UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMATICA

Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular

GUIA DE PRCTICAS

BIOQUMICA I

(Escuela Profesional de Qumica)

AUTORES:

Mg. Ana I. F. Gutirrez Romn

Mg. Carlos M. Santa Cruz Carpio
Mg. Oscar P. Nolasco Crdenas

Lima Per

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2016

Contenido
Temas
1

Introduccin

Preparacin de los Experimentos y registro

Medidas de Seguridad

Organizacin de los grupos de prctica

Extraccin de ADN

Osmosis y Difusin transporte Clula vegetal

Osmosis y Difusin transporte Clula animal

Clculos en bioenergtica

Mecanismo de accin del ATP en los Organismos vivos

10 Gliclisis con levaduras

11 Medida de la velocidad inicial de la amilasa 4 practicas
12 Cintica enzimtica
13 Efecto de pH y temperatura
14 Efecto de inhibidores sobre la velocidad enzimtica
15 Oxido Reduccin por la succinico deshidrogenas hgado y aceite capri
16 Fotosntesis
17 Bibliografa

Page 2

Correos de los autores:

Mg. Milagros Quintana Cceda

milagros quintana@gmail.com

Ana Gutirrez Romn: anaisabelflor@gmail.com

Carlos Santa Cruz Carpio: santacruzcm@yahoo.es
Oscar Nolasco Crdenas: oscarnol@gmail.com

Introduccin
Para la comprensin de la Bioqumica, actividad intelectual abierta con
limitaciones que establece el mtodo cientfico, se requiere una actitud de
curiosidad despierta para observar hechos en condiciones experimentales.
La capacidad de obtener informacin precisa al mximo de exactitud,
registrar, ordenar y presentar los datos en forma comprensibles a los observadores
independientes que tengan acceso a ellos es una habilidad que no se logra sino es
por la prctica personal del ejercicio.
El costo, espacio y tiempo disponible han hecho imposible el diseo de
prcticas en paralelo con la teora. Es por ello que la mayora de las escuelas de
Biologa de vanguardia en la educacin biolgica han reducido radicalmente el
tiempo dedicado al Laboratorio de Bioqumica. Sin embargo, la experiencia
didctica, nos indica que la prctica de experimentos elementales y sencillos,
aplicados a la biologa, estimula el inters cientfico de los estudiantes de
Bioqumica.
La presente Gua de Prcticas, tiene la finalidad de cumplir con los
siguientes Objetivos Especficos:
1. Ejercitar a los alumnos en el mtodo cientfico mediante el manejo de tcnicas
generales y sencillas, aplicables a mltiples problemas particulares.
2. Desarrollar habilidad para programar experimentos, sistematizar el trabajo de
laboratorio, manipular los equipos y realizar mediciones u observaciones
rigurosas, as como saber expresar sus resultados.
3. Procurar el desarrollo de iniciativa personal y de razonamiento lgico frente a
problemas que se planteen, de tal modo que el alumno pueda realizar
innovaciones o variaciones en los mtodos de trabajo.
4. Desarrollar el sentido de responsabilidad social para manejar los recursos
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humanos y materiales que inciden en su propia formacin.

5. Exigir en forma intransigente una actitud de honestidad intelectual.
Por la naturaleza de las prcticas y para poder cumplir con sus objetivos es
imprescindible una participacin activa y personal tanto de alumnos como de
docentes.
Mg. Ana I. F. Gutirrez Romn
Mg. Carlos M. Santa Cruz Carpio
FCCNM UNFV
Enero 2010

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Preparacin de experimentos y registro de resultados

El registro de los resultados de los experimentos es una parte esencial de
cualquier trabajo cientfico. Los experimentos de laboratorio son el fundamento de las
hiptesis, teoras, conocimientos cientfico y tecnologa, y son intiles si no se
consigna por escrito la descripcin de lo que se ha hecho y observado en tal forma
que permita a cualquiera, con cierto conocimiento del asunto, que repita, compruebe
o corrija el trabajo realizado sin necesidad de gua especial.
Las anotaciones deben ser breves y muy claras; se llevarn en las pginas en
blanco de esta gua, as como las grficas y calibraciones de los experimentos que lo
requieran. Se harn inmediatamente despus de cada experimento sin confiar a la
memoria un momento ms de lo necesario.
Para que los experimentos de laboratorio tengan valor formativo, se aprenda a
hacer observaciones exactas, se estimule la curiosidad y se desarrolle un sentido
crtico basado en los aspectos cuantitativos de la ciencia es necesario que antes de
iniciar el trabajo en el laboratorio:
se revise en textos, los principios fundamentales implicados
se reflexione y relacione con otros principios o hechos previamente conocidos
se estudie y comprenda bien las instrucciones del experimento antes de realizarlo

La gua se conservar limpia y ordenada, para permitir la lectura fcil de las

anotaciones, que deben ser una descripcin completa y honesta de lo que ha visto y
echo. No es aceptable hacer anotaciones en borrador para despus pasarlo en limpio y
conceder al aspecto esttico un valor que no merece.
Aunque los experimentos que se harn, producen resultados previsibles por las
teoras conocidas que de ellos se derivan originalmente, cualquier resultado
imprevisto, raro, o an absurdo debe anotarse y de ningn modo llenar el protocolo
con lo que debi pasar pues sera una relacin completamente intil. Los asientos
falsos o las omisiones no ensean nada. S en cambio, el anlisis concienzudo de los
resultados inesperados o contrarios a lo previsto, que pueden ser fuente de mucha
informacin til para el desempeo futuro en el laboratorio.

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Medidas de Seguridad
Todos los accidentes personales por triviales que sean deben comunicarse al profesor
encargado de la prctica.
Las sustancias que se utilizan, y las operaciones que se realizan en el laboratorio son
potencialmente txicas y peligrosas. Trabaje con cuidado, atento a los eventos que puedan
comprometer la seguridad personal o colectiva.
1.

Usar mandil, para proteger la ropa y el cuerpo

2.

No fumar en el interior del laboratorio

3.

No consumir alimentos, ni bebidas en el laboratorio

4.

No utilizar la llama del mechero sin cerciorarse antes de que no haya cerca
lquidos inflamables.

5.

Dirija la boca del tubo o matraz de reaccin, lejos de s mismo y del vecino, el
contenido puede proyectarse.

6.

Con los lquidos corrosivos, cidos y lcalis concentrados, o venenosos, se debe

tener cuidado de no inhalar sus vapores y el contacto con cualquier parte del cuerpo.
Si se tiene contacto accidentalmente, lvese de inmediato con abundante agua del
cao y avise al profesor.

7.

No mantenga el mechero o cocina encendida sin necesidad.

8.

No arroje slidos (grasa, cerillos, papel de filtro, etc.) al desage.

9.

Cudese de no arrojar cerillos encendidos o incompletamente apagados a los

depsitos de basura.

10.

No cambie de lugar los reactivos para uso del grupo. Deben estar disponibles
para todos.

11.

No confunda los tapones de los frascos de reactivos ni se introduzcan en ellos

pipetas o goteros. De preferencia sirva un poco del que necesita en un tubo de ensayo
o matraz muy limpio y de all srvase para su experimento.

12.

Tenga especial cuidado con los solventes voltiles que pueden llegar a provocar
explosiones. Si se vierte accidentalmente sobre la mesa, squela inmediatamente con
un trapo hmedo y enjuguese ste en el chorro de agua, exprimindolo.

13.

Conserve limpio su lugar. Lave con mucho cuidado el material de vidrio y

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enjuagar con abundante agua

Actividad N1:Coordinacin y formacin de grupos

En esta actividad se organizarn los grupos de trabajo de acuerdo al horario y nmero
establecido por la EPQ y de acuerdo a la asistencia de los alumnos, los integrantes se
mantendrn en su respectivo grupo por todo el semestre acadmico, sern responsables del
cumplimiento de lo solicitado para el mejor desarrollo de las actividades programadas.

Actividad N2:EXTRACCIN DE ADN

Introduccin
La extraccin de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que
los iones salinos son atrados hacia las cargas negativas del ADN,
permitiendo su disolucin y posterior extraccin de la clula. Se empieza
por lisar (romper) las clulas mediante un detergente, vacindose su
contenido molecular en una disolucin tampn en la que se disuelve el
ADN. En ese momento, el tampn contiene ADN y todo un surtido de
restos moleculares: ARN, carbohidratos, protenas y otras sustancias en
menor proporcin.
Las protenas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrn fraccionado en
cadenas ms pequeas y separadas de l por accin del detergente. Slo queda,
por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampn y detergente.
La precipitacin de los cidos nucleicos permite su purificacin y concentracin.
Se basa en la simultnea neutralizacin de las cargas negativas y deshidratacin
de la molcula, lo cual posibilita su agregacin y precipitacin.
Objetivo
El objetivo fundamental de esta prctica es utilizar unas sencillas
tcnicas para poder extraer el ADN
Materiales

Solucin de Cloruro de sodio al 2 %

Detergente no ionico al 1%
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Alcohol isoproplico frio

Colorante azul de metileno

3 vasos descartables plstico o de cristal limpios

Procedimiento
1. Beber (sin tragar) tres cucharadas de solucin salina y removerla en la boca
durante un minuto.
2. Devolver la solucin salina a un vaso (esto se hace para coger clulas
epiteliales de la boca y as poder extraer el ADN de ellas). RECORDAR
QUE ES ADN de tus clulas y de las bacterias presentes en la boca.
3. Aadir un ml de la solucin detergente a la solucin que contiene las
clulas epiteliales extradas de nuestra mucosa bucal. Remover despacio
para no hacer burbujas (as rompemos las membranas celulares y podemos
extraer el ADN de las mismas). Verter en un tubo unos 5 ml de este lisado
celular.
4. En un tubo por separado, mezclar los 1ml de alcohol isoproplico frio con
tres gotas de azul de metileno.
5. Con cuidado verter la mezcla del alcohol y colorante en el tubo que
contiene el lisado celular, inclinando el tubo para que el alcohol genere una
capa sobre el lisado celular.
6. Esperar 5 minutos y ver cmo se forman grumos y cadenas blancas.
Como el ADN no es soluble en alcohol, forma un slido en la interfase de la capa
de alcohol y agua salada (donde las capas se juntan). La mayor parte de las
clulas epiteliales se vern disueltas en el agua salada, mientras que las cadenas
blancas sern miles de molculas de ADN unidas unas contra la otra formando
grumos. Las molculas de ADN individuales son demasiado pequeas para ser
vistas a simple vista.
A partir de la longitud enorme de las fibras, tambin se confirma que en
el ncleo el ADN se encuentra compactado.

Nota importante. El producto filamentoso obtenido de esta extraccin no es ADN

puro ya que, entremezclado con l, hay fragmentos de ARN. Una extraccin

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especifica se realiza aadiendo enzimas que fragmentan las molculas de ARN y

protenas (protocolos de PURIFICACIN de ADN).

Osmosis y Difusin
Objetivos:
a) Observar los fenmenos de difusin y smosis
b) Describir la importancia en el intercambio de sustancias en la clula.
Teora:
La membrana plasmtica celular es una bicapa lipdica fluida y semipermeable, ya que
permite el paso de algunos solutos hacia el interior de la clula.
Muchas sustancias, adems del agua, entran a la clula y salen de ella por efecto de los
gradientes de concentracin, aunque slo unas cuantas (CO2 y O2) puedan hacerlo tan
fcilmente como el agua.
El volumen celular cambia cuando el agua penetra o sale de la clula por un proceso
denominado osmosis. Por lo cual, las clulas de los organismos pluricelulares deben
permanecer en equilibrio osmtico con los lquidos tisulares que los baan.
La smosis se define como una difusin pasiva,
caracterizada por el paso del agua, disolvente, a travs
de una membrana semipermeable, desde la solucin
ms diluida a la ms concentrada.
Si los lquidos extracelulares aumentan su
concentracin de solutos, se hara hipertnica respecto
a las clulas, como consecuencia se originan prdida
de agua y deshidratacin (las clulas animales se
crenan y las vegetales la membrana puede desprende
bruscamente de la pared celular ocurriendo la
plasmlisis)

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De igual forma, si los

lquidos extracelulares se
diluyen,
se
hacen
hipotnicos respecto a las
clulas.
El agua tiende a pasar al
protoplasma y las clulas
se hinchan y se vuelven
turgentes,
pudiendo
estallar (en el caso de
clulas vegetales la pared
de celulosa lo impedira,
en el caso de los animales
puede producirse la lisis celular), por un proceso de turgescencia.
Segn el medio en el que se encuentre la clula, la membrana dejar pasar algunos solutos,
modificando as la turgencia de la clula.
Materiales Microscopio ptico

Agua destilada
Tubos de ensayo
Algodn
Gradillas
Marcador de vidrio
Solucin hipotnica NaCl 0.065 M (0.43%)
Solucin hipertnica NaCl al 2% y 4%
Azul de metileno
Solucin isotnica de NaCl al 0.9% (suero fisiolgico)

Debers traer de casa

Lanceta hematolgica
3 Goteros
Planta Elodea
Cebolla
Buscar el coeficiente de extincin molar de la hemoglobina
Procedimiento

Actividad N3: Prueba en clulas vegetales

Page 10

En cinco laminas numeradas coloque:

-0.5 ml. de solucin hipotnica NaCl 0.09 %
-0.5 ml. de solucin hipotnica NaCl 0.45 %
-0.5ml. de solucin isotnica de NaCl al 0.9% (suero fisiolgico)
-0.5 ml. de solucin de hipertnica NaCl al 2%
-0.5 ml. de solucin de hipertnica NaCl al 4%
2. Colocar una hoja de Elodea en cada solucin y esperar 3 a 5 min.
3. Colocar una laminilla y observar.
Repetir con muestras de cebolla
1.

Actividad N4: Prueba en clulas animales

1

2
3
4
5
6
7

En cinco tubos de ensayo numerados coloque:

-1 ml. de solucin hipotnica NaCl 0.09 %
-1 ml. de solucin hipotnica NaCl 0.45 %
-1 ml. de solucin isotnica de NaCl al 0.9% (suero fisiolgico)
-1 ml. de solucin de hipertnica NaCl al 2%
-1 ml. de solucin de hipertnica NaCl al 4%
Obtener unas gotas de sangre empleando la lanceta hematolgica en un tubo limpio
con heparina
Dejar caer 3 a 4 gotas de sangre en cada uno de los tubos con un gotero (o directamente
de la puncin).
Agite los tubos y dejar en reposo durante 2 3 minutos.
Con un gotero coloque en una lmina portaobjeto una gota de cada uno de los tres
tubos.
Luego examine en el microscopio su aspecto. Observar qu efecto ha tenido las
distintas soluciones sobre la morfologa del eritrocito y explicar por qu.
Estime la concentracin de hemoglobina al espectrofotmetro

Cuestionario:
1. Dibujar todo lo observado en la prctica que pueda servirle para la discusin de sus
resultados.
2. Indique en que muestras se observ: a) Osmosis b) Difusin c) Turgencia d)
Plasmlisis
3. Mencione y dibuje las diferencias encontradas en cada uno de los huevos sometidos a
cada proceso.
4. Qu factores podran afectar la velocidad de difusin?
5. Defina el movimiento Browniano y como se relaciona con la difusin?
6. Diferencie la pared celular de la clulas vegetales.
Bibliografa:
1. ..
2. ..

Page 11

Actividad N5: Clculos en bioenergtica

En esta actividad tiene un carcter de dinmica pequea de grupo, en ella se desarrollarn
problemas para el clculo de las variaciones de energa en un determinado proceso
biolgico, cada alumno deber conseguir 10 problemas de esta temtica los cuales sern
intercambiados en clase discutidos y resueltos con la ayuda del profesor. Los problemas
podrn ser obtenidos de los textos de bioqumica que figuran en la bibliografa del sillabus
o de pginas webs de internet.

Actividad N6: Mecanismo de accin del ATP en los

Organismos vivos
En esta sesin de seminario y discusin los alumnos buscaran artculos recientes sobre el
rol y el mecanismo de accin del ATP en un sistema biolgico, estos artculos sern
presentados y expuestos por el alumno discutidos y evaluados.

Actividad N7:Glucolisis con levadura

Objetivos:
a)Diferenciar respiracin anaerbica de aerbica.
b)Definir y comprender la fermentacin, conocer

sus materiales de partida y sus

productos finales.
c)Estudiar la tasa de fermentacin en levadura midiendo la produccin de CO2.
d) Analizar el efecto de la presencia de O2 en cultivos anaerobios de levadura.

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Teora
Los hetertrofos obtienen energa oxidando molculas orgnicas y acoplando las
reacciones de oxidacin a la sntesis de ATP. El ATP es entonces usado para realizar
reacciones metablicas necesarias para mantener la integridad fsica del organismo y
sustentar todas sus otras actividades.
Algunos organismos son capaces de existir en ausencia de oxgeno molecular y
pueden ser perjudicados por la presencia de este elemento. La respiracin anaerbica, en
ausencia de oxgeno es llamada fermentacin. Comienza con una sustancia rica en energa
como la glucosa, utiliza las enzimas de la gliclisis y finalmente produce etanol y anhdrido
carbnico o una mezcla de cidos orgnicos y otros compuestos. Hay una ganancia neta de
solamente dos molculas de ATP por cada molcula de glucosa oxidada en la fermentacin.
Las levaduras son hongos eucariticos unicelulares comercialmente muy
importantes. Ellas son necesarias para la produccin de cerveza, vino, pan y productos
qumicos industriales. En este experimento se estudiar la produccin de CO 2 durante la
fermentacin de varios carbohidratos por clulas de levadura y el efecto del O2 en la
fermentacin.
Cuando microorganismos facultativos se estn cultivando anaerbicamente y se
exponen al oxgeno, hay una inhibicin de la fermentacin alcohlica y disminucin del
consumo de glucosa, esto es conocido como efecto Pasteur y refleja el incremento de
rendimiento energtico obtenido por el metabolismo respiratorio de la glucosa comparado
con el obtenido por la fermentacin de la glucosa. Cuando se consume glucosa
aerobiamente por cada mol oxidado se producen 36/38 moles de ATP, por lo que se
consume menos glucosa que cuando se oxida por la va anaerobia en la que solo se obtienen
2 moles de ATP por mol de glucosa.
2(ADP+Pi)

2ATP

GLUCOSA

ETANOL
Figura N1. Destino de la glucosa en condiciones aerobias (respiracin) o anaerobias (fermentacin).

Materiales y Reactivos:
1.
2.
3.

Pipetas Pasteur
Tubos de ensayo
Pipetas graduadas

2.
3.
4.

Parafilm
Levadura
Sacarosa 2%

Page 13

5.
6.

Galactosa 2%
Glucosa 2%

7.

Almidn 2%

Page 14

Experimento I:
1.

2.
3.
4.

5.
6.
7.

Debe disponer de una gradilla, una piseta con agua destilada, seis tubos de ensayo, seis
pipetas graduadas de 2 ml, seis pipetas Pasteur con bulbo y trozos de parafilm. Marque
los tubos 1, 2, 3, 4 y 5. Llnelos del siguiente modo:
Tubo 1 = 1.25 ml de glucosa (2% p/v)+ 1.25 ml de suspensin de levadura.
Tubo 2 = 1.25 ml de sacarosa (2% p/v)+ 1.25 ml de suspensin de levadura.
Tubo 3 = 1.25 ml de galactosa (2% p/v)+ 1.25 ml de suspensin de levadura.
Tubo 4 = 1.25 ml de almidn (2% p/v)+ 1.25 ml de suspensin de levadura.
Tubo 5 = 1.25 ml de agua + 1.25 ml de suspensin de levadura.
Mezcle las soluciones. Selle el extremo inferior de una pipeta graduada con parafilm.
Usando la pipeta Pasteur llene completamente la pipeta graduada con la solucin del tubo
1 por el extremo superior.
Coloque sobre el extremo sin sellar de la pipeta graduada el tubo 1 invertido. Invierta
luego todo el sistema cuidadosamente manteniendo juntos el tubo de ensayo y la pipeta.
Repita el procedimiento con los dems tubos.
El gas producido se acumular en el extremo cerrado de la pipeta graduada.
Registre el nivel del gas en las pipetas cada 2 minutos por alrededor de 20 min.
Anote los datos en una la tabla.
Minut
Gluco
o
sa
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20

Nivel de Gas (ml)

Sacar Galact Almid
osa
osa
n

Agua

Experimento II:
Marque los tubos 1, 2, 3, 4 y 5. Llnelos del siguiente modo:
Tubo 1 = 1.25 ml de glucosa (2% p/v)+ 1.25 ml de suspensin de levadura.
Tubo 2 = 1.25 ml de agua + 1.25 ml de suspensin de levadura.
Tubo 3 = 1.25 ml de glucosa (2% p/v)+ 1.25 ml de agua
2. Mezcle las soluciones y colquelas en matraces de 25 ml. Agite por 20 minutos.
3. Filtre el contenido del tubo 1 (Experimento I) y de los matraces 1 y 2 (Experimento II) y
usando el mtodo enzimtico determine la cantidad de glucosa presente.
1.

Absorbancia

[Glucosa]

Tubo 1
Matraz 1
Matraz 2
Matraz 3
Discuta sus resultados

Cuestionario
1.

El tipo de carbohidrato fermentado afecta la tasa formacin de gas?

2.

Qu tipo de carbohidrato sustent la tasa ms rpida de fermentacin? Por qu?

3.

Qu molcula es desdoblada en la reaccin que produce el CO2?

4.

Por qu es ventajoso para un organismo realizar fermentacin?

5.

Cuando el carbohidrato es fermentado por la levadura, slo un tercio de los carbonos son
liberados en forma de CO2. El resto del carbono es liberado como molculas
de.....................

Actividad N8 Primer exmen de practica

Actividad N9: Medida de la velocidad inicial.

OBJETIVOS:
a) Evaluacin de la actividad de la amilasa salival
b) Definir las condiciones del sistema enzimtico

y medir la actividad enzimtica

(velocidad inicial).
TEORA:
La presencia de una enzima se demuestra siguiendo la desaparicin del substrato o aparicin
del producto de la reaccin. Para ello la enzima es incubada con el substrato bajo condiciones
cuidadosamente controladas y se sacan alcuotas a intervalos de tiempo para ser analizadas. Debe
considerarse adems controles para corregir los errores que se presentan debido a reacciones qumicas
espontneas no especficas ni catalizadas por la enzima.
La amilasa es la enzima responsable de la hidrlisis del almidn, tanto su actividad como la
presencia de sus transcriptos est asociada a este polisacarido. Kuhn, en 1925 demostr la presencia
de dos amilasas: la alfa amilasa Ec 3.2.1.1 y la beta amilasa 3.2.1.2. La alfa amilasa hidroliza los
enlaces alfa 1-4 pero no puede hidrolizar los enlaces alfa 1-6 de las cadenas ramificadas de la
amilopectina, por lo que se requiere de la enzima desramificadora para la hidrlisis completa del
almidn.
El estudio "in vitro" implica, sin embargo, aislar y purificar aunque sea parcialmente la
enzima y posteriormente analizar individualmente las variables que influyen en su actividad. Para
todo este proceso es indispensable fijar inicialmente en forma tentativa las condiciones
experimentales en que se realizar el ensayo enzimtico, tomando en consideracin todos los
conocimientos generales que se tienen sobre la naturaleza de las enzimas y aquellos hechos
particulares que nos permiten suponer algunas cualidades o requerimientos especiales de la enzima en
estudio. De este modo se debe elegir un pH, una temperatura y un tiempo de incubacin compatible
con la naturaleza proteica de la enzima, condiciones que deben ser en lo posible lo ms semejantes a
las del medio en el cual la enzima acta "in vivo". Adems se debe procurar que las concentraciones
de la solucin amortiguadora del pH que se use en el medio de incubacin, garanticen la estabilidad
del pH elegido durante el lapso de observacin y que la concentracin del substrato sea lo
suficientemente alta para mantener la saturacin de la enzima, mientras dure el experimento.
Un mtodo para la determinacin cuantitativa de la actividad de la amilasa es el amiloclasico
iodometrico. En este mtodo el sustrato, almidn tamponado, se incuba con la muestra producindose
la hidrlisis enzimtica. Este se detiene al agregar el reactivo de yodo. La disminucin de color
respecto a un sustrato sin muestra permitir medir la actividad enzimtica.
La Unidad Amiloltica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra, que puede
hidrolizar 10 mg de almidn en 30 minutos,

MATERIALES y REACTIVOS:
1.

2.

Solucin de Sustrato almidn 500

mg/L, en buffer fosfato 0.1 M y NaCl
0.15 M (pH 7)
Reactivo de yodo 0.01 eq/L de Yodo
en HCl 0.02M

3.
4.
5.
6.
7.

Enzima amilasa
Tubos de prueba y pipetas
Centrfuga clnica
Espectrofotmetro o fotocolormetro
Bao de mara a 37C.

PROCEDIMIENTO:
La presencia de una enzima se demuestra siguiendo la desaparicin del substrato o la
aparicin del producto de la reaccin. Para ello la enzima es incubada con el substrato bajo
condiciones cuidadosamente controladas y se sacan alcuotas a intervalos de tiempo para ser

analizadas. Debe considerarse adems controles para corregir los errores que se presentan
debido a reacciones qumicas espontneas no especficas ni catalizadas por la enzima.
Reactivos
Agua Destilada
Substrato
Incubar a 37 C por 5 min
Enzima
Inmediatamente mezcle e incube a 37
Agregar 4,5 de solucin reveladora
Leer al espectro a 640nm

(mL)
(mL)

0.01
0.5

--0.5

(mL)

---

0.01

C por 7.5 min

En esta tcnica se incuban 10 l de muestra con 0.25 mg de almidn contenidos en 0.5 ml de

solucin de sustrato durante 7 minutos y medio, lo que equivale a incubar 100 ml de muestra
con 10 000 mg de almidn durante 30 minutos. Si todo el almidn fuera hidrolizado, la actividad
amilsica de la muestra sera de 1000 UA/dl. Para obtener las unidades de actividad amilsica, la
fraccin de almidn digerido se multiplica por 1000.
AmilasaUA / dl

Absorbancia (Tubo1) Absorbancia (Tubo 2)

1000
Absorbancia (Tubo1)

CUESTIONARIO:
1. Cul es la actividad de la muestra analizada?
2. La actividad de la amilasa es directamente proporcional al volumen empleado? Si no es
as que cantidad describe mejor la cantidad de enzima presente?
3. En relacin al almidn defina los trminos gelatinizacin, licuefaccin, sacarificacin
4. En que se diferencian las enzimas amilasas y que orgenes tienen?
5. Qu reaccin catalizan las amiloglucosidasas y cul es su origen?

Actividad N10: Cintica enzimtica.

OBJETIVO:
a) Conocer como la concentracin de substrato puede modificar la velocidad de reaccin
y calcular la constante de Michaelis de una enzima.
TEORA.Si se analiza la influencia de la concentracin del substrato, manteniendo la
concentracin de la enzima constante, y se dibuja una grfica con los resultados, se obtiene
una hiprbola rectangular. Esta curva est expresada matemticamente por la ecuacin de
Michaelis:
Vmax
Vmax S
v = -------------- v = ------------1 + Km. / S
S + Km.
donde v es la velocidad de la reaccin, Vmax es la velocidad mxima, S es la concentracin
molar de substrato y Km. es una constante equivalente a la concentracin de substrato con la
que se obtiene la mitad de velocidad mxima. Suele usarse la expresin de Lineweaver-Burk,
que es la reciproca de la ecuacin de Michaelis y da una lnea recta.

1 Km.
1
1
--- = ------- . ---- + ---v Vmax S
V
MATERIALES y REACTIVOS:
1. Solucin de Sustrato almidn 500
mg/L, en buffer fosfato 0.1 M y NaCl
0.15 M (pH 7)
2. Reactivo de yodo 0.01 eq/L de Yodo
en HCl 0.02M

3.
4.
5.
6.
7.

Enzima amilasa
Tubos de prueba y pipetas
Centrfuga clnica
Espectrofotmetro o fotocolormetro
Bao de mara a 37 C

PROCEDIMIENTO
Se montar el siguiente set de trabajo:
1(Reaccin 2(Reaccin 3(Reaccin 4(Reaccin
enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica)
H2Od
(mL)
0.4
0.3
0.2
0.1
Substrato (mL)
0.1
0.2
0.3
0.4
Enzima (mL)
0.01
0.01
0.01
0.01
Reactivos

5(Reaccin
enzimatica)
--0.5
0.01

Para cada tubo de reaccin deber hacerse un tubo blanco enzimtico (sin enzima)
El blanco para el espectrofotmetro se realizar mezclando 0.5mL de agua con 4.5mL

de solucin de lugol.
Inmediatamente mezcle e incube a 37 C por 7.5 min
Agregar 4,5 mL de solucin reveladora
Leer al espectro a 640nm

Actividad N11: factores que afectan la velocidad

enzimtica.
Experimento I.- Concentracin de la Enzima
OBJETIVO:
a)

Conocer como la concentracin de la enzima puede modificar la velocidad de

reaccin.

PROCEDIMIENTO
Se montar el siguiente set de trabajo
1(Reaccin 2(Reaccin 3(Reaccin 4(Reaccin 5(Reaccin
enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica)
H2Od
(mL)
0.4
0.3
0.2
0.1
--Substrato (mL)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Enzima (mL)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Reactivos

Deber hacerse un tubo blanco enzimtico (sin enzima)

El blanco para el espectrofotmetro se realizar mezclando

0.5mL de agua con 4.5mL

de solucin de lugol.
Inmediatamente mezcle e incube a 37 C por 7.5 min
Agregar 4,5 mL de solucin reveladora
Leer al espectro a 640nm
CUESTIONARIO
1.
2.

Experimento II.- Efecto del pH

OBJETIVOS:
a) Conocer como la variacin de pH puede modificar la velocidad de reaccin.
TEORA.El efecto de pH en la cintica enzimtica es debido a cambios en el estado de
ionizacin de los componentes del sistema enzimtico (enzima libre, complejo enzima substrato, substrato). Es posible que la enzima reaccione con una slo especie inica de un
substrato ionizable o tenga diferente afinidad con las diferentes especies inicas del substrato.
Por su carcter de protena posee numerosos grupos ionizables. Si se varia la
ionizacin de estos grupos en el nivel del sitio activo o en algn punto lejano, para que de
alguna manera altere el sitio activo, se afecta el tipo de unin y la estabilidad del complejo
enzima - substrato o la actividad cataltica misma.
Los efectos del pH sobre la actividad enzimtica implican modificacin del Km o de
la velocidad mxima de la reaccin o de ambos.
PROCEDIMIENTO
Se montar el siguiente set de trabajo:
1(Reaccin 2(Reaccin 3(Reaccin 4(Reaccin 5(Reaccin
enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica)
Substrato (mL)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
pH 3
pH 5
pH 7
pH 9
pH 11
Enzima (mL)
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
Reactivos

Deber hacerse un tubo blanco enzimtico (sin enzima)

El blanco para el espectrofotmetro se realizar mezclando

solucin de lugol.
Inmediatamente mezcle e incube a 37 C por 7.5 min
Agregar 4,5 mL de solucin reveladora
Leer al espectro a 640nm
CUESTIONARIO
3.
4.

Experimento III.- Efecto de la Temperatura

0.5mL de agua con 4.5mL de

OBJETIVO:
a) Conocer como la variacin de temperatura puede modificar la velocidad de reaccin.
PROCEDIMIENTO
Se montar el siguiente set de trabajo
1(Reaccin 2(Reaccin 3(Reaccin 4(Reaccin
enzimatica) enzimatica) enzimatica) enzimatica)
Substrato (mL)
0.5
0.5
0.5
0.5
Enzima (mL)
0.01
0.01
0.01
0.01
TEMPERATURA
Sobre hielo Ambiente
37 C
60 C
Reactivos

Deber hacerse un tubo blanco enzimtico (sin enzima)

El blanco para el espectrofotometro se realizar mezclando

0.5mL de agua con

4.5mL de solucin de lugol.

Inmediatamente mezcle e incube a 37 C por 7.5 min
Agregar 4,5 mL de solucin reveladora
Leer al espectro a 640nm
CUESTIONARIO
1. Realice sus anotaciones y haga sus respectivos clculos.
2. Para cada experimento ejecute su respectiva grfica.
3. Comente sus resultados.
4. Grafique las absorbancias vs. las concentraciones de almidon digerido.
5. Grafique la velocidad (concentracin de producto) vs. tiempo.
BIBLIOGRAFA
1. Gutierrez R., Ana y Santa Cruz C., C. (1998) Gua de Prcticas Bioqumica.
Universidad Nacional Federico Villarreal.
2. WIENER LAB. 1995. Vademcum. Edicin Revisada y Actualizada. Rosario-Argentina.

Actividad N12: Efecto de inhibidores enzimticos.

Evaluar el efecto de los inhibidores de la amilasa

Actividad N13: Oxido reduccin por la succnico DH

Objetivos:

Usar el azul de metileno como indicador del proceso de oxidacin, es decir como
aceptor final de hidrgenos.
b) Determinar la actividad Enzimtica de la Succnico Deshidrogenasa, en un extracto de
hgado, rin o corazn.
c) Estudiar algunos factores que afectan el transporte de electrones, siguiendo esta va.
a)

Teora.La Succnico Deshidrogenasa cataliza la oxidacin del cido Succnico a cido Fumrico.
HOOC - CH2 - CH2 - COOH <===> HOOC - CH = CH - COOH + 2H+
La Succnico Deshidrogenasa es una flavoprotena que no requiere coenzima
nicotinamida y que se encuentra en las mitocondrias. Adems de formar parte del ciclo de
Krebs es capaz de reducir directamente a la coenzima Q de la cadena respiratoria. Es
altamente especfica para el cido succnico y es inhibida competitivamente por numerosos
cidos dicarboxlicos, en especial, mlico y oxaloactico. Es una tpica "enzima -SH";
inhibida no competitivamente por arsenicales trivalentes, monoyodoacetato, metales pesados
y an por el oxgeno. Estos inhibidores oxidan los grupos sulfihidrilos o forman compuestos
covalentes con ellos (Asmercapturos, derivados S-alquilos, sales de metales pesados).
Fundamento.- El azul de metileno es un pigmento de color azul que se decolora al
reducirse. El NADH2 puede reducirlo debido a la presencia en el extracto de tejido de una
diaforasa, que es una flavoprotena capaz de catalizar esa reaccin y corresponde al Lipoato
Deshidrogenasa; el potencial redox del azul de metileno es + 0.011 voltios.
La reaccin deben hacerse en anaerobiosis, pues el azul de metileno reducido es
autooxidable, es decir, puede ser oxidado espontneamente por medio del oxgeno molecular.
Para conseguir la anaerobiosis se utilizan los tubos de Thumberg, en los cuales se puede
hacer fcilmente el vaco y reemplazar el aire por un gas inerte (nitrgeno). Una anaerobiosis
relativa se puede conseguir mediante una capa de vaselina lquida, que asla el medio de
incubacin del aire.
Materiales y Reactivos:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Fosfato de sodio 0.15 M a pH 7.0

Succinato de sodio 0.10 M
Malonato de sodio 0.10 M
Azul de metileno 0.02 %
Cianuro de potasio 0.08 M
Cloruro de mercurio 0.10 M
Vaselina lquida
Arena
Tubos y pipetas

Procedimiento:
1. Preparacin de la enzima
a.
b.

Se usarn hgados, riones o corazones de ratas, rganos que se guardarn

congelados. Cortar los rganos en pequeos trozos y colocarlos en un mortero.
Agregar aproximadamente un gramo de arena y 5 mL de fosfato de sodio pH 7,0.

c.

d.

Moler hasta obtener una pasta fina y agregar otros 5 mL. de fosfato. Dejar esta mezcla
a la temperatura ambiente por unos 15 minutos, revolviendo de vez en cuando para
destruir substratos endgenos.
Vaciar el contenido a un tubo de centrifuga y centrifugar a baja velocidad durante
unos 5 minutos para sedimentar la arena, ncleos y clulas enteras que haya quedado
sin destruir. Conservar en hielo el sobrenadante.

2. Ensayo de la Succnico Deshidrogenasa.- Determinar la actividad de la Succnico

Deshidrogenasa, usando los controles adecuados para un sistema completo: Succinato de
sodio 0.020 M; azul de metileno 0.004%; 1.0 mL de preparacin enzimtica para un
volumen final de la mezcla de 5.0 mL. Es recomendable colocar los componentes en el
orden indicado. Inmediatamente despus de colocar el sistema, mezclar y agregar
aproximadamente 2.0 mL de vaselina lquida al tubo, no usar pipeta.
La actividad enzimtica se reconocer por la decoloracin del azul de metileno. Cada grupo
de trabajo disear sus propios experimentos, que permitan responderlas preguntas que se
han formulado con respecto a los blancos necesarios y a los factores que puedan influir en
la reaccin.
Cuestionario
1. Escriba la ecuacin del azul de metileno
2. Use la magnitud de decoloracin del azul de metileno como ndice de la actividad
enzimtica. Evale semi - cuantitativamente el efecto de los diversos factores estudiados.
3. Qu significado energtico para la fosforilacin oxidativa tiene el hecho de que la
Deshidrogenasa Succnico no requiere NAD?
4. Qu diferencias existen entre actividad succnico deshidrogenasa y succnico oxidasa?
5. Cul es el fundamento del mtodo manomtrico de Warburg? Cmo se podra medir la
respiracin de un tejido mediante el mtodo de Warburg?
6. Mencione tres enzimas flavnicas, indicando las reacciones que catalizan.
7. Cul es la caracterstica espectrofotomtrica que permite distinguir al NAD reducido del
oxidado?
8. Qu efecto tiene el KCN sobre la succnico deshidrogenasa? Cmo lo demostrara?

Prctica N14: Fotosntesis

OBJETIVO:
a) Observar y Evaluar la Tasa Fotosinttica.
TEORA
La fotosntesis es el proceso biolgico mediante el cual las plantas y los
microorganismos fotosintetizadores obtienen biomasa. Bsicamente est constituida por una
fase de transduccin de energa y otra fase de sntesis. La ecuacin general de la fotosntesis
es: 6CO2 + 6H2O C6H12O6 +6O2 .

La tasa de fotosntesis se puede obtener midiendo la cantidad de oxgeno producido

por unidades de tiempo. La tasa fotosinttica por lo tanto se puede entender como la
velocidad de produccin de oxgeno dada por la siguiente ecuacin:
VO2= (Vol O2)/t
donde VO2 es la velocidad o tasa de fotosntesis, Vol O 2 es el volumen de oxigeno
producido y t es el tiempo.
Debido a que las burbujas de O2 son de tamao y formas regulares y adems es
proporcional al Vol O2, se puede cuantificar la VO2 por medio de la ecuacin,
VO2= (N burbujas O2)/t.
La tasa de fotosntesis es dependiente de la intensidad de luz, de la temperatura, de la
concentracin de CO2 y de la composicin qumica del agua en el caso de una planta
acutica.
MATERIAL y REACTIVOS
1. Elodea sp. u otra planta acutica.
2. Agua destilada
3. Fuente de luz.
4. Cronmetro

5.
6.
7.
8.

2 frascos de boca ancha

2 embudos de vidrio
2 tubos de ensayo
2 soportes con focos de 20 y 75 Watts

PROCEDIMIENTO
Preparar frascos con agua destilada.
Colocar en estos frascos la elodea o planta acutica bajo el embudo y sumergir
dentro del frasco.
3.
Llena el tubo de ensayo con agua e invirtelo sobre el vstago del embudo,
procurando que no se derrame.
4.
Repite los pasos descritos en el otro frasco obteniendo 2 montajes similares
5.
Ilumina cada frasco con un foco distinto
6.
Espera unos 15 minutos y mide con una regla el espacio vaco que queda en el
tubo de ensayo. Hasta aqu obtenemos la cantidad de O2 en volumen.
7.
Para obtener en nmero de burbujas hacer otra preparacin con agua destilada.
8.
Colocar en estos la planta acutica sumergida cortando previamente una rama.
9.
Medir la tasa de fotosntesis cronometrando el nmero de burbujas de oxgeno
producidas por cada 10 segundos durante 100 y 120 segundos.
10.
Observa durante una hora lo que pasa en ambos frascos
11.
Anota la cantidad de burbujas que se desprenden cada minuto y mide nuevamente
el espacio vaco en el tubo de ensayo
12.
Disea una tabla de datos que resuma los resultados y colocar en una hoja de
clculos.
1.
2.

CUESTIONARIO
1. Anote sus resultados y explique.

Bibliografa
Teora
ARMSTRONG F. B. (1989): Biochemistry. Thrid Edition. Oxford University Press.
BOHINSKI C. R. (1978): Bioqumica. Fondo educativo Interamericano, S.A.
BOHINSKI C. R. (1991): Bioqumica. 5ta. Ed. Addison-Wesly Iberoamericana.
LEHNINGER A. L. (1982): Principles of Biochemistry. Worth Publishers, INC.
U.S.A.
5. LEHNINGER A.L.; NELSON D. Y COX M. (1995): Principios de Bioqumica. 2da.
Ed. Editorial Omega S.A.
6. MATHEWS C. K. y van Holde K. E. (1990): Biochemistry. The Benjamin/Cumming
1.
2.
3.
4.

Publishing Company, U.S.A.

7. STRYER L. (1976): Bioqumica. Editorial Revert S.A. Encarnacin, 86, Barcelona Espaa.
8. VOET D. Y VOET J. (1990): Bioqumica. Ed. Omega S.A.

Prcticas
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

ARIAS M. F., ARROYO B. A., GARCA DE GMEZ M. E. y VILLALOBOS M. R.

(1985): Curso de Bioqumica. Univ. Nacional Autnoma, Mxico.
FALEN B. J. M. (1982): Manual de Prctica de Bioqumica. UNFV. Lima - Per.
FRAIS F. (1972): Practical Biochemistry an Introductory course. Butterworths
London, University Park Press Baltimore.
GORNALL A.G., BARDAWILL C. y DAVID M.M. (1949): Determination of serum
proteins by means of the Biuret reaction. J. Biol. Chem. 177: 751 - 766.
NELSON N. (1944): A photometric adaptation of de Somogy Method for the
determination of glucosa. J.Biol.Chem. 153: 375 - 380.
PLUMMER T. D. (1981): Introduccin a la Bioqumica Prctica. Ed. Mc Graw-Hill
Latinoamerica S.A.
BRYAN L.W. y WILSON K. (1981): Principios y Tcnicas de Bioqumica
Experimental. Ed. Omega, S.A. Barcelona 36, Espaa.