriana, principalmente porque disminuye
la tensin superficial y la transferencia de oxgeno.
2.6 TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS DE LAS

BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES
La extensa aplicacin de las bacterias azufre-oxidantes a la
biolixiviacin se debe a su capacidad de oxidacin mediante los
mecanismos ya descritos y a su elevada tolerancia a los metales pesados en
solucin. Esto hecho provoca que una vez lixiviado el mineral, si el metal que
pasa a la solucin est a una concentracin no txica para la bacteria, no
afectara de forma significativa al metabolismo celular, de lo contrario
producira su inhibicin o muerte. Para la aplicacin de estas bacterias a
procesos concretos de lixiviacin es necesario conocer los lmites de
tolerancia de la bacteria frente a los metales presentes en el mineral y a las
condiciones en que se va a trabajar posteriormente, esto permite disear un
proceso que trabaje con concentraciones de metal adecuadas para el
crecimiento y capacidad oxidativa de la bacteria.
Existen muchos estudios dedicados a conocer la tolerancia de estas
bacterias a distintos metales pesados. En su mayora se refieren a
Acidithiobacillus ferrooxidans debido a su tradicional uso en la biolixiviacin
y los numerosos trabajos desarrollados para estudiar el efecto de diversos
61
ANTECEDENTES
parmetros sobre la capacidad de oxidacin del in ferroso de esta
bacteria.
En las tablas 12 y 13 se recogen datos de tolerancia de distintas
cepas de At. ferrooxidans y At. thiooxidans a varios metales pesados. Se
pueden observar que no existen niveles absolutos de tolerancia para los
iones metlicos, ya que dependen de la cepa utilizada y su estado
fisiolgico, su historial previo de exposicin al txico en cuestin y las
condiciones ambientales durante la exposicin, as como el mtodo
utilizado para la determinacin de la toxicidad o la tolerancia. Adems, los
niveles
de
tolerancia
pueden
incrementarse
por
reinoculacin
del
microorganismo a concentraciones ms altas del in txico de manera

progresiva. As, la resistencia ligada a la adaptacin de una especie a un
metal en concreto puede incrementar o disminuir la tolerancia del
organismo a otros metales (Tuovinen y col., 1971). Los mecanismos de
toxicidad de los metales y la resistencia bacteriana son complejos y no
estn completamente comprendidos, no obstante, se han propuesto
algunos mecanismos para ciertos metales (Hutchins y col., 1986).
En los estudios acerca de la resistencia de Acidithiobacillus
ferrooxidans a determinados metales pesados se encuentra una gran
disparidad de datos debidos, principalmente, a que las cepas que se
estudian en cada caso son distintas y a que las condiciones experimentales
de los estudios no son siempre las mismas. Los primeros trabajos acerca de la
tolerancia de At. ferrooxidans a los metales pesados fueron realizados por
Tuovinen y col.(1971) e Imai y col.(1979).
En los ltimos aos, un gran nmero de trabajos se han enfocado al
estudio de la tolerancia natural de esta especie y al aumento de su
capacidad para tolerar un metal por continuos subcultivos en cantidades
iguales o crecientes del metal.
62
ANTECEDENTES
Ion metlico
Cobre
Cadmio
Zinc
Nquel
Cromo
Limite tolerancia
(g/l)
Referencia
4,5
Tuovinen y col. (1971)
0,63
Imai y col. (1975)
Brahmaprakash y col. (1988)
10
Hubber y nStetter (1990)
63,5
Rossi (1990)
10
Leduc (1997)
25
Das y col. (1997)
19
Boyer y col. (1998)
12,7
Novo y col. (2000)
10
Cabrera y col. (2005)
1,12
Imai y col. (1975)
0,112
Rossi (1990)
56,2
Baillet y col. (1997)
10
De y col. (1997)
0,5
Cerruti y col. (1998)
67,2
Novo y col. (2000)
10
10
Trevors y col. (1985)
70
Kondratyeva y col. (1995)
6,5
Rossi (1990)
40
Das y col. (1997)
30
0,006
Tuovinen y col. (1971)
0,06
Imai y col.(1975)
10
Hubber y Stetter (1990)
9,4
Leduc (1997)
19
Chisholm y col. (1998)
58,7
Dew y col. (1999)
35,2
Novo y col. (2000)
30
0,02
Sisti y col. (1998)
3,9
Baillet y col. (1998)
0,4
Tabla 12: Lmites de tolerancia de At. ferrooxidans a distintos iones metlicos
63
ANTECEDENTES
Ion metlico
Limite tolerancia
(g/l)
Referencia
Zinc
39
Sakamoto y col. (1989)
Cadmio
45
Sakamoto y col. (1989)
As(III)
Collinet y Morin (1990)
As(IV)
40
Collinet y Morin (1990)
Fe(II)/Fe(III)
30/10
Sluszny (1995)
Al(III)
10
Sluszny (1995)
Cu(II)
6,5
Matlakosvka y Sklodowska (2001)
Tabla 13: Lmites de tolerancia de At. thiooxidans a distintos iones metlicos
Baillet y col. (1997) estudiaron la tolerancia de una cepa de At.

ferrooxidans exponindolo a un amplio rango de concentraciones de ion
cadmio(II). Una vez encontrado el lmite de tolerancia (56,25 g Cd(II)/l)
expusieron al cultivo a dicha concentracin hasta observar que el tiempo
de oxidacin de ferroso y la produccin bacteriana toman valores similares
a los encontrados para el cultivo sin presencia de metal. A esto lo llaman
cultivo adaptado y, posteriormente, lo suplementan con cantidades
superiores de metal. Se observa que en presencia del in cadmio se
produce una adaptacin gentica, tras varios subcultivos sin aadir metal,
la adicin de cadmio al cultivo provoca una respuesta mejor a la obtenida
cuando se aade metal por primera vez, lo que indica que la exposicin
previa al txico ha generando un cambio permanente en la bacteria. De lo
contrario, si el cultivo, tras varios subcultivos sin presencia del txico, hubiera
respondido de forma similar a cuando se aade por primera vez metal, la
exposicin al txico produce un cambio no permanente o reversible, la
bacteria vuelve a su estado normal cuando el estmulo (metal) cesa,
adaptacin fisiolgica.
En otro trabajo, Baillet y col. (1998) estudiaron la tolerancia al cromo,
en este caso el lmite de tolerancia fue encontrado para 3,9 g Cr(III)/l,
encontrndose que para posteriores subcultivos no mejora de forma
64
ANTECEDENTES
significativa el tiempo necesario para la oxidacin del sustrato ni aumenta la
produccin bacteriana.
Sisti y col. (1998) estudiaron la tolerancia de At. ferrooxidans y At.
thiooxidans al ion cromo (III), observando efecto inhibitorio a partir de los 20
mg Cr(III)/l pero tras varios subcultivos, se alcanza una tolerancia de 0,5 g
Cr(III)/l. Das y col. (1997) presentaron valores de tolerancia para distintas
cepas de esta bacteria al cobre y al zinc. Por distintos subcultivos
consiguieron obtener cultivos adaptados a estas concentraciones con un
tiempo de oxidacin de ferroso similar al de un cultivo control (sin metal).
Existen otros estudios de adaptacin al cobre, Boyer y col. (1998) que
encontraron el lmite de tolerancia a este metal para At. ferrooxidans en 19
g Cu(II)/l, la adaptacin del cultivo les permiti doblar este valor,
alcanzando los 38 g Cu(II)/l. Por otra parte, Novo y col. (2000) presentaron la
inhibicin de una cepa At. ferrooxidans LR para 12,7 g Cu(II)/l. El cultivo una
vez crecido en presencia de este metal se puso en presencia de cobre,
cadmio, nquel o zinc a concentraciones conocidas como toleradas. Slo se
observ una mejora en el crecimiento bacteriano en el cultivo con cobre, lo
cual sugiere la implicacin de un mecanismo de especiacin de la bacteria
en la resistencia a metales. Posiblemente, debido al estrs al que se somete
la clula por la exposicin al metal, se produce un cambio en la ruta de
sntesis de protenas que impide o disminuye la capacidad para resistir otras
especies metlicas.
En algunos de estos trabajos el estudio del lmite de tolerancia se
realiza como paso previo a la utilizacin de esta bacteria como biosorbente
(Boyer y col., 1998, Baillet y col., 1997 y 1998).
65
ANTECEDENTES
2.7 APLICACIONES DE LA BIOLIXIVIACIN

BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES.
CON
La aplicacin de las bacterias azufre-oxidantes en la obtencin de

metales a partir de minerales ha permitido conocer las condiciones
favorables y los mecanismos involucrados en la disolucin de metales. El
desarrollo de investigaciones con minerales simples ha provocado, en
primer lugar, la aplicacin y el estudio de esta capacidad bacteriana a
residuos contaminados habitualmente por
metales (lodos, sedimentos,
suelos) y, en segundo lugar, la aplicacin a escala industrial de los

procesos con resultados ms ventajosos. En este captulo se realiza un
recorrido
general
por
las
tendencias
observadas
en
los
trabajos
desarrollados por distintos autores dirigidos al estudio de los procesos de

biolixiviacin con bacterias azufre-oxidantes en distintos sustratos.
2.7.1 BIOLIXIVIACIN DE MINERALES

La capacidad de las bacterias azufre-oxidantes para la extraccin
de metales a partir de minerales de baja ley ha sido muy estudiada. (Tipre,
2004; Gmez y col., 1999; Donati y col., 1996).
Existen trabajos dedicados al estudio de la lixiviacin de la pirita con
Acidithiobacillus ferrooxidans. Estos procesos se basan en la oxidacin del
Fe(II) a Fe(III) por parte de esta bacteria y el ataque del ion frrico al mineral
(Fowler y col., 1999).
La tendencia en los ltimos aos es la seleccin de una cepa o
consorcio de ellas ms adecuadas para la solubilizacin del mineral,
determinar la cantidad de sustrato necesaria para llevar a cabo este
proceso, as como estudiar el mecanismo responsable del proceso de
lixiviacin.
66
ANTECEDENTES
La biolixiviacin de covelita (CuS) ha sido estudiada en numerosos
trabajos. As, Donati y col. (1996) estudiaron la influencia del sustrato sobre la
biolixiviacin de la covelita empleando cultivos puros y mixtos de At.
ferrooxidans y At. thiooxidans.
En presencia de Fe(II) At. ferrooxidans lo oxida generando Fe(III) que
ataca el mineral hasta que el proceso se ralentiza por la presencia de
jarositas, lo cual no permite una lixiviacin elevada. La lixiviacin en estas
condiciones con At. thiooxidans comienza por la oxidacin qumica del
ferroso y el ataque del frrico a la covelita, que da lugar a cobre soluble y
azufre, que es oxidado por la bacteria. El cido obtenido ataca al mineral y
proporciona un ambiente de bajo pH donde se evita la formacin jarositas.
En presencia de azufre elemental la biolixiviacin se debe al ataque cido,
siendo mayor para At. thiooxidans por su tendencia a crecer hasta un pH
ms bajo, esta bacteria produjo el mayor porcentaje de biolixiviacin.
En un trabajo posterior (Pogliani y Donati, 2000) se intent comprobar
que la biolixiviacin de covelita por la accin de At. ferrooxidans y At.
thiooxidans se poda extrapolar a un sistema ms complejo que un sulfuro
puro (mineral de covelita, magnetita y pirita). El estudio se realiz con
adicin de ferroso o de frrico o ninguno de ellos. Cuando no se adiciona
hierro la mayor lixiviacin es obtenida por At. ferrooxidans, esencialmente
debido a un mecanismo directo, y At. thiooxidans una vez que el hierro
presente en el propio mineral es oxidado por el aire, la bacteria oxida el
azufre formado. Los cultivos inoculados con frrico y el cultivo At.
ferrooxidans con ferroso (oxidacin casi instantnea a frrico) muestran una
disolucin del cobre similar en el tiempo. La extraccin de cobre no fue
mxima, dado que la presencia de frrico produce la precipitacin de
jarositas, impidiendo en cierto grado la solubilizacin. La mayor solubilizacin
se obtuvo para At. thiooxidans suplementado con ferroso, lo cual corrobora
67
ANTECEDENTES
el mecanismo propuesto en el estudio de la biolixiviacin de la covelita
pura.
En un trabajo ms reciente (Falco y col., 2003) se consider la
posibilidad de obtener una mayor lixiviacin de la covelita mediante un
cultivo mixto de At. thiooxidans y la bacteria hierro-oxidante Leptospirillum
ferrooxidans. El estudio tambin se realiz con y sin adicin de ferroso. En
esta ocasin tambin se comprob la mayor lixiviacin para At. thiooxidans
en presencia de ferroso.
Est comprobado que la biolixiviacin de metales procedentes de
minerales est regida en gran parte por la adhesin previa de la bacteria al
mineral (Pogliani y Donati, 1999; Sand y col., 2001; Porro y col., 1997). Por ello
algunos trabajos han sido desarrollados para intentar relacionar ambas
propiedades. Porro y col. (1997) desarrollaron un trabajo para tratar de
establecer
la
relacin
existente
entre
las
propiedades
superficiales
(hidrofobicidad) de At. ferrooxidans y At. thiooxidans crecidos en diferentes

fuentes de energa, no slo con la capacidad de adhesin sino tambin
con la eficacia de biolixiviacin de diferentes sustratos (azufre (S),
molibdenita (MoS2) y covelita (CuS)). Las bacterias crecidas en azufre,
sustrato hidrfobo, se adhieren en gran medida a sustratos de carcter
hidrfobo como la molibdenita y el azufre. At. ferrooxidans crecido en
medios con ferroso present una elevada adhesin a la covelita, un sustrato
ms hidroflico, que cuando es crecido sobre azufre. Se demostr una clara
relacin entre la adhesin sobre diferentes sustratos y la fuente de energa
empleada. Sin embargo, no se observ una relacin tan directa entre las
clulas adheridas y la eficacia de biolixiviacin, el ataque de At. thiooxidans
a la covelita fue elevado a pesar de que no se dio una elevada adhesin
celular.
68
ANTECEDENTES
El estudio de biolixiviacin de minerales no slo se ha realizado sobre
los sulfuros minerales ms comunes. Existen, entre otros, trabajos acerca de
la biolixiviacin de molibdeno a partir de un mineral de cobre (Nasernejad y
col., 1999) o de la lixiviacin de nquel de un sulfuro de nquel poco comn,
Ni3S2 (Giaveno y Donati, 2001).
Los resultados positivos obtenidos en los estudios bsicos de
biolixiviacin de ciertos minerales hace pensar en la aplicabilidad real de
stos y se han desarrollado estudios con el objetivo de conocer las
condiciones ptimas para la biolixiviacin de minerales complejos.
En su trabajo, Gmez y col. (1999) estudiaron las condiciones ptimas
para la biolixiviacin de un mineral complejo mediante un cultivo mixto de
At. ferrooxidans, At. thiooxidans y Leptospirillum ferrooxidans. Se estudio la
influencia del medio nutriente, la agitacin, la densidad de pulpa del
mineral, la adicin o no de dixido de carbono y la temperatura. Los
mejores resultados se obtienen con medio 9K sin hierro, densidad de pulpa
del 5% y agitacin mecnica. La mayor lixiviacin para cobre ocurri a 30C
y fue por ataque directo, para el zinc aumenta con la temperatura y la
disolucin fue mayoritariamente qumica.
Tipre y col. (2004) estudiaron la biolixiviacin de otro concentrado
mineral de cobre, plomo y zinc con un consorcio bacteriano formado por
At. ferrooxidans, At. thiooxidans, Leptospirillum ferrooxidans y organismos
hetertrofos. El experimento en discontinuo mostr para 20% p/v de mineral
la mayor solubilizacin (73% de Cu y 84% de Zn). La extraccin mediante un
sistema en semi-continuo y densidad de pulpa del 25% p/v solubiliz 79% de
Cu y 82% de Zn y la operacin en continuo en un reactor de tanque
agitado obtuvo extracciones del 85,3% y 80% de Cu y Zn, respectivamente.
La biolixiviacin en continuo con la adicin controlada del mineral se prev
69
ANTECEDENTES
como una tecnologa viable econmicamente para la extraccin de
metales de un concentrado mineral.
La capacidad oxidativa de las bacterias azufre-oxidantes tambin se
aplica en procesos de biooxidacin, como en los minerales refractarios de
oro, donde la tarea de estas bacterias es lixiviar los metales constituyentes
del concentrado de minerales que acompaa al metal valioso para
favorecer su extraccin, este proceso est aplicado tecnolgicamente en
algunos lugares (Nestor y col., 2001).
2.7.2 BIOLIXIVIACIN DE LODOS

En las plantas de tratamiento biolgico de aguas se procesan
elevados volmenes de aguas residuales urbanas y de aguas residuales
industriales, lo cual genera una cantidad desmesurada de lodos, que la
mayora de las veces son depositados en el medio ambiente sin tratamiento
previo (incineracin, landfilling, descargas en el mar, aplicacin a suelos
agrcolas (Xiang y col., 2000)). Se ha demostrado que la aplicacin
agrcola de los lodos es un medio factible y efectivo por la aportacin de
constituyentes beneficiosos para el crecimiento de las plantas y, a su vez, la
mejora de las propiedades fsicas del suelo (Chang y col., 1984). Aunque los
lodos de aguas residuales poseen buenas caractersticas fertilizantes, la
presencia de metales pesados restringe su uso. La reduccin de metales
pesados por medio del control de la fuente que los genera es un proceso
caro y complicado ya que, con frecuencia, es difcil identificar las fuentes
de origen de los metales presentes en el lodo por la diversidad de
contribuciones que puede tener una planta de aguas residuales. La
eliminacin de metales antes de la aplicacin a la tierra de los lodos puede
ser una mejor opcin.
Existen varios mtodos qumicos, como la extraccin con AEDT o el
tratamiento con cidos, que han sido aplicados con este objetivo. La
70
ANTECEDENTES
extraccin con AEDT muestra una elevada eficacia de eliminacin para el
Cu, Pb y Cd pero, sin embargo, baja para Fe, Ni y Cr (Jenkins y col., 1981).
En los tratamientos cidos se emplean cidos orgnicos y minerales para
solubilizar metales a bajos pH, se obtienen elevadas eficacias pero las
dificultades de operacin y el elevado consumo de agentes qumicos hace
poco atractivos estos mtodos (Hayes y col., 1980).
Se ha desarrollado y demostrado que los procesos de biolixiviacin
aplicados a este tipo de residuos constituyen una tecnologa prometedora.
En las ltimas dcadas, muchos trabajos han sido dirigidos a investigar la
eficacia de la eliminacin de metales pesados procedentes de lodos
residuales por medio de mtodos de biolixiviacin, empleando bacterias
acidfilas hierro-oxidantes y/o azufre-oxidantes como At. ferrooxidans y At.
thiooxidans (Tyagi y col., 1988 y 1991; Jenkins, 1988; Chartier y Couillard,
1997). Estos procesos pueden disminuir en un 80% los costes si lo
comparamos con un mtodo qumico tradicional. Los distintos estudios
realizados hasta el momento han sido, en su mayora, enfocados a
determinar la influencia de los diversos parmetros que intervienen en la
biolixiviacin.
Algunos estudios previos (Tyagi y col., 1988; Blais y col., 1993) indican
la necesidad de la preacidificacin del lodo a pH menores de 4,5, lo cual
limita su aplicacin industrial por el consumo de cido que esto implica.
Adems, esto puede provocar otros efectos como la acidificacin del suelo
enmendado con lodo. Por otra parte, la biolixiviacin genera un ambiente
fuertemente oxidante y una disminucin del pH que, adems de solubilizar
los metales, digiere gran parte la materia orgnica presente en el lodo, lo
cual puede provocar la prdida de algunos nutrientes que le restan valor
nutritivo al lodo resultante.
71
ANTECEDENTES
Entre los estudios acerca de la biolixiviacin de lodos existen muchos
enfocados a determinar la influencia de algunos parmetros sobre este tipo
de procesos.
As, Wong y col. (2001) estudiaron el efecto del pH inicial en la
biolixiviacin de lodos anaerobios mediante un cultivo indgena de At.
ferrooxidans. Se observ una disminucin del pH de 3-7 a 2,1-2,4 en tan slo
6 das. En cuanto a la biolixiviacin, despus de 16 das de incubacin se
obtuvieron porcentajes de eliminacin bastante elevados: 50,2-78,4 % de Cr,
63,7-74,1% de Cu, 74,9-88,2% de Zn y 15,5-38,6% de Ni.
Xiang y col. (2000) estudiaron la influencia del sulfato ferroso presente
en el medio sobre la biolixiviacin de lodos anaerobios realizada por un
cultivo indgena de bacterias azufre-oxidantes. La biolixiviacin de los
distintos metales fue dispar. La solubilizacin de cromo se mostr
dependiente del crecimiento del cultivo, sin embargo, la solubilizacin del
zinc ocurri en funcin del pH del medio. Cobre, nquel y plomo tras llegar a
un mximo de lixiviacin presentaron fluctuaciones por efectos de
readsorcin o formacin de complejos. Se consigui solubilizar: 70,6 % de
Cr(III), 87% de Zn(II), 91,5% de Cu(II), 54% de Ni(II) y 16% de Pb. Los niveles de
los metales que quedaron en el lodo estaban dentro de los lmites permitidos
por la legislacin.
La solubilizacin en el rango de temperaturas de 20-40C mostr
valores entre 37-41% de Cr, 53-56% de Cu, 63-68% de Ni, 50-59% de Pb y 7785% de Zn. Tras una mayor fase de latencia, los cultivos a 20C alcanzan
valores de solubilizacin similares en torno a los 10 das.
Otros trabajos tratan de estudiar como influye la presencia de slidos
y de una fuente de energa en la biolixiviacin de metales presentes en
lodos por parte de las bacterias azufre-oxidantes.
72
ANTECEDENTES
Lombardi y col. (2001) estudiaron la biolixiviacin del zinc presente en
un lodo con cultivos At. ferrooxidans con y sin presencia de Fe(II), At.
thiooxidans con y sin presencia de S y un control. El porcentaje de
solubilizacin del Zn fue aproximadamente del 85-90% para At. thiooxidans
con azufre y el 80% para At. ferrooxidans con hierro, At. thiooxidans produce
una mayor solubilizacin pero At. ferrooxidans lo realiza en un menor tiempo,
ya que At. thiooxidans requiere una primera etapa de oxidacin de azufre
para producir cido sulfrico para la lixiviacin del metal, mientras At.
ferrooxidans puede solubilizar el metal por ataque del frrico generado por
la oxidacin del ferroso presente en el medio.
Por otra parte, es importante verificar, tras el proceso de biolixiviacin,
como afecta la especiacin qumica a los metales que quedan en el lodo.
Con este objetivo en varios trabajos (Villar y col., 2001; Lombardi y Garcia Jr,
2001) se realizan procedimientos de extraccin secuencial para determinar
el reparto de los metales en cada una de las fracciones del lodo y
determinar la biodisponibilidad del metal residual que permanece tras la
biolixiviacin ya que, en ocasiones, los metales pueden mostrar una mayor
movilidad y afectar en mayor medida al suelo y las plantas, una vez que el
lodo sea aplicado con fines agrcolas, con lo cual, el proceso de
biolixiviacin podra producir un efecto global negativo.
El estudio realizado por Matlakowska y Sklodowska (2001) se dirigi a
evaluar la efectividad de biolixiviacin de cobre y cadmio por un cultivo
puro de At. ferrooxidans o mixto con At. thiooxidans, con distintos sustratos
(azufre, covelita y calcocita) en distintos tipos de lodos (lodos primarios,
lodos
anaerobios,
lodos
deshidratados
lodos
deshidratados
preacidificados). Los lodos anaerobios y deshidratados parecen ser los ms

indicados para ser lixiviados, tras 21 das se alcanz una extraccin del 40-
73
ANTECEDENTES
50% de Cd y Cu. La biolixiviacin en todos los casos fue ms efectiva en el
caso del cultivo mixto suplementado con azufre.
Habitualmente los lodos son sometidos a procesos de incineracin,
esto hace que la idea de biolixiviacin de metales tambin sea trasportada
a este tipo de residuos. Existen diversos trabajos enfocados al estudio de
procesos de biolixiviacin con bacterias azufre-oxidantes sobre las cenizas
resultantes de la incineracin de residuos. Ting y col. (2001) realizaron un
estudio comparativo entre la lixiviacin qumica y la biolixiviacin por At.
ferrooxidans de algunos metales para diferentes densidades de pulpa de
estas cenizas. La lixiviacin qumica para 1% p/v de cenizas con cido
sulfrico 1M (77,5% Al, 42,3% Zn, 15,9% Pb, 7,0% Cu y 26,9% Mn) fue ms
eficiente en el tiempo y la solubilizacin del plomo pero la biolixiviacin con
At. ferrooxidans (75,3% Al, 44,7% Zn, 4,4% Pb, 11,6% Cu y 84,5% Mn) mostr
mayor solubilizacin de cobre y manganeso, los resultados para aluminio y
zinc fueron similares.
Krebs y col. (2001) estudiaron tambin la biolixiviacin de metales
presentes en cenizas con cultivos Acidithiobacillus en funcin de la cantidad
de ceniza presente y de la adicin o no de lodos anaerobios (fuente de
nutrientes, energa y flora indgena). La incorporacin de lodos produce un
aumento de la poblacin bacteriana y un mayor descenso del pH, dando
lugar a un menor tiempo necesario para la solubilizacin. Para densidades
entre 0,5-4%, pH 1-1,5, se obtuvo la solubilizacin del 80% de Cd, Cu y Zn, el
60% de Al, 30% de Ni, 10% de Cr y 5% de Pb, lo que supone el 50% del total
de metales presente en la ceniza.
Otros trabajos se han dirigido a la aplicacin de la biolixiviacin a
residuos concretos, como pueden ser los lodos procedentes de la actividad
industrial. Solisio y col. (2002) aplicaron At. ferrooxidans a la remediacin de
lodos procedentes de dos tipos de industrias, lodos de la produccin de
74
ANTECEDENTES
aleaciones
de
hierro-manganeso
(alto
contenido
en
Zn)
lodos
procedentes de una planta de oxidacin andica de aluminio (alto

contenido en aluminio). En el lodo rico en zinc se present una solubilizacin
del 73% de zinc para un 10% de contenido en lodo, sin embargo, el lodo rico
en aluminio slo present una solubilizacin importante (78-77%) para un
contenido en lodo menor del 3%.
Al igual que los lodos, los sedimentos tambin presentan elevado
contenido en metales pesados. En su trabajo Chartier y Couillard (1997)
presentaron el estudio de los parmetros que influyen en la biolixiviacin de
sedimentos por At. ferrooxidans (pH inicial, % de inculo, incorporacin de
nutrientes). Se observ que la biolixiviacin del cobre dependa de la
presencia de bacteria y la lixiviacin el zinc y el plomo se debi a la
presencia de cido en el medio. En general, se obtuvo una lixiviacin
aceptable del contenido en cobre (60-80%) y zinc (80-90%) pero no para el
plomo (< 30%), el pH afecta la solubilidad de este metal, el nivel de plomo
queda en valores superiores a los permitidos por la legislacin. Otro trabajo
realizado por estos autores (Mercier y col., 1996) se dirige a la mejora de las
condiciones para la solubilizacin del plomo en sedimentos acuticos. Para
evitar una elevada concentracin de sulfato se sustituy el sulfato ferroso
por cloruro ferroso, como fuente de energa para At. ferrooxidans,
obteniendo la solubilizacin de 5 mg Pb/l. Cuando la acidificacin previa
del lodo se realiz con cido clorhdrico en lugar de cido sulfrico se
biolixiviaron 11 mg Pb/l. En contraposicin el bajo contenido en sulfato no
permite el desarrollo adecuado de la bacteria y, por consiguiente, la
eficacia en la solubilizacin de otros metales es menor.
2.7.3 BIOLIXIVIACIN DE SUELOS

La actividad industrial ha provocado una elevada deposicin de
metales pesados y compuestos orgnicos en sus alrededores, siendo uno de
75
ANTECEDENTES
los mayores acumuladores de esta contaminacin el suelo. La complejidad
de la aplicacin de la biolixiviacin con bacterias azufre-oxidantes reside en
que stas son sensibles a bajas concentraciones de una gran variedad de
compuestos orgnicos frecuentemente presentes en el suelo (Tuttle y
Dugan, 1976). Algunos investigadores han tratado de demostrar que
algunas cepas Acidithiobacillus son tolerantes a ciertas sustancias orgnicas
(Zagury y col., 1994) y este hecho ha dado la posibilidad de aumentar la
aplicacin de este proceso a los suelos y sedimentos contaminados.
Gmez y Bosecker (1999) estudiaron la biolixiviacin de metales
pesados de varios suelos con cultivos aislados del propio suelo. El medio
empleado para el crecimiento de los cultivos, el tipo y la cantidad de suelo
fueron los parmetros de estudio. La biolixiviacin fue mayor del 50% de los
metales presentes. At. ferrooxidans logr la solubilizacin total de Cd, Co, Cu
y Ni y At. thiooxidans solubiliz mas del 80% de Cd, Co, Cu y Zn. No se
detect plomo ni bario en el lixiviado, dada la insolubilidad de sus sulfatos
correspondientes.
Gourdon y Funtowicz (1995) aplicaron la capacidad de producir
cido sulfrico de las bacterias azufre-oxidantes para eliminar los metales
pesados presentes en suelos contaminados de un rea industrial. El 80-90%
de los metales (Zn, Pb, Cu y As) esta fuertemente unido a la matriz del suelo,
en la fraccin residual. El proceso de biolixiviacin, que se llev a cabo con
cepas de At. ferrooxidans y At. thiooxidans con y sin suplemento de azufre.
Se elimin 45-50% de zinc y 35-40% de cobre en 90 das, mientras que el
plomo y el arsnico no fueron apenas solubilizados. Los mejores resultados se
obtuvieron para At. thiooxidans con azufre en el medio.
White y col. (1998) tambin realizaron un proceso similar. El estudio de
biolixiviacin se llev a cabo con un suelo contaminado de forma artificial y
un suelo contaminado por la actividad industrial. En el suelo artificial (Cd,
76
ANTECEDENTES
Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Zn) se consigui la solubilizacin de mayor cantidad
de metal que la aadida, es decir, se solubiliz parte del metal mineralizado
en el suelo anteriormente. El porcentaje de biolixiviacin de estos metales
fue del 90-99%, excepto para el plomo (66%) cuya solubilizacin se
mantena incompleta tras 180 das. En el suelo industrial, con alto contenido
en Cu y Ni, se obtuvo una solubilizacin algo menor y la lixiviacin fue ms
lenta debido a que todo el metal est formando parte de la matriz del
suelo, de forma ms arraigada, y a un mayor tamao de partcula de este
soporte.
2.7.4 BIOLIXIVIACIN DE OTROS RESIDUOS

El estudio las bacterias azufre-oxidantes y su aplicacin en residuos
comunes (minerales, suelos, sedimentos, lodos, etc), ha dado lugar a que
algunos investigadores traten de aplicar esta capacidad a residuos ms
concretos o de otro tipo. A continuacin se citan algunos ejemplos.
Idachaba y col. (2004) evalan la lixiviacin del cromo presente en
un residuo procedente de un proceso de estabilizacin/solidificacin
mediante la accin de At. thiooxidans formando una pelcula. El tiempo de
formacin de sta influye de forma positiva en la extraccin. A modo
general, se observ que el 50% del cromo se lixivia en las primeras 24 horas.
Uno de los residuos ms txicos y numerosos que contienen metales
pesados son las pilas. Cerruti y col. (1998) tratan de aplicar la produccin de
cido sulfrico de las bacterias azufre-oxidantes para disminuir el contenido
en metales de las bateras de nquel/cadmio. El trabajo se realiz en
biorreactores con At. ferrooxidans. Tras 93 das, se solubiliz el 100% del
cadmio, 96,5 % de nquel y 95% de hierro.
77
ANTECEDENTES
2.7.5 APLICACIONES INDUSTRIALES

Durante los ltimos 25 aos la biolixiviacin ha abierto nuevas
oportunidades para la extraccin metalrgica y la biohidrometalurgia ha
sido implantada en la industria del cobre y el uranio, especialmente en el
tratamiento de minerales de baja ley (Bosecker, 1997).
Actualmente existen 11 plantas a gran escala que operan procesos
de biolixiviacin en tanque agitado que emplean tres tecnologas diferentes
para procesar concentrados minerales refractarios de metales preciosos y
concentrados de pirita, cobalto y calcopirita (Brierley y Briggs, 2002).
La biolixiviacin en pilas para recuperar cobre se ha convertido en
una prctica comn en la industria. Desde 1980 hasta ahora 13 plantas han
trabajado realizando operaciones de biolixiviacin (tabla 14), pero no todas
estn en la actualidad en produccin, debido al agotamiento de reservas
minerales o, en otros casos, por problemas operativos. Estas plantas
recuperan cobre a partir de la calcocita (Cu2S). El cobre es lixiviado de dos
formas: mediante cido sulfrico pasando a covelita (CuS) o por la accin
del frrico, formado a partir de la oxidacin bacteriana de ferroso. El cobre
en la forma de calcopirita (CuFeS2) lixivia pobremente. Actualmente, se
estn desarrollando nuevas tecnologas empleando microorganismos
termfilos para la biolixiviacin de calcopirita, utilizando pilas o sistemas de
reactor de tanque agitado. La lixiviacin en pilas de la calcocita es llevado
a cabo en aglomerados minerales de tamao de partcula entre 1-4 cm,
que se acumulan en pilas de 6-10 metros de altura y cientos de metros de
ancho y de largo. La lixiviacin es aplicada mediante regado por goteo. La
solucin lixiviada que drena de las pilas es rica en sulfato de cobre y se
enva a un circuito de extraccin para la recuperacin del cobre. La
produccin de cobre est en el rango de 10000-100000 t Cu/ao segn el
tamao de las plantas de operacin.
78
ANTECEDENTES
Planta y localizacin
Tamao (t mineral/da)
Aos en operacin
Lo Aguirre, Chile
16000
1980-1996
Gunpowders Mammoth Mine, Australia
In situ
1991-presente
Mt. Leyson, Australia
1370
1992-1997
Cerro Colorado, Chile
16000
1993-presente
Girilambone, Australia
2000
1993-clausurada
Ivan-Zar, Chile
1500
1994-presente
Quebrada Blanca, Chile
17300
1994-presente
Andacollo, Chile
10000
1996-presente
Dos Amigos, Chile
3000
1996-presente
Cerro Verde, Per
32000
1996-presente
Zaldvar, Chile
20000
1998-presente
S&K Copper, Myanmar
18000
1998-presente
Ecuatorial Tonopah, USA
24500
2000-2001
Tabla 14. Plantas industriales de lixiviacin de cobre. Olson y col. (2003)
En el campo de la biooxidacin, como pretratamiento para la

obtencin
de
metales
preciosos,
la
primera
planta
comercial
de
biolixiviacin en tanque agitado fue abierta en 1986 para el tratamiento de

un concentrado de oro sulfdico. En la Tabla 15 se muestra un listado de las
plantas
de
pretratamiento
de
concentrados
de
oro
refractario.
Normalmente, las plantas de este tipo operan con un 15-20% de densidad

de concentrado. Las plantas emplean mezclas de microorganismos
mesfilos y termfilos, de este modo, la oxidacin de la pirita aumenta en
reas internas de las pilas donde la temperatura puede ser de hasta 81C.
Brierley y Briggs (2002) han publicado una descripcin de los equipos y
procesos empleados en la biooxidacin comercial.
La aplicacin comercial de la biolixiviacin para la obtencin del
uranio a partir de minerales de baja ley se practica desde los aos 60. Las
ms conocidas son las lixiviaciones in situ en las minas subterrneas de
Canad. En ese tiempo la produccin anual era entre 50-60 t de U3O8 (Olson
y col., 2003).
79
ANTECEDENTES
Tamao
Planta y localizacin
(t concentrado/da)
Tecnologa
Aos de operacin
Inicialmente 10
Fairview, South Africa
Expandido a 35
BIOX
1986-presente
Expandido a 40
Sao Bento, Brazil
Harbour Lights, Australia
Wiluna, Australia
Sansu, Ghana
Inicialmente 150
BIOX
Expandido
Eldorado
40
BIOX
1992-1994
BIOX
1993-presente
BIOX
1994-presente
Inicialmente 115
Expandido a 158
Inicialmente 720
Expandida a 960
1990-presente
Youanmi, Australia
120
Bac Tech
1994-1998
Tamboraque, Per
60
BIOX
1990-presente
Beaconsfield, Australia
70
Bac Tech
2000-presente
Laizhou, China
100
Bac Tech
2001-presente
Tabla 15. Plantas comerciales de biolixiviacin en tanque agitado para el pretratamiento de

concentrados de oro. Olson y col. (2003)
La biolixiviacin est siendo utilizada comercialmente slo para la

recuperacin de cobre, uranio y oro, sin embargo, en el futuro estos
procesos se podran convertir en importantes para la recuperacin de zinc,
nquel, cobalto y molibdeno. La infraestructura y los costes de operacin son
mucho ms bajos que los mtodos convencionales pirometalrgicos e
hidrometalrgicos. Las plantas de proceso pueden ser construidas en las
proximidades de los depsitos minerales, salvando as los costes de
transporte. Los procesos no son complejos y son fciles de controlar.
80
ANTECEDENTES
2.8 REDUCCIN DEL Cr(VI) POR LA ACCIN DE LAS

BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES
Los compuestos de cromo tienen varias aplicaciones industriales
como la obtencin de cromita, el galvanizado o el curtido de pieles entre
otras (Lawson, 1997). El cromo es acumulado en el medio ambiente por su
almacenamiento inapropiado o por la disposicin de residuos de forma
inadecuada. El cromo hexavalente es clasificado como un contaminante
primario dada su movilidad en suelos y aguas subterrneas y sus efectos
dainos sobre los seres vivos.
La reduccin de Cr(VI) conduce a la formacin de Cr(III), ms estable
y menos txico, por tanto, este proceso se considera adecuado para ser
implementado como una tecnologa limpia. La reduccin o inmovilizacin
del Cr(VI) puede ser llevada a cabo de forma abitica por distintas
sustancias (Palmer y Wittbrodt, 1991; Namasivayam y Raganathan, 1993,
James, 1996), pero estudios recientes han demostrado la idoneidad del uso
de la reduccin biolgica para el tratamiento de residuos que contienen
cromo (Quintana y col., 2001).
Generalmente, la biorreduccin se realiza en presencia de fuentes de
carbono complejas y, de forma general, los microorganismos realizan la
reduccin en condiciones anaerobias, empleando el Cr(VI) como aceptor
de electrones (Turick y col., 1996). La reduccin del cromo hexavalente con
bacterias aerobias y que no requieren una fuente de carbono supone una
alternativa ms atractiva.
Las bacterias azufre-oxidantes, At. ferrooxidans y At. thiooxidans
obtienen la energa de la oxidacin de una variedad de compuestos de
azufre. La oxidacin de dichos compuestos inorgnicos, en concreto del
azufre elemental, genera una serie de compuestos intermedios de azufre
81
ANTECEDENTES
(sulfitos, tiosulfatos y politionatos) con un alto poder reductor (Steudel y col.,
1987).
La capacidad de los cultivos Acidithiobacillus para reducir el Cr(VI)
en condiciones aerobias ha sido estudiada en algunos trabajos (Baillet y
col., 1998; Sisti y col., 1998; Quintana y col., 2001; Viera y col., 2003).
Aunque
los
completamente
mecanismos
elucidados,
se
de
oxidacin
sabe
que
At.
de
azufre
thiooxidans
no
estn
requiere
glutationato reducido (GSH) como intermedio para la oxidacin de azufre

elemental (Schlegel y Bowien, 1989) y, por tanto, se piensa que At.
ferrooxidans puede actuar de igual modo (Rossi, 1990):
Sn + GSH GSSnH
[8]
El polisulfuro formado es oxidado sucesivamente a diferentes

compuestos como sulfito (ecuacin [9]), tiosulfato, otros politionatos y,
finalmente, sulfato (ecuacin [10]).
2
GSSnH + O2 + H2O GSSn1H + SO3 + 2H+
[9]
1
2
2
SO3 + O2 SO4
2
[10]
Si este mecanismo es correcto, la reaccin [9] genera compuestos

reductores y es responsable de la aparicin de protones en solucin, hecho
que est de acuerdo con algunos trabajos realizados (Quintana y col., 2001;
Viera y col., 2003) donde la reduccin del Cr(VI) viene acompaada de un
aumento de la concentracin de protones en el medio.
Se ha demostrado recientemente que la capacidad de reduccin
del Cr(VI) por las bacterias azufre-oxidantes se puede relacionar con los
compuestos reductores asociados a las partculas de azufre y las clulas
(Quintana y col., 2001). De esta forma, el estudio realizado por Steudel
82
ANTECEDENTES
(1989) indic que el azufre coloidal de los cultivos de Acidithiobacillus se
presenta como una larga cadena de politionatos formando micelas o
glbulos de unas pocas micras.
Con el objeto de estudiar la capacidad de estas bacterias para
reducir el Cr(VI) en distintas condiciones se han llevado a cabo diversos
trabajos. As, Sisti y col.(1998) estudiaron la reduccin del Cr(VI) con At.
ferrooxidans y At. thiooxidans en cultivo discontinuo y formando biopelculas
con las cepas previamente adaptadas al Cr(III). En cultivo discontinuo se
registr inhibicin completa de At. ferrooxidans para concentraciones
mayores de 2 mM, y de At. thiooxidans para concentraciones superiores a 1
mM. La inmovilizacin de las clulas sobre azufre produjo una mayor
reduccin del Cr(VI), llegando At. ferrooxidans hasta 7mM.
En un estudio posterior, Quintana y col. (2001) evaluaron la
capacidad de reduccin del Cr(VI) por At. ferrooxidans a diferentes valores
de pH y en condiciones aerobias y anaerobias. El estudio se realiz
separando el azufre coloidal obtenido del cultivo bacteriano por filtracin,
con el objeto de poner en contacto ste con la solucin de cromo. Se
observ que la habilidad de reduccin del azufre coloidal tiene lugar a un
amplio rango de pH, aunque la reduccin aumenta al disminuir el pH.
Adems se observ que la reduccin fue mayor cuando la fase de
crecimiento del cultivo fue ms avanzada y se demostr la habilidad de At.
ferrooxidans para emplear el Cr(VI) como aceptor de electrones.
Viera y col (2003) presentaron la reduccin de Cr(VI) mediante At.
thiooxidans para diferentes valores de pH y la integracin de este proceso
con la inmovilizacin de Cr(III) por la accin de dos cultivos del gnero
Desulfovibrio. Ambos procesos operaron secuencialmente en condiciones
de flujo continuo permitiendo la transformacin de una solucin de 5 mg/l
de Cr(VI).
83
ANTECEDENTES
3 BIOPRECIPITACIN
CON
BACTERIAS
SULFATO-
REDUCTORAS
3.1 PRECIPITACION DE METALES DISUELTOS
Las aguas residuales generadas como producto de actividades
mineras, el procesado de metales y las industrias petroqumicas se
caracterizan por tener un elevado nivel de metales, sulfato, otras sales y un
bajo pH. Si no son tratadas de forma apropiada estas aguas pueden causar
un serio impacto en el medio ambiente. Adems de los metales y la acidez,
el sulfuro de hidrgeno producido a partir del sulfato en condiciones
anaerobias puede tambin causar efectos nocivos. Por ello, se hace
necesario el desarrollo de mtodos de tratamiento con el objeto de eliminar
los metales, el sulfato y la acidez de estas aguas. Convencionalmente se
han empleado mtodos qumicos, como la neutralizacin con cal, para el
tratamiento de aguas de estas caractersticas. Sin embargo, estos mtodos
se consideran costosos y producen una elevada cantidad de lodos
qumicos que requieren de un posterior tratamiento. Los mtodos biolgicos
de tipo pasivo o llevados a cabo en reactores han venido siendo estudiados
y desarrollados para el tratamiento de estos medios, aunque las
aplicaciones a gran escala son aun limitadas (Tuppurainen y col., 2002).
Entre estos tratamientos se encuentra la bioprecipitacin, una
tcnica que aprovecha la capacidad de los microorganismos para reducir
los metales pesados presentes en un medio pasndolos a un estado de
oxidacin menor dando lugar a compuestos ms estables por su menor
solubilidad y, por tanto, tambin menor movilidad o biodisponibidad. Los
metales pueden ser eliminados biolgicamente por diferentes mecanismos
de precipitacin, ya sea como sulfuros, carbonatos e hidrxidos o por
84
ANTECEDENTES
sorcin sobre la biomasa ocurriendo a veces ambos fenmenos de forma
simultnea.
El proceso biolgico anaerobio de reduccin de sulfato es
potencialmente superior a otros procesos de precipitacin ya que puede
eliminar tanto los metales como el sulfato presentes, siendo uno de los
procesos ms baratos para la eliminacin de metales de aguas residuales
(Bowell, 2000). En el proceso de reduccin de sulfato los metales son
precipitados con el sulfuro producido por microorganismos sulfatoreductores formndose sulfuros metlicos insolubles (Drury, 1999; Groudev y
col., 1999).
Aunque muchos microorganismos generan metabolicamente sulfuro
de hidrgeno, siendo el sulfato un sustrato primario, este proceso sucede a
pequea escala e implica la incorporacin de azufre dentro de la clula y
su consiguiente degradacin catablica. Esta va de produccin de sulfuro
de hidrgeno se conoce como reduccin de sulfato asimilatoria. En
contraste, la reduccin no asimilatoria de sulfato es un proceso directo que
produce 10-100 veces ms sulfuro de hidrgeno y es de gran inters
fisiolgico debido a su similitud con la respiracin de oxgeno y nitrgeno
(Postgate, 1984). La habilidad de las bacterias sulfato-reductoras para
realizar la reduccin no asimilatoria de sulfato ha dado lugar al desarrollo de
gran nmero de investigaciones dirigidas a su estudio general y a su
aplicacin a distintos niveles.
3.2 BACTERIAS SULFATO REDUCTORAS

Las bacterias sulfato-reductoras (BSR) constituyen un nico grupo
fisiolgico de procariotas ya que tienen la capacidad de utilizar sulfato
como aceptor final de electrones en la respiracin. En un principio se
tomaron como una curiosidad pero luego el inters creci por su relacin
85
ANTECEDENTES
con otras formas de vida. En las ltimas dcadas el estudio de los procesos
metablicos de las bacterias sulfato-reductoras ha recibido una atencin
considerable y, a partir de los estudios, realizados se puede decir que stas
son muy similares a otras bacterias y que la caracterstica que ms las
distingue es la forma en que metabolizan el sulfato (Barton, 1995). Las
bacterias sulfato-reductoras estn ampliamente distribuidas en la Tierra, se
sabe que estos microorganismos juegan un papel significativo en la
naturaleza por medio de numerosas interacciones (Figura 8)
Asociacin con
animales
Produccin de
combustibles
Transformaciones
geoqumicas
Tratamiento de
aguas residuales y
pantanos
Biocorrosin
Bacterias
sulfatoreductoras
Bioremediacin
Descomposicin
de alimentos
Ciclos de nutrientes
medioambientales
Figura 8: Interacciones de las bacterias sulfato-reductoras. (Barton, 1995)
Durante un tiempo se pens que slo existan unas pocas especies

sulfato-reductoras y que exclusivamente empleaban lactato o piruvato
para su crecimiento. Sin embargo, en la actualidad se conoce que estas
bacterias tienen capacidad y diversidad para utilizar varios compuestos
como donador de electrones (Hansen, 1993). En un principio tambin se
pens que la nica reaccin inorgnica asociada a estas bacterias era la
86
ANTECEDENTES
reduccin de sulfato, pero actualmente se conoce que interaccionan con
gran variedad de compuestos en su medio ambiente. La figura 9 muestra
algunas de las reacciones de oxidacin-reduccin asociadas a varios
miembros de la familia de las sulfato-reductoras.
H2
S2-
N2
NO2-
CO
e- + H+
SO42-
S0
Compuestos
orgnicos-S
NO3-
NH3
Compuestos
orgnicos-S
O2
CO2
HO
Compuestos
orgnicos-C
H2O2
H2O
Bacterias sulfato-reductoras
Se0
SeO32-
U6+
Fe3+
Seleniometionina
U4+
Fe2+
Hg0
Hg(metil)2
Cr6+
Cr3+
Figura 9: Transformaciones qumicas atribuidas a las bacterias sulfato-reductoras. (Barton,

1995)
Existen tres grupos celulares bsicos de bacterias sulfato-reductoras:

eubacterias gram-negativas, eubacterias gram-positivas y arqueobacterias.
Las bacterias sulfato-reductoras mesfilas y gram-negativas son las ms
ampliamente distribuidas en la naturaleza. Este grupo incluye cinco gneros
que oxidan compuestos orgnicos de forma incompleta a acetato (Tabla
16)
(Desulfovibrio,
Desulfobotulus,
Desulfobulbus,
Desulfohalobium,
Desulfomicrobium) y siete gneros que oxidan compuestos orgnicos de

forma completa a dixido de carbono (Desulfoarculus, Desulfobacer,
87
ANTECEDENTES
Desulfobacerium,
Desulfococcus,
Desulfomonile,
Desulfonema,
Desulfoarcina) (Barton, 1995).

Especie
Cepa
Habitat
Sustrato
Fijacin N2
D. africanus
NCIB 8401
Agua
Lactato
D. desulfuricans
DSM 642
Suelo
Lactato
D. frutosovorans
DSM 3604
Sedimentos de estuarios
Fructosa
NR
D. furfuralis
DSM 2590
Residuos de papel
Furfural
NR
D. giganteus
DSM 4123
Sedimentos
Glicerol
D. gigas
NICB 9332
Agua de laguna
Lactato
D. longus
DSM 6739
Productos del petrleo
Lactato
NR
D. pager
ATCC 29098
Heces humanas
Lactato
NR
D. sulfodismutans
DSM 3696
Barro de agua dulce
Tiosulfato
NR
D. vulgaris
NCIB 8303
Suelo
Lactato
Dbu. marinus
DSM 2058
Barros marinos
Propionato
Dbu. propionicus
DSM 2032
Barro de agua dulce
Propionato
Dsm. apsheronum
AUCCM 1105
Depsitos de petrleo
Lactato
NR
Dsm. Baculatum
AUCCM 1378
Mineral de manganeso
Lactato
Dbo. Sapovorans
DSM 2055
Barro de agua dulce
Butarato
NR
Dh. Retbaense
DSM 5692
Sedimentos de lago hipersalino
Lactato
NR
Tabla 16: Algunas caractersticas de bacterias sulfato-reductoras mesfilas gram-negativas.

NR: no recogida en bibliografa. (Barton, 1995)
3.2.1 CARACTERSTICAS
Las bacterias sulfato-reductoras son bacterias hetertrofas que
requieren condiciones anaerobias estrictas con un poder de oxidoreduccin menor de -200mV. El principal sustrato orgnico empleado como
fuente de carbono y energa para los organismos que tienen mayor
velocidad de crecimiento, como Desulfovibrio sp., es un cido orgnico de
bajo peso molecular como el cido actico y lctico o alcoholes como el
etanol (Postgate, 1984; White y col., 1997). El metabolismo del carbono es
esencialmente similar en todos los casos, el sustrato orgnico es oxidado
completamente a CO2 o de forma incompleta a algn compuesto
88
ANTECEDENTES
intermedio. Se genera un ATP va una cadena de transporte electrnico con
el sulfato como aceptor terminal de electrones que se reduce a sulfuro.
Las bacterias sulfato-reductoras mesfilas tienen su mximo de
crecimiento a pH 6-8, aunque, algunos aislados pueden crecer en
condiciones moderadamente cidas, pH 3-4. En esas condiciones las
bacterias son encontradas en sedimentos y su aparente tolerancia al cido
se deriva de la existencia de un microambiente ms neutral dentro del
hbitat, el cual es mantenido mediante la actividad de las propias
bacterias. Tanto la reduccin de sulfato como la reduccin de metales
utilizan protones contribuyendo a la alcalinidad en el ambiente de la
bacteria (Postgate, 1984).
3.2.2 GNERO Desulfovibrio

Beyerinck (1895) present un aislado de Spirillum desulfuricans y
apunt la importancia de la produccin microbiana de sulfuro de
hidrgeno para su estudio y su aplicacin. La descripcin morfolgica de
esta bacteria deja pocas dudas acerca de que se aisl y caracteriz la
primera especie Desulfovibrio. Muchos investigadores han ampliado el
conocimiento sobre las eubacterias sulfato-reductoras gram-negativas, la
clase a la cual pertenece el gnero Desulfovibrio (Voordouw, 1995).
Postgate (1984) realiz un amplio estudio en el que se incluye el
descubrimiento del citocromo c3. Otros investigadores (LeGall y Fauque,
1988; Peck Jr, 1994) han documentado una amplia variedad de enzimas y
protenas que han sido encontradas en especies Desulfovibrio
y han
sugerido su participacin en el metabolismo de estas bacterias.

Widdel (1991 y 1992) ampli el conocimiento actual de las bacterias
sulfato-reductoras gram-negativas mediante el descubrimiento de otros
gneros en los que se incluyen entre otras: Desulfobulbus, Desulfobacter,
Desulfobacterium,
Desulfococcus,
Desulfomonile,
Desulfonema,
89
ANTECEDENTES
Desulfobotulus y Desulfoarculus. Los avances en biologa molecular han
permitido descubrir la composicin, metabolismo y diversidad de las
bacterias Desulfovibrio en el medio ambiente.
3.2.3 METABOLISMO DE LAS BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS

El metabolismo del carbono por las bacterias sulfato-reductoras
ocurre va mecanismo respiratorio (Hansen, 1993; Postgate, 1984). Los
sustratos empleados incluyen alcoholes, cidos orgnicos, e hidrocarburos,
aunque los alcanos no son metabolizados y los azucares no se utilizan. Sin
embargo, cada cepa slo es capaz de metabolizar un rango limitado de
estos sustratos. La preferencia por los sustratos ha sido empleada para
clasificar las bacterias sulfato-reductoras en tres grupos que pueden diferir
tambin en la velocidad de crecimiento (White y Gadd, 1998).
El grupo hidrogeno-lactato lo constituyen principalmente especies
Desulfovibrio y Desulfomaculum. Utilizan los cidos orgnicos, lactato,
piruvato, succinato, fumarato y malato y pueden emplear tambin etanol
siendo el producto final acetato y/o CO2. Ciertos miembros de este grupo
pueden utilizar hidrogeno como donador de electrones en presencia de
CO2, acetato y otras fuentes de carbono. Es el grupo con crecimiento ms
rpido (t1/2= 3-4 h en lactato).
Un segundo grupo incluye la especie Desulfobacter, bacterias que
son capaces de oxidar completamente acetato a CO2, aunque algunas
pueden emplear lactato o etanol. El rango de sustratos es muy limitado y no
son capaces de emplear hidrogeno como donador de electrones. El
crecimiento es ms lento (t1/2= 20 h).
El ltimo grupo se caracteriza por emplear cidos grasos de mayor
peso molecular que el acetato. Son algunas especies Desulfobulbus y
90
ANTECEDENTES
Desulfovibrio, algunas oxidan slo un nmero limitado de estos sustratos a
acetato y otras oxidan un gran rango de estos cidos grasos hasta CO2. Este
grupo
incluye
algunos
organismos
extremadamente
verstiles
que
degradan compuestos fenlicos como cidos aromticos (Postgate, 1984).
3.2.4 METABOLISMO DEL GNERO Desulfovibrio

El sulfato es el aceptor de electrones preferente de las especies
Desulfovibrio (Voordouw, 1995). ste es reducido a sulfuro mediante una
serie de reacciones en las que intervienen varias enzimas:
SO4
+ ATP + 8H+ int HS + AMP + 2Pi
[11]
Hidrgeno, formato, lactato o piruvato y muchos otros compuestos

orgnicos, incluidos hierro metlico y algunos compuestos del petrleo,
pueden servir como donadores de electrones para la reduccin del sulfato.
El crecimiento quimiolitotrfo de Desulfovibrio con el hidrgeno como
donador de electrones requiere de acetato o CO2 como fuente de
carbono e implica un gradiente de protones del interior al exterior celular. El
primero en describir este proceso fue Badziong y col. (1979). La habilidad
para utilizar hidrgeno como donador de electrones para la produccin de
energa es general en el gnero Desulfovibrio (White y Gadd, 1998).
Cuando lactato o piruvato son empleados como donadores de
electrones, se oxidan de forma incompleta a acetato y CO2, como se
muestra en la reacciones [12] y [13]
Lactato piruvato + 2Hint + 2e

+
[12]
Y el piruvato es oxidado a acetato y dixido de carbono
Piruvato + ADP + Pi acetato + CO2 + ATP + 2Hint + 2e

+
[13]
91
ANTECEDENTES
De este modo, considerando la reaccin de conversin energtica
[14]
AMP + ATP 2 ADP
[14]
y las ecuaciones [11], [12] y [13] se llega a una reaccin que

relaciona dos moles de lactato por mol de sulfato
2 lactato + SO4
2 acetato + 2CO2 + HS
[15]
y combinando [11], [13] y [14] se obtiene para el piruvato:
4 piruvato + 2 ADP + 2Pi + SO4
4 acetato + 4CO2 + 2 ATP + HS [16]
Una gran variedad de alcoholes y aldehdos de cadena corta

pueden servir como donadores de electrones, se ha purificado y
caracterizado la enzima alcohol-deshidrogenasa de la especie Desulfovibrio
gigas (Hensgens y col., 1993) y el gen de la aldehido-oxidasa ha sido
clonado y secuenciado. Tambin se conoce la habilidad de algunas cepas
sulfato-reductoras en zonas industriales para utilizar el hierro elemental como
donador de electrones (Little y col., 1991), este hierro es producido
industrialmente mediante el calentamiento de xidos de hierro en un
ambiente reductor y revierte a su forma oxidada mediante procesos de
corrosin.
Adems de la diversidad de donadores de electrones, las especies
Desulfovibrio pueden utilizar otros aceptores de electrones distintos del
sulfato. Algunas cepas Desulfovibrio desulfuricans pueden reducir nitrato a
nitrito o amonio (Dalsgaard y Bak, 1994). A pesar de considerarse a las
bacterias sulfato-reductoras estrictamente anaerobias, existen especies
Desulfovibrio que pueden emplear oxgeno como aceptor de electrones
(Dilling y Cypionka, 1990). Otros organismos son capaces de reducir
arsenato a arsenito (Ahman y col., 1994) y el Fe(III) ha sido sugerido como un
92
ANTECEDENTES
importante aceptor de electrones para Desulfovibrio sp. en sedimentos
anaerobicos (Coleman y col., 1993).
Las bacterias sulfato-reductoras contribuyen a la reduccin e
inmovilizacin de metales pesados. Las condiciones reductoras creadas por
las sulfato-reductoras generan la reduccin de algunos iones metlicos. En
particular, pueden contribuir a la eliminacin de Cr(VI), convirtiendo
oxianiones como CrO42- a especies catinicas menos txicas como el Cr(III)
que son precipitadas o bioadsorbidas (Fude y col., 1994; Lovley y Philips,
1994), y a la transformacin de U(VI) soluble reducindolo a U(IV) insoluble
(Lovley y col., 1993; Lovley, 1995), se piensa que el citocromo c3
periplasmtico sirve como metal reductasa en todos los casos.
3.3 FUNCION
DE
LAS
REDUCTORAS EN LA
METALES
BACTERIAS
SULFATOBIOPRECIPITACIN DE
La generacin de sulfuros por parte de las bacterias sulfatoreductoras tiene una serie de consecuencias de especial relevancia en la
eliminacin de metales: creacin de un ambiente reductor, eliminacin de
la acidez y precipitacin de metales en forma de sulfuros. Los sulfatos
metlicos se encuentran con frecuencia en aguas contaminadas, como las
aguas cidas de mina, normalmente por la accin de bacterias azufreoxidantes en los ambientes relacionados con la actividad minera. La
presencia de metales en forma de sulfatos tambin es resultado de
procesos metalrgicos como la fundicin de minerales sulfuro (Barnes y col.,
1991; White y col., 1997).
Los productos de solubilidad de la mayora de los sulfuros metlicos
son muy bajos, de modo que la produccin de una cantidad moderada de
sulfuro puede eliminar los metales de forma efectiva, reducindolos a
93
ANTECEDENTES
concentraciones por debajo de los niveles permitidos en el medio ambiente
(Cathorne
Dobbs,
1990).
Adems,
estos
microorganismos
son
necesariamente anaerobios y en estas condiciones los sulfuros son ms

estables (White y Gadd, 1998). Adicionalmente, el aumento de pH puede
resultar en la precipitacin de metales como el hierro y el aluminio su forma
hidrxidos (Weast, 1978).
3.3.1 ADHESIN BACTERIA-MINERAL

Las bacterias sulfato-reductoras generan sustancias polimricas
extracelulares (EPS) que les permiten desarrollarse fcilmente en forma de
pelcula.
Las
EPS
comprenden
una
mezcla
de
polisacridos,
mucopolisacridos y protenas que varan en funcin de la especie y el

cultivo y pueden unirse a metales solubles o partculas finas. Algunos
estudios indican la adhesin de los sulfuros precipitados sobre la biopelcula
formado por las bacterias sulfato-reductoras (White y Gadd, 2000a y b)
Pero las EPS pueden afectar a las caractersticas de superficies
metlicas cuando forman complejos con iones metlicos. La interaccin
bacteria-metal, en este caso, tiene un efecto negativo, por el cual las
bacterias sulfato-reductoras son objeto de estudio en numerosos trabajos
(Beech y Sunner, 2004; Fang y col, 2002). La formacin de estas biopelculas
con frecuencia se da sobre superficies como canalizaciones industriales,
tuberas de aguas residuales o intercambiadores de calor, originando lo que
se conoce como biocorrosin. El sulfuro producido por estas bacterias
causa lo que se conoce como la despolarizacin catdica de hidrgeno y
daa el pasivado de aceros y otros tratamientos de superficies metlicas
acelerando la interaccin andica.
94
ANTECEDENTES
3.4 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA REDUCCION DE

SULFATO
Para llevar a cabo de forma efectiva la reduccin de sulfato por
parte de las bacterias sulfato-reductoras, es necesario controlar una serie de
factores principales, aunque el valor de estos parmetros depende
ampliamente de las caractersticas del medio que se pretende remediar.
Estos factores son:
Nutrientes: Las bacterias sulfato reductoras por tratarse de

organismos hetertrofos, requieren de una fuente de carbono.
Suelen ser cidos orgnicos de cadena corta, alcoholes y
otros
compuestos
menos
comunes.
Algunas
cepas
metabolizan diferentes fuentes, con lo cual es importante

conocer cual aporta un mayor crecimiento bacteriano o una
mayor
actividad
bacteriana
(White
Gadd,
1996).
Habitualmente estas bacterias se encuentran en hbitats

donde cuentan con una fuente de carbono cercana (lodos,
sedimentos). Adems requieren de la presencia de otros
nutrientes esenciales como nitrgeno, fsforo, sales de amonio
y magnesio. Cuando el hidrgeno es empleado como aceptor
de electrones se requiere de dixido de carbono y otros
sustratos como fuente de carbono para la bacteria.
Fuente de energa: habitualmente, la fuente de carbono

tambin acta como donador de electrones.
Aceptor de electrones: para llevar a cabo su actividad es

necesario que exista una proporcin de sulfato suficiente en el
medio. Existen estudios que tratan de relacionar la cantidad
ptima de sulfato o la velocidad de reduccin de sulfato
95
ANTECEDENTES
necesarias para un mayor crecimiento bacteriano (Moosa y
col., 2002). Mantener la cantidad de sulfato adecuada es
importante tambin para evitar la proliferacin de bacterias
metangenicas
que
habitualmente
coexisten
con
las
bacterias sulfato-reductoras compitiendo por el acetato o el

hidrgeno.
Condiciones anaerobias: Las bacterias sulfato-reductoras son

anaerobias estrictas, es indispensable crear un ambiente
anxico que se obtiene por el desplazamiento del oxgeno
presente en el medio mediante una corriente de gas libre de
ste, normalmente nitrgeno, o por el aporte de compuestos
reductores
(acido
tiogliclico,
cido
ascrbico)
que
consumen el oxgeno que pueda quedar en un sistema

cerrado.
pH:
las
bacterias
sulfato-reductoras
crecen
mejor
bajo
condiciones ligeramente alcalinas en un rango de 7,0-7,8 y

toleran valores entre 5,5 y 9,0. El valor ptimo de pH difiere
mucho segn la cepa y del habitat en el que se encuentre
previamente la bacteria ya que habitualmente se pueden
encontrar en efluentes industriales o aguas cidas de mina
(Barton, 1995).
Potencial redox: es un factor clave para el inicio de la

reduccin de sulfato y depende del sustrato orgnico
seleccionado, debe estar por debajo de -200 mV.
Temperatura: Las bacterias sulfato-reductoras mesfilas crecen

mejor entre 28-38 C y su temperatura lmite est entorno a 45
C, aunque tambin existen algunas cepas termfilas. La
temperatura es un factor muy influyente, hay autores que
96
ANTECEDENTES
hablan de cambios estacionales en la reduccin de sulfato en
estudios llevados a cabo en sedimentos (Jorgensen, 1977). El
rango de temperatura ptimo para las bacterias sulfatoreductoras se encuentra en torno a los 30 C.
Composicin del medio: El medio a tratar puede contener

compuestos como carbonatos o fosfatos que pueden influir en
el pH del medio o favorecer el crecimiento de bacterias que
coexistan con este grupo de bacterias.
Ion sulfuro: producto de la reduccin de sulfato, es txico para

las bacterias sulfato-reductoras y otras bacterias anaerobias.
La distribucin del sulfuro en ambientes acuosos en sus diversas
formas (S2-, HS-, H2S) es dependiente del pH. La forma disociada
o libre de hidrgeno (S2-) es la responsable de la toxicidad e
inhibicin de la bacteria. Las bacterias metanognicas son
afectadas a una concentracin de sulfuro de 150 mg/l
aproximadamente (Kalyuzhnyi y col., 1998), mientras que las
sulfato-reductoras tienen relativamente una alta tolerancia al
sulfuro, en torno a 1000 mg/l de sulfuro (libre de hidrgeno)
inhiben a stas bacterias pero solo un 50% (Isa y col., 1986). No
obstante, el sulfuro producido a partir de la reduccin de
sulfato puede aislar a las SRB de los efectos txicos de metales
pesados mediante la precipitacin de stos, un efecto
llamado proteccin sulfuro (Utgikar y col., 2002).
Metales pesados: Los metales pesados presentes en forma

soluble pueden afectar de forma negativa a la bacteria, con
lo cual es importante conocer los mximos niveles permitidos
por la bacteria antes de aplicarlas para la remediacin de un
medio contaminado. Por otra parte, a medida que transcurre
97
ANTECEDENTES
el proceso la cantidad de metal disminuye en el medio por la
propia actividad bacteriana, retirndose a la vez, sulfuro.
3.5 TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS

Muchos metales son txicos a los microorganismos, incluidas las
bacterias
sulfato-reductoras,
ya
que
pueden
desactivar
enzimas
reaccionando con sus grupos funcionales, desnaturalizar protenas y

competir con cationes esenciales (Mazidji y col., 1992). Las concentraciones
de metales pesados txicas para las bacterias sulfato-reductoras estn en
un rango que va desde unas ppm hasta ms de 100 ppm segn la cepa y el
ion metlico. La Tabla 17 recoge las concentraciones txicas de diversos
metales por distintos autores. Por otra parte, en la literatura tambin se
recoge el efecto estimulatorio que producen los metales pesados en
cantidades traza sobre la produccin de sulfuro de hidrgeno.
En los ltimos aos Utgikar y col. (2002 y 2003) han llevado a cabo
varios estudios acerca de la inhibicin y toxicidad que producen los metales
pesados sobre las bacterias sulfato-reductoras. Su estudio se dirigi a
conocer la toxicidad de los metales pesados para la posible aplicacin de
estas bacterias para la reduccin de la contaminacin de las aguas cidas
de mina, disminuyendo la elevada concentracin de sulfato y metales
pesados as como la acidez caractersticas de este tipo de ambientes,
mediante la precipitacin de las especies metlicas en forma de sulfuros.
El objetivo de la investigacin fue determinar el efecto txico y/o
inhibitorio de los metales disueltos sobre un cultivo mixto de bacterias
sulfato-reductoras. La exposicin a un agente externo puede resultar en la
muerte celular (efecto txico) o en la disminucin de la actividad
metablica (efecto inhibitorio).
98
ANTECEDENTES
Metal
Cu
Zn
Cepa SRB
Cd
Ni
Referencia
txica (mg/l)
Cepas Desulfovibrio
20-50
Booth y Mercer (1963)
Cepas Desulfovibrio
Temple y Le Roux (1964)
Cepas Desulfovibrio
2-20
Saleh y col. (1964)
Cultivo mixto
4-20
Hao y col.(1994)
Cultivo mixto
12
Utgikar y col. (2003)
Cultivo mixto
25-40
Hao y col.(1994)
Cultivo mixto
20
Utgikar y col. (2003)
13
Poulson y col.(1997)
Cultivo mixto
75-80
Hao y col.(1994)
Cepa L60
125
Loka Bharath y col.(1990)
Cultivo mixto
>4-20
Hao y col.(1994)
Cepa L60
54
Cultivo mixto
10-20
Hao y col.(1994)
10
Poulson y col.(1997)
Desulfovibrio
desulfuricans
Pb
Concentracin
Desulfovibrio
desulfuricans
Cr
Cultivo mixto
60
Hao y col.(1994)
Hg
Cepa L60
74
Cultivo mixto
20
Hao y col.(1994)
Mezcla (Cr, Ni,Cu,

Cd, Zn, Pb)
Tabla 17: Toxicidad de varios metales pesados sobre bacterias sulfato-reductoras
El estudio se realiz en botes sellados suplementados con cobre (618,5 mg Cu(II)/l) y zinc (6,5-20 mg Zn(II)/l) y en un reactor en discontinuo (1l)
suplementado con 25 mg Cu(II)/l. El estudio en menor escala mostr un
descenso de todas las concentraciones probadas para los dos metales pero
solo llega hasta cero para los niveles menores de metal, encontraron que
los cultivos suplementados con cantidades mayores no precipitaron
totalmente. Para la mayor concentracin estudiada de cobre se insolubiliz
aproximadamente un 16% y para la mayor de zinc un 37%.
99
ANTECEDENTES
Es destacable que la precipitacin ocurre mayoritariamente en las
primeras 50 horas y luego se produce una disminucin de la velocidad de
produccin de sulfuro metlico. Los autores sugieren que esta ralentizacin
se debe a la no disponibilidad de ion bisulfuro, ya que los metales estn
presentes en solucin y, por tanto, se deduce que la velocidad de la
reaccin de reduccin de sulfato tambin disminuye. La inhibicin no
puede deberse a los metales disueltos ya que la concentracin es menor a
la inicial, por ello la hiptesis es que el sulfuro metlico formado inhibe a la
bacteria a travs de un obstculo fsico. El metal precipitado acta como
barrera y dificulta el acceso del par donador-aceptor de electrones al lugar
activo de la bacteria o la enzima. Esta adhesin fue comprobada por
microscopa electrnica. Una ilustracin de este proceso de inhibicin se
representa en la figura 10. Debido a este efecto los bioreactores para el
tratamiento de efluentes, tipo agua cida de mina, debe contar en su
diseo con un dispositivo que permita la sedimentacin y separacin del
sulfuro metlico precipitado.
En un trabajo posterior se desarroll matemticamente una expresin
de velocidad que incorpora los efectos adversos que influyen en la
biocintica de la reduccin de sulfato. La reduccin de sulfato por las
bacterias sulfato-reductoras puede ser representada por una expresin tipo
Monod:
dS
kSX
=
dt K s + S
100
ANTECEDENTES
sustrato orgnico
sulfuro de metal
ion metlico precipitado
sustrato orgnico
ion sulfato
ion bisulfuro
ion sulfato
bacteria
(a) Clula activa
ion bisulfuro
bacteria
capa de sulfuro de
metal precipitado
(b) Precipitacin en torno a la clula
bacteria
(c) Inhibicin celular
Figura 10: Mecanismo de inhibicin de sulfuros metlicos. (Utgikar y col., 2002)
La reduccin del nmero viable de clulas (efecto txico) se traduce

en una disminucin de X, y una disminucin en la velocidad metablica se
traduce en una disminucin de la constante de velocidad k, estos trminos,
dependientes de la cantidad de metal presente en el medio, se expresan:
Efecto txico: X(M)=Xo exp(-KTM)
Efecto inhibitorio: k(M)=ko exp(-KIM)
Incorporando ambos trminos a la expresin se obtiene una
disminucin de la velocidad cuando la concentracin de metal aumenta.
Esta expresin fue aplicada al estudio de la toxicidad del cobre y el
zinc sobre un cultivo mixto de bacterias sulfato-reductoras. Los resultados
mostraron una mayor toxicidad del cobre que del zinc (KT=10,6 y 2,9 mM-1
respectivamente). Las constantes de inhibicin fueron aproximadamente 18
101
ANTECEDENTES
y 25 mM-1 para cobre y zinc, lo que indica que el zinc resulta algo ms
inhibitorio.
3.6 APLICACIN DE LA BIOPRECIPITACIN DE

METALES POR BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS
La posibilidad de eliminacin de metales disueltos en medios cidos
con alto contenido en sulfato mediante el empleo de bacterias sulfatoreductoras ha dado lugar al desarrollo de numerosos trabajos dirigidos a
evaluar los distintos factores que influyen en el proceso, as como estimular
la actividad de estas bacterias. La mayora de los trabajos han sido
desarrollados a escala de laboratorio y planta piloto, algunos enfocados al
desarrollo de este proceso in situ, aunque tambin existen tratamiento ex
situ y algunas aplicaciones industriales (White y col., 1997).
En Hammack y Edenborg (1992) se presenta un estudio llevado a
cabo en un reactor de lecho empaquetado de 900 ml con compost como
soporte de un cultivo de bacterias sulfato-reductoras. Se elimin el 75% del
nquel presente cuando no se cont con una fuente de carbono adicional y
un 95% cuando se aadi lactato al medio.
Con este mismo soporte, Dvorak y col. (1992) llevaron a cabo un
estudio a escala piloto de dos tipos de sistemas para el tratamiento de
aguas contaminadas por metales. El sistema Pittsburg (tres reactores de 200 l
en serie), en el que se elimin la totalidad del hierro y el aluminio, y el
sistema Palmerton (reactor de 4500 l), que elimin la mayora del Zn, Mn, Ni y
Cd del medio.
La aplicacin ms extensa de un proceso empleando las bacterias
sulfato-reductoras es el tratamiento de aguas subterrneas procedentes de
una planta de fundicin de zinc en Holanda. La planta piloto comprende un
reactor de acero inoxidable de 9 m3 con un lecho de lodo. Esta planta
102
ANTECEDENTES
elimin los metales txicos (principalmente zinc) y el sulfato procedentes de
las aguas contaminadas. El reactor emple un consorcio indefinido, pero
seleccionado, de bacterias sulfato-reductoras con etanol como sustrato
orgnico. El proceso fue expandido en 1992 a escala comercial (reactor de
cemento de 1800 m3) con capacidad para tratar 7000 m3/da de agua
contaminada (Barnes y col., 1991).
En su trabajo, Christensen y col. (1996) estudian la posibilidad de un
tratamiento in-situ de las aguas cidas de minas empleando como base
para el proceso material de mina. El objetivo del estudio se centra en
estimular la actividad de las bacterias sulfato-reductoras presentes
aadiendo una solucin sustrato (lactato, protenas, cenizas, cidos grasos)
y la incorporacin adicional de estircol o un inculo crecido de bacterias
sulfato-reductoras. La experiencia suplementada con sustrato e inculo
adicional result la ms positiva, ya que acorta la fase de latencia y mejora
la actividad bacteriana dando lugar a la eliminacin de metales en menor
tiempo.
Elliot y col. (1998) trataron la remediacin de drenajes cidos de mina
con bacterias sulfato-reductoras. Para ello operaron con una columna de
flujo ascendente y su objetivo fue estudiar la influencia de la disminucin del
pH del medio para as alcanzar valores similares a los que se encuentran en
este tipo de medio. Las bacterias toleraron un pH de aproximadamente 3.
El trabajo de Kim y col. (1999) se dirigi tambin a la aplicacin in-situ
de las bacterias sulfato-reductoras. El estudio evala la habilidad de las
bacterias sulfato-reductoras para prevenir la generacin de aguas cidas
de mina procedentes de las pilas de residuos pirticos. En la experiencia,
llevada a cabo en columnas con residuos de mina, se evalu el efecto del
pH del medio. En 30 das se redujo el 80-100% del carbono orgnico total y la
concentracin de metales (Cu, Cd, Ni, Zn). En concreto, para un lixiviado de
103
ANTECEDENTES
pH 2-3 se consigui la alcalinizacin hasta pH 7 en 4 das y se obtuvo un 99%
de eliminacin para cadmio, cobre y zinc y un 87% para el nquel. La
formacin de los sulfuros sucedi en el orden esperado CuS, CdS, NiS y ZnS
de menor a mayor producto de solubilidad.
Por su parte, Foucher y col. (2001) propusieron el tratamiento de
drenajes cidos de minas mediante un proceso en dos etapas. El estudio
lleva a cabo el tratamiento a escala piloto de un agua cida artificial y,
posteriormente, un efluente real de una zona minera. En la primera etapa se
emple un biorreactor de lecho fijo donde se produjo el crecimiento de las
bacterias sulfato-reductoras en condiciones anaerobias. El sulfuro de
hidrgeno generado se dirige a una columna y de all la mezcla gaseosa se
introduce en un reactor de mezcla completa donde se encuentra el medio
contaminado y en el cual se produce la etapa de precipitacin de metales
en forma de sulfuros. En el efluente real la precipitacin de metales se
produjo de forma selectiva: Cu y Zn a pH 2,8 y 3,5, respectivamente, y otros
metales (Ni, Fe) a pH 6.
Un estudio similar para el tratamiento de aguas cidas de mina con
cadmio y cobre fue llevado a cabo por Luptakova y Kusnierova (2002). El
mtodo incluye tres etapas: la produccin biolgica de H2S en discontinuo
en un reactor anaerobio inoculado con Desulfovibrio desulfuricans, la
precipitacin de metales con el H2S generado de forma selectiva (Cu pH 2,8
y Cd pH 3,5) y la separacin de los sulfuros metlicos formados mediante
filtracin por membrana.
La aplicacin de las bacterias sulfato-reductoras tambin se realiza
en procesos combinados cuando el medio contaminado posee otros tipos
de compuestos o txicos adems de sulfato y metales pesados. Groudeva y
col. (2001) presentan el tratamiento de aguas contaminadas con petrleo y
metales pesados. El estudio se realiza en pantanos donde se almacenan
104
ANTECEDENTES
este tipo de residuos. Los pantanos contienen una flora autctona que
incluye distintos hongos y bacterias capaces de degradar los compuestos
de petrleo y a su vez bacterias sulfato-reductoras. stas se encuentran en
la base de los pantanos donde se dan condiciones anxicas y llevan a
cabo la reduccin del contenido en sulfato de las aguas y la eliminacin de
metales pesados (Cd, Cu, Pb, Mn y Fe).
El uso de este tipo de tcnicas in situ, como el tratamiento en
pantanos, va tomando mayor importancia frente a las tcnicas ex situ en
biorreactores. En Gibert y col. (2002) se describe la aplicacin de las
bacterias sulfato-reductoras en barreras permeables reactivas. Las barreras
permeables se instalan en acuferos con un material reactivo adecuado
que induce la realizacin de procesos biolgicos y fsico-qumicos para la
biorremediacin de las aguas subterrneas que fluyen a travs de l. En el
trabajo se desarrollan los distintos aspectos necesarios para el diseo de
esta tcnica.
Tuppurainen y col. (2002) investigaron la eliminacin de zinc y sulfato
de un agua residual sinttica de forma paralela en cuatro reactores de flujo
ascendente a escala de laboratorio. Estudiaron la influencia del soporte, la
adaptacin o no previa al residuo y el contenido en zinc (50 o 200 mg/l).
Durante el proceso el 30-40% del sulfato y sobre el 98% del zinc fue eliminado
y ms de 150-200 mg de H2S fueron producidos en cada reactor. Las
columnas que operaban durante 48 das en presencia del residuo antes de
introducir el metal eliminaron una mayor cantidad en los primeros das pero
al final de la experiencia (150 das) la eliminacin fue similar para adaptadas
y no adaptadas.
Jong y Perry (2003) estudiaron la recuperacin de unas aguas
contaminadas por sulfato, arsnico y varios metales pesados (Cu, Zn, Ni, Fe,
Al, As, Mg) en un reactor anaerobio de lecho empaquetado de flujo
105
ANTECEDENTES
ascendente. El cultivo empleado fue un aislado mixto de bacterias sulfatoreductoras procedente de una zona minera. Realizaron una primera etapa
de adaptacin de 14 das, etapa discontinua, en la que el cultivo se puso
en contacto con el medio contaminado y se estudi el nivel de
precipitacin de los metales para distintas concentraciones (5, 10, 20 y 50
mg/l de cada metal). Esta investigacin demostr la reduccin de sulfato y
eliminacin consecutiva de Cu, Zn, Ni, Fe y As. La eficacia de eliminacin
fue de un 97,5% para Cu, Zn y Ni, >82% para Fe y >77,5% para As, sin
embargo no fue nada efectivo para Mg y Al.
Hulshof y col. (2003) realizaron un estudio con el objeto de evaluar la
efectividad de la adicin directa de virutas de madera o residuos de pulpa
de papel a residuos de mina y la inhibicin potencial de los constituyentes
de los residuos sobre el crecimiento bacteriano. En la columna con residuos
de pulpa de papel se obtuvo una mayor reduccin de sulfato y se requiri
menor tiempo de residencia, posiblemente sea debido al mayor contenido
en nutrientes (N, P, C) de este material. En ambas columnas se obtuvo la
remocin total del zinc (80 mg/l), el presente en mayor cantidad, y de otros
metales.
3.7 INTEGRACIN DE PROCESOS DE BACTERIAS

AZUFRE-OXIDANTES Y BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS
Existen trabajos que tratan de integrar la biolixiviacin de los metales
existentes en un medio y la bioprecipitacin de estos mismos metales
presentes en el lixiviado obtenido.
Con esta integracin se logra extraer los metales presentes en un
medio aumentando su movilidad por la accin de las bacterias acidfilas y,
posteriormente, inmovilizar las especies metlicas para su deposicin de
106
ANTECEDENTES
forma controlada o para su reutilizacin, de esta accin se encargan las
bacterias sulfato-reductoras.
Con este fin, White y col. (1998) presentaron un proceso biolgico
integrado de este tipo, compuesto por una etapa de lixiviacin realizada
por bacterias azufre-oxidantes seguida de la reduccin de sulfato y la
precipitacin de metales presentes en el lixiviado. En el estudio a escala de
laboratorio, emplearon un suelo contaminado artificialmente con metal. A
medida que decreca el pH los metales fueron lixiviados en el orden: Mn, Cr,
Ni, Co, Cd, Zn, Cu, Pb, aunque se dieron periodos donde hubo lixiviacin
simultnea de varios. En la etapa de bioprecipitacin se empleo un reactor
de sedimentacin interna con recirculacin, capaz de retener una elevada
concentracin de biomasa, con un cultivo indefinido de bacterias sulfatoreductoras resistentes a los metales por su exposicin previa a stos en los
ambientes en que habitan. Los metales precipitaron principalmente como
sulfuros aunque tambin se formaron carbonatos e hidrxidos. La
eliminacin de los metales alcanz una eficacia global de ms del 98%.
Groudev y col. (2001) realizaron el tratamiento de tierras agrcolas
contaminadas por elementos radiactivos (uranio, radio, torio) y metales
pesados (cobre, zinc, cadmio) mediante dos mtodos biotecnolgicos
diferentes, el estudio fue llevado a cabo en dos porciones de suelo de unos
200 m2. En ambos mtodos se realiz una solubilizacin inicial de los
contaminantes mediante la accin de la microflora indgena del suelo,
principalmente bacterias auttrofas mesfilas acidfilas y algunas basfilas y
ciertos organismos hetertrofos. En condiciones naturales la oxidacin de los
sulfuros minerales se produce a velocidades relativamente bajas, debido a
algunos factores como son el elevado pH, la limitacin de oxgeno en el
suelo, la insuficiente humedad durante relativamente largos periodos de
tiempo y la ausencia de nutrientes como nitrgeno y fsforo. Para tratar de
107
ANTECEDENTES
mejorar las condiciones de aireacin y humedad se realiz el arado y la
irrigacin del suelo y el aporte de nutrientes necesarios. Tras la solubilizacin,
una de las porciones de tierra se trat mediante un sistema de enjuague y
el efluente procedente del suelo cargado de metales disueltos fue tratado
por un sistema pasivo, como los pantanos, y las soluciones agotadas se
reciclaron al suelo. En la otra porcin, no se lav el suelo y una gran
cantidad de metales qued retenida en las capas ms profundas de suelo,
donde los contaminantes son inmovilizados como resultado de la actividad
de las bacterias sulfato-reductoras que habitan esta zona del suelo. La
actividad de estas bacterias fue estimulada por la inyeccin al suelo de una
solucin de compuestos orgnicos.
Viera y col. (2003) presentaron un proceso combinado dirigido a la
reduccin de Cr(VI) y precipitacin del Cr(III) obtenido. Para ello,
aprovechan la capacidad Acidithiobacillus thiooxidans para reducir de
forma indirecta el Cr(VI). Esta primera etapa fue llevada a cabo en un
reactor de tanque agitado y en ella se obtuvo la reduccin casi total del
Cr(VI) a Cr(III). La solucin de Cr(III) generada pas al reactor de
bioprecipitacin (reactor de tanque agitado), donde las bacterias sulfatoreductoras han sido previamente crecidas en condiciones anaerobias
durante seis das, a partir de los cuales la solucin metlica suplementada
con lactato (4,5 g/l) ingresa en el reactor (75 ml/da). En esta etapa, del
Cr(III) introducido durante 8 das (6 mg) slo 0,3 mg Cr(III) no precipitaron.
El elevado contenido en metales de lodos, sedimentos y aguas
procedentes de la actividad minera e industrial hace pensar en la
necesidad de tcnicas que traten de solventar este problema. El uso de
este tipo de procesos combinados permite, no solo extraer de forma natural
el metal, sino volver a obtenerlo en forma de sulfuro pero fuera del medio
contaminado. La diversidad de medios posibles hace necesario el estudio
108
ANTECEDENTES
en profundidad de cada caso pero, no obstante, una vez sentadas las
bases en las cuales se generan las condiciones adecuadas para la
obtencin del metal, estos procesos muestran una alta aplicabilidad y
versatilidad.
4 INMOVILIZACIN DE CELULAS
4.1 EMPLEO DE LA INMOVILIZACIN
Algunos microorganismos y otros materiales celulares tienen una
tendencia natural a adherirse a superficies y, de esta forma, ser
inmovilizados.
Muchos
biocatalizadores
que
biorreactores
intervienen
avanzados
en
el
requieren
proceso
que
los
(microorganismos,
enzimas,) estn inmovilizados en un soporte slido con el fin de reducir el

lavado celular e incrementar la concentracin de biocatalizador en el
proceso.
Desde
que
se
propuso
la
primera
aplicacin
de
los
microorganismos inmovilizados, se han desarrollado un gran nmero de

procesos de este tipo en diferentes campos: biomdica (produccin de
frmacos y reactivos), biosensores (medida de concentracin de solutos
mediante reacciones catalizadas por enzimas), qumica (produccin de
etanol,
combustibles
gaseosos,),
macromolculas,
produccin
de
alimentos y bebidas, tratamientos de aguas residuales (Scott, 1987).
4.2 MTODOS DE INMOVILIZACIN

La inmovilizacin de microorganismos se puede definir como una
tcnica que limita la libertad de movimiento de las clulas. Esta movilidad
puede ser restringida por una agregacin celular, por adhesin a un soporte
o por atrapamiento. Las tcnicas de inmovilizacin se suelen clasificar en
dos tipos:
109
ANTECEDENTES
Adhesin: los microorganismos se adhieren a la superficie de otros
microorganismos o de un soporte por autoadhesin o por un enlace
qumico.
Atrapamiento:
los
microorganismos
quedan
retenidos
en
los
intersticios de un material poroso o son fsicamente envueltos por una matriz

porosa como un gel o una membrana.
4.2.1 Adhesin
Los mtodos de adhesin aprovechan la capacidad de los
microorganismos
de
adherirse
otros
microorganismos,
formando
agregados, o a superficies slidas. Esta habilidad puede ser natural o

inducida, y constituye la base de una tcnica de inmovilizacin celular de
bajo coste pero efectiva.
La formacin de agregados o flculos ocurre principalmente cuando
se tiene un cultivo con alta concentracin celular en suspensin. Este hecho
ocurre tanto con levaduras (Saccharomyces cerevisiae) como bacterias
(Zymomonas mobilis). La agregacin microbiana puede ser inducida o
mejorada variando las condiciones ambientales, como puede ser la adicin
de polielectrlitos o la aireacin.
En la adhesin a superficies slidas, dependiendo de la naturaleza
del soporte, el enlace entre microorganismo y superficie puede ser el
resultado de interacciones inicas, fsicas, hidrofbicas o de Van der Waals.
El mecanismo de adhesin, aunque no est totalmente elucidado para
todos los microorganismos, en general se debe a la secrecin por parte de
la clula de ciertas macromolculas, como mucopolisacridos, que actan
como adhesivos para iniciar la interaccin microorganismo-superficie.
110
ANTECEDENTES
La principal ventaja de estas tcnicas es su simplicidad y su mayor
inconveniente la posible desorcin de los microorganismos despus de su
utilizacin.
4.2.2 ATRAPAMIENTO
Los mtodos de atrapamiento consisten en el confinamiento de
microorganismos dentro de la red de un polmero, o bien en membranas
semipermeables que presentan poros de un tamao tal que evitan la salida
del microorganismo pero permiten la difusin del sustrato y productos. Estas
tcnicas no dependen de una forma significativa de la naturaleza de las
clulas.
Normalmente
la
encapsulacin
atrapamiento
implica
la
ubicacin de las clulas en los huecos intersticiales de la red de un polmero,

stas se obtienen a partir de sus precursores (monmeros, olgomeros o
polimricos), mediante cambios en las variables de solubilidad (disolvente,
temperatura, fuerza inica y pH).
Desde el punto de vista fsico, la interaccin de microorganismos con
superficies se da en tres etapas sucesivas:
Adhesin reversible debida a energas dbiles.
Adhesin
firme,
denominada
adhesin
irreversible,
que
contempla la formacin de uniones por puentes de hidrgeno

y enlaces inicos.
Secrecin de material extracelular, adhesin ms lenta.
Desde el punto de vista de los microorganismos y una vez producida

la interaccin, el desarrollo y formacin de la pelcula bacteriana se da en
tres pasos.
Adsorcin o inmovilizacin de los microorganismos sobre la

superficie soporte.
111
ANTECEDENTES
Adherencia
consolidacin
de
la
interfase
entre
microorganismos y soporte.
Colonizacin por crecimiento y divisin de los microorganismos

sobre la superficie.
4.3 INMOVILIZACION
OXIDANTES
La
tendencia
natural
DE
de
BACTERIAS
las
bacterias
azufre
AZUFREoxidantes,
Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans para crecer

sobre superficies los convierte en organismos ideales para la inmovilizacin
celular. Un gran nmero de investigadores han tratado de desarrollar esta
capacidad para la mejora de los procesos en los que se ven involucrados
este tipo de microorganismos (Armentia y Webb, 1992).
Con el propsito de mejorar la capacidad
de Acidithiobacillus
ferrooxidans para oxidar ferroso se han desarrollado gran nmero de

trabajos dirigidos a la inmovilizacin de este microorganismo sobre
diferentes soportes y condiciones de operacin. De este modo, se han
usado muchos tipos de reactores, operando tanto en rgimen discontinuo
como en continuo, con el fin de obtener los mejores resultados.
Para la inmovilizacin de At. ferrooxidans se han empleado varias
matrices, existiendo trabajos de adhesin sobre esferas de vidrio (Grishin y
Tuovinen, 1988), resinas de intercambio inico (Karamanev y Nikolov, 1988) o
carbn activo (Grishin y Tuovinen, 1988, Carranza y Garca, 1990, Halfmeier y
col., 1993) y de atrapamiento en alginato, carragenato y perlita (Wakao y
col., 1994, Lancy y Tuovinen, 1984). Otros soportes, como la espuma de
poliuretano (Armentia y Webb, 1992) o la fibra de aleacin de nquel
(Gmez y col., 2000) combinan las ventajas de la adhesin y el
atrapamiento. Este tipo de trabajos se dirigen a la mejora de las condiciones
112
ANTECEDENTES
experimentales para la obtencin de una mayor oxidacin del ferroso, sin
embargo, existen pocos estudios acerca de la inmovilizacin de At.
ferrooxidans con azufre como sustrato, en ausencia de ferroso.
El estudio de Acidithiobacillus thiooxidans no est tan avanzado
como el de At. ferrooxidans, de modo que el nmero de trabajos
desarrollados en cuanto a la inmovilizacin de esta bacteria es mucho
menor. No obstante, la estructura celular y la capacidad para adherirse a
las superficies hacen pensar en la posibilidad de inmovilizacin de esta
bacteria en los mismos soportes que se han estudiado para la otra bacteria.
De este modo, se conocen algunos trabajos sobre At. thiooxidans
inmovilizado sobre azufre para distintos tamaos de partcula (Pogliani,
1999).
4.4 INMOVILIZACION
POLIURETANO
SOBRE
ESPUMA
DE
La espuma de poliuretano ha tomado ltimamente una gran

relevancia como soporte para las tcnicas de inmovilizacin, debido al
elevado nmero de aplicaciones de ste que se recoge en la literatura:
eliminacin de compuestos orgnicos (Manohar y col., 2001, Moe e Irvine,
2001a y b, Hori y col., 2001, Yang y col., 2003), control de olores de residuos
(Burguess y col., 2001), fermentacin de cido actico (de Ory y col., 2004),
eliminacin de hidrocarburos (Holubar y col., 1994), oxidacin de sulfato
ferroso (Armentia y Webb, 1992), etc. En dichos trabajos, se inmovilizaron (o
coinmovilizaron) varios microorganismos dentro de los soportes empleando
diferentes tipos de reactores: tanque agitado, columnas empaquetadas o
biofiltros (de Ory y col., 2005).
La espuma de poliuretano es un material inerte con unas buenas
propiedades mecnicas (alta resistencia y elasticidad) y un bajo coste
113
ANTECEDENTES
comercial. Presenta una alta porosidad (cercana al 97%) y, por tanto, una
alta
superficie
de
adsorcin.
Adems,
este
material
no
sufre
los
inconvenientes de escalamiento que se experimentan con otras matrices

de encapsulacin ya que pueden ser preparados fcilmente grandes
volmenes de este soporte. Otra ventaja importante de este soporte es que
los problemas de difusin de oxgeno se pueden reducir debido al elevado
tamao de poro, hecho que es muy importante para el metabolismo de los
microorganismos aerobios. En la Figura 11 se muestran algunas unidades
cbicas de espuma de poliuretano comercial y una fotografa de
microscopa electrnica de su estructura interna.
Un aspecto a tener en cuenta para la correcta comprensin del
fenmeno involucrado en el proceso de inmovilizacin sobre espuma de
poliuretano es el equilibrio de adsorcin-desorcin en la biopelcula.
Figura 11: fotografa de algunas unidades de espuma de poliuretano y estructura interna

(x50) de la espuma de poliuretano.
Cuando la biopelcula de microorganismos inmovilizados est en

formacin (adsorcin) ocurre simultneamente una prdida continua de
clulas (desorcin), especialmente si el reactor es agitado enrgicamente.
De modo que, debe ser establecida una velocidad de agitacin adecuada
para encontrar un balance satisfactorio entre los dos efectos. Por un lado,
una agitacin vigorosa mejora las condiciones generales de transferencia
114
ANTECEDENTES
de masa a la biomasa sumergida y, como consecuencia, aumenta la
poblacin microbiana total as como el nmero de clulas adsorbidas
dentro del soporte. Por otro lado, los efectos de erosin y las colisiones
pueden aumentar por una agitacin turbulenta frenando seriamente los
procesos de adsorcin de la superficie celular. Al mismo tiempo, la
concentracin de biomasa intersticial (clulas sumergidas en el lquido
retenido dentro de la estructura interna del soporte) constituye una fuente
potencial importante de biomasa para ser inmovilizada por el continuo
equilibrio de adsorcin-desorcin y tiene, adems, una gran importancia en
las sucesivas fermentaciones posteriores.
115
C.-MATERIAL Y MTODOS
MATERIAL Y MTODOS
1 MATERIAL Y MTODOS
1.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS
1.1.1 BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES
Las bacterias azufre oxidantes empleadas en este estudio son cepas
de la coleccin alemana de microorganismos DSMZ, en concreto,
Acidithiobacillus ferrooxidans DSM 11477 y Acidithiobacillus thiooxidans DSM
11478.
1.1.1.2 Mantenimiento de las cepas

El medio de sales empleado para el mantenimiento de ambas
bacterias es de idnticas caractersticas y contiene nutrientes esenciales
tales como magnesio, fsforo, potasio y nitrgeno. La composicin del
medio se describe en la Tabla 18 y es similar al propuesto para el
crecimiento de Acidithiobacillus ferrooxidans en presencia de in ferroso por
Silverman y Lundgren (1959). Este medio sin la adicin de Fe(II) se denomina
medio 0K. El medio ha de ser suplementado con la fuente de energa propia
de cada bacteria, as
Acidithiobacillus ferrooxidans: es una bacteria hierro y azufre

oxidante, es decir, toma energa de la oxidacin de hierro (II) o
de compuestos de azufre reducido. Por tanto, el medio puede
ser suplementado con Fe (II), en forma de sulfato ferroso, o con
azufre elemental.
Acidithiobacillus thiooxidans: al ser exclusivamente azufre

oxidante el mantenimiento consiste en el aporte de las sales
nutrientes y el azufre elemental necesarios.
119
MATERIAL Y MTODOS
Compuesto
g/l
(NH4)2SO4
3,0
MgSO4
0,5
K2HPO4
0,5
KCl
0,1
Ca(NO3)2
0,01
Tabla 18: Composicin del medio de nutrientes para las bacterias azufre-oxidantes.
Mantenimiento con in ferroso

Para el crecimiento de las bacterias azufre-oxidantes con in ferroso
se utiliza el medio denominado como 9K, ya que contiene 9 g/l de Fe (II).
Para la preparacin de un litro de este medio se disuelven las sales del
medio 0K en 1000 ml de agua destilada, se ajusta el pH a 1,8 con H2SO4 5M y
se esteriliza en autoclave (121C, 20 min). Posteriormente, se disuelve el in
ferroso (44,8 g FeSO47H2O) en 300 ml del medio preparado, se ajusta a pH
1,8 y se esteriliza mediante un sistema de filtracin a vaco. Por ltimo, se
incorpora la disolucin estril de ferroso al medio 0K reservado y se conserva
a 4C.
El mantenimiento de la cepa en volumen final de 100 ml consiste en
la adicin de 90 ml de medio 9K en un matraz estril de 250 ml. Este volumen
se inocula con 10 ml de cultivo en fase exponencial de crecimiento y se
incuba en un agitador a 30C y 150 rpm.
Mantenimiento con azufre elemental
La preparacin del medio de crecimiento requiere preparar el
volumen necesario de medio 0K, ajustado a pH 1,8 para At. ferrooxidans
pH 2,5 para At. thiooxidans. A continuacin, se procede a la esterilizacin en
120
MATERIAL Y MTODOS
autoclave (121C, 20 min). Por ltimo se esteriliza el azufre elemental en
microondas (3 pulsos de 30 s).
Para el mantenimiento de la cepa en un volumen final de 100 ml se
depositan 90 ml de medio 0K en un matraz estril de 250 ml y se le aade 1
g de azufre elemental. Posteriormente, se inocula con 10 ml de cultivo en
fase exponencial de crecimiento y se incuba en un agitador a 30C y 150
rpm.
Debido a que los experimentos se han realizado tomando como
fuente de energa el azufre, el mantenimiento se realiz siempre en
presencia de ste. Los cultivos de At. ferrooxidans crecidos en hierro que se
emplean en una experiencia con azufre como nica fuente de energa,
necesitaron de subcultivos continuados en azufre para eliminar por
completo la presencia de hierro.
Seguimiento de las cepas
El azufre elemental, por su carcter hidrofobo, se mantiene en la
superficie del cultivo cuando lo incorporamos al medio. A medida que se va
consumiendo por la accin de las bacterias pasa a formar una suspensin
coloidal (Figura 12).
Los cultivos de bacterias azufre-oxidantes han de ser refrescados, es
decir, se ha de renovar su medio de crecimiento cuando se han alcanzado
valores constantes de pH y poblacin celular. Dicha renovacin no se ha de
realizar cuando hay agotamiento de sustrato, ya que esto suele ocurrir a un
pH muy bajo y provoca situaciones de estrs a las clulas dando lugar a
cultivos posteriores con una larga fase de latencia y de baja poblacin
bacteriana.
121
MATERIAL Y MTODOS
Figura 12: Medio 0K suplementado con azufre y At. ferrooxidans y At. thiooxidans crecidos en
dicho medio (5 das)
Los cultivos se encuentran en la fase exponencial de crecimiento

cuando alcanzan un valor de pH igual a 1,0, aproximadamente, y la
poblacin bacteriana se encuentra en torno a 1 108 clulas/ml. En este
momento se encuentran en condiciones idneas para ser utilizadas como
inculo de las distintas experiencias que se deseen realizar.
Para cultivos crecidos con in ferroso como fuente de energa, se
renueva el medio cuando la concentracin de Fe(II) en el medio es de
aproximadamente 20 mg/l. La determinacin de la concentracin de este
in se realiza por el mtodo de la 1,10-fenantrolina propuesto por Vogel
(1989).
1.1.2 BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS

Las bacterias sulfato-reductoras empleadas fueron Desulfovibrio
vulgaris ATCC 29579 y Desulfovibrio sp. ATCC 49975, siendo esta ltima un
cultivo mixto de varias cepas de ste gnero.
122
MATERIAL Y MTODOS
1.1.2.2 Mantenimiento de las cepas
Los medios para la conservacin y el crecimiento de estas bacterias
fueron propuestos por Postgate en 1979. Debido al carcter anaerobio de
estas bacterias, su mantenimiento es ms complejo y se pueden distinguir
dos medios diferentes en funcin de la finalidad que se le vaya a dar al
cultivo: el medio Postgate B para el mantenimiento y el medio Postgate C
para el crecimiento y la realizacin de experimentos que requieran una
elevada reduccin de sulfato.
Medio de mantenimiento
El medio Postgate B se caracteriza porque no facilita la produccin
de biomasa en elevadas cantidades pero contiene compuestos reductores
que producen la anaerobiosis de este. La composicin del medio Postgate
B se presenta en la Tabla 19
Compuesto
g/l
KH2PO4
0,50
NH4Cl
CaSO4
Mg SO4
Lactato de sodio
3,5
Extracto de levadura
FeSO47H2O
0,5
cido ascrbico
0,1
cido tiogliclico
0,1
Tabla 19: Composicin del medio Postgate B
Para
su
preparacin
se
realiza
el
siguiente
procedimiento
experimental, se incorporan los compuestos en el orden descrito en la Tabla
123
MATERIAL Y MTODOS
19 excepcin de los cidos, se preajusta el pH a 7 con NaOH o KOH 2N y se
aaden los compuestos reductores (cido tiogliclico y cido ascrbico). A
continuacin, se vuelve a ajustar el pH a 7,0-7,5 y se preparan botes de
vidrio de 10 ml, con tapn de goma y virola metlica (tipo penicilina) para
asegurar el sellado hermtico. Posteriormente, se fracciona el medio
depositando 9 ml en cada bote y cerrndolo inmediatamente. Durante este
tiempo es necesario mantener el medio en agitacin para evitar que se
forme un precipitado coloidal y para favorecer la accin de los compuestos
reductores. Se debe proceder al sellado de los botes con la mayor urgencia
posible. Finalmente, se esterilizan a 121C durante 20 minutos y se mantiene
a 4C hasta su uso.
Para realizar los subcultivos, se utilizan frascos ya esterilizados con
medio Postgate B y se desinfectan con alcohol en la zona donde se va a
introducir el inculo, as como aquellos que se utilizan como inculo. Se
toma 1 ml de cultivo crecido en Postgate B y se inyecta en un frasco con
medio fresco teniendo especial cuidado de no introducir aire. Esta
operacin se realiza por triplicado y se incuban de forma esttica a 30C.
Seguimiento de las cepas
La presencia de sulfato ferroso en el medio provoca que las bacterias
reduzcan ste, dando lugar a sulfuro ferroso, que se caracteriza por ser un
precipitado negro (Figura 13). La presencia de este precipitado suele ocurrir
a las 24-48 horas y nos indica el ptimo crecimiento de estas bacterias. En
este momento se puede realizar un recuento de la biomasa para
comprobar el crecimiento y se mantienen los cultivos a 4C.
La actividad de la cepa se mantiene durante 20 das, tras los cuales
es necesario realizar un nuevo cultivo.
124
MATERIAL Y MTODOS
Figura 13: Medio Postgate B y Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp. crecidos en medio
Postgate B (48 horas).
Medio de crecimiento
El medio Postgate C se caracteriza por no contener compuestos
reductores y se emplea cuando se persigue un crecimiento bacteriano
elevado. Este medio permite una mayor reduccin de sulfato y es una
modificacin del propuesto por Postgate (1984) ya que omite la adicin de
sulfato ferroso y cido ctrico, con el objetivo de facilitar la precipitacin de
los iones metlicos de inters. Su composicin se detalla en la Tabla 20
Compuestos
g/l
KH2PO4
0,50
NH4Cl
Na2SO4
4,5
CaCl 6 H2O
0,06
MgSO4 7 H2O
0.06
Lactato de sodio
Extracto de levadura
Tabla 20: Composicin del medio Postgate C modificado.
125
MATERIAL Y MTODOS
Para la preparacin del medio Postgate C, se aaden los
compuestos en el orden descrito en la tabla 20, se ajusta el pH a 7,5 con
NaOH KOH 2N y se esteriliza en autoclave (121C y 20 minutos). Una vez
enfriado se conserva a 4C durante un tiempo limitado ya que es un medio
rico y pueden aparecer contaminaciones.
La inoculacin de bacterias sulfato-reductoras en medio Postgate C
se realiza utilizando un bote estril de 100 ml con un volumen de 90 ml de
medio. A continuacin, se hace pasar una corriente de gas inerte
(normalmente nitrgeno), que pasa previamente por un filtro, durante 5-10
minutos.
Al mismo tiempo, se utiliza un cultivo crecido en Postgate B y se filtra
con papel Whatman n4 para eliminar los precipitados de sulfuro ferroso y se
realiza una nueva filtracin a vaco con membrana de 0,22 m. Las clulas
retenidas se resuspenden en 10 ml de medio Postgate C y se aade al
medio contenido en el bote, sin dejar de pasar la corriente gaseosa.
Despus de 5 minutos, se retira el aporte gaseoso, se procede a cerrar y
sellar el bote, para cultivar en estufa a 30C.
Seguimiento del cultivo
El crecimiento del cultivo se puede comprobar de forma visual,
observando el espesamiento del medio y la concentracin celular en forma
de mucosidad (Figura 14). El seguimiento cuantitativo del crecimiento se
realiza con el control de varios parmetros como son la concentracin
celular, el pH y la concentracin del sulfato residual en el medio. Se suele
observar crecimiento favorable hasta unos 14 das.
126
MATERIAL Y MTODOS
Figura 14: Medio Posgate C y Desulfovibrio sp. crecido en este medio (14 das)
1.2 MTODOS DE ANLISIS

1.2.1 pH Y POTENCIAL REDOX
La medida de estos parmetros se realiz mediante un electrodo de
plata (CRISON 52-02) empleando un pHmetro CRISON micropH 2002.
1.2.2 CONCENTRACIN CELULAR

1.2.2.1 Bacterias en suspensin
Para la determinacin de la poblacin bacteriana se utiliz el
mtodo directo de recuento en microscopio ptico mediante una cmara
Neubauer (Gmez, 1997).
La cmara Neubauer es un dispositivo similar a un portamuestras, con
la diferencia de que cuenta con una cuadrcula en su zona central. La
cuadrcula aloja un volumen de 1
l de la muestra. Utilizando los objetivos
adecuados es posible contar las unidades celulares situadas sobre la zona

cuadriculada.
En este caso se emple un microscopio ptico Olympus BH-2 que
dispone de oculares con 15 aumentos y objetivos de 4, 10, 20, 40 y 100
127
MATERIAL Y MTODOS
aumentos.
Previo
la
medida
se
requiere
realizar
la
dilucin
correspondiente para tener una concentracin a la que puedan distinguirse

y contarse las clulas. Las diluciones se realizaron con el medio de cultivo
caracterstico de cada cepa para no someter a unas condiciones
desfavorables a las clulas que puedan provocar la muerte celular y, por
tanto, un recuento errneo. El recuento se llev a cabo considerando ocho
casillas, no siempre contiguas, tomadas de la diagonal de la cuadrcula. La
concentracin celular se obtiene aplicando la siguiente expresin:
[Celular ] = n de clulas contadas factor de dilucin 4 10
n de casillas consideradas
Mcel
ml
Los recuentos celulares se realizaron por duplicado para disminuir los

posibles errores en la determinacin experimental.
1.2.2.2 Bacterias inmovilizadas

Los procesos de inmovilizacin de bacterias acumulan una elevada
concentracin de stas en los intersticios del soporte y adheridas en l. Para
realizar una estimacin de la concentracin de clulas que existe se ha de
realizar el recuento de la biomasa ocluida y la biomasa adherida.
Biomasa ocluida
Se toman varias unidades de soporte y se elimina el lquido intersticial
de cada una de ellas realizando presin con pinzas Millipore. En las
suspensiones obtenidas se realiza el recuento celular por cmara Neubauer
y se toma un valor medio.
Biomasa adherida
Cada una de las unidades de soporte se deposit en un recipiente
de 25 ml y se le aade un volumen exacto del medio de cultivo utilizado
para el crecimiento de la bacteria a un pH similar al que se encuentra en la
muestra (10 ml). Se introducen en un bao de ultrasonido (vetrasons-H
128
MATERIAL Y MTODOS
selecta) durante 15 minutos. Las bacterias adheridas se desprenden de la
superficie del soporte y pasan al medio lquido. Se realiza el recuento celular
de cada una de las muestras. Los soportes se secan en estufa (80 C, 24
horas) y se pesan en balanza analtica. La biomasa adherida se expresa
como Mclulas/miligramos de soporte.
Mcelulas
10 ml
Mcelulas
=
ml
mg de soporte mg de soporte
1.2.3 CONCENTRACIN DE PROTONES

La medida de la concentracin de protones en el medio se realiz
mediante una valoracin con hidrxido sdico 0,02 N factorizada con
biftalato potsico.
1.2.4 CONCENTRACION DE SULFATO

La concentracin de sulfato en el medio se realiz mediante el
mtodo
turbidimtrico
clsico
(Clesceri
col.,
1989)
con
algunas
adaptaciones. Este mtodo consiste en la reaccin del ion sulfato con

cloruro de bario para dar sulfato de bario, que se caracteriza por formar
una suspensin blanca que enturbia el medio acuoso. La medida de esta
turbidez se relaciona con la concentracin de sulfato.
El protocolo a seguir para la realizacin de esta medida requiere
preparar patrones entre 20 y 100 ppm de sulfato. Para ello se utiliza una
disolucin de 1000 ppm de sulfato de sodio.
Las muestras se centrifugan durante 2 minutos o se filtran por
membrana de 0,22 micras para evitar la interferencia de otros componentes
en la medida.
Tanto los patrones como las muestras se llevan a un volumen final de
25 ml en matraces aforados, el contenido de stos se deposita en tubos de
129
MATERIAL Y MTODOS
vidrio de 40-50 ml, para facilitar la agitacin. A continuacin se aade 1 ml
de una solucin tampn (45 ml de H2O destilada, 4,5 ml de HCl
concentrado, 15 ml de etanol absoluto, 7,5 ml de glicerina y 11,25 g de
NaCl), se agita y se aade una punta de esptula de BaCl2. La mezcla se
agita un minuto en vortex (Heildolph REAX2000) y se deja reposar otro
minuto. La medida se realiz en un espectrofotmetro Hewlett-Packard 8453
a una longitud de onda de 450 nm.
1.2.5 CONCENTRACION DE IONES METLICOS

La
concentracin
de
iones
metlicos
se
determina
por
espectroscopia de emisin atmica por plasma de acoplamiento inducido.

El espectrmetro empleado fue un Iris Intrepid de Thermo Elemental. Antes
de realizar la medida se requiere realizar un procedimiento para la
adecuacin de la muestra. Para ello, se toma la muestra con jeringa de 10
ml y se filtra por un filtro de jeringa de nylon de 0,22 micras (ALBET-JNY-02025-100) para separar el metal no soluble y las bacterias que pueden influir en
el deterioro de la muestra antes de su medida.
A continuacin se diluye la muestra filtrada en agua destilada o en el
medio en que se encuentra hasta un volumen total de 3 ml, de modo que la
medida quede dentro de la recta de calibrado preparada y supere el lmite
mnimo de deteccin.
Posteriormente, se acidifica con cido ntrico (60%) para conservar la
muestra a un pH menor a 2, en el caso de que sea necesario.
Esta mezcla se conserva a 4C hasta el momento de la medida.
El procedimiento de medida realiza la media de tres lecturas de
cada muestra.
130
MATERIAL Y MTODOS
1.2.6 CONCENTRACION DE CROMO HEXAVALENTE

La determinacin del Cr(VI) se realiza por el mtodo de la
difenilcarbazida (Clesceri y col, 1989).
Para ello, en matraces aforados de 5 ml se preparan patrones entre
0,5 y 1 ppm de Cr(VI) a partir de una disolucin de 1000 ppm de dicromato
potsico. Se prepara un blanco con agua destilada de igual volumen.
Las muestras se llevan a un volumen de 5 ml en matraces aforados de
modo que su medida entre en el rango de determinacin y a continuacin
se vierten estas muestras en tubos de 10 ml y se acidifica con una gota de
cido sulfrico concentrado.
Se aaden 0,25 ml de difenilcarbazida (0,1 g en 20 ml de acetona) y
se agita en vortex para favorecer la reaccin. Tras diez minutos en reposo, la
medida se realiza en un espectrofotmetro a una longitud de onda de 540
nm.
1.2.7 PREPARACIN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPA

ELECTRNICA
La visualizacin de las bacterias empleadas as como de las
experiencias realizadas sobre distintos soportes (espuma, precipitados
metlicos) se realiz en un microscopio electrnico Quanta 200 previo
pretratamiento de las muestras.
La toma de la muestra se realiza de distinta forma en funcin de su
estado:
Muestras slidas: se centrifugan y se deposita el pellet en un

tubo de 5 ml (si es muy grande se separa en varias porciones)
Muestras lquidas: las bacterias en suspensin, se concentran y

se depositan sobre un cubreobjetos tratado con polilisina
131
MATERIAL Y MTODOS
durante 10 min. La polilisina se deposita previamente y se retira
el exceso antes de poner la muestra con papel absorbente.
Los cubreobjetos (20 mm) se colocan en un recipiente
diseado para ello donde quedan almacenados en vertical.
A continuacin se procede a la fijacin con glutaraldehido al 2,5 %
en tampn de cacodilato de sodio 3-hidrato (0,1M, pH 7,2) y se deja actuar
durante 1 hora.
Para retirar el glutaraldehido, se aade cacodilato (0,1M, pH 7,2) por
las paredes sin tocar la muestra. Se realizan 2 lavados de 10 minutos cada
uno.
Seguidamente, se realiza una nueva fijacin con OsO4 al 1%
(disolucin tampn cacodilato 0,2M-OsO4 al 2%) durante 1 hora. Este paso
no siempre es necesario, se realiza siempre y cuando no se haya
conseguido una fijacin con los pasos anteriores.
Por ltimo, se realiza el secado por punto crtico y el metalizado (100150 s). Las muestras se conservan en campana de secado hasta que se
observan al microscopio.
1.2.8 DIGESTIN DE COMPUESTOS INSOLUBLES DE METAL

Esta tcnica se emple para determinar la cantidad de metal que
permanece insoluble en una solucin o matriz slida, antes o despus de
aplicar un proceso de solubilizacin.
Para un medio de, aproximadamente 100 ml, se aadieron 10 ml de
HNO3 y 10 ml de HCl , ambos concentrados. Se calent y agit durante 1
hora. Tras dejar enfriar se filtr y se llev a un volumen conocido para
determinar su contenido en metales por espectroscopa de emisin
atmica.
132
MATERIAL Y MTODOS
2 PROTOCOLOS EXPERIMENTALES
El estudio de los procesos de solubilizacin y precipitacin de los iones
Cr(III), Ni(II) y Zn(II), as como, la reduccin del Cr(VI), por la accin de
bacterias azufre-oxidantes y sulfato-reductoras se llev a cabo mediante la
sucesin de las etapas experimentales descritas a continuacin:
Solubilizacin de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias azufreoxidantes en discontinuo.
Solubilizacin de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias azufreoxidantes en continuo.
Reduccin de Cr(VI) con bacterias azufre-oxidantes en

discontinuo.
Reduccin de Cr(VI) y solubilizacin de Cr(III) con bacterias

azufre-oxidantes en continuo.
Precipitacin de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias sulfatoreductoras en discontinuo.
Precipitacin de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) con bacterias sulfatoreductoras en continuo.
Inmovilizacin de At. ferrooxidans y At. thiooxidans sobre

espuma de poliuretano.
Integracin de los procesos de solubilizacin y precipitacin de

Cr(III), Ni(II) y Zn(II) en continuo.
133
MATERIAL Y MTODOS
2.1 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIN DE Cr(III),

Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES
EN DISCONTINUO
El estudio de la solubilizacin de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) por la
accin de las bacterias azufre-oxidantes se llev a cabo primeramente en
rgimen discontinuo.
Se tomaron como referencia las concentraciones mximas de estos
metales en lodos para ser aplicadas al suelo: 1500 mg Cr/kg materia seca,
400 mg Ni/kg materia seca y 4000 mg Zn/kg materia seca. Estas mismas
cantidades en disolucin dan lugar a concentraciones mayores a los que se
pueden encontrar habitualmente en efluentes contaminados. Por otra
parte, los estudios previos indicaron que algunas de estas concentraciones
no son toleradas por este tipo de bacterias.
Por tanto, se decidi trabajar con el 20% y el 50% de estas cantidades
en el medio de cultivo. La cantidad necesaria de cada metal se
suplement empleando, xido de cromo (III) (Cr2O3), sulfuro de nquel (NiS) y
sulfuro de zinc (ZnS), respectivamente.
Se prepararon ensayos con cada metal slo y combinando todos
ellos. En la Tabla 21 se recogen las concentraciones de metal empleadas en
cada uno de ellos.
En matraces erlenmeyers de 250 ml se aadieron 90 ml de medio 0K
(ajustado a pH 4), 1 g de azufre elemental y la cantidad necesaria de
metal. A continuacin se inocul al 10% con un cultivo de At. ferrooxidans o
At. thiooxidans en fase exponencial de crecimiento. Se realiz un control
estril (C50) al que se suplementaron todos los metales a la mxima
concentracin de cada uno de ellos.
134
MATERIAL Y MTODOS
Ensayo
[Cr(III)]
ppm
Cr20
300
Cr50
750
[Ni(II)]
ppm
Ni20
80
Ni50
200
[Zn(II)]
ppm
Zn20
800
Zn50
2000
M20
300
80
8000
M50
750
200
2000
C50
750
200
2000
Tabla 21 Concentraciones de los metales empleados en cada uno de los ensayos
El seguimiento de la experiencia se realiz tomando muestras cada 34 das, reponiendo previamente el volumen de agua evaporado. A cada
muestra se le determin el pH, la poblacin celular y la concentracin de
metales en solucin. Al final de la experiencia se determin la cantidad de
metal residual de cada ensayo mediante digestin cida.
Dado que los metales habitualmente se encuentran integrados en
matrices slidas como lodos, sedimentos o suelos, se estudi tambin la
solubilizacin de estos metales en las mismas condiciones en presencia de
una matriz slida como la arena. Para ello, se prepararon arenas
contaminadas artificialmente con cromo, nquel y zinc individualmente y los
tres al mismo tiempo. La cantidad de arena agregada en cada ensayo dio
lugar a las mismas concentraciones iniciales que en el estudio de
solubilizacin anterior y el seguimiento de la experiencia se realiz siguiendo
el mismo procedimiento descrito anteriormente.
135
MATERIAL Y MTODOS
2.2 PROTOCOLO PARA LA SOLUBILIZACIN DE Cr(III),

Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES
EN CONTINUO
La solubilizacin en continuo de los iones metlicos Cr(III), Ni(II) y Zn(II)
se llev a cabo preparando un cultivo de At. thiooxidans en un reactor de
tanque agitado de modo que el medio cido que sale de forma contina
se hizo pasar por una columna de lecho fijo en la que se encontraba una
arena contaminada artificialmente con los metales citados.
La descripcin del equipo se detalla a continuacin y se encuentra
representado en la figura 15.
sensor pH
Sensor de
temperatura
At. t.
Arena con Cr(III),

Ni(II) y Zn(II)
Aireacin
30C 300 rpm
Medio 0K pH4
Lixiviado
Figura 15: Equipo para la solubilizacin continua de cromo, nquel y zinc mediante un cultivo
de At. thiooxidans.
136
MATERIAL Y MTODOS
2.2.1 REACTOR DE At. thiooxidans

Para el crecimiento de esta bacteria azufre-oxidante se emple un
reactor de tanque agitado con un volumen de trabajo de 800 ml sobre un
volumen total de 1 litro.
El reactor estaba provisto de un sensor de temperatura y un sensor de
pH para el control del proceso. La agitacin (300 rpm) se obtuvo por
agitacin magntica y el oxgeno necesario se proporcion mediante un
compresor que suministraba un caudal de aire de 1,04 vvm.
El cultivo se realiz aadiendo al reactor 720 ml de medio 0K (a pH 4),
8 g de azufre elemental y 72 ml de un cultivo de At. thiooxidans en fase
exponencial de crecimiento (1020 Mcel/ml y pH 0,96) y se mantuvo a 30C y
300 rpm. Tras una primera fase en rgimen discontinuo, cuando el pH se
encontr en un valor de 1, se conect la alimentacin en continuo
mediante una bomba peristltica.
Diariamente se realiz la medida de pH, concentracin de protones,
concentracin de sulfato, poblacin bacteriana y volumen alimentado.
2.2.2 SOLUBILIZACIN DE METALES PRESENTES EN ARENA

Para llevar a cabo el estudio de la solubilizacin de los metales
presentes en una arena contaminada artificialmente, se colocaron 50 g de
sta en una columna de vidrio de 60 ml de volumen total.
La arena se prepar con aquellas concentraciones de cada uno de
los metales estudiados que segn la legislacin vigente marcan el mnimo
para que sea considerado como un lodo contaminado. De este forma, los
50 g de arena contenan: 75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y 200 mg de Zn(II)
aportados en forma de Cr2O3, NiS y ZnS, respectivamente.
137
MATERIAL Y MTODOS
A travs de la columna se hizo pasar un caudal de medio cido
procedente del reactor de crecimiento exactamente igual al de entrada
de alimentacin del reactor de At. thiooxidans.
Diariamente se le determin al lixiviado obtenido el pH, la
concentracin de protones, la concentracin de sulfato, la concentracin
de cada uno de los metales y el volumen obtenido.
2.3 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIN DE Cr(VI)

CON
BACTERIAS
AZUFRE-OXIDANTES
EN
DISCONTINUO
Para la determinacin de la capacidad de reduccin del cromo
hexavalente por At. ferrooxidans y At. thiooxidans en discontinuo se sigui el
protocolo descrito a continuacin.
Se prepar una disolucin de dicromato potsico (K2Cr2O7) de 1000
ppm y se esteriliz por filtracin a vaco por membrana de 0,22 m.
Una serie de erlenmeyers de 250 ml fueron suplementados con 90 ml
de medio 0K (pH 4,0) y 1 g de azufre elemental. A este medio se le aadi el
volumen necesario para obtener una concentracin final de 1, 2,5, 5 y 10
mg/l; y finalmente, se inocul al 10% con cultivos en la fase exponencial de
crecimiento.
Se realiz un control sin inculo a la mayor concentracin de Cr(VI)
considerada (10 ppm) y dos controles inoculados (uno de cada bacteria)
sin metal.
El seguimiento de esta experiencia se realiz mediante la medida del
pH, la poblacin celular, la concentracin de Cr(VI), empleando el mtodo
de
la
difenilcarbazida,
la
concentracin
de
cromo
total,
por
espectroscopia de emisin atmica.
138
MATERIAL Y MTODOS
2.4 PROTOCOLO PARA LA REDUCCIN DE Cr(VI) Y

SOLUBILIZACIN DEL Cr(III) CON BACTERIAS
AZUFRE-OXIDANTES EN CONTINUO
Para el estudio de la reduccin del Cr(VI) y la solubilizacin del Cr(III)
presentes en un residuo por la accin de las bacterias azufre-oxidantes, se
emple un reactor para el crecimiento de un cultivo At. thiooxidans y una
columna de lecho empaquetado, que soportaba el residuo, donde se
produjo la reduccin/solubilizacin del cromo por la accin del medio
procedente del reactor de At. thiooxidans. La descripcin del proceso se
detalla a continuacin y se encuentra representado en la figura 16.
Aireacin
At. thiooxidans
+ azufre
Residuo de
cromo
pH1
Medio 0K
pH5
Lixiviado
Figura 16: Esquema del sistema empleado para la reduccin del Cr(VI) y la solubilizacin del
Cr(III) presentes en un residuo mediante la accin de At. thiooxidans
2.4.1 Reactor de At. thiooxidans

El reactor empleado fue una columna de lecho empaquetado
constituida por 170 g de azufre elemental (tamao de partcula 2-4 mm). El
139
MATERIAL Y MTODOS
azufre tiene una doble finalidad: actuar como soporte para la inmovilizacin
de las bacterias y como sustrato. La columna dispona de 150 ml de
volumen til sobre un total de 300 ml.
Inicialmente se aadi a la columna medio 0K a pH 2,5 y se inocul al
10% con un cultivo At. thiooxidans en fase exponencial de crecimiento.
La alimentacin del reactor constaba de medio 0K ajustado a pH 5.
El oxgeno necesario para el metabolismo celular se proporcion mediante
un sistema de aireacin conectado a un difusor (1,10 vvm). Para la entrada
de alimentacin y salida de medio se emple una bomba peristltica de
doble cabezal.
El seguimiento del reactor se realiz diariamente mediante la medida
del pH, la concentracin de protones y la poblacin celular.
El sistema oper inicialmente en discontinuo hasta alcanzar un pH
igual a 1, es entonces cuando se dispuso en rgimen continuo para obtener
la renovacin de todo el medio presente en la columna y se mantuvo de
nuevo en discontinuo. Este proceso se repiti hasta asegurar la formacin
de la biopelcula, momento en que se mantiene en rgimen continuo.
2.4.2 Columna con residuo de cromo

En una columna de caractersticas similares a la empleada para la
inmovilizacin de At. thiooxidans, se aadieron 157 g del residuo de cromo a
tratar.
El residuo empleado proceda de un filtro prensa de una planta de
galvanizado. Dicho filtro, constituido principalmente de compuestos
arcillosos, retiene el cromo procedente de los baos de cromado y cuando
se colmata se desecha y es renovado por otro; este hecho supone una
acumulacin elevada de cromo en el medio donde se almacenan.
140
MATERIAL Y MTODOS
El contenido del residuo es 30% de Cr(III) y 0,1% de Cr(VI).
La columna estaba conectada a una bomba peristltica que
permita la salida de lixiviado a un caudal similar al de entrada de medio a
pH 1. El seguimiento de la columna se realiz midiendo el volumen
recolectado de lixiviado y determinando a ste el pH, la concentracin de
protones, la concentracin de sulfato y la concentracin de cromo
hexavalente y total.
2.5 PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIN DE Cr(III),

Ni(II) y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS EN DISCONTINUO
Las experiencias realizadas tenan el objetivo de estudiar la tolerancia
de las bacterias sulfato-reductoras a los iones metlicos, as como
cuantificar la capacidad de precipitacin de dichos iones por estas
bacterias.
Durante la experimentacin fueron necesarios cultivos crecidos en
medio Postgate C, y para ello, con la antelacin suficiente, se sembraron en
medio Postgate C las cepas de bacterias sulfato-reductoras necesarias
mantenidas en medio Postgate B, de acuerdo al protocolo descrito
anteriormente en el apartado 1.1.2.2 de esta misma seccin.
Una vez crecido el cultivo y, antes de utilizarlo en la experiencia, es
necesario retirar el sulfuro que existe en el medio, con el fin de que no se
produzca una precipitacin inicial de los metales solubles que se vayan a
suplementar al medio. Para ello se centrifuga (5000 G, 30 min, 20 C) o se
filtra a vaco por membrana de 0,22 micras y se resuspende en el volumen
necesario de medio Postgate C fresco
141
MATERIAL Y MTODOS
Las disoluciones de los metales objeto del estudio se prepararon a
partir de una disolucin stock de 1000 ppm para cada in metlico con
Cr2(SO4)3, NiSO4 6H2O y ZnSO4 7H2O, respectivamente, filtrados a vaco por
membranas de 0,22 micras para asegurar su esterilizacin.
Se prepararon recipientes de vidrio con medio Postgate C estril a los
que se aadi el volumen de disolucin metlica necesario para disponer
de la concentracin metlica deseada en cada ensayo. Cada prueba se
realiza por duplicado.
A continuacin se burbuje una corriente de N2 gaseoso durante
unos minutos, y se aadi 5 ml de inculo a cada prueba manteniendo la
corriente de nitrgeno unos minutos ms. Se cerraron hermticamente con
tapn de goma y virola metlica. Los cultivos se incubaron a 30C en estufa.
El muestreo se realiz cada 3-4 das extrayendo con aguja y jeringa
1,5-2 ml de cada experimento cuidando de no introducir aire en el bote,
hecho que se evita haciendo pasar la corriente de nitrgeno durante unos
minutos despus del muestreo.
De cada muestra se tom una fraccin para la determinacin de la
concentracin celular, que se diluye si es necesario, y el resto se filtr por
filtro de membrana de 0,22 micras. Al sobrenadante obtenido se le
determin la concentracin de sulfato y se acondicion para la medida del
in o iones metlicos que existan en la muestra.
2.6 PROTOCOLO PARA LA PRECIPITACIN DE Cr(III),

Ni(II) Y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS EN CONTINUO
Para el estudio de la precipitacin de iones metlicos en solucin
mediante bacterias sulfato-reductoras se procedi a realizar un cultivo
142
MATERIAL Y MTODOS
continuo de estas bacterias en un reactor de tanque agitado. El sulfuro de
hidrgeno obtenido se puso en contacto con una disolucin metlica de
cromo, nquel y zinc.
El proceso se detalla a continuacin y se encuentra representado en
la figura 17.
sensor pH
Sensor de
temperatura
Nitrgeno
D. sp
30C 500 rpm
Medio Postgate C
Precipitado
Figura 17 Sistema empleado para la precipitacin de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) en solucin
con un cultivo Desulfovibrio sp. en continuo.
2.6.1 REACTOR DE Desulfovibrio sp.

Para el crecimiento de este cultivo mixto de Desulfovibrio sp. se utiliz
un reactor de tanque agitado de 800 ml cerrado hermticamente. El
reactor dispona de una entrada para el paso de una corriente de N2
gaseoso que permiti asegurar las condiciones anaerobias necesarias tanto
143
MATERIAL Y MTODOS
al inicio como a lo largo de la experiencia cuando se produca algn
cambio que implicase entrada de aire al sistema.
El reactor cuenta adems con un sensor de temperatura y un sensor
de pH. La toma de muestra se realiz mediante una jeringa en la
conduccin de salida del reactor para evitar la manipulacin en el interior
del reactor y la entrada no deseada de aire al sistema.
El cultivo se prepar con 720 ml de medio Postgate C y 72 ml de un
cultivo de Desulfovibrio sp. en fase exponencial de crecimiento. El cultivo se
mantuvo en rgimen discontinuo durante dos das y, transcurrido este
tiempo, necesario para el crecimiento de la biomasa hasta la fase
exponencial, se comenz a operar en rgimen continuo con la entrada de
medio Postgate C.
El seguimiento del cultivo continuo se realiz con la medida diaria del
pH, la poblacin bacteriana y la concentracin de sulfato.
2.6.2 REACTOR DE PRECIPITACIN

Para determinar la capacidad para precipitar iones metlicos del
medio generado por las bacterias sulfato-reductoras se prepar una
disolucin con los sulfatos comunes de cromo, nquel y zinc hasta obtener
una concentracin de 1500 ppm de Cr(III), 400 ppm de Ni(II) y 4000 ppm de
Zn(II).
Se realiz un seguimiento diario del volumen que se fue descargando
en el reactor de precipitacin. En dicho reactor se dispone de un medio
lquido procedente del reactor de crecimiento de las bacterias sulfatoreductoras, la disolucin metlica bajo estudio y una cantidad de
precipitado generado. A una muestra de dicha mezcla se le determin el
pH, la concentracin de sulfato y la concentracin de metales en solucin.
En aquellos casos en los que se detect una escasa precipitacin, el
144
MATERIAL Y MTODOS
volumen recogido en el reactor de precipitacin se volvi a reutilizar para
continuar con la precipitacin de los metales en solucin, a fin de
completar la precipitacin total.
2.7 PROTOCOLO PARA LA INMOVILIZACIN DE At.

ferrooxidans Y At. thiooxidans SOBRE ESPUMA DE
POLIURETANO
Para el seguimiento de la dinmica de inmovilizacin de las bacterias
azufre-oxidantes sobre espuma de poliuretano se realiz un cultivo en
discontinuo, la metodologa empleada se representa en la figura 18.
Se emplearon matraces erlenmeyers de 500 ml a los que se le aadi
180 ml de medio 0K ajustado a pH 1,8 para el cultivo At. ferrooxidans o a pH
2,5 para At. thiooxidans. El medio se suplement con
2 g de azufre
elemental, 1 g de espuma de poliuretano (cubos de 0,5 cm de lado) y 20 ml

de inculo del cultivo correspondiente en fase exponencial. Los cultivos se
incubaron a 30C y 150 rpm. Y cuando alcanzaron un pH de 1, se retir el
medio filtrando el cultivo por un embudo Buchner y un filtro de papel
Whatman n4. La espuma retenida se llev a un nuevo matraz erlenmeyer
estril y se aadieron 200 ml de medio 0K al mismo pH que en la etapa
inicial y se incub en las mismas condiciones. Cuando el pH fue 1, se volvi
a repetir el procedimiento pero empleando medio 0K ajustado a pH 4, ya
que este medio ser el que se emplee en los procesos de solubilizacin de
metales con las bacterias inmovilizadas sobre espuma.
145
MATERIAL Y MTODOS
2 g S
2 g S
180 ml medio
0K pH ptimo
200 ml medio 0K
pH ptimo
20 ml
inculo
pH 1
pH 1
30C 150 rpm
2 g S
30C 150 rpm

200 ml medio 0K
pH 4
pH 1
NUEVO CICLO
30C 150 rpm
Figura 18: Procedimiento de inmovilizacin de bacterias azufre-oxidantes sobre espuma de

poliuretano
Los ciclos se continuaron realizando en estas ltimas condiciones

hasta observar que la cantidad de biomasa inmovilizada se mantiene
constante al final de cada etapa y que los ciclos tienen una duracin
similar. El seguimiento de la experiencia se realiz midiendo diariamente el
pH, la concentracin de protones y la concentracin de sulfato. Al final de
cada ciclo se determin la biomasa ocluida y la biomasa retenida en el
soporte.
146
MATERIAL Y MTODOS
2.8 PROTOCOLO PARA LA INTEGRACIN DE LOS

PROCESOS DE SOLUBILIZACIN Y PRECIPITACIN
DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II) EN CONTINUO.
La integracin de los procesos de solubilizacin y precipitacin se
llev a cabo en el sistema experimental descrito en la figura 19. La etapa de
solubilizacin se desarroll con un cultivo de At. thiooxidans inmovilizado
sobre espuma de poliuretano. Para ello, se inocularon al 10% dos
erlenmeyers de un litro los cuales contenan 650 ml de medio 0K, 4 g de
cubos de espuma de poliuretano y 6,5 g de azufre elemental. Se realizaron
cuatro ciclos de inmovilizacin en discontinuo y, a continuacin, se
depositaron en una columna de vidrio donde se llev a cabo el crecimiento
de este cultivo en continuo. Inicialmente la columna se prepar con 7,5 g
de espuma de poliuretano con una densidad celular de 12 Mcel/mg de
espuma sumergidas en 650 ml de medio 0K a pH 4 y con 6,5 g de azufre
elemental.
sensor pH
At. thiooxidans
inmovilizado
sobre espuma
de poliuretano
Sensor de
temperatura
pH1
Arena
contaminada
Nitrgeno
30C 500 rpm
Aireacin
Medio Postgate C
Lixiviado
Medio 0K
Precipitado
Figura 19. Esquema del sistema empleado para la integracin de los procesos de
solubilizacin y precipitacin de cromo, nquel y zinc en continuo.
Una vez que se alcanz un valor de pH 1 el sistema comenz a

operar en rgimen continuo mediante el uso de una bomba peristltica de
147
MATERIAL Y MTODOS
doble cabezal. La alimentacin continua consisti en medio 0K a pH 4 y el
aporte de azufre elemental se realiz de forma puntual cuando se detect
un descenso en la produccin de cido sulfrico. El efluente procedente de
la columna se hizo pasar a travs de una columna de lecho empaquetado
con la arena contaminada. En concreto, la columna se prepar con 50
gramos de una arena que contena 75 mg de Cr(III), 50 mg de Cr(VI), 20 mg
de Ni(II) y 200 mg de Zn(II). El lixiviado procedente de la columna se recogi
en un erlenmeyer de un litro y, tras tomar muestra, se filtr para eliminar los
posibles slidos arrastrados del lecho antes de someter esta solucin al
proceso de bioprecipitacin. Diariamente se sigui el estado del proceso
midiendo el pH, la concentracin de protones y la concentracin de sulfato
tanto a la salida del reactor como al lixiviado, y a ste tambin se le
determin el volumen obtenido y la concentracin de los iones metlicos.
La etapa de precipitacin se realiz en condiciones similares a las
empleadas en el proceso de precipitacin en continuo descrito con
anterioridad en el que se empleaba un lixiviado artificial. Se emple un
reactor de tanque agitado para el crecimiento del cultivo mixto de
bacterias sulfato-reductoras, Desulfovibrio sp., en medio Postgate C. Una vez
obtenido el estado estacionario, el medio procedente del reactor se gote
sobre un embudo de decantacin donde se encontraba la fraccin de
lixiviado diaria obtenida de la etapa de solubilizacin.
Se sigui la concentracin celular, el pH y la concentracin de sulfato
en el reactor de crecimiento de Desulfovibrio sp. y al volumen de
precipitado obtenido se le determin el pH, la concentracin de sulfato y la
concentracin de metales en solucin.
148
D.-RESULTADOS
RESULTADOS
1 SOLUBILIZACIN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II)

1.1 SOLUBILIZACIN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON
BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN DISCONTINUO
Se estudi la solubilizacin de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II), aislados o
combinados entre s a dos concentraciones distintas de cada uno de ellos
en presencia de At. ferrooxidans y At. thiooxidans. Se tomaron como
referencia concentraciones de 1500 ppm de Cr(III), 400 ppm de Ni(II) y 4000
ppm de Zn(II), siendo estos valores los mximos permitidos por la legislacin
vigente para lodos que pueden ser aplicables a suelos. Sin embargo, estas
concentraciones pueden resultar txicas para los microorganismos, por lo
que se decidi trabajar con el 20% y el 50% de stas en solucin, esto da
lugar a concentraciones que se pueden encontrar de forma habitual en
lodos (Matlakoska y Sklodowska, 2001; Villlar y col. 2001), sedimentos (Chen
y Lin, 2000; Seidel y col. 1998) y suelos (Gmez y Bosecker, 1999)
contaminados. De esta forma, se denomin a estas experiencias como 20 o
50 segn el porcentaje de estas cantidades que se encuentran en solucin.
Durante la experimentacin se sigui la evolucin del pH, la
concentracin del metal en solucin y la concentracin de biomasa, la
evolucin de las concentraciones de cada uno de ellos se representa en un
mismo grfico para cada bacteria en presencia de las dos concentraciones
de metal estudiada en cada caso.
Para ambas bacterias se observ que, en presencia de la
concentracin menor de cromo y de nquel se produjo un descenso
acusado del pH parejo al cultivo control.
151
RESULTADOS
Figura 20: Fotografa de microscopa electrnica (x 20000) de las bacterias azufre-oxidantes

empleadas en el estudio, At. ferrooxidans (izqda.) y At. thiooxidans (dcha.)
En el experimento de At. ferrooxidans en presencia de cromo (III)

(figura 21) se observa una solubilizacin inicial significativa y luego se
mantiene prcticamente constante durante todo el estudio para las dos
concentraciones estudiadas.
En el caso del experimento AfCr20 se observa un aumento de la
biomasa pasado el tercer da, a partir de este momento se estabiliza la
cantidad de metal solubilizado independientemente de la disminucin
progresiva del pH (1,8-0,7) y del crecimiento de la poblacin bacteriana.
Este comportamiento es distinto cuando se trabaja con la concentracin
ms alta de metal (AfCr50), de tal forma que la biomasa se mantiene en los
valores iniciales, lo que hace pensar que la cantidad de metal solubilizado
al principio, puede inhibir la actividad metablica de At. ferrooxidans. A
pesar de ello, la cantidad de cromo solubilizado es muy pequea en ambos
casos (< 2%) y slo es posible su justificacin en base a la baja solubilidad
del xido de este metal.
152
RESULTADOS
At. ferrooxidans + Cr(III)
14
900
800
12
700
Mcel/ml
500
400
300
[Cr(III)] (ppm)
10
600
200
2
100
0
0
0
10
12
14
16
Tiempo (das)
Mcel/ml AfCr20
Mcel/ml AfCr50
[Cr] AfCr20
[Cr] AfCr50
Figura 21: Evolucin del crecimiento bacteriano y concentracin de metal para At.
ferrooxidans en presencia de 300 y 750 de ppm de Cr(III)
En la figura 22 se representa la evolucin de la concentracin

bacteriana y la concentracin de Cr(III) en solucin para los cultivos de At.
thiooxidans. Al igual que para el experimento con At. ferrooxidans, tan slo
el cultivo de menor concentracin registra un crecimiento apreciable de la
biomasa, llegando a niveles similares de poblacin que ste otro
microorganismo. Este aumento de la biomasa tiene relacin directa con el
descenso registrado en el valor del pH (2,0-0,5). En este experimento,
tambin se observa una solubilizacin inicial del metal que se mantiene
prcticamente constante a lo largo del tiempo.
153
RESULTADOS
At. thiooxidans + Cr(III)
900
16
800
14
700
Mcel/ml
600
10
500
8
400
6
300
[Cr(III)] (ppm)
12
200
100
0
0
0
10
12
14
16
Tiempo (das)
Mcel/ml AtCr20
[Cr] AtCr20
Mcel/ml AtCr50
[Cr] AtCr50
thioooxidans en presencia de 300 y 750 de ppm de Cr(III)
Por tanto, se puede decir que, a las concentraciones ensayadas, At.

thiooxidans no es capaz de solubilizar el xido de cromo presente en el
medio.
Las figuras 23 y 24 representan la evolucin del proceso de
solubilizacin
de
Ni(II)
por
At.
ferrooxidans
At.
thiooxidans,
respectivamente. As, en el caso de At. ferrooxidans se puede observar que

la presencia de la menor concentracin de nquel no afecta al crecimiento
de esta especie bacteriana ya que, tras una fase de latencia de 3 das, se
observa un crecimiento exponencial del cultivo. Este aumento se
corresponde con un descenso en el pH (1,8-0,6) y un aumento gradual en la
solubilizacin del sulfuro metlico.
154
RESULTADOS
At. ferrooxidans + Ni(II)
1400
40
1200
35
Mcel/ml
25
800
20
600
15
400
[Ni(II)] (ppm)
30
1000
10
200
0
0
10
12
14
16
Tiempo (das)
Mcel/ml AfNi20
[Ni] AfNi20
Mcel/ml AfNi50
[Ni] AfNi50
ferrooxidans en presencia de 80 y 200 ppm de Ni(II)
La cantidad final solubilizada fue mayor de 17,5 ppm, lo que supone

un 22,1% del metal agregado. Por el contrario, la concentracin mayor de
nquel estudiada afecta claramente al crecimiento celular, de tal forma que
ni el pH ni la biomasa varan con respecto a los valores iniciales y la
cantidad de metal solubilizada inicialmente se mantiene constante.
155
RESULTADOS
1200
60
1000
50
800
40
600
30
400
20
200
10
[Ni(II)] (ppm)
Mcel/ml
At. thiooxidans + Ni(II)
0
0
10
12
14
16
Tiempo (das)
Mcel/ml AtNi20
[Ni] AtNi20
Mcel/ml AtNi50
[Ni] AtNi50
Figura 24 Evolucin del crecimiento bacteriano y concentracin de metal para At.

thiooxidans en presencia de 80 y 200 ppm de Ni(II)
En los experimentos realizados con At. thiooxidans se puede observar

un comportamiento similar, de modo que con la menor concentracin de
sulfuro, se registra un crecimiento microbiano importante, mientras que la
concentracin de biomasa permanece prcticamente invariable cuando
se encuentra presente una mayor concentracin del sulfuro (AtNi50). De
esta forma, se puede llegar a registrar una solubilizacin del 21,7% de Ni(II)
para el caso de AtNi20, mientras que en el experimento de mayor
concentracin, la solubilizacin que se consigue es la inicial del sulfuro
(16,7%) permaneciendo invariable con el tiempo.
En las figuras 25 y 26, se muestra la evolucin de los distintos
parmetros seguidos para las experiencias en presencia de sulfuro de zinc.
156
RESULTADOS
En general, se puede decir que la presencia del zinc inhibe la actividad
bacteriana, ya que se registran fases de latencia un poco ms acusadas
que
para
el
resto
de
los
compuestos
metlicos
ensayados.
Este
comportamiento puede tener su explicacin en una mayor solubilidad

inicial del sulfuro de zinc, de tal forma, que en las primeras horas de cultivo
se pueden alcanzar valores de 600 - 900 ppm de Zn(II) en solucin para los
experimentos con At. ferrooxidans y 600 700 ppm de Zn(II) para los cultivos
de At. thiooxidans, de tal forma que nos encontramos ante elevadas
concentraciones del metal en solucin que provocan la inhibicin parcial o
total de la actividad bacteriana. Este hecho no ocurre en los ensayos con
compuestos de cromo o nquel ya que la solubilizacin propia de stos no
llega a superar tales niveles de solubilizacin inicial, principalmente porque
la cantidad aportada de estos metales es mucho menor.
At. ferrooxidans + Zn(II)
450
1200
400
Mcel/ml
300
800
250
600
200
150
400
100
[Zn(II)] (ppm)
1000
350
200
50
0
0
0
10
12
14
16
Tiempo (das)
Mcel/ml AfZn20
[Zn] AfZn20
Mcel/ml AfZn50
[Zn] AfZn50
Figura 25 Evolucin del crecimiento bacteriano y concentracin de metal para At.

ferrooxidans en presencia de 800 y 2000 ppm de Zn(II)
157
RESULTADOS
De las dos cepas ensayadas, At. ferrooxidans es ms sensible a la
presencia de Zn en solucin, ya que no se registra crecimiento para el caso
del 50%, mientras que si es posible encontrar un aumento de la poblacin
bacteriana para At. thiooxidans. Esta evidencia tiene una relacin directa
con el grado de solubilizacin, de tal forma, que se registran valores de
78,4% y 43% para las dos concentraciones estudiadas en los cultivos de At.
thiooxidans.
Una vez que se estudiaron los comportamientos de las dos cepas
frente a cada uno de los compuestos metlicos de forma individual, el
siguiente paso en la experimentacin fue determinar la influencia que tiene
la presencia de los compuestos de cromo (III), nquel (II) y zinc (II) de forma
conjunta para acercarnos a lo que puede ocurrir de forma natural en un
residuo contaminado
At. thiooxidans + Zn(II)
600
1000
900
500
800
Mcel/ml
600
300
500
400
200
[Zn(II)] (ppm)
700
400
300
200
100
100
0
0
0
10
12
14
16
Tiempo (das)
Mcel/ml AtZn20
[Zn] AtZn20
Mcel/ml AtZn50
[Zn] AtZn50
thiooxidans en presencia de 800 y 2000 ppm de Zn(II)
158
RESULTADOS
En cuanto al comportamiento de At. ferrooxidans en presencia de la
mezcla de metales, la tendencia est claramente condicionada por la
presencia de zinc. De tal forma que, para el caso de las experiencias con el
20% de cada cantidad referencia de metal (figura 27), se obtuvo un
crecimiento celular importante a partir del dcimo da de incubacin y,
para el caso de las experiencias con 50% no se detect crecimiento
microbiano relevante (figura 28).
At. ferrooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (20%)
25
Mcel/ml - [Zn(II)] (ppm)
600
20
500
15
400
300
10
200
5
100
0
[Cr(III)], [Ni(II)] (ppm) - pH
700
0
0
10
15
Tiempo (das)
Mcel/ml
[Zn]
[Cr]
[Ni]
pH
Figura 27: Evolucin del pH, crecimiento bacteriano y concentraciones de metales para At.
ferrooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (20% de concentraciones mximas, 300ppm
de Cr(III), 80 ppm de Ni(II) y 800 ppm de Zn(II)).
159
RESULTADOS
At. ferrooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (50%)
1200
50
Mcel(ml) - [Zn(II)] (ppm)
40
35
800
30
600
25
20
400
15
10
200
45
1000
5
0
0
0
10
15
Tiempo(das)
Mcel/ml
[Zn]
pH
[Cr]
[Ni]
ferrooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (50% de concentraciones mximas, 750ppm
de Cr(III), 200 ppm de Ni(II) y 2000 ppm de Zn(II))
Si
se
comparan
los
porcentajes
de
solubilizacin
de
estas
experiencias, se puede comprobar que se encuentran en el mismo nivel a

los obtenidos de forma individual. Es decir, que la presencia de varios tipos
de compuestos metlicos en el medio no afecta de forma significativa al
comportamiento de estas cepas.
At. thiooxidans se comporta de manera similar, la combinacin de
metales parece que no afecta al porcentaje de solubilizacin final y la
evolucin del crecimiento celular (figuras 29 y 30) fue pareja a la vista para
At. thiooxidans en presencia de zinc.
160
RESULTADOS
At. thiooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (20%)
700
Mcel/ml - [Zn(II)] (ppm)
600
20
500
15
400
300
10
200
5
100
0
25
0
0
10
15
Tiempo (das)
Mcel/ml
[Zn]
[Cr]
[Ni]
pH
thiooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (20% de concentraciones mximas, 300ppm
Con el objetivo de comparar los resultados obtenidos mediante

solubilizacin biolgica con aquellos que pueden obtenerse por mtodos
qumicos, se llevo a cabo la digestin cida de cantidades iguales de los
compuestos metlicos empleados en 100 ml de medio 0K a pH 4. Tras la
adicin de cido ntrico y cido clorhdrico, se llev la mezcla a ebullicin,
tal como se describe en el apartado de Material y Mtodos de la presente
memoria Los resultados tambin se compararan con la solubilizacin
obtenida por un control estril realizado con medio 0K ajustado a pH 1,8
para una composicin de metales igual a la estudiada con las bacterias. En
la tabla 22 se puede muestran los porcentajes de solubilizacin obtenidos
con el cultivo At. ferrooxidans, el cultivo At. thiooxidans, la debida al ataque
161
RESULTADOS
con cidos fuertes y la obtenida con el control estril para una mezcla
metlica de cromo, nquel y zinc.
60
1000
50
800
40
600
30
400
20
200
10
Mcel(ml) - [Zn(II)] (ppm)
1200
At. thiooxidans + Cr(III), Ni(II), Zn(II) - (50%)
0
0
10
15
Tiempo(das)
Mcel/ml
[Zn]
pH
[Cr]
[Ni]
thiooxidans en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II) (50% de concentraciones mximas, 750ppm
Modo de
Solubilizacin
Cr2O3
NiS
ZnS
At. ferrooxidans
1,13 (1,5%)
4,52 (22,6%)
106,5 (53,25%)
At. thiooxidans
1,01 (1,35%)
4,85 (24,25%)
110 (55%)
Digestin cida
1,12 (1,49%)
18,51 (92,5%)
168,9 (84,45%)
Control pH 1,8
1,14 (1,51%)
2,21 (11,05%)
42,22 (21,11%)
Tabla 22:. Cantidad en mg y porcentaje (%) de cada metal solubilizado de una

combinacin de compuestos metlicos (75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y 200 mg de Zn(II) en
100 ml de medio 0K) por At. ferrooxidans, At. thiooxidans, digestin cida y control steril a pH
1,8 l.
162
RESULTADOS
Como
se
puede
observar
la
solubilizacin
del
cromo(III)
es
prcticamente igual independientemente del mtodo empleado. Este

hecho se debe, fundamentalmente, a la insolubilidad caracterstica del
xido de cromo empleado, ya que ste presenta una elevada resistencia a
su disolucin en presencia de una gran variedad de agentes qumicos.
Por el contrario, el ataque qumico con cidos fuertes permite una
elevada solubilizacin del sulfuro de nquel (92,5%) y del sulfuro de zinc
(84,45%) frente a la obtenida por un mtodo biolgico. No obstante, el
porcentaje de solubilizacin biolgica obtenidos para las dos bacterias
empleadas permite reducir en gran medida el contenido metlico de
ciertos residuos hasta alcanzar niveles aceptables para ser depositados o
reutilizados segn la legislacin. Al mismo tiempo, la solubilizacin de nquel
y zinc con medio a pH 1,8 es mucho menor a la obtenida en los dems
casos, pero permite asegurar que una proporcin del metal solubilizado se
debe a la accin de los compuestos del medio cido generado por las
bacterias azufre-oxidantes.
Por tanto, cuando se desea llevar a cabo la solubilizacin de los
metales presentes en un medio contaminado, existe la necesidad de
realizar una evaluacin de las ventajas e inconvenientes que presenta cada
una de ellas en funcin de la cantidad de metal que se desea solubilizar y
del uso posterior que se le quiera dar al residuo. De esta forma, si mediante
una tcnica de tipo qumico nos podemos asegurar un elevado grado de
solubilizacin, su aplicacin resulta mucho ms costosa y genera un ataque
ms agresivo al medio ambiente que mediante la aplicacin de una
tcnica de tipo biolgico. En ese sentido, para concentraciones bajas de
los metales ensayados, la solubilizacin biolgica se presenta como una
alternativa viable y de menor coste econmico y ambiental que la digestin
163
RESULTADOS
cida, ya que no requiere del uso de compuestos qumicos ni de un aporte
energtico.
Los resultados de solubilizacin en este estudio son menores a los
obtenidos por Villar y col. (2001). Estos autores estudiaron la lixiviacin de los
metales presentes en lodos anaerobios mediante un cultivo indgena de
bacterias azufre-oxidantes en cultivo discontinuo. El lodo empleado
contena concentraciones de cromo, nquel y zinc dentro del rango de las
concentraciones consideradas en el presente trabajo (685 mg Cr(III)/kg, 38
mg Ni(II)/kg y 888 mg Zn(II)/kg). En dicho trabajo se calcula la eficacia de
solubilizacin (r) como la razn entre la cantidad de metal disuelto y la
cantidad de metal total en el lodo.
r=
mg metal disuelto
mg metal total
El clculo de este trmino permite hallar la constante de velocidad

de solubilizacin del metal (k (d-1)) asumiendo una cintica de solubilizacin
de primer orden.
d(1 r )
= kt ln(1 r ) = kt
dt
La pendiente de la representacin de ln(1-r) en funcin del tiempo
proporciona
el valor de la constante k. En la tabla 23 se presentan los
valores de la constante de velocidad y el porcentaje de solubilizacin para

cada metal para la experiencia a 30C llevada a cabo por Villar y
colaboradores, a las concentraciones que ms se asemejan a las
empleadas en el presente trabajo.
164
RESULTADOS
metal
k (d-1)
% solubilizacin
Cromo
0,125
40
Nquel
0,377
64
Zinc
1,000
80
Tabla 23: Constante y porcentaje de solubilizacin de los metales presentes en un lodo

presentados por Villar y col. (2001)
De igual manera se realiz el clculo de estas constantes para cada

una de las experiencias realizadas en este trabajo, tanto para At.
ferrooxidans como para At. thiooxidans, dichos valores se presentan en la
tabla 24 junto a los porcentajes de solubilizacin. Dado que la mayor
solubilizacin ocurre en los primeros 3 das se calcul la velocidad en este
periodo y, por ello, se presenta el porcentaje de solubilizacin a los 3 das y
al final del proceso (da 14).
Si se realiza la comparacin entre los resultados obtenidos se observa
que las constantes de velocidad obtenidas en este estudio son siempre
menores a las obtenidas en el experimento con lodos. Este hecho se debe
principalmente a que en ocasiones la cantidad de metal dispuesta para
solubilizar es mayor, el compuesto de cromo empleado para el estudio de
solubilizacin en el presente trabajo destaca por su baja solubilidad incluso
en condiciones cidas extremas y, por otra parte, el cultivo empleado por
Villar y colaboradores se constituye de un consorcio de bacterias azufreoxidantes aislado del propio lodo y, por tanto, habituadas a la presencia de
los metales existentes en el lodo. En cuanto al porcentaje de solubilizacin,
slo en el caso del zinc, se obtienen valores similares a los encontrados por
Villar y col. (2001), la insolubilidad del xido de cromo y una mayor cantidad
de nquel suplementada en el presente trabajo dan lugar a unos
porcentajes mucho ms bajos. El grado de solubilizacin obtenido coincide
con los resultados presentados por otros autores (Chen y Lin, 2000; Xiang y
165
RESULTADOS
col. 2000; Krebs y col. 2001), de tal forma que la solubilizacin es mayor para
el ion zinc, en menor extensin para nquel y luego para cromo, el cual
muestra mucha resistencia a la biolixiviacin.
At.
ferrooxidans
Experiencia
Cr20
Metal
da 14
k(d-1 )
da 3
da 14
0,002
1,2
1,25
0,0015
1,06
1,38
0,0023
1,68
1,73
0,0016
1,62
1,86
0,051
16,5
22,07
0,051
15,96
21,74
0,055
16,65
18,42
0,077
21,98
24,48
0,472
76,56
80,81
0,391
70,25
78,38
0,182
43,16
48,63
0,127
32,95
43,05
Cr
0,027
0,93
0,98
0,0018
1,29
1,31
Ni
0,0504
16,36
25,71
0,046
16,55
25,54
Zn
0,432
74
76,94
0,426
73,43
78,81
Cr
0,003
1,53
1,51
0,0027
1,31
1,36
Ni
0,583
18,98
22,62
0,069
21,62
24,28
Zn
0,187
44,38
53,25
0,138
35,1
55
Cr
Ni
Zn
Zn50
M20
M50
% solubilizacin
da 3
Ni50
Zn20
At.
thiooxidans
k(d-1 )
Cr50
Ni20
% solubilizacin
Tabla 24: Constante y porcentaje de solubilizacin de cada uno de los metales para las
distintas experiencias de solubilizacin con At. ferrooxidans y At. thiooxidans.
Hasta el momento se ha estudiado el comportamiento de las

bacterias con los metales presentes en forma de compuestos insolubles en
el medio de crecimiento, sin embargo, para acercarnos un paso ms a la
configuracin de un suelo o lodo contaminado real, es necesario que estos
sulfuros se encuentren confinados en una matriz slida. En este sentido, se
realiz un estudio en el que se prepar una arena contaminada con los
mismos compuestos metlicos en la misma proporcin que los experimentos
anteriores y, sta se agreg al medio de cultivo de ambas cepas para el
seguimiento de la solubilizacin.
La primera consecuencia de la adicin de arena es el aumento del
pH inicial en torno a 2,5 - 3, sensiblemente superior a las experiencias
166
RESULTADOS
realizadas sin la presencia de arena. Adems, transcurridos 3 das de
incubacin, se produce la solubilizacin de algunos componentes de la
arena ya que se registra una alcalinizacin del medio y el pH se sita en un
rango de entre 7 y 8,5. En estas condiciones, nos encontramos aadiendo
una variable adicional y las bacterias no pueden crecer ni realizar su
actividad oxidativa debido a su carcter acidfilo. Por tanto, no se observ
ningn tipo de solubilizacin de los iones metlicos presentes. Los resultados
indicaron la imposibilidad de poder solubilizar los compuestos metlicos
tomados empleando arena como soporte. Se puede pensar que un mayor
tiempo de contacto entre bacteria y metal podra llevar a la acidificacin
del medio para bajas concentraciones de metal.
Por tanto, se puede concluir que la solubilizacin de metales en
forma de compuestos insolubles, tanto libres como alojados en una matriz
de un soporte (como la arena) que puedan interferir en la actividad
metablica de estas bacterias, sera ms conveniente realizarlo de forma
indirecta, es decir, creciendo el cultivo de las bacterias en su medio de
crecimiento ptimo con azufre como fuente de energa. A continuacin, se
utiliza el medio cido generado en el metabolismo microbiano para ponerlo
en contacto con el residuo slido donde se encuentre el metal objeto de
lixiviacin.
167
RESULTADOS
1.2 SOLUBILIZACIN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON At.

thiooxidans EN CONTINUO
Para el estudio de solubilizacin de cromo, nquel y zinc por la accin
de At. thiooxidans en continuo se emple un cultivo de este microorganismo
crecido en un reactor de tanque agitado y cuyo medio, una vez alcanzado
un pH igual a 1, se haca pasar a travs de una columna de lecho fijo con
una arena contaminada por estos metales. El sistema empleado se muestra
en la figura 31.
Figura 31: Sistema empleado para la solubilizacin continua de una arena contaminada de
Cr(III), Ni(II) y Zn(II) mediante el medio cido generado por At. thiooxidans crecido en cultivo
sumergido.
Inicialmente, el crecimiento de At. thiooxidans (figuras 32 y 33) en

cultivo sumergido se mantuvo 3 das en rgimen discontinuo hasta alcanzar
un pH de 0,99 (800 Mcel/ml, 0,23 g H+/l, 15,5 g SO4=/l) y, a partir de ese
168
RESULTADOS
momento, se comenz a trabajar con alimentacin continua. Inicialmente
se estableci un caudal de 12 ml/h, que result muy bajo, y provoc gran
inestabilidad en el cultivo, de forma que se llegaron a alcanzar valores de
pH por debajo de 1 y grandes fluctuaciones en la poblacin celular. Sin
embargo, a partir de los 12 das, el pH del cultivo se estabiliz en un valor
prximo a 1 y una poblacin de 300 Mcel/ml, para un caudal de 15 ml/h
(THR 2,2 das). Esta situacin se mantuvo, hasta que la poblacin subi en el
da 30 de operacin hasta un valor de 700 Mcel/ml, sin que hubiese ningn
otro cambio aparente, posiblemente por una adaptacin del cultivo a las
condiciones de operacin. De cualquier forma, esta nueva situacin
termina en un nuevo estado estacionario que resulta adecuado para el
objetivo que se persigue en esta experiencia. En ambos casos, se puede
observar que se trabaja en rgimen de estado estacionario, ya que el resto
de parmetros (concentracin de sulfato y protones) tambin permanecen
en valores casi constantes durante los perodos anteriormente reseados.
1600
2.5
1400
Mcel/ml
1000
1.5
800
600
400
pH
1200
0.5
200
0
0
0
10
20
30
40
Tiempo (das)
Mcel/ml
pH
Figura 32: Seguimiento de la poblacin bacteriana y el pH en el reactor de At. thiooxidans.
169
[SO4=] g/l
20
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
15
10
5
0
0
10
20
30
[H+] g/l
RESULTADOS
40
Tiempo (das)
[SO4]
[H+] g/l
Figura 33: Seguimiento de la concentracin de sulfato y de protones en el reactor de At.

thiooxidans.
El medio cido generado en este reactor se empez a circular a

travs de la columna una vez alcanzado el estado estacionario en el
reactor de At. thiooxidans. Inicialmente, el lixiviado obtenido present un pH
bsico debido a la alcalinidad de la arena, y a medida que fue pasando el
medio cido por el lecho se produjo la neutralizacin de los compuestos del
residuo hasta alcanzar un pH menor a 1, cuando se haba obtenido un
volumen de lixiviado de 600 ml.
De esta forma, mientras el lixiviado obtenido fue bsico, no se
observ solubilizacin alguna de zinc, sin embargo fue ms significativa para
el nquel, alcanzando su concentracin mxima, y tambin se observ
solubilizacin del cromo (figura 34). Una vez que el pH fue menor a 2, se
increment considerablemente la lixiviacin del zinc, alcanzndose una
concentracin mxima de 186,8 ppm. Pasados 5 litros de medio cido, la
cantidad lixiviada de este metal fue insignificante.
170
140
120
100
80
60
40
3
2
20
[Zn(II)]
[Cr(III)], [Ni(II)] y pH
RESULTADOS
-20
0
10
12
Volum en de liviviado (l)

[Cr(III)]
[Ni(II)]
pH
[Zn(II)]
Figura 34: Concentracin de los iones metlicos en el volumen de total de lixiviado.
En este perodo de solubilizacin de zinc, se solubiliz una pequea

fraccin de cromo y nquel que permanecieron prcticamente constantes
en un rango entre 1-3 ppm. Cuando el volumen de lixiviado obtenido
alcanz los 4,5 litros se registr un incremento notable de la lixiviacin de los
tres metales estudiados. Este hecho no se observ en otros experimentos
posteriores de solubilizacin continua llevados a cabo en este trabajo, con
el mismo tipo de residuo aunque en distintas condiciones de produccin de
cido y cantidad de metal. Por tanto, esta anomala pudo deberse a que la
compactacin de la arena hizo que se formaran caminos preferenciales del
medio cido a travs del lecho, de modo que, a partir de un momento, al
producirse
la
solubilizacin
de
algunos
compuestos
se
redujo
la
compactacin del lecho facilitndose as el contacto del medio cido con

otra porcin an muy rica en metal y, por tanto, la lixiviacin de una gran
proporcin del metal presente. Este comportamiento viene a resaltar la
necesidad de una adecuada homogeneizacin previa del residuo a tratar
para evitar cambios indeseables en el proceso de solubilizacin.
171
RESULTADOS
En la ltima fase del proceso se registr la lixiviacin del cromo,
principalmente, ya que es el metal que aun quedaba en mayor cantidad,
la concentracin mxima de este metal en el lixiviado se mostr una vez
obtenidos 4,5 litros de lixiviado.
Finalmente, y tras hacer pasar 11,4 litros de medio cido se obtuvo
una elevada solubilizacin de todos los metales: 55,4% de Cr(III), 100% de
Ni(II) y 100% de Zn(II).
Como se puede observar, el procedimiento seguido es adecuado
para llevar a cabo la solubilizacin de los metales estudiados cuando stos
se encuentran presentes en medios contaminados, pero esto implica el
consumo de un elevado volumen de cido y, para ello, el mantenimiento
de un cultivo de bacterias azufre-oxidantes en continuo durante unos 40
das. Cabe resaltar que, en la etapa final del proceso la cantidad de metal
solubilizado fue bastante baja a pesar del volumen de cido invertido en el
proceso. Por tanto, habra que llegar a una situacin de compromiso entre
la cantidad de metal solubilizado y el consumo de medio cido de modo
que el proceso resulte viable, siempre que se consiga un residuo con
concentraciones permitidas por la legislacin con el menor consumo de
medio cido posible.
En este punto, sera necesario realizar una valoracin tcnica y
econmica del proceso de solubilizacin continua de los metales presentes.
Por un lado, estimar econmicamente el medio cido necesario para llegar
a los niveles de solubilizacin deseados y establecer una comparacin
respecto a la utilizacin de cido obtenido por va qumica, para
determinar la viabilidad econmica del proceso. Por otro lado, habra que
estudiar la componente ambiental del proceso, de tal forma que se pueda
valorar la incidencia sobre el medio ambiente de un medio cido generado
por un proceso biolgico frente a un medio cido mineral. De cualquier
172
RESULTADOS
forma, este aspecto se escapa de los objetivos planteados en este trabajo y
sera necesario realizar un estudio ms detallado que permitiera llegar a
conclusiones adecuadas.
En general, la obtencin biolgica de cido sulfrico a partir de una
fuente relativamente barata, el azufre elemental, resulta econmicamente
favorable frente al tratamiento con soluciones concentradas de cido
sulfrico, ya que se reducen los costes de obtencin y transporte del cido
y, a su vez, su impacto ambiental. Adems, el pH en el medio de
crecimiento de la bacteria desciende gradualmente, de modo que, los
metales presentes en el medio pasan a solucin a diferentes velocidades en
funcin de sus solubilidades, permitiendo as ser separados de la solucin de
forma selectiva.
Al mismo tiempo, en este proceso se ha utilizado un reactor continuo
con la biomasa en suspensin y sera ms adecuado, para favorecer la
generacin de medio cido por parte de las bacterias azufre-oxidantes, la
inmovilizacin de las bacterias en un soporte inerte, ya que esta operacin
permite una mayor concentracin de la poblacin celular, un menor riesgo
de lavado celular, por lo que se puede trabajar a mayores velocidades de
dilucin, y una menor influencia de los cambios de las condiciones externas
sobre el crecimiento del cultivo.
173
RESULTADOS
2 REDUCCION DEL Cr(VI)

2.1 EXPERIENCIAS DE REDUCCIN DEL Cr(VI) EN
DISCONTINUO
Como ya se ha reseado en los antecedentes de la presente
memoria, en aquellos residuos que se encuentra contaminacin por cromo
ste suele estar presente tanto en forma hexavalente como trivalente. Por
tanto, dada la alta toxicidad que presenta la primera de las formas
mencionadas se hace necesario disponer de algn tratamiento que
permita la reduccin del Cr(VI) a Cr(III) para su posterior eliminacin del
residuo contaminado. En este sentido, y aprovechando la habilidad que
tienen las bacterias acidfilas del gnero Acidithiobacillus para tolerar y
reducir el cromo hexavalente, se programaron una serie de experiencias
con Acidithiobacillus ferrooxidans y Acidithiobacillus thiooxidans para
determinar los niveles de tolerancia a este inde estas bacterias en rgimen
discontinuo y, posteriormente, se aplic esta propiedad para el tratamiento
de un residuo de cromo en rgimen continuo.
Para estudiar la tolerancia al cromo (VI) y la capacidad de reduccin
de este in por parte de las bacterias azufre-oxidantes, se cultiv a At.
ferrooxidans y At. thiooxidans en presencia de varias concentraciones de
cromo hexavalente (1, 2,5, 5 y 10 ppm), mediante la adicin de una
disolucin de dicromato potsico. Al mismo tiempo, se prepar un control
estril con una concentracin de 10 ppm de este in metlico para su
comparacin con los cultivos bacterianos y poder discernir la posible
influencia de un mecanismo qumico de reduccin. Durante toda la
experimentacin se sigui la evolucin del pH, la concentracin de
biomasa total y la concentracin de cromo (VI) en solucin.
174
RESULTADOS
Analizando el comportamiento de At. ferrooxidans frente a las
distintas concentraciones de cromo (VI) (figura 35), se puede observar que
la presencia de concentraciones menores de 5 ppm de Cr (VI) no afectan
significativamente al crecimiento microbiano, de tal forma que se pueden
alcanzar concentraciones microbianas similares al cultivo control sin
presencia de metal. As, para una concentracin mayor de 5 ppm se
observa un cierto grado de inhibicin (se alcanza un 70% menos de
concentracin bacteriana), aunque s es posible registrar un alto grado de
reduccin del Cr(VI) con un desfase de 48 horas respecto a las
concentraciones menores ensayadas. En presencia de 10 ppm de cromo
(VI), no se observa crecimiento celular y el pH permanece constante, lo cual
indica inhibicin total de la actividad bacteriana, ya que no se observ
aumento de la concentracin de protones en el medio y, por tanto,
oxidacin del azufre suplementado.
Para las menores concentraciones ensayadas (1 y 2,5 ppm) se
registr una reduccin completa del Cr(VI) en 24 horas, y hasta que no se
reduce todo el cromo no se observa descenso del pH, debido a la
oxidacin de azufre y, por tanto, un aumento del crecimiento bacteriano.
Este hecho coincide con el observado por Sisti y col. (1998), quienes
recogen este hecho experimental, de tal forma que el crecimiento
bacteriano se empieza a detectar de forma considerable cuando
desaparece la presencia del cromo (VI) y comienza el mecanismo de
oxidacin del azufre coloidal presente en el medio de cultivo.
Todos los experimentos realizados se detuvieron tras 11 das de cultivo,
bien porque se registr un descenso acusado del pH para aquellos que
haban conseguido la reduccin del cromo (VI), o bien porque no se registr
actividad microbiana tras este tiempo de cultivo.
175
RESULTADOS
(a) pH
6
Af
pH
Af1
Af2,5
Af5
Af10
C10
1
0
0
10
12
(b) Poblacin bacteriana

1200
Mcel/ml
1000
800
600
400
200
0
0
10
12
(c) Concentracin de Cr(VI)
12
[Cr(VI)] (ppm)
10
8
6
4
2
0
0
10
12
Tiempo (das)
Figura 35:Evolucin del pH (a), poblacin bacteriana (b) y concentracin de Cr(VI) (c) pra
At. ferrooxidans
176
RESULTADOS
Cabe resaltar que no se produce reduccin del cromo (VI) de tipo
qumico ya que el cultivo estril a 10 ppm de este metal, se mantuvo en los
niveles iniciales y adems no registr descenso del pH.
Esta misma experiencia se realiz con At. thiooxidans
y la
representacin de cada uno de los parmetros medidos se recoge en la

figura 36. A diferencia de los cultivos con At. ferrooxidans, se puede observar
que At. thiooxidans es un poco ms sensible a la presencia de cromo (VI),
ya que aunque para el cultivo con la menor concentracin se puede
registrar un comportamiento similar al observado para At. ferrooxidans, con
una reduccin total y crecimiento similar, para las concentraciones
superiores se observa un comportamiento distinto. De esta forma, para una
concentracin de 2,5 ppm de Cr(VI) se observa una fase de latencia de 96
horas, a pesar de que se puede conseguir la reduccin completa del cromo
(VI) a las 24 horas de cultivo.
At. thiooxidans es inhibido notablemente por 5 ppm de Cr(VI), ya que
se puede observar una reduccin inicial del 50% de la concentracin a las
48 horas del cultivo, mantenindose prcticamente constante en este nivel
hasta los 11 das de cultivo. Al mismo tiempo, no se observ un crecimiento
celular significativo, ni tampoco un descenso en el valor del pH. Por tanto, se
puede decir que, aunque la poblacin bacteriana inicial del cultivo tiene
capacidad de reduccin del cromo (VI) presente, no es capaz de continuar
dicha reduccin hasta el 100% porque se encuentra inhibido el crecimiento
microbiano por la presencia del metal. Este misma discusin sera aplicable
al cultivo con 10 ppm de cromo (VI), ya que se registra un leve descenso de
la cantidad de cromo (VI) a las 24 horas de cultivo, pero no se detect
crecimiento microbiano alguno debido a la inhibicin completa de la
actividad bacteriana que se mantiene constante durante todo el tiempo de
cultivo.
177
RESULTADOS
(a) pH
5
At
At1
At2,5
pH
At5
At10
C10
2
1
0
0
10
12
(b) Poblacin bacteriana

1000
Mcel/ml
800
600
400
200
0
0
10
12
(c) Concentracin de Cr(VI)

12
[Cr(VI)] (ppm)
10
8
6
4
2
0
0
10
12
Tiempo (das)
Figura 36: Evolucin del pH. (a), poblacin bacteriana (b) y concentracin de Cr(VI) (c) para
At. thiooxidans
178
RESULTADOS
Por tanto, a la vista de los resultados obtenidos en estos experimentos,
se puede concluir que ambas especies bacterianas tienen una respuesta
similar a la presencia de este in aunque no presentaron igual nivel de
tolerancia. Los datos obtenidos se resumen en la tabla siguiente:
% Cr(VI)
Tiempo
reducido
(das)
Af1
100
Af2,5
100
Af5
100
Af10
32,69
11
At1
100
At2,5
100
At5
64,7
11
At10
16,53
11
C10
1,53
11
Experiencia
Tabla 25: Porcentaje de reduccin del Cr(VI) para At. ferrooxidans y At. thiooxidans y tiempo
empleado para obtener el nivel de reduccin indicado
En el trabajo llevado a cabo por Quintana y col. (2001) se estudi la

reduccin de una solucin de 10 ppm de Cr(VI) a partir del medio
generado por un cultivo discontinuo de At. ferrooxidans. El proceso se realiz
de forma indirecta, sin poner en contacto la bacteria con el cromo
hexavalente, los compuestos reductores generados y adheridos al azufre
coloidal se hicieron pasar sobre la solucin de cromo(VI). Este modo de
trabajo permiti una mayor reduccin, obtenindose para pH 2 una
reduccin del 45%.
En un estudio realizado por Viera y col. (2003) de forma similar pero en
este caso con At. thiooxidans, se obtuvo la reduccin de aproximadamente
el 60% del cromo(VI) para una solucin de 10 ppm. No obstante, el volumen
de disolucin tratada en cada caso fue de 5 y 20 ml respectivamente, con
lo que la cantidad total de cromo reducido es menor que en el presente
179
RESULTADOS
trabajo, pero, por otra parte, estos estudios presentan como ventaja el poco
tiempo de contacto necesario para llevar a cabo estos niveles de
reduccin, que fue tan slo de unos minutos.
Los resultados encontrados en la bibliografa acerca de la reduccin
de forma indirecta del cromo (VI) con el medio generado por la bacterias
del gnero Acidithiobacillus, as como la baja tolerancia de estas bacterias
al cromo hexavalente hace pensar en la conveniencia de disear procesos
de reduccin de este in de forma indirecta, donde se puedan aprovechar
la capacidad para generar compuestos reductores y para reducir este in
de dichas bacterias sin daar su metabolismo celular. Con dicho objetivo, se
procedi al desarrollo de un sistema en rgimen continuo y de contacto
indirecto entre el medio generado por las bacterias y el concentrado de
cromo.
180
RESULTADOS
2.2 REDUCCIN DE Cr(VI) Y SOLUBILIZACIN DE

Cr(III) CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN
CONTINUO
El objetivo de esta experiencia fue aplicar la capacidad de las
bacterias azufre-oxidantes para reducir el Cr(VI) a Cr(III), y, a su vez,
solubilizar el Cr(III), presente en forma insoluble, de un residuo operando en
rgimen continuo. El sistema empleado se muestra en la figura 37.
Figura 37: Sistema empleado para la reduccin de Cr(VI) y solubilizacin de Cr(III) de un

residuo por la accin de At. thiooxidans inmovilizado sobre azufre elemental.
Para llevar a cabo este proceso se inmoviliz At. thiooxidans sobre

azufre elemental siguiendo el proceso descrito en la seccin de Material y
Mtodos de esta memoria. El uso de esta bacteria permite la produccin de
181
RESULTADOS
un medio con mayor concentracin de protones y en menor tiempo que At.
ferrooxidans, lo cual resulta ventajoso para la solubilizacin del Cr(III).
Se inocul al 10% el medio 0K presente en la columna con un cultivo
At. thiooxidans en la fase exponencial de crecimiento y se realizaron varios
ciclos de inmovilizacin para asegurar una elevada concentracin celular.
La finalizacin de cada ciclo se estableci cuando el pH en el reactor
alcanz un valor prximo a 1, momento en el que se renov el medio.
Despus de varios ciclos de inmovilizacin, se consider que la formacin
de la biopelcula era estable cuando la concentracin de protones y la
poblacin celular en suspensin permanecieron constantes tras cada ciclo.
Los intervalos de tiempo en los que no se estuvo incorporando
alimentacin a la columna, se trabaj en rgimen discontinuo con
recirculacin del medio para proporcionar homogeneidad y favorecer el
acceso del medio a todas las partculas de azufre contenidas en sta.
En la figura 38 se presentan los valores de pH y poblacin celular
durante toda la etapa de inmovilizacin. Como se puede observar, se
necesitaron 250 horas de operacin para alcanzar una poblacin celular
estable cercana a los 300 Mcl/ml en la columna. Alcanzado el estado
estacionario, se continu operando por cargas, de tal forma que cuando el
pH era menor o igual a 1, se proceda a la descarga del medio y la carga
posterior con medio 0K hasta conseguir nuevamente un pH de 1
182
RESULTADOS
2,5
350
300
200
1,5
150
pH
Mcel/ml
250
100
0,5
50
0
0
50
100
150
200
0
300
250
Tiempo (horas)
Mcel/ml
pH
Figura 38: Evolucin del crecimiento bacteriano de At. thiooidans inmovilizado sobre
partculas de azufre
El medio descargado de la columna de inmovilizacin se hizo pasar

por otra columna donde se encontraba un residuo que contena cromo
trivalente y hexavalente. Los resultados obtenidos en la etapa de
16
14
12
10
[Cr(VI)] (mg/l)
[Cr(III)] (g/l) pH
reduccin/solubilizacin del cromo se representan en la figura 39.
0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0
4500
Volumen de lixiviado (ml)

pH
[Cr(III)] g/l
[Cr(VI)] mg/l
Figura 39 Evolucin del pH y concentracin de Cr(III) y Cr(VI) en el lixiviado obtenido en

funcin del volumen de medio cido pasado a travs de la columna de residuo
183
RESULTADOS
Inicialmente el medio cido provoc dos efectos:
Se produjo la disminucin de la alcalinidad propia del residuo.

El medio cido puede solubilizar los compuestos arcillosos que
forman parte del residuo, pero el pH se mantiene en valores
elevados y en estas condiciones no se aprecia solubilizacin
del Cr(III).
La salida presenta una concentracin significativa de Cr(VI), y

por tanto, este hecho indica un tiempo insuficiente de
contacto entre el medio y el residuo para que se lleve a cabo
la reduccin o bien que la concentracin de azufre coloidal y,
por tanto, de compuestos reductores, no fue suficiente para
producir la reduccin del Cr(VI).
De esta forma, se puede observar que hasta que el volumen del

medio cido pasado no super los 2 litros, se siguieron observando
fluctuaciones en el pH del lixiviado y la concentracin de Cr(III) estuvo
siempre por debajo de 10 ppm. Tan slo en un caso (Vlixiviado = 1030 ml) en el
que se produjo una disminucin notable del pH, se observ una lixiviacin
importante de Cr(III) (69 mg). Esta disminucin es de carcter puntual y
pudo deberse a la acidificacin de una zona determinada por el
establecimiento de un camino preferencial del medio.
Por tanto, despus de un tiempo de operacin bajo estas
condiciones, se concluy que el rgimen por cargas no era el ms
adecuado para llevar a cabo la reduccin, ya que en aquellos perodos de
tiempo
sin
entrada
de
alimentacin,
el
sistema
se
mantena
en
recirculacin, y pudo ocurrir que la poca cantidad de metal que se hubiera

lixiviado por la accin del medio cido, volviera a precipitar en el residuo.
Este hecho est perfectamente justificado por el equilibrio cido-base que
184
RESULTADOS
se establece entre el medio cido y el residuo arcilloso, provocando que el
pH global aumente y no se registre lixiviacin apreciable.
Por ello, a partir de los primeros 1900 ml se decidi interrumpir la
recirculacin del medio cido y se comenz a operar de forma continua
con el medio obtenido directamente de la columna de inmovilizacin,
siendo el caudal de salida del lixiviado de la columna sensiblemente menor
que el de alimentacin para facilitar un tiempo de contacto suficiente para
la solubilizacin. Una vez detenida la alimentacin se mantena la salida de
efluente hasta vaciar la columna de todo el medio lquido, quedando as
preparado para la siguiente carga.
Con este cambio en el rgimen de operacin de la columna se
registr una inmediata solubilizacin de cromo (III) y un descenso
considerable del pH que se mantuvo en un rango entre 1,8-3.
Durante las primeras horas de funcionamiento, las caractersticas del
lixiviado estuvieron fluctuando hasta alcanzar unos valores constantes una
vez que el volumen acumulado de medio cido super los 3300 ml. En este
momento, la concentracin de Cr(III) se mantuvo en torno a los 4000 ppm y
el valor de pH estuvo siempre por debajo de 2,5. Despus de hacer pasar 4
litros de medio cido, se obtuvo un 12% de la solubilizacin del Cr(III) (5,68
gramos de los 47,1 presentes en el residuo), aunque habra que destacar
que un 8% se obtuvo en los ltimos 900 ml recogidos, una vez alcanzada la
composicin constante en el lixiviado.
Siguiendo la tendencia obtenida en esta ltima fase, se puede
realizar una estimacin terica del volumen necesario para lixiviar todo el
cromo presente. En estas condiciones se obtuvo una solubilizacin media de
421,14 mg Cr(III) / 100 ml de medio cido, es decir, 4,21 g Cr(III) / L.
185
RESULTADOS
La cantidad de Cr(III) que permanece en la columna sera de:
47,1 g Cr(III) totales 5,68 g Cr(III) lixiviados = 41,42 g Cr(III) sin lixiviar
que necesitaran:
41,42 g Cr(III) / 4,21 g Cr(III) / L = 9,83 l de medio cido.
Aproximadamente 10 litros de medio seran necesarios para la
lixiviacin del 100% del cromo contenido en el residuo. Se observa que un
volumen similar de medio cido fue necesario para la solubilizacin de tan
slo el 54,6% del cromo presente en la arena en la experiencia de
solubilizacin continua descrita con anterioridad, a pesar de que la
cantidad de cromo fue menor (se solubilizaron 41mg de 75mg totales). Este
hecho se debe, fundamentalmente, a la distinta solubilidad de los
compuestos de cromo tratados en cada caso. Adems se corrobora que
para una mayor concentracin de metal se da una mayor solubilizacin,
como se observ en la etapa de solubilizacin en discontinuo.
Con respecto a la reduccin de Cr(VI), no se detect la presencia de
este in a partir de los 2900 ml de lixiviado obtenido, si bien la cantidad de
Cr(VI) acumulada en el lixiviado alcanz los 11,5 mg de los 157 mg totales, lo
que indica que el 7,34% de Cr(VI) no fue reducido y que, por tanto, se
obtuvo una reduccin del 92,66%. Se comprob que el proceso de
reduccin de forma indirecta y continua resulta viable ya que permite una
elevada reduccin del cromo hexavalente sin interferir en el metabolismo
celular, y en mayor medida que en las experiencias de contacto indirecta
pero en rgimen discontinuo presentadas por Quintana y col. (2001) y Viera
y col. (2003).
186
RESULTADOS
3 PRECIPITACIN DE Cr(III), Ni(II) y Zn(II)

3.1 ESTUDIO DE TOLERANCIA Y PRECIPITACIN DE
Cr(III), Ni(II) y Zn(II) CON BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS EN DISCONTINUO
3.1.1 Estudio con Cr(III)
Para el estudio de la tolerancia de las bacterias sulfato-reductoras al
ion cromo(III) se emplearon las cepas Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio
sp. y se suplement el medio de crecimiento Postgate C con Cr2(SO4)3 para
obtener las siguientes concentraciones iniciales: 1, 4,5, 9, 12 y 15 ppm de
Cr(III).
El crecimiento bacteriano se vio inhibido para las dos cepas por la
presencia de este metal (figura 40), incluso para la menor concentracin
estudiada (1 ppm) la poblacin no alcanz el mximo de crecimiento
obtenido por la bacteria sin metal (control Dv y Dsp). Adems se observ
que, a partir de los siete das, se produce una estabilizacin de la poblacin.
El descenso de la concentracin de sulfato (figura 41) fue paralelo al
crecimiento celular. Los cultivos con mayor crecimiento presentaron un
mayor consumo de este sustrato hasta los siete das, momento a partir del
cual la concentracin de sulfato se mantiene prcticamente constante.
La medida de la concentracin de cromo(III) soluble en el medio
permiti calcular el porcentaje de cromo precipitado con respecto al
suplementado inicialmente. Estos valores estn representados en la figura
42.
A
simple
vista
se
puede
observar
que
el
porcentaje
de
bioprecipitacin aumenta a lo largo del tiempo y que la cantidad de metal

precipitado es mayor cuanto mayor es la cantidad inicial, lo cual da lugar a
187
RESULTADOS
mayores
porcentajes
de
precipitacin.
De
este
modo,
la
mayor
precipitacin ocurre para los cultivos suplementados con 15 ppm de Cr(III) a

los once das, obtenindose un 24,7 % de precipitacin para la cepa pura y
un 24,13% para el cultivo mixto.
(a) Desulfovibrio vulgaris
600
Mcel/ml
500
1 ppm
4,5 ppm
9 ppm
12 ppm
15 ppm
control Dv
400
300
200
100
0
0
10
12
Tiempo (das)
(b) Desulfovibrio sp.

700
600
1 ppm
4,5 ppm
9 ppm
12 ppm
15 ppm
control Dsp
Mcel/ml
500
400
300
200
100
0
0
10
12
Tiempo (das)
Figura 40:Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en

presencia de cromo(III)
188
RESULTADOS
sulfato (ppm)
4000
1 ppm
4,5 ppm
9 ppm
12 ppm
15 ppm
C 15 ppm
control Dv
3500
3000
2500
2000
1500
0
10
12
Tiempo (das)

4000
1 ppm
4,5 ppm
9 ppm
12 ppm
15 ppm
C 15 ppm
control Dsp
sulfato (ppm)
3500
3000
2500
2000
1500
0
10
12
Tiempo (das)
Figura 41 Consumo de sulfato de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia
de cromo(III).
A los once das, los valores de precipitacin son muy similares para
ambos casos, sin embargo, a los tres das, se observa una mayor
189
RESULTADOS
precipitacin para el cultivo mixto, lo cual aporta una ventaja en el sentido
del tiempo, ya que en cuatro das se obtiene el 10-15% de precipitacin.
% bioprecipitacin
25
20
15
10
5
0
4
7
Tiempo (dias)
1 ppm
4,5 ppm
9 ppm
12 ppm
11
15 ppm
C 15 ppm
% bioprecipitacin
25
20
15
10
5
0
4
11
Tiempo (dias)
1 ppm
4,5 ppm
9 ppm
12 ppm
15 ppm
C 15 ppm
Figura 42: Precipitacin de cromo(III) con Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp.(b)
Para los ensayos estriles preparados con 15 ppm de Cr(III) se detect

una precipitacin menor del 1%, este hecho permite justificar que no hay
190
RESULTADOS
precipitacin en ausencia de microorganismos, y que el compuesto
responsable de la precipitacin slo se produce por un mecanismo
biolgico.
Adems de la capacidad de precipitacin, se puede determinar a
partir de este estudio la tolerancia de las bacterias sulfato-reductoras al ion
Cr(III). El lmite de tolerancia est en torno a 15 ppm, ya que a dicha
concentracin se observ una importante inhibicin del crecimiento y un
descenso de la actividad metablica con menor consumo de sulfato. A
pesar de ello, se obtuvo una precipitacin de Cr(III) que puede justificarse
con la produccin de sulfuro. En los estudios con concentraciones mayores
(20 ppm, datos no mostrados) se encontr una alta toxicidad para ambas
cepas, registrndose la muerte celular y la ausencia de actividad
metablica.
Los valores de tolerancia (15 ppm) son mucho menores que los
obtenidos por Hao y col.(1994), que presentaron un cultivo mixto de
bacterias sulfato-reductoras que tolera 60 ppm de Cr(III). Sin embargo, Viera
y col. (2003) encontraron el mismo nivel de tolerancia para ambos cultivos a
20 ppm de Cr(III).
3.1.2 Estudio con Cr(VI)

Habitualmente, los medios contaminados por cromo presentan
cromo hexavalente junto con el cromo trivalente. Aunque un objetivo de
nuestro estudio es la reduccin del Cr (VI) a Cr (III) mediante el trabajo de
las bacterias azufre-oxidantes, puede ocurrir que el lixiviado arrastre cromo
hexavalente si no se ha producido una reduccin total. Por ello, parece
interesante estudiar la tolerancia de estas bacterias al ion Cr (VI).
Dado que la cepa mixta en el estudio de precipitacin del Cr(III), y
de otros iones, mostr mayor actividad se decidi realizar la experiencia con
191
RESULTADOS
este cultivo. Para ello, se procedi de forma similar a los experimentos
anteriores. Se prepararon 50 ml de medio Postgate C con concentraciones
de 1, 5 y 10 ppm de Cr(VI) y se inculo al 10% con Desulfovibrio sp. En este
caso, tan slo se llev a cabo el estudio de la tolerancia del cultivo mixto a
este in metlico, por tanto, no se realiz el seguimiento de la
concentracin de metal en el sobrenadante. A partir de los resultados
obtenidos de la poblacin celular (figura 43) y el consumo de sulfato (figura
44),
se
deduce
claramente
la
tolerancia
de
Desulfovibrio
sp.
concentraciones de 1 y 5 ppm de Cr(VI) aunque se observa una ligera

inhibicin si comparamos la evolucin de estos dos parmetros para cultivos
suplementados con metal y el cultivo control. Sin embargo, una
concentracin de 10 ppm de Cr(VI) result txica para la clula. Los datos
de tolerancia obtenidos permitieron realizar un estudio posterior con
Desulfovibrio sp. en presencia Cr(VI) y Cr(III) en solucin.
1000
900
800
Mcel/ml
700
600
500
control Dsp
400
1 ppm
300
5 ppm
200
10 ppm
100
C 10ppm
0
0
10
12
Tiempo (das)
Figura 43: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(VI).
192
RESULTADOS
4000
3500
sulfato (ppm)
3000
2500
control Dsp
2000
1 ppm
5 ppm
1500
10 ppm
C 10ppm
1000
500
0
0
10
12
Tiempo (das)
Figura 44: Consumo de sulfato de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(VI.)
3.1.3 Estudio con Cr(III) y Cr(VI)

Estudiada la tolerancia al Cr(III) y Cr(VI) de forma independiente, se
procedi a realizar el estudio de ambos iones en combinacin. A partir de
los datos obtenidos, se seleccionaron las concentraciones adecuadas para
llevar a cabo este estudio.
En esta experiencia, al igual que en las anteriores, se dispusieron
botes de vidrio de 50 ml, medio Postgate C suplementado con 15 ppm de
Cr(III) y 1, 2,5 y 5 ppm de Cr(VI). Para ello, se emplearon disoluciones de
Cr2(SO4)3 y K2Cr2O7. Se inocul al 10% con Desulfovibrio sp. crecido en
Postgate C. Se prepar tambin un control estril de 15 ppm de Cr(III) y 5
ppm de Cr(VI) (C15/5) para determinar si se produce precipitacin debido
a factores no biolgicos. Los ensayos se realizaron por duplicado y el
seguimiento del crecimiento fue muy similar al caso anterior (Figura 45).
193
RESULTADOS
600
Mcel/ml
500
400
300
control Dsp
200
15/1
100
15/2,5
15/5
0
0
10
12
14
Tiempo (das)
Figura 45: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(III) y Cr(VI).
La presencia de ambos iones afecta al crecimiento de la bacteria y

al sptimo da se produce el mximo crecimiento celular. El consumo de
sulfato se corresponde de forma directa con el crecimiento de la poblacin
y la precipitacin del metal.
En la figura 46 se muestran los porcentajes de precipitacin de cada
uno de los ensayos realizados. En esta experiencia, el cultivo mixto se mostr
tolerante a las mayores concentraciones probadas. La respuesta tuvo una
tendencia similar al caso anterior, de tal forma que a mayor concentracin
de metal presente en el medio mayor porcentaje de l precipita, este
hecho puede deberse a la posible reduccin del Cr(VI) a Cr(III) por parte de
las bacterias sulfato-reductoras, lo cual hace que la cantidad de Cr(III) en
solucin aumente y, por ello, se observe una mayor precipitacin. De
cualquier modo el porcentaje de precipitacin se situa en un valor cercano
al obtenido para 15 ppm de Cr(III).
194
RESULTADOS
30
% bioprecipitacin
25
20
15
10
5
0
15
15/1
15/2,5
15/5
C15/5
Figura 46. Porcentaje de bioprecipitacin para Desulfovibrio sp. En presencia de Cr(III) y

Cr(VI).
3.1.4 Estudio con Ni(II)

El estudio del efecto del ion Ni(II) sobre las bacterias sulfatoreductoras se realiz aadiendo al medio de crecimiento 1, 4, 8,5, 17 y 30
ppm de Ni(II) a partir de una disolucin de sulfato de niquel (NiSO4 H2O).
La evolucin del crecimiento bacteriano se muestra en la figura 47.
La poblacin aument de forma significativa hasta los siete das de cultivo y,
a partir de ah, se produjo una ligera estabilizacin. Resulta evidente que la
concentracin de metal afecta al metabolismo celular de tal modo que,
para ensayos con 17 ppm, el crecimiento fue muy bajo y para 25 ppm no se
observ crecimiento significativo. Se puede decir que la concentracin de
25 ppm de Ni(II) resulta txica para el cultivo puro (Dv) y el mixto (Dsp) ya
que, adems del descenso celular, no se observ consumo alguno de
sulfato.
195
RESULTADOS
1200
Mcel/ml
1000
1 ppm
800
4 ppm
8,5 ppm
600
17 ppm
400
25 ppm
Control Dv
200
0
0
10
12
Tiempo (das)
(b) Desulfovibrio sp .
1200
Mcel/ml
1000
1 ppm
4 ppm
8,5 ppm
17 ppm
25 ppm
Control Dsp
800
600
400
200
0
0
10
12
Tiempo (das)
Figura 47. Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en
presencia de nquel(II)
Al igual que ocurre en ausencia de metal, el cultivo mixto en

presencia de las concentraciones ms bajas de metal (1, 4 y 8,5 ppm)
alcanz una mayor concentracin celular que Desulfovibrio vulgaris a las
mismas concentraciones de metal.
196
RESULTADOS
Solo se produjo un consumo de sulfato significativo (Figura 48) en los
casos donde se observ crecimiento celular notable, siendo claramente
mayor el descenso de la concentracin de sulfato para el cultivo mixto.
4500
1 ppm
4 ppm
8,5 ppm
17 ppm
25 ppm
C 25 ppm
Control Dv
sulfato (ppm)
4000
3500
3000
2500
2000
1500
0
10
12
Tiempo (das)
4500
1 ppm
4 ppm
8,5 ppm
17 ppm
25 ppm
C 25 ppm
Control Dsp
sulfato (ppm)
4000
3500
3000
2500
2000
1500
0
10
12
Tiempo (das)
Figura 48. Consumo de sulfato de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia
de nquel(II)
197
RESULTADOS
En cuanto a la precipitacin de Ni(II) (Figura 49), se observ para
ambos cultivos una precipitacin en torno al 65% para los ensayos de 1
ppm, de un 92% para los ensayos de 4 ppm y un 96% para los de 8,5 ppm.
Para el experimento con 17 ppm de Ni(II), se registr una leve precipitacin
con el cultivo mixto(<20%), siendo nula para el cultivo puro.
% bioprecipitacin
120
100
80
60
40
20
0
4
11
Tiempo (dias)
1 ppm
4 ppm
8,5 ppm
17 ppm
C 25 ppm
% bioprecipitacin
120
100
80
60
40
20
0
4
1 ppm
4 ppm
7
Tiempo (dias)
8,5 ppm
17 ppm
11
C 25 ppm
Figura 49: Precipitacin de nquel(II) para Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en
presencia de nquel(II)
198
RESULTADOS
En el cultivo puro se puede observar que la precipitacin mxima
que se alcanza para el caso con 1 ppm ocurre en tan slo cuatro das, pero
los ensayos de 4 y 8,5 ppm mejoraron su precipitacin al cabo de los siete
das y este valor se mantiene constante en el siguiente muestreo.
Para el cultivo mixto los resultados de precipitacin obtenidos a los
cuatro das alcanzaron un mximo, ya que un mayor tiempo de cultivo no
conlleva un aumento de esta cantidad. Se puede decir que en tan solo
cuatro das, con este cultivo se pueden precipitar 8,5 ppm de Ni(II) casi en
su totalidad.
Ambos cultivos toleran hasta 8,5 ppm, y concentraciones mayores
ralentizan el crecimiento y reducen la capacidad reductora del sulfato de
estas bacterias. El cultivo mixto de bacterias sulfato-reductoras empleado
por Hao y col. (1994) result ms tolerante a la presencia de ion nquel (1020 ppm)
3.1.5 Estudio con Zn (II)

La experiencia fue realizada suplementando el medio de cultivo
Postgate C con sulfato de zinc (ZnSO4 7H2O) para obtener unas
concentraciones iniciales de Zn(II) de 5, 7, 10, 15 y 20 ppm.
El crecimiento bacteriano (Figura 50) se ve afectado de una forma
gradual en funcin de la concentracin de metal en el medio, siendo la
fase de latencia mayor a medida que aumenta la cantidad de zinc en
solucin. Se puede observar que el cultivo puro (Dv) presenta un
crecimiento similar a los 14 das de incubacin para los experimentos con
concentraciones menores de 10 ppm. De igual modo, el cultivo mixto (Dsp)
puede llegar a valores considerables de biomasa para concentraciones por
debajo de 15 ppm, encontrndose una importante inhibicin para el caso
de 20 ppm. Este comportamiento vuelve a poner de manifiesto que el
199
RESULTADOS
cultivo mixto tolera mayores concentraciones del metal en solucin, como
bien se ha observado con los metales ensayados anteriormente.
1000
5 ppm
7 ppm
10 ppm
15 ppm
20 ppm
control Dv
Mcel/ml
800
600
400
200
0
0
10
12
14
Tiempo (das)
1200
Mcel/ml
1000
5 ppm
7 ppm
10 ppm
15 ppm
20 ppm
control Dsp
800
600
400
200
0
0
10
12
14
Tiempo (das)
Figura 50: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en
presencia de zinc(II)
200
RESULTADOS
Como se observa en la figura 51, el consumo de sulfato se muestra
parejo al aumento de la poblacin. Cabe resaltar que en presencia de
Zn(II) se obtiene mayor poblacin celular y, por tanto, mayor consumo de
sulfato que en presencia de otros iones.
5000
5 ppm
7 ppm
10 ppm
15 ppm
20 ppm
C 20 ppm
control Dv
sulfato (ppm)
4000
3000
2000
1000
0
0
10
12
14
Tiempo (das)
sulfato (ppm)
5000
5 ppm
4000
7 ppm
10 ppm
3000
15 ppm
2000
20 ppm
C 20 ppm
1000
control Dsp
0
0
10
12
14
Tiempo (das)
Figura 51: Consumo de sulfato de Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b) en presencia
de zinc(II)
201
RESULTADOS
Si observamos los porcentajes de bioprecipitacin, se puede ver que
el comportamiento de los dos cultivos de bacterias sulfato-reductoras fue
bastante distinto en este caso (Figura 52).
% bioprecipitacin
120
100
80
60
40
20
0
4
11
14
Tiempo (dias)
5 ppm
7 ppm
10 ppm
15 ppm
20 ppm
C 20 ppm
120
% bioprecipitacin
100
80
60
40
20
0
4
11
14
Tiempo (dias)
5 ppm
7 ppm
10 ppm
15 ppm
20 ppm
C 20 ppm
Figura 52:. Precipitacin de zinc(II) para Desulfovibrio vulgaris (a) y Desulfovibrio sp. (b)
202
RESULTADOS
Para el cultivo Desulfovibrio vulgaris con 5 ppm de Zn(II) se alcanz
una precipitacin cercana al 100% tras siete das de incubacin y fueron
necesarios 11 das para alcanzar niveles similares en el experimento con 7 y
10 ppm. Para el resto de las concentraciones, tras 14 das de incubacin,
slo el caso de 15 ppm alcanz una precipitacin notable (20%), siendo tan
slo de un 9% para el cultivo de 20 ppm.
Estos resultados indican que existe una correspondencia entre el
crecimiento del cultivo y la concentracin de metal precipitado. De tal
modo que, la cantidad de metal precipitado aumenta en el tiempo hasta
alcanzar un mximo que coincide con el momento en que se supera la fase
exponencial de crecimiento en cada cultivo. Este hecho se corrobora
tambin para el cultivo mixto, donde a los 7 das se observa el mximo de
precipitacin para el cultivo con 5 ppm, a los 11 das, coincidiendo con el
aumento de la poblacin celular, se precipit el 99-95% del metal de los
cultivos con 7-15 ppm y a los 14 das se obtuvo una precipitacin del 93%
para el caso de 20 ppm. La concentracin mxima tolerada de zinc (20
ppm) coincide con la obtenida por Utgikar y col. (2001) aunque algo menor
que la presentada por Hao y col. (1994) cuyo cultivo mixto toler entre 25 y
40 ppm de este ion.
3.1.6 Estudio con Cr(III), Ni(II) y Zn(II)

Una
vez
estudiada
la
tolerancia
de
Desulfovibrio
vulgaris
Desulfovibrio sp. a los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) se llev a cabo un estudio
similar combinando estos metales, por pares y todos juntos. El objetivo de
este estudio es determinar el comportamiento de las bacterias sulfatoreductoras en presencia de una mezcla de iones metlicos, de forma similar
a como ocurrira en un medio natural.
203
RESULTADOS
Las concentraciones seleccionadas de cada metal fueron aquellas
toleradas por ambos cultivos y que presentaron una precipitacin
significativa. Con el fin de poder establecer comparaciones, dado que el
estudio con Cr(III) y Ni(II) se realiz hasta los 11 das de incubacin se
consideraron los valores correspondientes a este mismo tiempo para los
cultivos con Zn(II) y se establecieron iguales tiempos de muestreo en la
experiencia con combinacin de metales.
Se expuso a ambos cultivos a 15 ppm de Cr(III), 8,5 ppm de Ni(II) y 10
ppm de Zn(II). Las combinaciones se denominaron: CrNi, CrZn, NiZn y CrNiZn.
Figura 53: Experiencia de precipitacin de los iones cromo, nquel y zinc combinados en un
cultivo de Desulfovibrio vulgaris (11 das).
La evolucin de la concentracin celular de Desulfovibrio vulgaris

(Figura 54) en presencia de los metales fue similar, el crecimiento fue mayor
cuando los metales se encuentran combinados en parejas que para el
cultivo con cada uno de ellos por separado. La prolongada fase de
latencia del cultivo puro con 10 ppm de Zn(II) no se detecta cuando el
metal se encuentra combinado con alguno ms. Los datos de sulfato
(Figura 55) se muestran coherentes con el aumento de la poblacin celular.
204
RESULTADOS
Desulfovibrio vulgaris
Mcel/ml
800
700
Cr
600
Ni
Zn
500
CrNi
400
CrZn
300
NiZn
200
CrNiZn
100
0
0
10
12
Tiempo (das)
Figura 54: Crecimiento bacteriano para Desulfovibrio vulgaris en presencia de Cr(III), Ni(II) y
Zn(II).
Desulfovibrio vulgaris
4000
Cr
Ni
Zn
CrNi
CrZn
NiZn
CrNiZn
sulfato (ppm)
3500
3000
2500
2000
1500
1000
0
10
12
Tiempo (das)
Figura 55: Consumo de sulfato para Desulfovibrio vulgaris en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II)
En el caso del cultivo mixto (figura 56), el comportamiento es similar,

el crecimiento es mayor cuando se combinan dos metales, que cuando se
205
RESULTADOS
suplementan cada uno de ellos por separado. Se puede observar tambin
correspondencia entre crecimiento y consumo de sulfato (figura 57).
Desulfovibrio sp.
800
Cr
700
Ni
Mcel/ml
600
Zn
500
CrNi
400
CrZn
300
NiZn
200
CrNiZn
100
0
0
10
12
Tiempo (das)
Figura 56: Crecimiento bacteriano de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II).
sulfato (ppm)
Desulfovibrio sp.
4500
Cr
4000
Ni
Zn
3500
CrNi
3000
CrZn
2500
NiZn
2000
CrNiZn
1500
1000
0
10
12
Tiempo (das)
Figura 57: Consumo de sulfato de Desulfovibrio sp. en presencia de Cr(III), Ni(II) y Zn(II).
206
RESULTADOS
Podra pensarse en un efecto de co-precipitacin de los metales
cuando se dan condiciones reductoras en el medio, ya que en ausencia de
bacterias, el propio medio no produce precipitacin alguna, de tal forma
que los controles realizados con cada una de las combinaciones de metal
posibles no presentaron porcentaje de precipitacin mayor del 5%.
En la tabla 26 se muestran los porcentajes de bioprecipitacin de
cada metal individual y en combinacin para los dos cultivos de bacterias
sulfato-reductoras.
Cepa
Metales
slo
CrNi
CrZn
Cr(III)
24,7
28,0
29,2
Ni(II)
96,0
94,7
Zn(II)
92,9
Cr(III)
25,5
28,8
Ni(II)
96,1
95,4
Zn(II)
94,7
NiZn
CrNiZn
33,3
Desulfovibrio
100,0
95,1
100,0
100,0
vulgaris
Desulfovibrio
sp.
100,0
32,0
100,0
33,0
100,0
91,4
100,0
100,0
Tabla 26: Porcentajes de precipitacin de los iones metlicos solos y en combinacin para
Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio sp.
La cantidad de cromo precipitado aumenta en los ensayos en que se

encuentra combinado, aunque no se alcanzan los valores de precipitacin
tan elevados obtenidos para otros metales. Esta mejora puede atribuirse a
una co-precipitacin formando compuestos ms complejos, aunque esta
presuncin tendra que confirmarse mediante la determinacin analtica del
precipitado obtenido.
207
RESULTADOS
Las cantidades de nquel y zinc precipitados son bastante similares
cuando se encuentran solos o en combinacin, aproximadamente, se
alcanza el 100% de eliminacin del metal en solucin.
Para llegar a determinar las causas reales de este tipo de
comportamiento, sera necesario programar una nueva batera de
experimentos y profundizar en las tcnicas analticas para llegar a
determinar la naturaleza qumica de los precipitados obtenidos. Sin
embargo, estos experimentos no se han fijado como objetivos bsicos del
trabajo realizado y pueden constituir nuevos trabajos de investigacin
dentro de la lnea iniciada con este estudio.
Otro de los factores que puede influir significativamente en la
precipitacin de los metales en combinacin es la respuesta de las
bacterias ante los distintos metales. En este sentido, Utgikar y col. (2001)
presentaron un mecanismo de inhibicin de la reduccin de sulfato de las
bacterias sulfato-reductoras por la deposicin de las partculas del sulfuro
metlico formado sobre la membrana celular, lo que cual impide el acceso
de la materia orgnica y del ion sulfato a las inmediaciones de la clula,
reduciendo as la posibilidad de generar sulfuro y precipitar los iones
metlicos presentes en el medio. En la figura 17 se muestran fotografas
realizadas por microscopa electrnica donde se presenta un cultivo
Desulfovibrio sp. en presencia de una combinacin de cromo, nquel y zinc
al inicio de la experiencia y a los 14 das. Se observa claramente la
deposicin de precipitados sobre la superficie celular de las bacterias
cuando el proceso est por finalizar.
208
RESULTADOS
Figura 58: Fotografa de microscopa electrnica (x20000) de un cultivo Desulfovibrio sp. en

presencia de cromo, nquel y zinc para tiempo cero(izqda.) y a los 14 das (dcha)
Por tanto, la deposicin del sulfuro metlico sobre la superficie celular

puede explicar claramente el descenso de la actividad metablica de las
bacterias y de la bioprecipitacin de los metales estudiados.
209
RESULTADOS
3.2 PRECIPITACIN DE Cr(III), Ni(II) Y Zn(II) CON

BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN CONTINUO
Para el estudio de la precipitacin en continuo de los iones Cr(III),
Ni(II) y Zn(II) por la accin de las bacterias sulfato-reductoras se emple un
reactor de tanque agitado donde se creci un cultivo de Desulfovibrio sp..
Se utiliz el cultivo mixto por presentar una mayor velocidad de crecimiento
y de reduccin de sulfato que el cultivo puro, como ya se observ en el
estudio de precipitacin discontinua.
Figura 59: Sistema empleado para la precipitacin de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) presentes
en un lixiviado artificial por el medio generado por un cultivo Desulfovibrio sp.
El medio obtenido del reactor, rico en sulfuro de hidrgeno, se gote

sobre un depsito donde se encontraba la solucin metlica que haba de
210
RESULTADOS
ser precipitada y a la disolucin resultante se la denomin como
precipitado. El equipo empleado se muestra en la figura 59.
El reactor de bacterias sulfato-reductoras se mantuvo en rgimen
discontinuo durante 2 das (figura 60), a partir de ese momento se trabaj a
caudales crecientes partiendo de 6 ml/h hasta 14 ml/h, caudal que se
establece a los 9 das. El cultivo se mantuvo con una poblacin celular entre
300-500 Mcel/ml y una concentracin de sulfato entre 2-2,5 g/l de sulfato a
700
3.0
600
2.5
Mcel/ml
500
2.0
400
1.5
300
1.0
200
100
0.5
0.0
0
10
20
30
[SO4=] (ppm)
lo largo de todo el perodo de experimentacin.
40
Tiempo (das)
Mcel/ml
[SO4=]
Figura 60: Evolucin de la poblacin celular y la concentracin de sulfato en el reactor de

Desulfovibrio sp.
Una vez conseguido el estado estacionario, el efluente del reactor se

introdujo en el reactor de precipitacin.
Inicialmente, para evaluar la capacidad de estas bacterias para
precipitar iones metlicos se emple una disolucin a la que denominamos
lixiviado artificial. La solucin, de 100 ml, se prepar con sulfato de cromo,
de nquel y de zinc, para obtener una composicin final de: 766 ppm de
Cr(III), 376 ppm de Ni(II) y 3521 ppm de Zn(II), cantidades similares a las
211
RESULTADOS
tomadas como referencia en apartados anteriores del estudio. La figura 61
presenta un cuadro resumen de la cantidad de cada uno de los metales
durante el proceso de bioprecipitacin.
Formato:
Lixiviado artificial
76,6
37,6
352,1
Lixiviado residual
66,6
32,5
188,3
Fraccin
23,1
14,7
0,9 l medio
D. sp.
10
5,1
mg
Ni(II)
mg
Zn(II)
% de precipitacin
163,8
13,1
13,6
46,5
Fraccin sin tratar

43,5
5 etapas
51,1
Precipitacin
mg
Cr(III)
4,51 l medio
D. sp.
17,8
137,2
% de precipitacin
Precipitacin
0,2
6,1
45
0,87
41,5
88,1
Datos globales
Cantidad de lixiviado
tratada
33,1
19,8
214,9
4,51 l medio
D. sp.
Precipitacin
10,2
11,2
% de precipitacin
208,8
30,8
56,6
97,2
Figura 61. Cuadro resumen del proceso de precipitacin de iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) por
Desulfovibrio sp.
La adicin de 900 ml de medio con sulfuro de hidrgeno, procedente

del reactor de crecimiento de las bacterias sulfato-reductoras, alcanz una
reduccin del 13,1% de Cr(III), 13,6% de Ni(II) y 46,5% de Zn(II). Dado que el
precipitado obtenido contena una gran cantidad de metales en solucin,
se tomaron distintas fracciones de esta disolucin con el fin de poder llegar
a establecer el lmite de precipitacin que se puede conseguir bajo esta
metodologa. De esta forma, del lixiviado residual que qued de esta
primera etapa se trataron 23,1 mg de Cr(III), 14,7 mg de Ni(II) y 51,1 mg de
Zn(II) en total, y esta cantidad en solucin fue procesada mediante cinco
etapas de precipitacin que permitieron llegar a precipitar el 0,87% de
212
RESULTADOS
Cr(III), el 41,5% de Ni(II) y el 88,1% de Zn(II). Si consideramos que una fraccin
de la disolucin inicial no fue tratada, se puede calcular el porcentaje total
de precipitacin respecto a la cantidad de metal procesada, y de esta
forma, se obtuvo un 30,8% de Cr(III), 55,8% de Ni(II) y 97,16% de Zn(II).
Se observa que la mayor precipitacin ocurre para el ion Zn(II), como
ocurre en el caso de las experiencias en discontinuo. Este hecho puede
deberse a que la de solubilidad del sulfuro de zinc es menor a la solubilidad
de los dems compuestos en las condiciones en que se encuentra el medio,
con lo cual incluso para concentraciones muy bajas de sulfuro de
hidrgeno se obtiene precipitacin de zinc, preferentemente.
De los resultados obtenidos se puede destacar que la mayor
precipitacin ocurre cuando las concentraciones de los iones metlicos a
tratar son ms elevadas, de modo que la mayor precipitacin ocurre en la
etapa
inicial.
Las
ltimas
fracciones
del
lixiviado
residual
tratadas
presentaron una precipitacin nula o muy baja de cromo y nquel y la

precipitacin de zinc se fue haciendo menor a medida que el contenido de
ste en las distintas fracciones iba disminuyendo. En general, se puede
deducir que este proceso no resulta viable para concentraciones
demasiado bajas, ya que implica un elevado consumo del medio generado
por las bacterias sulfato-reductoras. Este hecho se observa claramente en la
segunda parte del proceso, en la cual fueron necesarios ms de 4,5 litros
para precipitar tan slo 0,2 mg de Cr(III), 6,1 mg de Ni(II) y 45 mg de Zn(II).
Por
tanto,
resulta
conveniente
favorecer
la
precipitacin
manteniendo unas concentraciones lo suficientemente elevadas en los

lixiviados a tratar como para que la precipitacin sea notable con el menor
consumo de medio reductor posible.
213
RESULTADOS
4 INTEGRACIN DE LOS PROCESOS

4.1 INMOVILIZACIN
DE
BACTERIAS
AZUFREOXIDANTES SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO
Con el fin de obtener una produccin de medio cido suficiente
para realizar el proceso de solubilizacin de iones metlicos en continuo, se
estudi la conveniencia de inmovilizar las bacterias azufre-oxidantes sobre
un soporte inerte. En este sentido, dada la experiencia de la que se dispone
con la espuma de poliuretano, se procedi al estudio del proceso de
inmovilizacin de ambas especies bacterianas sobre este soporte.
El procedimiento const de una primera etapa de inmovilizacin al
pH ptimo de crecimiento de cada bacteria de forma discontinua en
matraces erlenmeyers con las bacterias en suspensin y un gramo de
unidades cbicas de espuma de poliuretano. Tras dos ciclos, se emple
medio 0K ajustado a pH 4, por ser este valor ms adecuado para el
incremento de la produccin de cido.
Inicialmente, se observ que las partculas de azufre elemental
suplementadas permanecieron en la superficie del lquido, debido a su
carcter hidrfobo, de modo que se pens en la incompatibilidad de este
sustrato con el soporte elegido, ya que las bacterias retenidas en el interior
de la espuma difcilmente podran acceder a la fuente de energa. Sin
embargo, la accin de las bacterias en suspensin hace que la oxidacin
del azufre produzca partculas de menor tamao que difunden fcilmente
en la matriz porosa o se adhieren a su superficie, teniendo lugar este
proceso en las primeras 24 horas (figura 62).
214
RESULTADOS
Figura 62: Cultivo discontinuo a de At. thiooxidans crecido sobre espuma de poliuretano.
El seguimiento de la experiencia se realiz midiendo diariamente el

pH, la concentracin de sulfato y la concentracin de protones que se
produce. Se fij como criterio para finalizar un ciclo de inmovilizacin que el
pH estuviera prximo a un valor de 1; en este momento, se determin la
concentracin de biomasa inmovilizada de acuerdo a la metodologa
descrita en el apartado de Material y Mtodos de la presente memoria. En
estas condiciones la concentracin de protones se encuentra en torno a los
0,25 g/l y la concentracin de sulfato en 15 g/l.
En la figura 63 se muestra la evolucin del pH a lo largo de los distintos
ciclos de inmovilizacin para At. ferrooxidans. La etapa de inicial se
compone de dos ciclos de menor extensin ya que al partir de un medio
ms cido (pH 1,8) el valor de pH 1 se alcanza en menor tiempo. Una vez
suplementado con medio 0K a pH 4, se pudo observar una tendencia muy
similar a partir del cuarto ciclo, tanto en la medida de pH como en la
215
RESULTADOS
concentracin de los productos de reaccin (figura 64), siendo la duracin
media de un ciclo de inmovilizacin de 165 horas. La constancia en los
ciclos respecto del tiempo coincide con el estacionamiento de la cantidad
de bacterias inmovilizadas en un valor de 15 Mcl/mg de soporte (figura 65).
1.9
1.7
pH
1.5
1.3
1.1
0.9
0.7
0.5
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Tiempo (horas)
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
[H+] g/l
[SO4=] g/l
Figura 63:.Evolucin del pH en el proceso de inmovilizacin de At. ferrooxidans sobre espuma

de poliuretano.
0,05
0
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Tiempo (horas)
[SO4] g/l
[H+] g/l
Figura 64: Evolucin de la concentracin de protones y de sulfato en el proceso de

inmovilizacin de At. ferrooxidans sobre espuma de poliuretano
216
RESULTADOS
Mcel/mg de soporte
30
25
20
15
10
At. thiooxidans
At. ferrooxidans
0
1
Ciclo
Figura 65: Evolucin de la poblacin celular inmovilizada por mg de espuma de poliuretano
en funcin de los ciclos realizados para At. ferrooxidans y At. thiooxidans.
La tendencia seguida en el proceso de inmovilizacin de At.

thiooxidans se muestra en las figuras 66 y 67, y cabe destacar que en este
caso, se necesita un menor tiempo para la inmovilizacin de esta especie
bacteriana. Los dos primeros ciclos fueron similares en extensin a los
observados para At. ferrooxidans, a pesar de que At. thiooxidans parte de
un pH inicial mayor (medio 0K pH 2,5). Una vez que el cultivo es
suplementado con medio a pH 4, la biomasa inmovilizada se establece en
torno a los 24 Mcl/mg de soporte (figura 65) en el cuarto ciclo y la
extensin de los ciclos no supera las 140 horas.
Por tanto, a la vista de los resultados se puede concluir que, tanto At.
ferrooxidans como At. thiooxidans pueden inmovilizarse en espuma de
poliuretano cuando se utiliza azufre elemental como fuente de energa,
siendo dicha inmovilizacin ms efectiva para el segundo de ellos.
Teniendo en cuenta estos resultados y, persiguiendo el objetivo de su
aplicacin para la produccin de medio cido, parece ms conveniente
217
RESULTADOS
utilizar columnas de At. thiooxidans inmovilizado sobre espuma de
poliuretano.
2.1
1.9
1.7
pH
1.5
1.3
1.1
0.9
0.7
0.5
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Tiempo (horas)
Figura 66: Evolucin del pH en el proceso de inmovilizacin de At. thiooxidans sobre espuma
de poliuretano
18
0.35
16
0.30
0.25
12
10
0.20
0.15
[H+ ] g/l
[SO4=] g/l
14
0.10
0.05
2
0
0.00
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Tiempo (horas)
[SO4] g/l
[H+] g/l
Figura 67: Evolucin de la concentracin de protones y de sulfato en el proceso de

inmovilizacin de At. thiooxidans sobre espuma de poliuretano.
218
RESULTADOS
4.2 INTEGRACIN
DE
LOS
PROCESOS
DE
SOLUBILIZACIN Y PRECIPITACIN EN CONTINUO
La integracin de los procesos de solubilizacin y precipitacin en
rgimen continuo estudiados se llev a cabo en el sistema descrito en la
figura 68.
Figura 68: Sistema empleado para la integracin de los procesos de solubilizacin y

precipitacin de iones metlicos en continuo.
Para realizar el proceso de solubilizacin se llev a cabo la

inmovilizacin de At. thiooxidans sobre espuma de poliuretano en matraces
erlenmeyers. Tras cuatro ciclos de inmovilizacin, la espuma colonizada se
incorpor a una columna de lecho fijo a la que se suplement medio 0K (pH
4) y azufre elemental. Inicialmente, el sistema oper en discontinuo (figura
69) hasta alcanzar un pH igual a 1, comenzando a trabajar en ese momento
en rgimen continuo con un caudal de alimentacin de 14,5 ml/h. Bajo
estas condiciones de operacin, el estado estacionario se estableci para
una poblacin celular inmovilizada de 33 Mcl/mg de espuma.
219
RESULTADOS
14
10
1.5
pH
[sulfato] (ppm)
12
4
2
0
0.5
0
12
16
20
Tiempo (das)
[sulfato]
pH
Figura 69: Evolucin de la concentracin de sulfato y pH en la columna de At. thiooxidans
El medio cido generado en la columna de At. thiooxidans se utiliz

como alimentacin de otra columna que contena 50 gramos de una arena
contaminada artificialmente con 75 mg de Cr(III), 50 mg de Cr(VI), 20 mg de
Ni(II) y 200 mg de Zn(II).
El aporte de cromo hexavalente a la arena se realiz con el objetivo
de determinar la reduccin del cromo(VI) a cromo(III) mediante los
compuestos reductores obtenidos por la oxidacin de azufre elemental por
parte de las bacterias azufre-oxidantes. El primer volumen de lixiviado
obtenido present una elevada concentracin de cromo (VI). Este hecho
se debe a la elevada solubilidad del dicromato potsico que hace que este
in se disuelva rpidamente en el medio cido circulante y abandone con
facilidad la matriz slida en la que se encuentra y, por otra parte, el tiempo
de residencia del medio fue insuficiente para que se produjese el contacto
adecuado entre los compuestos reductores y el cromo hexavalente. No
obstante, se observ una reduccin parcial del Cr(VI), ya que slo se
detect la presencia de este in en el primer lixiviado obtenido el cual
contena 39,7 mg de Cr(VI) de los 50 mg totales, lo que supone que en los
primeros 210 ml de medio cido se redujo el 20,6% de este in. Un aumento
220
RESULTADOS
del tiempo de residencia permitira el incremento de este porcentaje; de
cualquier modo la proporcin de este ion en la arena es mucho mayor a la
que se suele encontrar en los medios contaminados de forma natural.
Despus de esta primera etapa de solubilizacin, el contenido total
de Cr(III) en la arena se vi aumentado por la reduccin de Cr (VI) en un
total de 10,3 mg de Cr (III) para pasar a un total de 85,3 mg de Cr(III) totales.
Al igual que en el estudio independiente de solubilizacin en
continuo, se produce una lixiviacin inicial de cromo y nquel (figura 70)
cuando el pH del lixiviado no es muy cido debido a la alcalinidad del
soporte slido empleado. Alcanzadas las condiciones cidas, se muestra
una elevada solubilizacin del zinc contenido en la arena que se
acompaa por una leve y lenta lixiviacin de los otros metales. La figura 71
permite comprobar la evolucin de la cantidad de metal lixiviada en
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
2
3
Volumen (litros)
[Zn(II)]
[Cr(III)]
[Ni(II)]
[Cr(III)], [Ni(II)] y pH
[Zn(II)]
funcin del volumen de cido empleado para este proceso.
pH
Figura 70: Evolucin de la concentracin de metales en el lixiviado en funcin del volumen

de cido pasado a travs de la columna.
221
200
20
150
15
100
10
50
0
0
mg Cr(III) y mg Ni(II) lixiviados
mg Zn(II) lixiviados
RESULTADOS
Volumen (litros)
mg Zn(II)
mg Cr(III)
mg Ni(II)
Figura 71: Evolucin de la cantidad de cada metal solubilizado en funcin del volumen de
cido pasado a travs de la columna.
En la tabla 27 se presentan algunos valores representativos del

proceso de solubilizacin y precipitacin completo. En la etapa de
solubilizacin se puede observar que, despus de hacer circular por la
columna de residuo 2,4 litros de medio cido, las concentraciones de los
distintos metales toman valores muy bajos y se ha completado un alto
porcentaje de la solubilizacin total. En concreto, se solubiliz el 14,62% de
Cr(III), el 26,65% de Ni(II) y el 90,53% de Zn(II). De esta forma, despus de
pasar 3 litros ms de medio cido tan slo se consigui un aumento del
2,07% del Cr(III), un 6,25% del Ni(II) y un 7,89% del Zn(II). Como se puede
observar, el proceso es ms efectivo cuando los metales se encuentran a
mayores concentraciones, por lo que parece adecuado utilizar este
proceso para tratar cantidades similares a las iniciales e ir incorporando
posteriormente ms fracciones de residuo con el fin de mantener
concentraciones que permitan unos porcentajes de solubilizacin elevados.
La baja solubilizacin del cromo se debe principalmente a dos
motivos, la extrema insolubilidad del compuesto de cromo (III) empleado
222
RESULTADOS
(Cr2O3), lo que hace pensar que la mayor parte del cromo (III) lixiviado
proceda de la reduccin del cromo (VI), y la baja densidad del xido de
cromo que provoca que gran parte de la cantidad aportada a la arena
sea arrastrada por el lixiviado, retirndolo de la arena y eliminando, por
tanto, la posibilidad de ser solubilizado.
Cromo
Nquel
Zinc
mg totales en la arena
85,30
20,00
200,00
mg lixiviados en 2,4 l de medio cido
12,47
5,33
181,10
% lixiviado del total
14,62
26,65
90,53
medio reductor
0,27
2,88
50,73
% precipitado de 2,4 l de lixiviado
2,17
54,03
28,02
mg lixiviados en 5,5 l de medio cido
14,24
6,58
196,84
% lixiviado del total
16,69
32,90
98,42
medio reductor
0,29
2,90
54,53
% precipitado de 5,5 l de lixiviado
2,05
44,12
27,70
mg precipitados de 2,4 l de lixiviado con 2,2 l de
mg precipitados de 5,5 l de lixiviado con 4,8 l de
Tabla I1. Datos generales obtenidos en el proceso de solubilizacin-precipitacin.
Los porcentajes de solubilizacin finales obtenidos por este proceso

son menores a los mostrados para la solubilizacin con un cultivo At.
thiooxidans en suspensin. No obstante, el volumen de cido empleado
mediante esa metodologa fue mayor (11,4 litros). Para el mismo volumen
consumido en este proceso (5,5 litros), en el caso del cultivo de At.
thiooxidans en suspensin, se obtuvo una solubilizacin del 39,4% de Cr(III),
88,1% de Ni(II) y 97,7 % de Zn(II) frente al 17% de Cr(III), 34,3% de Ni(II) y 99,3%
de Zn(II) para At. thiooxidans inmovilizado. Como se puede observar estas
223
RESULTADOS
concentraciones fueron ms altas para el caso del cromo y nquel pero el
tiempo necesario para alcanzar estos niveles fue de 26 das frente a los 19
das empleados con At. thiooxidans inmovilizado en espuma de poliuretano.
Por tanto, en funcin del parmetro que deseemos optimizar habra
que decidir de que modo resulta ms conveniente operar. De cualquier
modo, si comparamos la cantidad de metal lixiviado en la primera etapa
(2,4 litros), que fue la que result ms efectiva, con los porcentajes de
solubilizacin obtenidos para el proceso con At. thiooxidans en cultivo
sumergido, dichos valores fueron menores para el cromo y el zinc y muy
similares para el nquel (5,5% de Cr(III), 27,7% de Ni(II) y 69,9% de Zn(II)). Estos
resultados justifican la inmovilizacin de las bacterias azufre-oxidantes de
cara a obtener una mayor solubilizacin de los metales en un menor
tiempo,
siempre
cuando
trabajemos
dentro
de
un
rango
de
concentraciones de metales que permita una solubilizacin significativa.

La siguiente etapa, de precipitacin, se realiz de forma similar al
proceso
descrito
anteriormente
en
la
presente
memoria
para
la
precipitacin de un lixiviado artificial de cromo, nquel y zinc. Para ello, se

creci un cultivo de Desulfovibrio sp., en un reactor de tanque agitado, en
el cual, tras una primera etapa en cultivo discontinuo se comenz a trabajar
en rgimen continuo con un caudal de alimentacin de medio de 12,5
ml/h. Alcanzado el estado estacionario, se oper de forma que el volumen
de medio lixiviado obtenido diariamente de la etapa de solubilizacin se
emple como medio para la precipitacin, el tiempo de contacto entre el
lixiviado y el efluente rico en sulfuro de hidrgeno procedentes del reactor
de Desulfovibrio sp. fue de 24 horas.
Durante toda la experimentacin, el lixiviado obtenido se filtr a
travs de una membrana de 0,22
m para retener el xido de cromo
arrastrado en el proceso de solubilizacin, con el fin de no interferir en la
224
RESULTADOS
medida de la concentracin de metales presentes en el sobrenadante del
precipitado.
De acuerdo con los resultados obtenidos (tabla 27), se puede decir
que el proceso de precipitacin es posible para los distintos metales
presentes en el lixiviado, pero al igual que en el proceso de solubilizacin, la
eficacia
del
proceso
fue
mayor
para
aquellos
lixiviados
con
concentraciones mayores de los metales. De este modo, las distintas

fracciones de lixiviado tratadas en los primeros 2,4 litros obtenidos en el
proceso de solubilizacin presentaron un porcentaje de precipitacin ms
alto. En esta primera etapa se registra la mayor parte de la precipitacin
total, de tal forma que se puede llegar a precipitar el 2,2% de Cr(III), el 54%
de Ni(II) y 28% de Zn(II) de la cantidad de lixiviado tratada, empleando para
ello 2,2 l de medio reductor. Se observa que, tal como ocurri en el estudio
anterior, la precipitacin de cromo es bastante baja mostrndose una
cierta preferencia por la precipitacin de los otros metales.
El elevado porcentaje de precipitacin del nquel frente al del zinc, se
debe a que las primeras fracciones presentan una concentracin
significativa de nquel y, sin embargo, no se detect an la solubilizacin del
zinc, lo cual hace que el sulfuro de hidrgeno se consuma en la
precipitacin del nquel en solucin. La baja concentracin de metales en
las fracciones de lixiviado tratadas posteriormente, dieron lugar a una baja
precipitacin de cromo y nquel, observndose slo precipitacin del ion
zinc.
La etapa final no resulta tan efectiva como era de esperar, ya que, el
tratamiento total del lixiviado obtenido en la etapa de solubilizacin dio
lugar a la precipitacin del 2,1% de Cr(III), 44,1% de Ni(II) y 27,7% de Zn(II)
empleando un total de 4,8 litros de medio procedente del reactor de
bacterias sulfato-reductoras.
225
RESULTADOS
4.3 COMPARACIN CON OTRO PROCESO

Finalizado el proceso integrado resulta interesante la comparacin
de los resultados obtenidos con un proceso similar. Para ello, se recurri al
trabajo realizado por White y Gadd (1998), en el cual se propone un
proceso de solubilizacin y precipitacin de un suelo contaminado
artificialmente, y se calcularon una serie de parmetros para hacer posible
dicha comparacin. Las tablas 12 y 13 presentan los datos referentes a la
etapa de solubilizacin y precipitacin del proceso integrado llevado a
cabo por estos autores y el realizado en el presente trabajo
Parmetros
Unid.
White y Gadd (1998)
Proceso Integrado
Volumen de trabajo
0,85
Caudal volumtrico
ml/h
100
15
Velocidad de dilucin
d-1
0,267
0,43
Tiempo empleado
190
19
Cantidad de residuo tratada
8000
50
Volumen de medio cido
456
5,5
Metales estudiados
Cr(III)
Ni(II)
Zn(II)
Cr(III)
Ni(II)
Zn(II)
Concentracin del residuo
mg/l
132,0
108,8
141,8
1500
400
4000
Cantidad tratada de metales
mg
1056
870,1
1134
85,3
20
200
Cantidad lixiviada
mg
950,4
817,9
1032,0
14,24
6,58
196,84
% lixiviado
90
94
91
16,7
32,9
98,4
Cant. lixiviada/vol. cido
mg/l
2,08
1,79
2,26
2,59
1,20
35,78
Tabla 12 : Parmetros pertenecientes al proceso de solubilizacin continua llevado a cabo

por White y Gadd (1998) y en el proceso integrado propuesto en este trabajo.
El proceso de solubilizacin de White y Gadd (1998) empleaba un

reactor (9 l) suplementado con 8 kg de suelo e inoculado con un cultivo de
bacterias azufre-oxidantes acidfilas y neutrfilas. Dicho proceso se
mantuvo 190 das operando y, para ello, se emplearon 456 litros de medio.
226
RESULTADOS
Como puede observarse, la concentracin del residuo tratado fue
mucho menor que en el proceso estudiado en este trabajo, aunque la
cantidad de cada metal tratada fue mayor. Estos autores obtuvieron
porcentajes de solubilizacin mayores del 90% para todos los metales,
mientras
que
en
el
estudio
detallado
en
la
memoria,
la
mayor
concentracin de metales en el residuo y la utilizacin de una velocidad de

dilucin mayor condujeron a unos porcentajes muchos menores en el caso
del cromo y el nquel. No obstante, cabe indicar que el proceso se detuvo
cuando se observ una baja solubilizacin con respecto al volumen de
cido empleado pero la experiencia previa de solubilizacin continua con
At. thiooxidans en cultivo sumergido, permiti asegurarnos que un mayor
volumen de cido empleado da lugar a la solubilizacin completa del
nquel y el zinc y una solubilizacin notable, mayor del 55%, del cromo.
Por otra parte, si comparamos la cantidad de metal solubilizado por
volumen de cido empleado, en el presente trabajo se obtienen mayores
niveles de solubilizacin para el cromo y el zinc, destacando este ltimo.
Este hecho viene a coincidir con el efecto observado de mayores
concentraciones en los lixiviados para aquellos casos en los que se parte de
una concentracin de metal mayor en el residuo. De cualquier modo, la
menor capacidad de lixiviacin en el sistema de White y Gadd (1998) se
puede deber a la forma en que se encuentran integrados los iones
metlicos en el suelo.
La etapa de precipitacin llevada a cabo por White y Gadd (1998)
se realiz en un reactor de sedimentacin interna con recirculacin,
alimentado con lixiviado a 100 ml/h e inoculado con un cultivo mixto
formado por distintas cepas resistentes a los metales y procedentes de
distintos ambientes. La seleccin del cultivo bacteriano y el diseo del
227
RESULTADOS
reactor para favorecer la precipitacin, dieron lugar a una elevada
precipitacin de todos los iones.
Los bajos rendimientos obtenidos en el proceso de precipitacin
llevado a cabo en el trabajo aqu presentado se corroboran si lo
comparamos con otros procesos como el de White y Gadd (1998), ya que
slo en el caso del zinc se obtuvo una precipitacin significativa con
respecto al volumen de medio procedente del reactor de bacterias sulfatoreductoras, debido a la alta concentracin de este metal en el lixiviado.
Este hecho experimental puede deberse a que en este trabajo no se ha
realizado ningn tipo de seleccin de las bacterias y se ha trabajado con
cepas de coleccin.
Parmetros
Unid.
White y Gadd (1998)
Proceso Integrado
Volumen de trabajo
0,8
Caudal volumtrico
ml/h
100
12,5
Velocidad de dilucin
d-1
2,4
0,375
Tiempo empleado
190
19
Cantidad de residuo tratada
8000
50
Volumen de medio D.sp.
456
4,8
Metales estudiados
Cr(III)
Ni(II)
Zn(II)
Cr(III)
Ni(II)
Zn(II)
Concentracin del lixiviado
mg/l
1,31
1,81
2,49
2,59
1,20
35,78
Cantidad tratada de metales
mg
597,0
828,4
1134
14,24
6,58
196,84
Cantidad precipitada
mg
581,9
664,0
1092,7
0,29
2,90
54,53
% precipitado
97,5
80,2
96,4
2,1
44,1
27,7
Cant. precipitada/vol. D. sp.
mg/l
1,28
1,46
2,40
0,06
0,60
11,36
Tabla 13: Parmetros pertenecientes al proceso de precipitacin continua llevado a cabo

por White y Gadd (1998) y en el proceso integrado propuesto en este trabajo.
228
E.-CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
Las bacterias azufre-oxidantes tienen la capacidad de solubilizar los

iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) presentes en compuestos de carcter
insoluble cuando stos se encuentran solos y en combinacin. En
concreto, operando en rgimen discontinuo At. ferrooxidans es
capaz de solubilizar 1,5 % de Cr(III), 22,6 % de Ni(II) y 53,25% de Zn(II) y
At. thiooxidans 1,35% de Cr(III), 24,25% de Ni(II) y 55% de Zn(II) de una
disolucin metlica compuesta por 75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y
200 mg de Zn(II) en 100 ml de medio.
La presencia de una matriz slida como la arena en el cultivo

discontinuo de las bacterias azufre-oxidantes provoca alteraciones
en el medio que inhiben la actividad celular y, por tanto, impiden el
proceso de solubilizacin de compuestos metlicos.
El proceso de solubilizacin en continuo propuesto permite lixiviar los

compuestos metlicos presentes en una arena
contaminada
artificialmente. El crecimiento en continuo de At. thiooxidans en

cultivo sumergido produce un medio de elevada acidez que puede
ser empleado de forma continua como agente lixiviante sobre el
lecho de arena contenido en una columna. Los porcentajes de
solubilizacin obtenidos haciendo pasar 11,4 l de medio cido por 50
g de arena (75 mg de Cr(III), 20 mg de Ni(II) y 200 mg de Zn(II)) fueron
de un 55,4% de Cr(III), 100% de Ni(II) y 100% de Zn(II) del total aadido.
Las bacterias azufre-oxidantes tienen la capacidad de reducir el

cromo hexavalente a cromo trivalente mediante la produccin de
compuestos reductores obtenidos a partir de la oxidacin de azufre
elemental. En cultivo discontinuo, At. ferrooxidans es capaz de reducir
totalmente un cultivo con 5 ppm de Cr(VI) en dos das y el 32,7% de
10 ppm, tras 11 das de incubacin. Sin embargo, At. thiooxidans se
muestra ms sensible a la presencia de este ion, y slo es capaz de
231
CONCLUSIONES
alcanzar un reduccin del 64,7% de 5 ppm de Cr(VI), tras 11 das de
incubacin, y el 16,5% de 10 ppm, encontrndose una elevada
inhibicin para esta concentracin.
La capacidad de reduccin del Cr(VI) y de solubilizacin del Cr(III) de

las bacterias azufre-oxidantes se puede aplicar de forma simultnea
en un proceso continuo con el fin de reducir la toxicidad de un
residuo de cromo (30% de Cr(III) y 0,1% de Cr(VI)). El proceso
diseado permite la reduccin de un 92,66% del Cr(VI) y la
solubilizacin de un 12% del Cr(III) de un total de 157 g de este residuo
cuando se hacen pasar 4 litros de medio cido.
Las bacterias sulfato-reductoras, Desulfovibrio vulgaris y Desulfovibrio

sp., pueden tolerar la presencia de los iones Cr(III), Ni(II) y Zn(II) y
precipitarlos a partir de compuestos solubles, como sulfatos, cuando
se encuentran solos y en combinacin. El cultivo puro (Desulfovibrio
vulgaris) tolera la presencia de 15 ppm de Cr(III), 8,5 ppm de Ni(II) y 10
ppm de Zn(II) alcanzando para dichas concentraciones una
precipitacin del 24,7% del Cr(III), 96% del Ni(II) y 92,7% del Zn(II). El
cultivo mixto (Desulfovibrio sp.) tolera la presencia de 15 ppm de
Cr(III), 8,5 ppm de Ni(II) y 20 ppm de Zn(II) obtenindose la
precipitacin en estos casos del 25,5% del Cr(III), 96,1% del Ni(II) y 93%
del Zn(II). Los porcentajes de precipitacin de dichos iones son
bastante similares cuando stos se encuentran en combinacin para
los dos cultivos estudiados.
El proceso propuesto para la precipitacin continua de cromo, nquel

y zinc en solucin permite evitar el problema de inhibicin y toxicidad
de estos metales sobre la actividad celular de las bacterias sulfatoreductoras. El tratamiento de un total de 33,08 mg de Cr(III), 19,74 mg
de Ni(II) y 214,84 mg de Zn(II) mediante este sistema permite la
232
CONCLUSIONES
precipitacin del 30,8% de Cr(III), 56,6% de Ni(II) y 97,2% de Zn(II). Este
hecho hace que sea susceptible de ser empleado para la
precipitacin de los metales presentes en las disoluciones obtenidas
en el proceso de solubilizacin en continuo llevado a cabo por las
bacterias azufre-oxidantes
Tanto At. ferrooxidans como At. thiooxidans pueden inmovilizarse en

espuma de poliuretano cuando se utiliza azufre elemental como
fuente de energa, siendo dicha inmovilizacin ms efectiva para el
segundo de ellos. Por ello la produccin de medio cido puede ser
favorecida por la aplicacin de esta operacin empleando
columnas
de
At.
thiooxidans
inmovilizado
sobre
espuma
de
poliuretano.
El proceso de solubilizacin en rgimen continuo resulta ms efectivo

cuando el crecimiento de At. thiooxidans se realiza inmovilizando las
bacterias sobre espuma de poliuretano. Este hecho proporciona una
mayor produccin de cido y, por tanto, una mayor solubilizacin de
los metales si lo comparamos con la solubilizacin obtenida para un
volumen igual obtenido por At. thiooxidans en cultivo sumergido. Con
5,5 litros de medio cido se obtuvo la solubilizacin del 17% de Cr(III),
34,3% de Ni(II) y 99,3% de Zn(II).
La adaptacin de una etapa de precipitacin con las bacterias

sulfato-reductoras al proceso de solubilizacin en continuo, proceso
integrado, da lugar a la alcalinizacin de los lixiviados pero la
precipitacin de lixiviados de baja concentracin metlica fue
insignificante, por lo que esta etapa slo resulta efectiva cuando se
tratan concentraciones relativamente elevadas permitiendo la
eliminacin de los metales en la solucin y la acidez tpica de este
tipo de medios.
233
CONCLUSIONES
El proceso propuesto resulta ventajoso para residuos contaminados

por metales y de caractersticas cidas que puedan ser retirados de
su origen (lodos, aguas residuales) ya que permitira la posterior
deposicin o la reutilizacin del residuo, pero no sera favorable para
medios naturales contaminados que se deseen recuperar o devolver
a su forma habitual, como suelos o sedimentos, dado que la
transformacin de estos medios mediante el proceso desarrollado
dara lugar a caractersticas diferentes (pH, conductividad, materia
orgnica, flora bacteriana) a las originales de estos medios antes
de ser contaminados.
234
F.-BIBLIOGRAFA
BIBLIOGRAFIA
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ESTUDIO DE PROCESOS PARA LA SOLUBILIZACIN Y

PRECIPITACIN DE IONES METLICOS CONTAMINANTES

Gema Cabrera Revuelta

ESTUDIO DE PROCESOS PARA LA SOLUBILIZACIN Y

Fdo: Gema Cabrera Revuelta

Fdo: Dr. D. Domingo Cantero

Fdo: Dr. D. Jos Manuel Gmez Montes

Fdo.: Dr. D. Jos Mara Quiroga Alonso

Despus de este largo camino siento la necesidad de dar las gracias a

Al Prof. Domingo Cantero Moreno, por brindarme la oportunidad de

Al Prof. Jos Manuel Gmez Montes de Oca, por su entrega, su

Al Prof. Edgardo Donati, le agradezco su acogida, su disponibilidad y

A mis compaeros del departamento, cada acontecimiento que

CONTAMINACIN POR METALES PESADOS.....

1.1.1 TCNICAS DE REMEDIACIN...

1.2 MICROORGANISMOS Y METALES PESADOS

1.2.1 TCNICAS DE BIORREMEDIACIN..

1.3 RESIDUOS DE LA INDUSTRIA DE GALVANIZADO.

1.4 CARACTERSTICAS Y TOXICIDAD DE LOS METALES

1.5 LEGISLACIN SOBRE METALES PESADOS.

BIOLIXIVIACIN CON BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES..

2.1. BIOLIXIVIACIN DE MINERALES.

2.1.1 CARACTERSTICAS DE Acidithiobacillus ferrooxidans Y

2.2 MECANISMOS INVOLUCRADOS EN LA BIOLIXIVIACIN DE

2.2.1 MECANISMO DIRECTO...

2.2.2 MECANISMO INDIRECTO...

2.2.3 DISCUSIN DE LOS MECANISMOS..

2.3FUNCIN DE LAS BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES EN LA

2.4 ADHESIN BACTERIA-MINERAL...

2.5FACTORES QUE INFLUYEN EN LA BIOLIXIVIACIN.

2.6TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS DE LAS BACTERIAS

2.7 APLICACIONES DE LA BIOLIXIVIACIN CON BACTERIAS

2.7.1 BIOLIXIVIACIN DE MINERALES...

2.7.2 BIOLIXIVIACIN DE LODOS......

2.7.3 BIOLIXIVIACIN DE SUELOS..

2.7.4 BIOLIXIVIACIN DE OTROS RESIDUOS...

2.7.5 APLICACIONES INDUSTRIALES..

2.8 REDUCCIN DEL Cr(VI) POR LA ACCIN DE LAS BACTERIAS

BIOPRECIPITACIN CON BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS..

3.1 PRECIPITACION DE METALES DISUELTOS...

3.2 BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS...

3.2.2 GNERO Desulfovibrio...

3.2.3 METABOLISMO DE LAS BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS.

3.3 FUNCION DE LAS BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS EN LA

3.3.1 ADHESIN BACTERIA-MINERAL....

3.4 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA REDUCCION DE SULFATO.

3.5 TOLERANCIA A LOS METALES PESADOS....

3.6 APLICACIN DE LA BIOPRECIPITACIN DE METALES POR

3.7 INTEGRACIN DE PROCESOS DE BACTERIAS AZUFREOXIDANTES Y BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS..

4.1 EMPLEO DE LA INMOVILIZACIN...

4.2 MTODOS DE INMOVILIZACIN.....

4.3 INMOVILIZACION DE BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES..

4.4 INMOVILIZACION SOBRE ESPUMA DE POLIURETANO...

1.1 MICROORGANISMOS Y MEDIOS...

1.1.1 BACTERIAS AZUFRE-OXIDANTES....

Mantenimiento de las cepas

1.1.2 BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS

Mantenimiento de las cepas

1.2 MTODOS DE ANLISIS.

1.2.1 pH Y POTENCIAL REDOX...

1.2.3 CONCENTRACIN DE PROTONES.

1.2.4 CONCENTRACION DE SULFATO.

1.2.5 CONCENTRACION DE IONES METLICOS

1.2.6 CONCENTRACION DE CROMO HEXAVALENTE..