Cultivo de plantas in vitro

Aislamiento y cultivo de clulas

Cultivo de clulas
vegetales

Diferenciacin
celu lar

vegetales en
suspencin

Clula

Tej ido

Organo

Planta

Em briog n esis so m tica, cu ltivo d e callo sidad es

Dr. Ing. Waldir D. Estela Escalante, MSc , PhD

Condiciones estriles

Proceso de embriognesis somtica

Generacin de callosidades
20g. de clulas contienen
millones de embriones
Callosidad

Planta madre

Clulas que aparecen sobre la superficie lesionada de una

planta, el cual gradualmente cubren y sellan el rea daada.

Tejido no diferenciado obtenido del cultivo de ex-plantas

Clulas en suspensin

Semilla desnuda
Planta in vitro

Semilla germinada

Medio slido inductor de callosidades (CIM)

Generacin de callosidades embriognesis

somtica indirecta

Foliolo s de
Alm cig o s
(30 das)

Foliolo s + m ed io
indu ctor d e
callosid ad es ( ag ar)

Corte p ar cial
per pendicu lar
lesin

Incub acin a
2324C oscurid ad

Transf er encia
de f oliolo s a
placas p etr i

Callo sid ades

Medio MS basal sales y vitaminas

Sucrosa: 3% (w/v) fuente de azcar
Gelrita: 0.2% (w/v) agar
cido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D): 1 mg/L fitohormona
Zeatina 2 mg/L (fitohormona)

 Favorece la proliferacin de callosidades fcilmente

desmenuzables balance de fitohormonas, ejem. alta
concentracin de auxina relativo a citoquinina.

Produccin de callosidades a partir de hojas

Suspensin celular

La callosidad se desarrolla en los bordes del tejido daado
a los 1015 das del inicio del cultivo.

El 100% de las ex-plantas desarrollan callus
desmenuzable de color amarillo oscuro. Culturas de callus
pueden ser mantenidos en placas petri y sub-cultivados (6
porciones de 1-1.5 cm por placa) cada 4 semanas.

Cultivos de clulas individuales (minora) y pequeos

agregados celulares (mayora) que proliferan y
completan un ciclo de crecimiento mientras estan
su spendidos en el medio liqudo

En cultivo batch, un ciclo de crecimiento se refiere a un
tra spaso (pa ssage).

Porciones desmenuzables de callus crecidas 4 semanas

pueden ser separadas y tran sferidas al medio lquido para
iniciar el cultivo de la suspen sin celular.

Produccin de metabolitos secundarios mediante

cultivo de clulas en suspensin

Seleccin entre
plantas silvestres:
mayor productora

Condiciones de cultivo
y aislamiento de la mejor
lnea (cepa) productora

Cultivo en
biorreactor

Maximizacin de
suspensin celular

Cultivo in vitro,
callognesis

Salto de escala

Proceso de
recuperacin:
extraccin y
purificacin

 Polisacridos microbianos estre san clulas vegetales

resultando en elicitacin (induccin)  incremento en
la sntesis de un metabolito  induccin de enzimas.

Adicin de precursor del compuesto deseado en el medio
de cultivo  induce cambios en el flujo de carbono para
favorecer la expresin de vas metablicas conllevando a
los compuestos buscados.

Produccin de nuevos genotipos por fusin de
protoplastos ingeniera gentica identificacin de
genes que codifican enzimas claves de vas metablicas
secundarias y su expre sin una vez introducido en las
clulas vegetales.

Uso de mutgenos para incrementar la variabilidad de
clulas.

Incremento de la produccin de metabolitos

secundarios

Uso de elicitores (activadores) biticos abiticos que
estimulan las vas metablicas al igual que en la planta
intacta:
 Luz: induce la sntesis de flavonoides
 Infeccin con organismos fitopatognicos: induce la
snte sis de compuestos antimicrobianos (ejm., hongo
Verticillium induce la sntesis de gosipol en cultivo de
Gossypium arboreu m)
 Quitosano induce la produccin de quitinasa en clulas
de zanahoria (Daucus carota).

Preparacin de suspensiones celulares a partir de

callosidades
Material vegetal: callosidades (callus) suspen siones
celulares son preparadas inoculando callosidades
fcilmente desmenuzables en medio lquido.
 Clulas individuales y/o agregados celulares son
mantenidos en su spensin mediante agitacin y
aireacin minimiza la hipoxia
 Luego del traspa so inicial, el cultivo se filtra (300
500 m) eliminacin de grandes masas de tejido.

Establecimiento y manteni miento de suspensiones

celulares

Preparacin de suspensiones celulares a partir de

callosidades

Callo sid ad
desm enuz ab le

Tamz (300 - 500

m) - filtracin

Liberacin
de clulas

Clulas
suspendidas

1er tr asp aso

(agit aci n)

Preparacin de cultivos celulares en su spen sin: 2 g de

callus se colocan en 50 ml de medio lquido para cultivo en
su spen sin (SCM): MS basal sales y vitaminas + 3% (w/v)
sucrosa + 1mg/L 2,4-D y 1mg/L quinetina (fitohormona),
hasta obtener una adecuada densidad celular, las clulas
forman aglomerados y el medio es su stituido cada semana.

Los cultivos celulares en su spensin se mantienen
mediante subcultivos en medio SCM + 0.5 mg/L 2,4-D
(fitohormona) y 0.5 mg/L quinetina. Subcultivos se realizan
transfiriendo 10 ml de una su spensin celular en la fase
exponencial final de crecimiento (cada 7 das) hacia 100 ml
de medio fresco (en frasco de 500 ml).

2do trasp aso

Los cultivos de suspen siones celulares se mantienen en un

agitador orbital a 120 rpm en oscuridad a 24C.

Luego de transferir el callus al medio lquido SCM y

mantener a agitacin constante, el callus comienza a
disociarse en pequeos grupos celulares y clulas
individuales.

Los cultivos de clulas en su spensin se e stabilizan en 2
meses. Lo s cultivos obtenidos mediante este proceso son
de color amarillo oscuro y consisten de clulas individuales
y agregados celulares de hasta 2.5 mm.

Las clulas pequeas esfricas conteniendo citoplasma
denso. Esta s culturas pueden ser mantenidas por largos
periodos de tiempo sin perdida de su capacidad embrinica
mediante sub-cultivo en la fase exponencial final de
crecimiento a medio fresco (culturas de 3 aos mantenidos
semanamente por sub-cultivo preservan sus competencias
embriognicas).

3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.

Promover el enraizamiento y propagacin

Controlar el tamao de la planta u organo
Promover, retardar o prevenir el floramiento
Inducir o prevenir la cada de hojas y/o fruto
(absci sin)
Control la aparicin de frutos y posterior desarrollo
Influencia en la toma de mineral desde el suelo
Cambiar la velocidad de desarrollo del cultivo
Incrementar la resistencia de la planta a pestes
Mejorar la resistencia de la planta a factores
ambientales como T, agua y polucin de aire
Prevenir el deterioro post cosecha.

Reguladores de crecimiento de plantas (fitohorm onas)

Modifican un cultivo cambiando el modo y/o la velocidad

de su re spuesta a los factores internos y externos que
gobiernan su desarrollo desde la germinacin hasta el
crecimiento vegetativo, desarrollo reproductivo, madurez
y sene scencia asi mismo conservacin post cosecha.

La regulacin del crecimiento incluye:

1. Regular la composicin qumica de la planta y/o el
color de la fruta
2. Iniciar o terminar el periodo de dormancia de semillas,
yemas y tuberculos

Efecto del regulador de crecim iento en la m orfologa

de callosidades de tabaco
0.1 mg /L quin etin a
3.0 mg /L 2,4-D

Callosidad fcilmente desmenuzable

2.0 mg /L IAA
3.0 mg /L 2-iP

Callosidad compacta

Tipos de cultiv os de suspensiones celulares y modelos

de crecimiento

Cultivo batch, continuo y fed batch manteniendo la

aireacin del medio. Se utilizan sistemas con agitadores
airlift.
Cultiv o batch crecimiento continua hasta que un
nutriente se vuelve limitante (traspaso ), usualmente fuente
de carbono.
Cultiv o continuo medio fresco es repuesto durante el
cultivo crecimiento sostenido. Tasa de dilucin = 1/da.

Ciclo de crecimiento en cultiv o batch (traspaso)

Cultiv o batch fases de crecimiento ciclo de

crecimiento tpico es de 3 a 6 duplicaciones celulares,
de 12 a 14 das en duracin:
Fase lag clulas activan el metabolismo para el
crecimiento celular
Fase exponencial ganancia de masa celular
exponencial debido a divisin celular
Fase lineal/desaceleracin progresiva ganancia
lineal de masa debido a expansin celular
Fase estacionaria crecimiento cesa

Cambios en v olumen de las clulas durante la fase

exponencial el tamao de clulas disminuye (divisin
celular >> ganacia en peso) y durante la fase lineal, el
tamao de clulas incrementa (divisin celular <<
ganancia en peso)

Lineal

Tamao del agregado celular clulas son mas
pequeas pero mas agregados durante la fase de
divisin y son mas grandes pero menos agregados
durante la fase de expansin

Estacionario
Lineal/desaceler acin progresiva

Log
Exponencial
Lag

Efectos de la densidad del inculo una mayor

densidad de inculo reduce la longitud de la fase lag y el
nmero de duplicaciones celulares por intervalo de
cultivo.

Tiempo (das)

Crecimiento
(
)
Volmen de clula
(----)

% unidades
celulares
<10 clulas

Cultivo de clulas vegetales

Volmen de clula

Los principios aplicados al cultivo de clulas microbianas

pueden aplicarse al cultivo de clulas vegetales

15
Agregacin celular
5
2.0 x 105 cel/ml

Crecimiento
relativo
(log)

6.2 x 105 cel/ml

Tiempo (das)

Densidad celular
del inculo

Densidades celulares son menores que en cultivo

microbiano

Tasas de crecimiento en cultivos microbianos son mayores
(0.11 h) que en clulas vegetales (0.020.03 h).

Clulas salvajes crecen mas rpido que las transformadas


OUR e s ms lento en clulas vegetales (13.5 mmol/l.h)

que en cultivos bacterianos (590mmol/l.h).

Biorreactores estndare s para cultivos microbianos
pueden ser adaptados fcilmente para cultivo de clulas
vegetales.

Estrategias de cultivo microbiano pueden aplicarse a
cultivo de clulas vegetales

Formacin de agregados, tendencia de clulas vegetales a
adherirse en las paredes del envase del biorreactor

Problemas en cultivo continuo inestabilidad gentica y

produccin acoplada al no crecimiento  solucion: cultivo
en biorreactores de dos etapas

Cultivos celulares no siempre producen los compuestos
que normalmente produce la planta, ejemp.: alcaloides
como morfina, tropane y quinolina son sintetizados en
cantidades extremadamente bajas en cultivos celulares

Variabilidad espontnea de la capacidad biosinttica de la
clula vegetal

Variabilidad gentica

Sensibilidad al esfuerzo cortante

Bajo contenido de protenas  deficiencia de promotores

Rendimiento de producto: optimizacin de medio 
proceso rentable  produccin industrial

Puede aplicarse cultivos batch, fed batch, continuo

Cultivo de clulas vegetales en cultivo batch en muchos
caso s no siempre sigue la cintica de crecimiento simple
de microorganismos

Produccin de metabolitos secundarios

Plantas superiores producen variedad de metabolitos
secundarios:

Esteroides, alcaloides y glucsidos uso farmacutico

Aromas y fragancias naturales uso en alimentos
(Theobro ma cacao y Coffea arabica produccin de
aromas caracter sticos)

Edulcorantes naturales (Stevia rebaudiana: esteviobiosido)

Insecticidas (aceites esenciales)

Pigmentos, etc.

Produccin de protenas recombinantes ingeniera

gentica:
 Enzimas
 Anticuerpos
 Hormonas
 Factores de crecimiento, etc.

Datos econmicos de algunas sustancias de origen

v egetal
Sustancia
y uso

Necesidad
anual

Farm acia:
Aj malici ne
3 5 tonel adas
Digoxi na
6 tonel adas
Vincristi na
5 10 tonel adas
Aditiv os alim ent arios y fr ag an cias:
Ac eite de j as mi n
100 kg
Ac eite de menta
Co sm etico s:
Shic onina

Costo industrial
US dolares/kg
1500
3000
5 mill ones dolar es /kg
5000

3000 tonel adas

30

150 kg

4000

Production of secondar y metabolites by plant tissue and cell cultures. Present

aspects and prospects. Nestl Research News. 1990.

Metabolitos secundarios:

Se originan del metabolismo primario

Frecuentemente limitado a determinados grupos

taxonmicos

Son sintetizados en:

Determinadas (e specilizadas) clulas
Determinados estadios de desarrollo

Biosntesis de metabolitos secundarios

Plantas que sintetizan productos de alta demanda son

usualmente cultivadas en gran escala

Clulas vegetales pueden cultivarse y ser producidas
(biomasa) en grandes biorreactores

Las callosidades y clulas vegetales en suspen sin
clulas morfolgicamente no diferenciadas (de hojas,
tallos, races)

En clulas no diferenciadas una pequea parte del
potencial biosinttico es expresado desventaja

Lim itaciones en la produccin industrial (salto de

escala) de m etabolitos secundarios en cultivo con
suspensiones celulares

Crecimiento lento de clulas con tiempos de duplicacin
de 24 a 48 horas que requieren usualmente 2 a 3
semanas para proporcionar suficiente biomasa

Susceptibilidad a contaminacin microbiana

Uso de culturas que provienen de una sla clula

Necesidad de oxgeno

Susceptibilidad al esfuerzo cortante debido al gran
tamao de las clulas (200 000 veces ms que
bacterias)

Multiplicacin celular y sntesis de metabolitos no estan
acoplados sntesi s de metabolitos sucede al final de la
fase de crecimiento.

Factores que afectan la produccin de metabolitos

secundarios
 Estado fisiolgico de las clulas vegetales
 Composicin qumica del medio medio de crecimiento
medio de produccin
 Tipo y concentracin de fitohormona usada en el medio:
quinetina, cido giberlico, 2,4-D (cido
diclorofenoxiactico), cido indol actico, etc.
 Densidad celular del inculo

 Nmero de subcultivos (10) prdida de capacidad

productiva
 Parmetros de fermentacin: T, O2, CO2, luminocidad
 Concentracin de fosfato acumulado dentro de las
clulas (crecimiento) y concentracin de fosfato en el
medio de produccin limitacin

 Aj malicina, catarantina

Aplicacin: terapia contra cancer

derivados de triptofano
Produccin biotecnolgica:

Medio de crecimiento (acumulacin de fosfato):
2,4-D (fitohormona)
Sucrosa

Medio de produccin Zenks

 Concentracin de sucrosa
 Concentracin de fuente de nitrgeno (NH4) en la etapa
de produccin

Condiciones de cultivo:

Biorreactor 720L airlift con sistema de agitacin de
una varias etapas

Baja velocidad de agitacin control de esfuerzo
cortante

Limitacin fosfato

Productividad < 1g/L.da

Catarantina
Ajmalicina
Catharanthus roseus
Rauwolfia serpentina

Produccin de alcaloides m onoterpenos indlicos

Catharanthus roseus

No adicin de 2,4-D
c. indol actico (fitohormona)
sucrosa (58%)