UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC – CCNH

FELIPE SILVA DE ALCÂNTARA

FERNANDO HENRIQUE GOMES ZUCATELLI
GUSTAVO PASSOS MEDROS
LEANDRO PEREIRA DOS SANTOS
THIAGO RODRIGUES BRITO

RELATÓRIO DE TRANSFORMAÇÕES BIOQUÍMICAS – TURMA A1

EXPERIÊNCIA 3 – DESNATURAÇÃO E PRECIPITAÇÃO DE
PROTEÍNAS

SANTO ANDRÉ
MARÇO / 2010
 Sumário

1. INTRODUÇÃO..............................................................................................................2
2. OBJETIVOS...................................................................................................................3
3. METODOLOGIA...........................................................................................................3
3.1. Materiais .....................................................................................................................3
3.2. Reagentes....................................................................................................................4
3.3. Métodos ......................................................................................................................4
3.3.1. Parte 1: Atividade enzimática do suco de abacaxi e desnaturação protéica por
aquecimento..........................................................................................................................4
3.3.2. Parte 2: Precipitação de proteínas..........................................................................5
4. RESULTADOS ..............................................................................................................5
4.1.1. Parte 1 ....................................................................................................................5
4.1.2. Parte 2 ....................................................................................................................6
5. DISCUSSÃO ..................................................................................................................7
6. CONCLUSÃO................................................................................................................8
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................................9
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1. INTRODUÇÃO
A manutenção da vida celular depende da continua ocorrência de um conjunto
de reações químicas, que devem atender duas exigências fundamentais: Elas
devem ocorrer em velocidades adequadas à fisiologia celular e precisam ser
altamente especificadas de modo a gerar produtos definidos [1].
As enzimas, substâncias orgânicas normalmente de origem protéica, são
responsáveis por essa manutenção, pois além de atender as duas requisições
principais regula a velocidade das reações celulares facilitando os processos.
Diferentes enzimas catalisam diferentes passos da via metabólica e cada enzima
pode sofrer uma regulação de sua atividade [1].
Nas reações enzimáticas, os reagentes são chamados de substratos, e cada
enzima é capaz de desenvolver reações apenas em seu determinado substrato
graças a uma região em sua estrutura denominada sitio ativo que armazena o
substrato especifico que a enzima devera catalisar. Logo, as enzimas são
extremamente especificas ao substrato onde atuam. Porém algumas enzimas
necessitam da presença de um cofator, orgânico ou inorgânico, para auxiliar a
reação que esta catalisa [1].
Enzimas Proteolíticas ou Proteases são enzimas que catalisam a clivagem
hidrolítica das ligações peptídicas, representam uma classe de enzimas com grande
relevância em processos fisiológicos, como coagulação sanguínea, morte celular e
diferenciação de tecidos, catalisam a quebra de ligações peptídicas em uma
proteína e uma família são divididas em exopeptidases e endopeptidases, de acordo
com a localização da ligação a ser clivada. As exopeptidases atuam na região final
das cadeias peptídicas, nos grupos amino ou carboxila terminais. Enquanto
endopeptidases atuam nas regiões internas da cadeia peptídica, entre os grupos
amino e carboxila [1] a [3].
As proteases possuem diversas aplicações comerciais e tecnológicas, são
responsáveis por mais da metade das vendas de enzimas. Por sua grande
importância em processos orgânicos, são valiosas para o desenvolvimento de novos
compostos farmacêuticos, sendo usadas em pomadas cicatrizantes e tem potencial
uso em outros medicamentos. Sua aplicação se estende até a indústria de
detergente e alimentícia, ou mesmo substituindo compostos tóxicos em tratamentos
de couro [4].
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Existem dois fatores fundamentais limitantes no funcionamento das enzimas

que são o pH e a temperatura do meio enzimático. Para a maioria das enzimas
existe uma faixa de pH no qual a atividade enzimática é máxima (na maioria dos
casos essa faixa é próxima do pH neutro) e mínima ao longo que este se afasta
desta faixa ideal. Já o caso da velocidade, como na maioria das reações químicas, a
velocidade da reação é favorecida pelo acréscimo da temperatura, que aumenta a
energia cinética das moléculas, fazendo com que um número maior delas atinja o
estado de transição. No entanto acima dos 50°C grande parte das enzimas sofre
desnaturação, provocando alterações na conformação da molécula causando a
perda do poder de catálise [1].

2. OBJETIVOS
Este experimento tem por objetivo analisar a atividade enzimática das
proteínas presentes no abacaxi sobre o colágeno e como a temperatura influência
nessa atividade. Também é objetivo do experimento analisar a ação de álcool e
sulfato de amônio (separadamente) sobre o colágeno.

3. METODOLOGIA
3.1. Materiais
• 8 tubos de ensaio de 20 mL.
• 1 tubo de ensaio de 30 mL.
• Estante para tubos de ensaio.
• Béquer de vidro de 100 mL (para aquecer água).
• Béquer de 50 mL (para água destilada).
• Funil de vidro pequeno e papel de filtro.
• Recipiente com gelo.
• Almofariz e pistilo.
• Pipetas de vidro de 5,0 mL.
• Bastão de vidro (para dissolver a gelatina).
• Placa aquecida ou banho-maria 100ºC.
• Estufa a 37°C.
• Balança.
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3.2. Reagentes
• Solução de sulfato de amônio 3 mol/L.
• Etanol absoluto.
• Abacaxi maduro (1 fatia média).
• Gelatina incolor e sem sabor.
• Água destilada.

3.3. Métodos
3.3.1. Parte 1: Atividade enzimática do suco de abacaxi e
desnaturação protéica por aquecimento.
Uma fatia de abacaxi foi cortada em pequenos pedaços e macerada, utilizando
almofariz e pistilo, a fim de extrair o suco. O suco foi filtrado em seguida utilizando o
funil de vidro e papel de filtro, em um tubo de ensaio de 20 mL e posteriormente
armazenado no gelo.
Posteriormente foram pesados 2g de gelatina incolor e sem sabor com uma
balança e dissolvidos em 20mL de água destilada em um tubo de ensaio de 30mL. A
solução foi agitada constante com uso do bastão de vidro em meio à água quente.
Após a solubilização, a solução de gelatina deve ser aquecida a 60°C e mantida
nessa temperatura até o uso.
Foram pipetados os itens da Tabela 1 nos tubos de ensaio de 20mL e as
amostras aquecidas a duas temperaturas (60°C e fervida) foram incubadas em suas
respectivas temperaturas por 5 minutos, e resfriadas no gelo imediatamente. Após o
resfriamento das amostras fervidas foram adicionadas a todos os tubos as soluções
de gelatina. As amostras foram incubadas por 10 minutos a 37°C e em seguida
resfriadas todas as amostras no gelo por 15 minutos.
Tabela 1 – Resumo do procedimento experimental.

Tubo 1 2 3 4
Água 2,0mL
Amostra de Abacaxi 2,0mL
Amostra de Abacaxi 60°C 2,0mL
Amostra de Abacaxi Fervida 2,0mL
Gelatina 2,0mL 2,0mL 2,0mL 2,0mL
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3.3.2. Parte 2: Precipitação de proteínas.

Foram pipetados nos tubos de ensaio de 20mL os reagentes conforme a
Tabela 2 e realizado o experimento em temperatura ambiente (~25°C). Os
resultados foram observados e anotados para serem discutidos.

Tabela 2 – Resumo do procedimento experimental.

Tubo 1 2 3

Água 2,0mL

Sulfato de Amônio 2,0mL

Etanol Absoluto 2,0mL

Gelatina 2,0mL 2,0mL 2,0mL

4. RESULTADOS
4.1.1. Parte 1
A análise dos resultados se baseou na formação ou não do gel, processo que
depende da integridade das cadeias poliméricas da proteína, caso ocorra alguma
fragmentação nas cadeias poliméricas, a formação do gel ficará comprometida.
Como relatado na Tabela 3, nos tubos 2 e 3 não houve formação de um gel,
mas sim de soluções homogêneas, essa constatação indica que ocorreu a ação de
enzimas proteolíticas presentes no suco de abacaxi, tal enzimas como a bromelina,
provocaram a degradação das macromoléculas da proteína (colágeno) presentes na
gelatina, provocando, assim, a perda do processo de formação do gel.
Com a mudança de temperatura, observou-se que quando o suco foi
submetido a uma temperatura de 60°C (tubo 3), não houve formação de gel, o que
indica a presença de atividade enzimática em tal temperatura. Já na amostra
submetida a uma temperatura de 37°C (tubo 4), houve formação do gel, tal fato está
relacionado com a possível redução da atividade enzimática, decorrente da
desnaturação em tal temperatura, como verificado por [10]
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Tabela 3 – Resumo do procedimento experimental (Tubos referentes à Tabela 1).

Parte 1
Tubo 1 Formação de uma mistura de caráter gelatinoso
Tubo 2 Solução homogênea
Tubo 3 Solução homogênea
Formação de uma mistura gelatinosa, com pequenas
Tubo 4
partículas sólidas no seu interior

4.1.2. Parte 2
A Tabela 4 apresenta um resumo das interações do etanol e do sulfato de
amônio com o colágeno da gelatina.
Tabela 4 – Resumo do procedimento experimental (Tubos referentes à Tabela 2).

Parte 2
Tubo 1 Completa dissolução, formação de uma solução homogênea.
Mistura com 3 fases, sendo a superior de aspecto gelatinoso, a
intermediária também de caráter gelatinoso mas de coloração branca e
Tubo 2
inferior líquida com algumas estruturas brancas provenientes da parte
intermediária.
Mistura com 2 fases, a superior de caráter gelatinoso e coloração branca
Tubo 3
com pequenos resíduos sólidos; inferior líquida com aspecto turvo.

No caso da adição de etanol, o que se observou foi à precipitação das

proteínas da gelatina devido à desnaturação, causada pelo rompimento das
interações fracas na proteína. A adição de sulfato de amônio provocou o efeito
denominado salting out, que consiste na diminuição da interação das proteínas com
a água, devido à solvatação dos íons presentes na solução salina. Essa diminuição
de interação provocou a coagulação das proteínas, o que explica a turvação
observada na amostra (Figura 1).
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Figura 1 – Resultado da adição dos reagentes na parte 2 do experimento. Da esquerda para a direita
tubos: 1(água)
2(sulfato de amônio)
3(etanol).

A dificuldade encontrada na realização do experimento foi à solubilização da

gelatina, pois a água deveria ser mantida a uma temperatura fixa quente, para que o
colágeno não se solidificasse.

5. DISCUSSÃO
O abacaxi é a principal fonte da enzima proteolítica bromelina (EC 3.4.22.4)
sendo este um nome genérico dado ao conjunto de enzimas proteolíticas
encontradas nos vegetais da família Bromeliaceae, da qual o abacaxi é o mais
conhecido. A bromelina é encontrada no caule, folhas, raízes e no fruto do abacaxi
(A. comosus) e em todas as espécies da família Bromeliaceae [5], [6]. Entretanto é
mais concentrada no caule. Ela pode ser obtida através dos restos do abacaxi, como
casca e caule após obter o suco do abacaxi. Existe uma protease no suco e outra no
extrato das sobras do abacaxi, a bromelaína do caule e a bromelaína da fruta, esta
mais concentrada.
Para realizar a purificação com intuito de preservar a sua função existem
diversas técnicas como, por exemplo: centrifugação fracionada, precipitação ou
dissolução por ação de sais e variadas técnicas cromatográficas (filtração em gel,
troca iônica, cromatografia de afinidade). No suco de abacaxi, a separação pode ser
feita por cromatografia de exclusão (filtração em gel). Essa técnica separa as
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proteínas de acordo com seus tamanhos e a matriz é constituída de um gel

conhecido comercialmente como Sephadex, que é sintetizado com diversos
tamanhos de poros, isto permite a exclusão de moléculas com um largo intervalo de
massa molecular [1].
As funções das proteases podem ser otimizadas fazendo com que as
interações entre o substrato e a enzima sejam realizadas completamente, ao se
levar o substrato ao estado de transição. Isto ocorre quando a temperatura alcança o
valor chamado de “temperatura ótima” e o “pH ótimo”, sendo a máxima temperatura
que pode ser atingida antes da desnaturação da proteína e o pH que possui a
distribuição de cargas elétricas ideal [7].
Todavia, quando uma proteína é aquecida até ser desnaturada (podendo ser
irreversível), esta perde suas propriedades pois não está mais na sua forma
tridimensional, e a função das proteínas é ligada a sua foram tridimensional [2], [3].
Ao cozinhar um alimento protéico, se desnaturam as proteínas do alimento,
facilitando a digestão do mesmo, já que os aminoácidos que a compõem estão mais
acessíveis do que antes pois agora a estrutura está mais próxima da estrutura
primária, e podem ser melhor digeridos e absorvidos [8], [9].
A bromelina tem diversos usos, todos baseados em sua atividade proteolítica.
Um deles está relacionado com a indústria alimentícia, como na clarificação de
cervejas, na fabricação de queijos, no amaciamento de carnes, no preparo de
alimentos infantis e dietéticos, entre outros, devida a sua capacidade de rmoper as
ligações peptídicas das proteínas e peptídeos contidos nos alimentos [5], [10].

6. CONCLUSÃO
Conclui-se que a atividade enzimática pode ser observada através da reação
das proteínas do abacaxi (bromelina) com as proteínas da gelatina (colágeno)
devido às diferenças observadas com relação ao estado final de cada mistura obtida
com reações a temperaturas diferentes.
Nas reações em que não ocorreu formação do gel, o colágeno presente na
gelatina foi degradado e nas que ocorreram a formação de gel a atividade da
protease do abacaxi foi inibida. Também se observou que a ação das proteases
depende da temperatura, sendo que depois de determinado valor, a proteína pode
sofrer degradação parcial, como observado na amostra que foi fervida, ou total.
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A ação de solventes nas proteínas ocorre de maneiras distintas dependendo de

cada solvente. No experimento foram observados 2 tipos de solventes, um que
promove o rompimento das ligações fracas (intermoléculas) das proteínas (etanol), e
outro que diminuiu a interação da proteína com a água devido à solvatação dos íons
presentes (sulfato de amônio). Efeito conhecido como salting out.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] MARZZOCO, Anita; TORRES, Bayardo B. Bioquímica Básica. 3.ed. Rio de

Janeiro, Editora, Ano. p.11-30.
[2] LEHNINGER, Albert. L.; DAVID, Nelson L.; COX, Michael M. Princípios de
Bioquímica. 4.ed. São Paulo, SAVIER, 2006. p.97-98, 124-127, 229.
[3] VOET, Donald; VOET. Judith G. et al. Bioquímica. 3.ed. Porto Alegre, Artmed,
2006. p.99,129, 233-240, 1414.
[4] GÓES, Paulo de. Proteases de Microrganismos. Instituto de Microbiologia da
Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Disponível em
<http://www.protease.ufrj.br/proteases.htm>. Acesso em 20 de mar. 2010.
[5] PINTO, NÍSIA A. V. D. et al. Modificações na Atividade Enzimática em
Abacaxi ‘Smooth Cayenne’ em Função da Temperatura de Armazenamento e
do Estádio de Maturação. Disponível em
<http://www.scientiaplena.org.br/sp_v5_111101.pdf> Acesso em 22 de mar. 2010.
[6] GONÇALVES, N. B. (Org.). Abacaxi. Pós-colheita. Embrapa agroindústria de
Alimentos (Rio de Janeiro, RJ). Brasília: Embrapa Comunicação para Transferência
de Tecnologia, (2000). 45p. (Frutas do Brasil; 5).
[7] ENZIMAS. Disponível em
<http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microor
g/enzimas.htm>. Acesso em 22 de mar. 2010.
[8] GORMAN, Rachel M. Um cérebro maior graças ao cozimento dos alimentos.
Disponível em
<http://www2.uol.com.br/sciam/reportagens/um_cerebro_maior_gracas_ao_coziment
o_dos_alimentos_5.html>. Acesso em 22 de mar. 2010.
[9] NEVES, Valdir A.; SOUZA, Karina A.F.D. de. Classificação de Proteínas.
Disponível em
<http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/introducao_proteinas/introducao_pr
oteinas_quatro.htm>. Acesso em 22 de mar. 2010.
[10] ROWAN, A. D.; BUTTLE D. J.; BARRET, A. J. The cysteine proteinases of the
pineapple plant. Biochemical Journal, 266: 869-75 (1990).