Establecimiento de un cultivo de callos de explantes de Neem

(Azadirachta indica)
Mayra, Maximiliano, Sandra, Dylan & Ligia.
Objetivo
Establecer un cultivo de callos mediante tcnicas de cultivo de vegetales in vitro, con el
propsito de obtener plantas completas para posibles aplicaciones futuras.

Introduccin
El cultivo in vitro permite el crecimiento y desarrollo de material vegetal en recipientes que lo
separan del ambiente exterior y lo mantienen en condiciones controladas y aspticas. Entre las
diversas tcnicas de cultivo in vitro, la micropropagacin consiste en la produccin clonal de
vegetales a partir, generalmente, de pices o explantos nodales de una planta madre. La gran
produccin de nuevas plantas se ve favorecida gracias al rpido crecimiento del material vegetal
in vitro y a la proliferacin de tallos durante los subcultivos.
Un programa de micropropagacin puede comprender las siguientes etapas:

Etapa 0: Seleccin y acondicionamiento de la planta madre

Etapa I: tratamientos de asepsia y establecimiento del cultivo mediante
Etapa II: Desarrollo y multiplicacin de los brotes
Etapa III: enraizamiento o acondicionamiento de los brotes para su aclimatacin a
condiciones ex vitro.
Etapa IV: Aclimatacin a condiciones ex vitro.

Los callos de plantas son masas celulares diferenciadas, no organizadas y de rpido crecimiento
que pueden ser producidas en todas las especies de plantas en respuesta a un suplemento de
hormonas endgenas o externas. Los cultivos de callos de plantas y cultivos de suspensin de
callos han incrementado su uso en biotecnologa, ya que es una herramienta para la
manipulacin gentica, micropropagacion, estudios del metabolismo y de desarrollo celular de
plantas, asi como para la produccin comercial de productos naturales (metabolitos primarios y
secundarios). (ArgenBio, 2007).
El rbol de Neem, tambin conocido como Nim, Lila india o Margosa, es una planta originaria de
la India cuya madera es parecida a la caoba, de buena calidad y duradera. Es una planta que se
utiliza con fines teraputicos. La corteza, las hojas y los frutos son las partes que poseen mayor
cantidad de aceites esenciales, por lo que son las ms utilizadas (Solguin, 2010). La corteza se
emplea en medicina popular local como febrfugo, y de ella se obtienen taninos, fibras y resinas.
Sus hojas se emplean como forraje para el ganado y de ellas se obtiene una sustancia empleada
para la fabricacin de insecticidas naturales.
Segn la gua para la Propagacin de 120 especies nativas de pnama y el Neotropico, la Familia
de Meliaceae (en donde pertenece el Neem) tiene en promedio una germinacin del 58% sin
pretratamiento en aproximandamente 4- 15 das. La germinacin de la semilla fresca del Cedro,

rbol procedente de la misma familia, se reporta en un 70-80%. La germinacin comienza a los

10 das y termina a los 30 das.

Materiales
Biologico

Hojas con tallo y frutos Neem.

Planta germinada de Neem
Semillas de Neem

Material de laboratorio

3 vasos de precipitados de 250ml

2 pipetas de 1ml
1 pizeta de 500ml
2 cajas Petri estriles
1 propipeta
1 frasco estril
Pinzas de diseccin de 30 cm estril
Bistur con navaja estril
Algodn
1 rollo de papel aluminio
Ligas de hule
Masking tape

Frascos estriles tipo gerber

conteniendo medio de cultivo MS

Equipo

Balanza digital
Parrilla con agitacin
Campana de flujo laminar
2 lmparas de alcohol o mecheros
Bunsen

Reactivos

Agua destilada
Etanol al 70%
Agua destilada estril
500ml Solucin de hipoclorito de
sodio: Blanqueador comercial al 10%
Frascos gerber con medio de cultivo
estril

Mtodo
Transporte de semillas/plantas de Neem
Se recolectaran 10 semillas del suelo y se realizara una prueba de viabilidad (germinacin) por
15 das para identificar la funcionalidad de las semillas dispersadas de forma natural en el suelo.
S las semillas tienen un porcentaje mayor al 60% de germinacin sealado en la literatura se
seleccionaran 3 de ellas para generar los explantes.
S el porcentaje de germinacin resulta menor al sealado se utilizaran explantes de los
meristemos de plntulas previamente recolectadas
48 horas antes en la misma zona,
mantenidas a temperatura ambiente.

Establecimiento del cultivo

Se pueden considerar dos situaciones en cuanto a la obtencin del explante: que est protegido
en el interior de un rgano, como el embrin, o que est en contacto con el exterior, como brotes
y yemas.
a) Para los explantes en el interior de rganos hay que realizar los siguientes pasos:
1. Lavar los frutos con agua corriente y detergente dentro de un recipiente con ayuda de un
escobillon.
2. Pelar el fruto eliminando aproximadamente 2 mm de grosor.
3. Cortar el fruto en rebanadas de aproximadamente 1 cm de grosor.
4. Sumergir las rebanadas en una solucin de etanol al 70% durante 60 segundos.
5. Eliminar la solucin y dar un lavado con agua destilada.
6. Sumergir las rebanadas en una solucin de blanqueador comercial al 10%, durante 10
minutos. A partir de este paso trabajar en la campana de flujo laminar o con mecheros,
limpiando previamente la superficie con una mota de algodn con alcohol.
7. Numerar y pesar los frascos en los cuales se van a colocar los tejidos, identificando
equipo, especie vegetal, fecha, RCV y concentracion empleada.
8. Eliminar la solucin.
9. Transferir el material vegetal a un frasco estril y lavar el material cinco veces con agua
destilada estril, con agitacin continua, durante 30 segundos en cada lavado.
10.Tomar una a una las rebanadas y transferirlas a una caja de Petri estril y con la ayuda de
unas pinzas de diseccin y bistur, cortar cubos de la zona del cambium de 1 cm por lado.
11.Colocar tres cortes (cubos) de cambium por frasco, procurando que la superficie de uno de
los lados del cubo quede en contacto con la superficie del medio de cultivo.
12.Volver a pesar los frascos y calcular el peso de los explantes por diferencia.
13.Coloque los frascos con los explantes en un cuarto de cultivo con fotoperiodo de 12 horas
de luz por 12 de oscuridad a una temperatura de 24-26C.
14.Observar cada semana el desarrollo de los cultivos, anotar las apariencias y cambios que
van sufriendo los explantes. Separar los frascos con explantes necrosados y contaminados
y describir si se trata de contaminacin bacteriana o fngica.
15.Pesar los frascos cada semana para calcular la tasa de crecimiento del callo.
b) Con un material vegetal saneado se puede seguir el siguiente protocolo:
1. Se cort un segmento apicales de crecimiento activo y de un tamao ligeramente
superior al deseado y coloco en un recipiente con agua destilada.
2. Se esterilizaron los explantes en un recipiente estril con blanqueador comercial al 10%,
durante 15 minutos.
3. Lavaron los explantes con abundante agua estril

4. Se coloc en Etanol al 70 % durante 10 minutos

5. Se lavaron los explantes con abundante agua estril
6. Se cort una pequea porcin del extremo del explante (por donde se cort inicialmente)
y colocar en el medio de cultivo.
7. Etiquetaron los recipientes con un cdigo adecuado que identifique el medio de cultivo, el
vegetal y la fecha
8. Colocaron los explantes en una cmara de crecimiento en oscuridad o a 25 C y 12 h de
fotoperiodo.

ANEXO
Contenido del Medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962)

NITRATOS NH4NO3 KNO3

SULFATOS MgSO4.7H2O 370 MnSO4 ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O
HALGENOS CaCl2 KI CoCl2.6H2O
FOSFATOS KH2PO4 H3BO3 Na2MoO4.2H2O
HIERRO Na2EDTA FeSO4.7H2O

Formulacin (mM)
NH4+
K+
Ca++
Mg++
SO4-2
PO4-2
NO3N total (mM)
Total (mM)

20.61
20.04
2.99
1.50
1.76
1.25
39.40
60.01
94.25

Fuentes de consulta
ArgenBio. (2007). Cultivo in vitro de plantas y su relacin con la Biotecnologa. Septiembre 8,
2015,
de
PQ
Bio
Sitio
web:
http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php?
action=cuaderno&opt=5&tipo=1e=35
Salcedo, Y., Ballesteros, G., Nila, A., Hernndez, E., Gonzlez, J. & Pea, Y.. (2009).
APROXIMACIONES BIOTECNOLGICAS PARA LA MANIPULACIN GENTICA DE NEEM (Azadirachta
indica).. Septiembre 8, 2015, de Instituto Tecnolgico Superior de Acayucan Sitio web:
http://www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/acapulco09/TRABAJOS/AREA_II/CII-69.pdf
Solguin (2010). Usos medicinales y aplicaciones curativas del neem/ Para qu sirve el neem.
Marzo 16, 2010. Sitio web: http://www.plantasparacurar.com/usos medicinales-y-aplicacionescurativas-del-neem/
Afaque Quraishi, V. Koche, P. Sharma & S.K. Mishra (2004) In vitro clonal propagation of neem
(Azadirachta indica). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 78: 281284, 2004.