Jos Antonio Paredes Arrascue

Dr. (c), Mg., Lic. en Tecnologa Mdica

Profesor Asociado de la Facultad de Medicina
U.N.M.S.M.
Tecnlogo Mdico del Servicio de Medicina Transfusional
H.N.E.R.M. - EsSalud

Reaccin de Aglutinacin y sensibilizacin.

Uso de potenciadores.
Efecto de las enzimas sobre la membrana
de los hemates.

Se trabajaron pruebas inmunolgicas antes que se

estableciese la inmunologa
`
`

Aglutingeno
Aglutininas

El protocolo completo de la prueba de compatibilidad es

una revisin de la evolucin de la prueba en s.
`
`
`
`
`

CI
TA
ALB
37 0C
Coombs

Fases de la Aglutinacin
`

1ra fase: Sensibilizacin

`
`

Temperatura
Tiempo

2da fase: Acercamiento entre clulas (Aglutinacin

propiamente dicha)

Teora de los puentes

Anticuerpos aglutinantes y no aglutinantes

`

Por lo general

Ej.
`
`

Aglutinantes
NO aglutinantes

IgM : aglutinantes,
IgG: no aglutinantes.
IgM anti A
IgG anti D

NO es una regla:
`
`

IgG anti A,B: aglutinantes

IgM anti Jka: no aglutinante

Tamao comparativo

IgG

14 nm

Potencial Z

25 nm

IgM

35 nm

Glbulo Rojo

7,2 um

7 200 nm

Potencial Zeta

Considerando la carga elctrica del glbulo rojo , la

fuerza inica del medio de la suspensin () y la
constante dielctrica del medio (D), Pollack desarroll la
siguiente expresin del potencial zeta (Z):
Z = f[, 1/D, 1/]
o sea, la diferencia del potencial zeta es una funcin que
varia directamente con la electronegatividad de la
membrana eritrocitaria () e inversamente con la
constante dielctrica del medio de suspensin (D) y con
la raz cuadrada de su fuerza inica ().

COOH-

COOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOH-

Cl- Na+

ClNa+
Na+

ClNa+

Cl-

ClNa+
Na+

Cl-

Na+
ClNa+ ClNa+
COOHNa+
Cl
COOHNa+
COOHNa+ ClNa+
ClCOOHNa+
COOHNa+ ClCOOH- Na+ Na+ ClCOOHCOOH- Na+ Na+ ClNa+ ClCOOHCOOH- Na+
Na+ ClNa+ Cl
COOHCOOH- Na+ Na+ Cl
Na+
COOH- Na+
ClCl
COOHNa+
Na+ COOH- Na+
ClNa+ Na+ Cl
Na+ ClClNa+
Cl-

_ + _ +_
+
+
+
+ + + + _
_
+
+
+
+ + + + + _
+ +
_
_
+
+ + + +
_ +
+
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_
_
_ + _
+ + ++ _
+
+
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+
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+
_
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_
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+
+
+ ++ +
+
+ +
COOH
_
+ ++ +_ + _ +
+
COOH
+
+
+
+
+ +
_
_
+ _
COOH
+
+
+ +
+
+ + + +
+
COOH
_
_
+
+
+
+
+
_
+
+ +
COOH
_
+
+ + +
+ _
+
+
+
COOH
+
+
+
+
+ _
+ _
+_
+
+
COOH
+
+
+
+
+
+
+
_
_
+
COOH
+ + + +
+
+
+
+ +_ + + _ +
COOH
+
+
_
+
+
_ +
COOH
+
+
+
+ + +
+
COOH
+ +
_ + + _ +
+
+
_
+
COOH
+
+ +
ImunoBase- DiaMed AG

La nube de iones positivos que involucra cada glbulo, se

vuelve menos densa mientras se aleja del glbulo. La
diferencia de potencial elctrico creada entre la doble
capa de iones positivos (Na+) cerca del glbulo y el
medio con iones de sodio y cloruro en equilibrio
(neutro), se llama Potencial Zeta.

Potencial Zeta crtico y clases de

Anticuerpos
POTENCIAL Z
(mV)

-23
- 18 a 23
-15
-8 a -10
-7

Aglutinacin imposible a partir de este punto

Potencial Z critico para IgM
Potencial Z de una suspensin de GR en (SSF)
Potencial Z crtico para IgG
Aglutinacin inespecfica por debajo de este punto

Fuente: Rouger P., Salmon C.; La pratique de lagglutination des Erytrocites et du test
de Coombs

Procedimientos ms importantes bajo la ecuacin de

Pollack para reducir el potencial zeta:
`
`
`
`

Tratamiento de los glbulos rojos por enzimas

proteolticas:
Adicin de substancias macro-moleculares
Cambio de la fuerza inica del medio
Prueba de la antiglobulina humana o prueba de Coombs:

+ + +++++ + ++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ ++ +
+
+
+
++ + + + + + + + + + + + + + + + ++++ + +
+++
+

+ + +++++ + ++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ ++ +
+
+
+
++ + + + + + + + + + + + + + + + ++++ + +
+++
+

+ ++
++ +
+

+ + +++++ + ++
+ + + + + + + + + ++ + + + +
+ + + ++++ + + + +++++
++++++

NH2

NH2

+ + +++++ + ++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ ++ +
+
+
+
++ + + + + + + + + + + + + + + + ++++ + +
+++
+

+ + +++++ + ++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ ++ +
+
+
+
++ + + + + + + + + + + + + + + + ++++ + +
+++
+

+ + ++++ + ++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ ++ +
+
+
+
++ + + + + + + + + + + + + + + + ++++ + +
+++
+

+ + +++ + + ++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ ++ +
+
+
+
+
+ + ++ ++++
++ + + +
+++++
+

POTENCIADORES

Adicin de sustancias macromoleculares

`

Pollack: primero en ofrecer un modelo plausible de

aglutinacin en medio macromolecular: papel de la
constante dielctrica del medio (D).
Albmina, dextran, ficol, PEG y otras (macromolculas
hidrosolubles), poseen un extremo positivo (amnico) y
otro negativo (carboxlico), cuando son aadidas al medio
de suspensin de los glbulos rojos se polarizan en el
campo elctrico (aumenta su constante dielctrica: D) son
atradas para cerca de los glbulos neutralizando sus
cargas negativas y promoviendo la dispersin de iones
positivos (Na+) cerca de ellos. La disminucin de este
escudo de cargas positivas, baja el valor del potencial zeta
y disminuye la fuerza de repulsin interglobular.

Albmina Srica Bovina

`

Las soluciones de albmina bovina ejercen un efecto

potenciador gracias a que aumentan la constante
dielctrica del medio en el que se hallan los hemates y
los anticuerpos; esto tiene como resultado la disminucin
del potencial Z y, en consecuencia disminuye, tambin la
repulsin electrosttica existente entre los hemates
cuando se hallan en suspensin en un medio salino.

Albmina Srica Bovina

`
`

Concentraciones ms empleadas: 30%, 22%, 6%, 3% (ms

usada en microplaca).
La temperatura ms adecuada para la conservacin de las
soluciones de albmina es de 4C. Adems, para evitar la
contaminacin bacteriana se utiliza la azida sdica (N3Na)
al 1: 1 000.

+ -+

--

+ +

-+ - + - +

-+
+-

+ + +++++ + ++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ ++ +
+
+
+
++ + + + + + + + + + + + + + + + ++++ + +
+++
+

+ +
+
+ +
+
+

+ -+

--

+ +

-+ - + - +

-+
+-

LISS (Low ionic Strength Saline)

Solucin de baja fuerza ionica (sbfi)

Liss
`

La carga de iones positivos y negativos que poseen es

inferior a la que contiene la solucin salina fisiolgica
normal, por ello, la interaccin de los iones del medio
dificulta menos las uniones antgeno/anticuerpo
(sensibilizacin de los hemates) permitiendo tiempos de
incubacin ms cortos

SSF
0.85%

LISS
0.2%

+ + +++++ + ++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ ++ +
+
+
+
+ + + + + + + + + + + + + + + + + ++++ + +
+ ++
+

SSF
0.85%

LISS
0.2%

+ + +++ + +
+
+
+
+
+
+
+
+ + + + + + ++ ++ ++++ +
+
+ + + +
++ + + + +
+ + +
+

SSF
0.85%

LISS
0.2%

+ + +++ + +
+
+
+
+
+
+
+
+ + + + + + ++ ++ ++++ +
+
+ + + +
++ + + + +
+ + +
+

LISS
`
`

`
`
`

Low Ionic Strength Saline 0.2 % ClNa, glucosa al 7%

Aumentan la cintica de la reaccin antgeno anticuerpo con lo
que reducen el periodo de incubacin:
` Incrementa la captacin de Anticuerpos por Ag
` Incrementa la velocidad de asociacin Ag-Ac.
` Disminuye el tiempo de incubacin.
Posibilita detectar anticuerpos dbiles que no pueden
detectarse por otros medios.
Formacin de aglutinados ms fuertes que los producidos con
otras tcnicas
Puede potenciar anticuerpos fros.

POLYBRENE

Polybrene
`

Es un policatin (polmero positivamente cargado)

de amonio cuaternario (bromuro de
exadimetrina) en cuya presencia, en baja fuerza
inica y a pH bajo, los hemates normales agregan
espontneamente, la cual puede ser disgregada
mediante citrato de sodio, Si los hemates estn
sensibilizados esta aglutinacin persiste

Esto puede deberse a la neutralizacin de la carga negativa

aportada por los residuos de Acido silico, que se
fundament en la observacin que el Polybrene no afecta a
las clulas que les falta el cido silico (por causas genticas
o por tratamiento con Enzimas).

Polybrene
`

Otra explicacin para la agregacin inducida por este

policatin es que la asociacin de las macromolculas con
molculas cargadas en la membrana celular expulsa a las
molculas de agua que forman la capa de hidratacin.
Problemas con deteccin de Anti Kell

SSF
0.85%

LISS
0.2%

+ + +++ + +
+
+
+
+
+
+
+
+ + + + + + ++ ++ ++++ +
+
+ + + +
++ + + + +
+ + +
+

LISS
0.2%

+ + +
+
+
+
+
+ + +
+ +
+ + +
+

PEG
`
`

`
`

Polmero linear que desplaza al diluyente, por lo que aumenta la

concentracin de Anticuerpo.
PEG especialmente en un medio de baja fuerza inica, agrega
los hemates y aumenta la sensibilidad de las tcnicas de
deteccin de anticuerpos, consiguiendo la disminucin del
tiempo de incubacin. Tiene una sensibilidad y especificidad
superior a la Albmina.
Lectura solo en fase de Antiglobulina, no se debe efectuar
lectura despus de la incubacin a 37C.
Reacciones inespecficas con Antiglobulina humana
poliespecfica

PEG
`

Aumenta la sensibilidad de la prueba para la deteccin de

Ac clnicamente significativos mediante la Prueba
Antiglobulina indirecta
Empleada como aditivo, mejora de manera espectacular la
sensibilidad de las pruebas de deteccin. La mayora de las
anticuerpos IgG se pueden detectar a niveles de potencia
ms bajos que por mtodos convencionales.
Puede requerir mayor nmero de lavados antes de aadir
la Antiglobluina.

Tratamiento por Enzimas

proteoliticas

Tratamiento por enzimas proteolticas

`

Descritas en 1946 por Pickles: son capaces de retirar

de la superficie del hemate fragmentos polipeptdicos
de las glicoprotenas de membrana, tales como el
cido silico (disminuyen ) y por consiguiente
disminuyendo el Potencial Zeta permitir un mayor
acercamiento de los hemates facilitando su
aglutinacin por los anticuerpos de tipo IgG.
De esa manera los hemates pueden ser aglutinados
por anticuerpos de clase IgG (no aglutinantes), como
IgG anti-Rho(D), en medio salino.

Tecnicas enzimticas
`
`
`
`
`

Las enzimas mas utilizadas: bromelina, papana y ficina

Aumentan la sensibilidad de deteccin de algunos
antgenos ( Rh, Kidd)
Destruyen antgenos de la membrana eritrocitaria ( M, N,
S, Fy)
Incrementan la deteccin de anticuerpos fros
Las pruebas para la investigacin de anticuerpos mediante
enzimas proteolticas son muy sensibles para
determinados anticuerpos pero tienden a dar resultados
falsos positivos, por ello los anticuerpos reactivos solo
con enzimas no suelen tener significacin clnica.

` Tripsina

Primera enzima descrita, da

muchos falsos positivos. Las clulas
tratadas con tripsina son especialmente
sensibles a la hemlisis, sobre todo en
pacientes con enfermedad de aglutininas
fras.

Ficina
`

Se obtiene desecando el ltex de la higuera.La ficina

en polvo produce, en muchas personas erupciones
cutneas, y si accidentalmente penetra en un ojo,
puede producir lesiones graves. Las clulas tratadas
con ficina dan con frecuencia resultados positivos
falsos, por lo que se recomienda trabajar con
controles positivos y negativos. Debe usarse slo
para pretratar las clulas, ya que an no se han
descrito mtodos de un solo paso para esta enzima.

Papaina
Obtenida de la papaya, se utiliza mucho porque rene
las propiedades de una adecuada sensibilidad junto
con una buena selectividad. Como sucede con todas
las Enzimas, si las clulas se tratan por exceso con
papaina se produce falsas reacciones positivas, pero
no tan frecuentemente como con la tripsina o la
ficina. Puede usarse para pretratar clulas o, cuando
se activa con la l-cistena, para tcnicas de una sola
fase. Es especialmente til para detectar anticuerpos
del sistema Rh.

Bromelina
Se obtiene del tronco de la pia, se emplea en tcnica de
una sola fase. Las clulas tratadas con esta enzima
detectan la mayora de anticuerpos del sistema Rh sin
mostrar sensibilidad a la cantidad de aglutina fra que
normalmente hay en el suero.
Eficacia en la eliminacin del Acido silico: Ficina >
papaina > bromelina > tripsina

Modificaciones del Potencial Zeta (Z) y de la carga

elctrica del hemate () por el tratamiento
enzimtico

% de
Potencial Carga Elctrica
del hemate
reduccin de
Hemates
(Z)
( x 103 ues/cm2)
(mV)
(z) y ()
No tratados
- 19,6
- 3,27
0.0
Tripsina
- 15,6
- 2,59
24.4
Bromelina
- 14,1
- 2,35
28.1
Papana
- 10,1
- 1,68
48.0
Ficina
- 9,00
- 1,51
53.9
Adaptacin de: P. Rouger, y C. Salmon; La Pratique de
lAgglutination des rythrocytes et du Test de Coombs

Tratamiento por enzimas proteolticas

`

Es importante sealar que ciertos grupos

antgenos de grupo sanguneo son destruidos o
inactivados por el tratamiento enzimtico: M, N, S,
s, Fya, Fyb, Xga.
Esta inactivacin exacerba la presencia de los
determinantes antignicos residuales, pudiendo provocar
efectos no deseados de aumento de reactividad de
anticuerpos sin importancia clnica