UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGA

CAPACIDAD
EXTRACTO

ANTIOXIDANTE
METANLICO

DE

EFECTO
ORTIGA

CITOPROTECTOR
(Urtica

dioica)

EN

DEL
LA

VIABILIDAD DE MACRFAGOS MURINOS, PUNO 2015.

TESIS
PRESENTADO POR:

Br. CHIPANA CHUQUICALLATA, Delia Rosa

Br. CHATA QUISPE, Guido Gustavo

PARA OPTAR EL TTULO PROFESIONAL DE:

LICENCIADO EN BIOLOGA
PUNO

PER
2015

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO-PUNO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGA
CAPACIDAD
EXTRACTO

ANTIOXIDANTE
METANLICO

DE

EFECTO
ORTIGA

CITOPROTECTOR
(Urtica

dioica)

EN

DEL
LA

VIABILIDAD DE MACRFAGOS MURINOS, PUNO 2015.

TESIS
PRESENTADO POR:
Br. CHIPANA CHUQUICALLATA, Delia Rosa
Br. CHATA QUISPE, Guido Gustavo
PARA OPTAR EL TITULO PROFESIONAL DE

LICENCIADO EN BIOLOGA
APROBADA POR EL JURADO REVISOR CONFORMADO POR:

PRESIDENTE DEL JURADO

..
Dra. Youri Teresa Del Carpio Condori

PRIMER JURADO

..
Blgo. Herminio Rene Alfaro Tapia

SEGUNDO JURADO

..
Mg. Dante Mamani Sairitupac

DIRECTOR

..
Mg. Juan Jos Pauro Roque
2

DEDICATORIA

Le dedico este trabajo a mi familia

por todo el apoyo incondicional
que me dieron para la realizacin
de este proyecto, por su empeo,
dedicacin y constancia que me
permiti culminar mis estudios y a
mis mejores amigos por cada una
de sus palabras.
Delia Rosa

Le dedico este trabajo a mi familia,

quienes siempre me dieron su
apoyo incondicional e hicieron
posible que pudiera lograr mis
metas, y a mi madre que desde el
cielo cuida de m en todo momento.
Guido Gustavo

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo de tesis primeramente nos gustara agradecer a Dios por la bendicin
para lograr nuestros objetivos.

A la Universidad Nacional del Altiplano de Puno por la oportunidad de estudiar y ser

profesional.

A nuestro director de tesis, Mg. Juan Jos Pauro Roque por dedicarnos su tiempo y
quien con sus conocimientos, su experiencia, su paciencia y su motivacin ha
colaborado para presentar esta investigacin.

A la Dra. Corina Vera Gonzles y Mg. Carlos Arenas Chavz, por los consejos, que
ayudaron a mejorar este trabajo y por la visin que nos inculcaron como investigadores.

Tambin nos gustara agradecer a los docentes quienes durante toda la carrera
profesional han aportado a nuestra formacin.

INDICE
RESUMEN .................................................................................................................... 6
I.

INTRODUCCIN: ................................................................................................ 7

OBJETIVO GENERAL: ............................................................................................... 8

OBJETIVOS ESPECFICOS: ....................................................................................... 8
II. REVISIN LITERARIA:...................................................................................... 9
2.1. ANTECEDENTES: ........................................................................................... 9
2.2. MARCO TERICO: ........................................................................................ 21
2.2.1. Ortiga (Urtica dioica)............................................................................ 21
2.2.2. Estrs oxidativo: ........................................................................................ 23
2.2.3. Antioxidantes: ............................................................................................ 31
2.2.4. Produccin de xido ntrico en macrfagos activados. ............................. 39
2.2.5. Ensayo de citotoxicidad: ............................................................................ 47
2.2.6. Genotoxicidad: ........................................................................................... 49
2.3. MARCO CONCEPTUAL: ............................................................................... 53
III.

MATERIALES Y MTODOS: ....................................................................... 55

3.1.

AREA DE ESTUDIO: .................................................................................. 55

3.2.

TIPO DE ESTUDIO: .................................................................................... 56

3.3.

POBLACIN Y MUESTRA: ...................................................................... 56

3.4.

MATERIALES: ............................................................................................ 57

3.5.

METODOLOGA: ....................................................................................... 59

3.5.1.

DISEO DEL MUESTREO O EXPERIMENTO:............................... 59

3.5.2.

DE LABORATORIO: ........................................................................... 61

3.5.3.

DISEO ESTADISTICO: .................................................................... 69

IV.

RESULTADOS Y DISCUSIN: .................................................................... 71

V.

CONCLUSIONES: .......................................................................................... 89

VI.

RECOMENDACIONES .................................................................................. 90

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS: ............................................................ 91

VIII. ANEXOS: ...................................................................................................... 100

RESUMEN
La excesiva oxidacin de biomolculas de tejidos, incluyendo los lpidos, las protenas
y ADN da lugar a daos en el organismo, es as que un exceso de radicales libres est
relacionado con una mayor incidencia de enfermedades. El objetivo de la investigacin
fue evaluar la capacidad antioxidante y efecto citoprotector del extracto metanlico de
ortiga (Urtica dioica) en la viabilidad de macrfagos murinos. Para la capacidad
antioxidante se us el mtodo de inhibicin del radical libre DPPH, el efecto sobre la
produccin de xido ntrico se determin con el mtodo de Griess, para la viabilidad
celular se aplic el mtodo de MTT y para evaluar la fragmentacin de ADN se aplic
el mtodo de electroforesis. Los datos fueron analizados mediante ANDEVA de un solo
factor y las pruebas de Tukey y Dunnett con p0.05. Los resultados demuestran que la
capacidad antioxidante est en relacin directa con la concentracin del extracto
metanlico de ortiga, obtenindose un 71.03, 64.11, 54.33 y 44.59% de inhibicin para
las concentraciones de 600, 400, 200 y 100 g/ml del extracto respectivamente, un IC50
de 157.88 g/ml, que al anlisis estadstico mostr diferencias altamente significativas
(p=6.977x10-09). El efecto del extracto metanlico de ortiga sobre la produccin de
xido ntrico en macrfagos murinos activados, la concentracin de 600 g/ml
disminuy la produccin de xido ntrico mostrando una concentracin de 10.02 M de
nitritos a diferencia del control 15.58 M que al anlisis estadstico mostr una
diferencia altamente significativa (p=3.1691x 10-06) y en la prueba de Dunnett al 95%.
En viabilidad celular, los macrfagos tratados con las concentraciones del extracto
metanlico de ortiga no mostraron diferencias significativas (p=0.669) porcentajes
mayores a 87% de viabilidad celular, mientras que los macrfagos sometidos a estrs
oxidativo por perxido de hidrgeno al 10 mM mostraron un 54.02% de viabilidad
celular, que al anlisis estadstico mostr diferencia altamente significativa (p=0.006) y
respecto al control en la prueba de Dunnett al 95%. Por otro lado, el efecto del extracto
metanlico de ortiga sobre la fragmentacin del ADN mostr una accin protectora, al
anlisis electrofortico se evidencia un efecto favorable en el sistema control y en los
sistemas en los cuales se encuentra presente el extracto metanlico de ortiga (Sistema I,
Sistema II), a las 24 horas no se observa fragmentacin que a diferencia del control
positivo de perxido de hidrgeno al 10 mM si presenta fragmentacin del ADN. Se
concluye que el extracto metanlico de ortiga, posee capacidad antioxidante y efecto
citoprotector en la viabilidad de macrfagos murinos.
6

I.

INTRODUCCIN:

Para los organismos aerbicos, el oxgeno es esencial para la vida; pero en determinadas
condiciones, como reacciones de naturaleza qumica, enzimtica, ionizante, humo de
cigarrillos, plaguicidas, mala alimentacin, entre otros, pueden producir radicales libres
en cantidades variables, por ejemplo el anin superxido, radical hidroxilo, perxido de
hidrgeno, oxgeno singlete, de tal modo que la elevacin o disminucin de las
concentraciones fisiolgicas de estas especies reactivas de oxgeno (EROS), acarrean
serias alteraciones funcionales, generando diversas patologas degenerativas, el cncer,
la enfermedad de Alzheimer, cataratas, arterioesclerosis, inflamacin, entre otras
(Migliore y Copped, 2009).

Los efectos nocivos de los radicales libres son neutralizados por antioxidantes naturales,
por el cual es necesario consumir antioxidantes como la vitamina C, E, betacaroteno,
flavonoides, entre otras, los cuales se les encuentra en muchos productos naturales
como frutas, legumbres, verduras, etc.

En este sentido; en los ltimos aos, se ha dado una fuerte corriente de estudios
orientados a la bsqueda de productos, de preferencia de origen natural, que poseen
propiedades antioxidantes, y es as; que el uso de plantas medicinales es en muchas
circunstancias una alternativa, en la prevencin y/o tratamiento de muchas
enfermedades. Sin embargo; si bien es cierto que la prctica de medicina natural eficaz
y de bajo costo, es una necesidad; el uso de plantas medicinales debe ser validado
cientficamente.

As en el Per, solo un pequeo porcentaje de plantas medicinales han sido estudiadas,

lo cual da una oportunidad ideal para la investigacin fitoqumica y farmacolgica, de
muchas otras plantas aun no descritas o poco conocidas; brindando un campo atractivo
en la bsqueda de riquezas para el desarrollo industrial tanto a nivel regional como
nacional.

Teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto; dentro de la flora peruana encontramos

una gran diversidad de plantas entre las cuales tenemos a la ortiga (Urtica dioica);
empleada en la medicina popular para el tratamiento de artritis, infecciones de riones
7

(nefritis) y del tracto urinario, as como antidiabtico, antimicrobiano, analgsico entre

otros, y cuyas hojas renen componentes que pueden actuar como agentes
antioxidantes, adems es considerado como un producto de amplia disponibilidad y
fcil cultivo (INFITO, 2009).

Lo mencionado en el prrafo anterior fortalece el inters de estudiar la capacidad

antioxidante y efecto citoprotector del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica)
en la viabilidad de macrfagos murinos, con la finalidad no solo de dar mayor validez a
los conocimientos empricos, sino tambin, de plantear una alternativa beneficiosa en la
prevencin de los efectos dainos que los radicales libres pueden ocasionar en el
organismo humano. Adems, que tenga perspectivas futuras de produccin e
industrializacin convirtindose en una alternativa ms viable que las actuales para
obtener los compuestos antioxidantes a partir de la dieta y coadyuvar al mejoramiento
de la salud humana y condiciones de vida de los pobladores de esta regin.
OBJETIVO GENERAL:

Evaluar la capacidad antioxidante y efecto citoprotector del extracto metanlico

de ortiga (Urtica dioica) en la viabilidad de macrfagos murinos.

OBJETIVOS ESPECFICOS:

Evaluar la capacidad inhibitoria del radical DPPH a diferentes concentraciones del

extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica).

Determinar el efecto del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) a

diferentes concentraciones, sobre la produccin de xido ntrico en macrfagos
murinos activados.

Determinar el efecto del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) a

diferentes concentraciones, sobre la viabilidad celular en macrfagos murinos.

Evaluar el efecto del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) a diferentes

concentraciones, sobre la fragmentacin del ADN de macrfagos murinos
sometidos a estrs oxidativo.

II.

REVISIN LITERARIA:

2.1. ANTECEDENTES:
Jakhar, et al. (2014), aislaron un antioxidante 3, 5, 7, 3,4- pentamethoxyflavona
(PMF), un derivado de quercetina aislado de Kaemperia parviflora, para determinar su
mecanismo de accin. Encontrando que en bajas concentraciones entre 50 a 100 g/ml
este compuesto poda proteger a macrfagos RAW 264.7 del estrs oxidativo inducido
con perxido de hidrgeno, lo que en un ensayo de viabilidad muestra que es de
aplicacin segura para su aplicacin teraputica, alcanzando valores de 96 % de
viabilidad.
Bak et al. (2013), realizaron un estudio sobre efecto antiinflamatorio de procianidinas
de uva silvestre (Vitis amurensis), en macrfagos murinos activados por
lipopolisacrido, a travs de inhibicin de xido ntrico (ON), prostaglandina E2
(PGE2) y western blot, encontrando que estos flavonoides inhiben la produccin de
xido ntrico y prostaglandina 2 a la concentracin de 35 g/ml, as mismo mediante
western blot se demostr que inhiba la expresin de la xido ntrico sintasa inducible,
cicloxigenasa 2 y citoquinas proinflamatorias (TNF- y IL-), concluyendo que este
efecto puede ser a travs de la inhibicin de la va NFB bajo la va de sealizacin de
p38, MAPK y Akt, lo que sustenta su uso como agente antinflamatorio natural.
Castro et al. (2013), determinaron que los macrfagos murinos mostraron una viabilidad
del 100%, cuando fueron expuestos al extracto etanlico de Merremia umbellata a una
concentracin de 100 g/ml. Adems mostraron que el extracto de Merremia umbellata
disminuy el edema y la actividad de la enzima MPO (mieloperoxidasa) en orejas
inflamadas de ratas, as como la produccin de xido ntrico en macrfagos activados; y
present significativa actividad captadora de los radicales libres DPPH, ABTS y H2O2,
demostrando la actividad antiinflamatoria y antioxidante en el extracto etanlico total de
Merremia umbellata.
Kais et al. (2013), determinaron la actividad antibacteriana y antioxidante del extracto
acetato etlico de ortiga (Urtica dioica) y diente de len (Taraxacum officinalis), los
resultados revelaron que el extracto acetato etlico de ortiga tuvo el mayor contenido de
compuestos fenlicos (48.3 mg equivalente del cido glico (GAE)/g de peso seco),
mientras que el diente de len tena slo (10.2 mg GAE/g de peso seco) de contenido
9

fenlico. La deteccin fitoqumica cualitativa exhibi flavonoides y fenoles presentes en

ortiga y diente de len.
Li et al. (2013), evaluaron el efecto protector del dao del ADN inducido por hidroxilo
y actividad antioxidante de Citri reticulatae Pericarpium, en China, utilizaron extractos
etanlicos, el efecto protector lo midieron por: dao al ADN, ensayo DPPH, ensayo
ABTS, ensayo de reduccin de Fe3+ y ensayo de reduccin de Cu2+, los resultados
mostraron que efectivamente protega contra el dao al ADN inducido por hidroxilo
(IC50= 944 g/ml), el ensayo DPPH mostr un IC50 = 349.67 g/ml y el contenido de
flavonoides fue de 198.29 g/ml, concluyendo que la capacidad antioxidante y efecto
protector se le atribuira a la presencia de flavonoides, especialmente hesperidin y
nerirutin.
Lin et al. (2013), determinaron la actividad antioxidante de extractos metanlicos y
acuosos de seis plantas: Bidens alba, Lycium chinense, Mentha arvensis, Plantago
asiatica, Houttuynia cordata y Centella asitica de la regin de Taiwan y su efecto
protector sobre el dao inducido por perxido de hidrgeno en linfocitos humanos, la
actividad antioxidante la determinaron por el porcentaje de inhibicin de trolox,
utilizaron el ensayo de MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol)
para determinar viabilidad celular y el dao sobre el ADN por el ensayo de comet,
llegaron a la conclusin de que los componentes antioxidantes pueden proteger el dao
al ADN, los extractos a las concentraciones de 25, 50 y 100 g/ml no fueron citotxicos
con 98% de clulas vivas y todos los extractos mostraron fuerte actividad antioxidante.
Tovar del Rio (2013), determin la actividad antioxidante mediante DPPH y ABTS de
extractos metanlicos y extractos con diclorometano de 30 plantas recolectadas en la
ecoregin cafetera de la Universidad Tecnolgica de Pereira, los resultados que obtuvo
demuestran que algunas plantas medicinales prometen ser fuentes de antioxidantes
naturales y que la actividad antioxidante de dichos extractos est relacionada con la
presencia de flavonoides y compuestos fenlicos en la composicin fitoqumica de la
planta, que se pudo evidenciar en los espectros UV de los extractos. Las especies ms
sobresalientes con extracto metanlico fueron Topobea cf discolor (40.80%) y
Alchornea grandis (39.27%) con valor de IC50 de 49.18 y 7.24 g/ml respectivamente;
adicionalmente con el extracto de diclorometano de Tovomita guianensis (clusiaceae),

10

present el mayor porcentaje de actividad antioxidante con un valor de 54.97% e IC50 de

71.09 g/ml.
Velzquez y Posada (2013), evaluaron la actividad antiinflamatoria in vitro de los
extractos en n-hexano, cloroformo, acetato de etilo, butanol y agua, obtenidos a partir de
la corteza interna de Tabebuia chrysantha. Se realizaron ensayos de viabilidad celular
para evaluar los efectos citotxicos de los extractos a tres concentraciones (2.5, 1.2 y
0.6 g/ml). Estas concentraciones mostraron porcentajes de viabilidad celular superiores
al 90% y por lo tanto los emplearon para estimular macrfagos murinos (RAW264.7)
con lipopolisacrido bacteriano (LPS), en presencia de los extractos vegetales y se
determin la produccin de prostaglandina E2 (PGE2), factor de necrosis tumoral alfa
(TNF-) y xido ntrico (NO).
Gder y Korkmaz (2012), encontraron actividad antioxidante in vitro de extracto
hidroalcohlico de raz, flor y hoja de Urtica dioica y Malva neglecta en Turqua, para
evaluar la actividad antioxidante se utiliz el mtodo de tiocianato frrico, los resultados
indicaron que los extractos de la raz, flor y hoja de Urtica dioica exhibieron actividades
antioxidantes potentes, con 79.8%, 78.3% y 76.4% de inhibicin respectivamente, a una
concentracin de 100 g/ml. Comparadas con 100 g/ml de los estndares antioxidantes
BHA (hidroxibutilanisol), BHT (butilhidroxitolueno) y tocoferol exhibiendo 66.2%,
70.6% y 50.1% de inhibicin, mostrando sinrgicamente su alta actividad antioxidante.
Kataki et al. (2012), evaluaron la actividad antioxidante, hepatoprotectora y
antihelmntica de extracto metanlico de hojas de ortiga (Urtica dioica L.) en la India,
para la actividad antioxidante encontr un valor de IC50 de 105.16 g/ml trabajando con
concentraciones de 50 a 250 g/ml de extracto metanlico y con un estndar de BHA de
87.32 g/ml. El efecto inhibitorio del xido ntrico fue evaluado qumicamente
haciendo una mezcla de nitroprusiato de sodio en buffer fosfato salino el cual fue
mezclado con las diferentes concentraciones de extracto metanlicos de ortiga,
utilizando el mtodo de Griess, los valores obtenidos fueron expresados en porcentaje
de inhibicin, encontrando un valor de 63.76% para la concentracin de 250 g/ml y un
valor de IC50 de 176.39 g/ml.
Khare et al. (2012), realizaron un estudio sobre evaluacin farmacognstico y actividad
antioxidante de Urtica dioica L. en la India. El cido ferlico, un antioxidante fenlicopotencial presente en esta especie, se ha estudiado a travs de cromatografa liquida de
11

alta performance (HPLC). El extracto de U. dioica hidroalcohlico muestra resultados

positivos para actividad antioxidante con valor de IC50 de 88.33 2.88 g/ml. El cido
ferlico se identific a Rf 0.61 0.01 y se cuantific a 0.73% en esta especie. Los
parmetros farmacolgicos reportados pueden ser considerados como los estndares de
calidad de U. dioica en la industria de hierbas. Presencia de compuesto fenlico sugiere
que la actividad antioxidante puede ser debido al contenido de cido ferlico.
Kukric et al. (2012), realiz un estudio sobre caracterizacin de la actividad
antioxidante y antimicrobiana de hojas de ortiga (Urtica dioica L.) en la zona de
Banja Luka en Repblica de Srpska, utilizaron hojas de ortiga frescas de diferentes
etapas de desarrollo. La actividad antioxidante no enzimtica fue determinada por
diferentes mtodos: FRAP, DPPH y ABTS. El contenido fenlico total en los extractos
de ortiga asciende a 208.37 mg GAE/ g de peso seco (dw), el contenido de flavonoides
totales fue de 20.29 mg de quercetina (QE)/g dw, y el contenido de flavonoles totales
fue de 22.83 mg QE/g dw. La actividad antioxidante determinado por el mtodo de
inhibicin del radical DPPH con un valor de IC50 de 31.38 g/ml.
Lai et al. (2012), evalu el efecto antioxidante y antiinflamatorio del extracto etanlico
de quinchoncho (Cajanus cajan L.) en macrfagos RAW264.7 tratados con perxido de
hidrgeno. Se investig el efecto del extracto al 50%, as como su principal
componente, cianidina-3-monoglucsido, una antocianina. Los resultados del HPLC
indicaron que 2 mg del 50% extracto de etanol de C. cajan L. contena 45 g de
cianidina-3-monoglucsido. Adems 50% del extracto (2 mg/ml) y de cianidina-3monoglucsido (10 M) protegen a las clulas RAW 264.7 del dao al ADN inducido
por 24 h de tratamiento con H2O2.
Otles y Yalcin (2012), analizaron el total de compuestos fenlicos, perfil de fenoles y
actividad antioxidante (mtodo de inhibicin del radical DPPH) de extractos
metanlicos de raz, tallo y hojas de ortiga (Urtica dioica), de 3 regiones costeras de
Turqua (Mediterranean, Aegean, Black sea y Marmaran). Encontraron que el contenido
total de fenoles, perfil de fenoles y actividad antioxidante obtenidos varia en relacin a
las partes de la planta (raz, tallo y hojas) analizadas, as mismo el contenido total de
fenoles, perfil de fenoles y actividad antioxidante obtenidos fueron diferentes segn la
procedencia de la planta y la actividad antioxidante no siempre tena relacin a la
concentracin de fenoles totales.
12

Caldern (2011), determin la capacidad antioxidante utilizando la tcnica de

decoloracin del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) de extractos de n-hexano,
diclorometano y metanol de 5 plantas dentro de ellas Urtica dioica, la cual para una
concentracin de 100 g/ml alcanz un porcentaje de inhibicin de 16.86 y 20.56% para
extracto en n-hexano y metanol respectivamente, concluyendo que los extractos
metanlicos tenan significativamente mayores porcentajes de actividad antioxidante, ya
que los porcentajes ms altos de capacidad antioxidante estn en los extractos polares.
Respecto a la caracterizacin fitoqumica, refiri que los flavonoides y fenoles podran
ser responsables de dicha capacidad antioxidante.
Dupuy (2011), evaluaron las propiedades inmunomoduladoras y antitumorales de
compuestos naturales en Panam, el efecto de estos compuestos sobre la produccin de
xido ntrico (NO) fue medido por medio de la reaccin de Griess. Los resultados
muestran una disminucin de la proliferacin de clulas mononucleares de sangre
perifrica tratados con columbianatina (2.5 g/ml) y antocianina (2.5 -7.5 g/ml), se
observ que los macrfagos tratados con lupeol (30 g/ml), casearina G (30 g/ml) no
tuvieron efectos citotxicos sobre linfocitos ni macrfagos. En conjunto, estas
observaciones indican que lupeol, casearina G, antocianina y columbianatina podran
ser compuestos tiles en la elaboracin de drogas antiinflamatorias.
Darukhshan (2010), realiz un estudio sobre la actividad preventiva de dao oxidativo
del ADN y el potencial antioxidante de las plantas utilizadas en el sistema Unani de
medicina. El 50% de extractos alcohlicos de diez plantas Unani como I. Cleome, R.
damascena, C. scariosus, G. gummifera, A. pindrow, V. wallichii, H. antidysenterica,
A.piretro, A. tenuifolius y C. scariosus. Los valores de IC50 para el de inhibicin de
DPPH estaban en el rango de 10.36 a 206.50 g/ml. La inhibicin de xido ntrico fue
de 69, 73.9 y 72.24 % para C. icosandra a 210.07 g/ml, R. damascena a 398.84 g/ml
y C. scariosus a 350 g/ml respectivamente. La actividad preventiva del dao oxidativo
del ADN de extracto de planta diferente estaban en el rango de 0.13 a 1.60 mg/ml. Por
ltimo, la actividad antioxidante fue potencialmente significativo, as como la actividad
preventiva de dao oxidativo del ADN se observ con tres extractos de plantas a saber
C. icosandra, R. damascena y C. scariosus.
Ding et al. (2009), en su estudio preliminar de la actividad antiinflamatoria, de ocho
triterpenos y un esterol, se aislaron a partir del extracto de diclorormetano de tallos y
13

hojas de Rhus sylvestris. Se identificaron estos compuestos como 10 a-cucurbitadienol

(1), glut-5-en-3-ol (2), acetato de b-amirina (3), b-amirina (4) y lupeol (5), cycloart- 24en-3-ona (6), cycloart-25-en-3,24-diona (7), 24 hydroxycycloart-25-en-3-ona (8), bsitosterol (9), y 20-hidroxi-4,40-dimethoxychalcone (10). Adems, los compuestos en
concentraciones no citotxicas (0-1.0 M) segn el ensayo de viabilidad celular con
MTT, se utilizaron macrfagos para determinar su capacidad para bloquear secrecin de
citoquina inflamatoria en presencia de LPS en la lnea celular de macrfagos murinos
RAW 264.7. Entre los compuestos que se probaron, los compuestos 8 y 9 reducen la
secrecin inducida por LPS de IL- 6, as como TNF-, en la lnea celular de macrfagos
RAW264.7 de rata. Adems, los compuestos 2, 3, 7, y 10 disminuyeron especficamente
solamente la secrecin de TNF- , incluso en concentraciones de 0.01 M.
Llanes (2009), evalu la actividad inmunomoduladora de 24 extractos de 10 plantas de
la familia Euphorbiaceae sobre las clulas mononucleares de sangre perifrica (CMSP)
de individuos sanos, las clulas fueron expuestas, ya sea a cada extracto nicamente o al
extracto en presencia de Lipopolisacarido como agente inductor de proliferacin,
apoptosis o produccin de citoquinas, respectivamente. De los 24 extractos evaluados,
15 extractos modulan en mayor o menor grado uno o varios de los parmetros
evaluados de la inmunidad sobre CMSP, estos resultados demuestran la presencia de
compuestos inmunomoduladores en esta familia de plantas.
Nikolova y Dzhurmanski (2009), evaluaron la capacidad de inhibicin de radicales
libres de extractos de plantas cultivadas en Bulgaria, utilizaron un total de 28 extractos
metanlicos de 22 plantas medicinales cultivadas, mediante el ensayo de DPPH, sus
resultados muestran un IC50 de 175 g/ml para ortiga (Urtica dioica), llegando a la
conclusin de que los extractos metanlicos estudiados pueden exhibir una fuerte
actividad antioxidante y que esta actividad se debe a los compuestos fenlicos que
presentan en su composicin.
Yang et al.( 2009), evaluaron el efecto inhibitorio de la produccin de xido ntrico del
extracto etanlico de 260 plantas de la regin de Corea, de las cuales 122 extractos
mostraron efecto inhibitorio de la produccin de xido ntrico mayor a 25% a una
concentracin de 100 g/ml, demostrando que muchos de los componentes naturales de
las plantas medicinales han sido demostrados como inhibidores de la expresin de

14

NOSi, en macrfagos activados y sus estructuras pueden ser categorizadas como

sesquiterpenos, flavonoides, poliacetilenos y lignanos.
Ramos et al. (2008), evaluaron la capacidad antioxidante de plantas medicinales
peruanas nativas e introducidas por el mtodo de la coloracin del radical 2,2-difenil-1picril hidrazilo (DPPH). La capacidad antioxidante obtenida a las concentraciones de 1
g/ml, 50 g/ml, 100 g/ml y 200 g/ml fueron comparados frente al cido ascrbico
(vitamina C), la cual present una actividad antioxidante de 92.82%.
Alzamora et al. (2007), con el objetivo de evaluar la produccin de xido ntrico (NO)
por macrfagos peritoneales murinos cultivados con extractos metanlicos (EM) de los
ecotipos rojo, negro, morado y blanco de Lepidium peruvianum Maca. La dosis de EM
fue de 800 g/ml por ecotipo, se consideraron controles sin EM. La produccin de NO
se determin por acumulacin de nitrito en el medio y se evidenci con el reactivo de
Peter Griess, las concentraciones de nitrito se calcularon en base a la curva estndar
elaborada con Nitrato sdico (NaNO2). Las concentraciones producidas de nitrito
fueron de 7.45, 6.79, 5.76, 5.61 y 6.81 mM para los EM de los ecotipos morado, negro,
blanco, rojo y control respectivamente. Los cuatro ecotipos indujeron la produccin de
NO, aunque con el ecotipo morado fue superior.
Bellido (2007), en un trabajo realizado con el objetivo de determinar la actividad
antioxidante del fruto de Corryocactus brevistylus sancayo y su accin protectora
sobre la fragmentacin del ADN en timocitos y homogeneizado de hgado de Rattus
novergicus, la actividad antioxidante se determin por la capacidad atrapadora del
radical DPPH y la fragmentacin del ADN mediante electroforesis. La actividad
antioxidante del Corryocactus brevistylus, inhibe al radical DPPH con un ndice Ic50
2.47 y en el anlisis electrofortico a concentraciones de 4 y 4.5% el dao del ADN
habra sido disminuido. Las concentraciones del fruto Corryocactus brevistylus 3%,
3.5%, 4%, 4.5%, poseen actividad antioxidante, al inhibir al radical DPPH de manera
proporcional a las concentraciones del fruto, a su vez las cuatro concentraciones
protegen el ADN de linfocitos de rata del dao inducido por perxido de hidrgeno.
Garca (2006), demostr el efecto inmunomodulador del extracto acuoso de Mangifera
indica L. sobre la funcionalidad de los macrfagos y la respuesta alrgica. El extracto
de M. indica inhibi in vivo la quimiotaxis e in vitro la fagocitosis, la produccin de
xido ntrico, el proceso de transcripcin de los genes que codifican para las citoquinas
15

TNF- (factor de necrosis tumoral), IL-1 (Interleukina) y GM-CSF (factor estimulante

de colonias de macrfagos), las enzimas COX-2 (ciclooxigenasa 2) y NOS-2 (xido
ntrico sintasa 2) y el factor de transcripcin nuclear NFB; y estimul la transcripcin
de los genes de TGF en macrfagos peritoneales. La mangiferina tuvo efectos
farmacolgicos de tipo inhibitorio igual que el extracto sobre la quimiotaxis, la
fagocitosis, la expresin de la NOS-2 y la COX-2 en macrfagos peritoneales.
Harput et al.(2005), realizaron un estudio de estimulacin de la proliferacin de
linfocitos y la inhibicin de la produccin de xido ntrico en extracto acuoso de Urtica
dioica, la produccin de xido ntrico fue inhibida por el extracto acuoso de Urtica
dioica en dosis dependiente a las concentraciones de 50-500 g/ml, sin afectar la
viabilidad celular, adems el extracto no altera la expresin de la protena NOSi medida
en western blot, indicando que la inhibicin de la produccin de xido ntrico por el
extracto acuoso de Urtica dioica no fue debido al efecto supresor en la transcripcin o
translocacin de la protena NOSi en macrfagos activados por LPS.
Napolitano et al. (2005), evaluaron la inmunomodulacin de la produccin de xido
ntrico en macrfagos murinos tratados con extractos etanlicos y de hexano de tres
especies de plantas de uso tradicional (Serjaniac lethalis, Cupania vernalis y Casearia
sylvestris) del Cerrado Brasileo, los extractos de hojas de Serjaniac lethalis y Cupania
vernalis inhibieron significativamente la produccin de xido ntrico, mientras que
Casearia sylvestris fue inactiva o presento baja actividad en la produccin de xido
ntrico, o fue muy citotoxica, Serjaniac lethalis mostr el mximo valor de viabilidad
celular con 97.4% con un IC50 de 151.8 g/ml, concluyendo que los extractos
seleccionados son fuente potencial de componentes que podran ser usados como
agentes antiinflamatorios.
Snchez et al. (2005), investigaron sobre la Punica granatum L. Granada, algunos de
sus fitocomponentes del fruto muestran una actividad antioxidante. Los resultados
obtenidos demuestran que el extracto de granada tiene capacidad de disminuir el dao
inducido por el perxido de hidrgeno en clulas de ovario de Hamster chino
cultivadas in vitro. El extracto de frutos enteros de granada fue capaz de secuestrar
especies reactivas del oxgeno producidas por el perxido de hidrgeno, mecanismo
mediante el cual ejerce su accin protectora del ADN frente a las lesiones causadas por
este agente.
16

Cceres (2004), determin la capacidad antioxidante del extracto acuoso de Passiflora

mollissima al 100% y su accin protectora sobre la viabilidad celular y fragmentacin
del ADN en macrfagos de Rattus norvegicus sometidos a estrs oxidativo causado por
perxido de hidrgeno (H2O2) 10mM. La capacidad antioxidante se determin haciendo
uso del mtodo de inhibicin del radical libre DPPH, evidencindose que el extracto
acuoso de P. mollissima es dependiente de la concentracin. La accin protectora se
determin por la tcnica de viabilidad celular, donde las clulas sometidas a la presencia
del extracto acuoso dieron como resultado el mayor porcentaje de clulas vivas en 720
min de observacin a diferencia de las clulas tratadas con H2O2 que ofrecieron el
menor porcentaje de clulas viables. La accin protectora se determin a travs de la
tcnica de fragmentacin de ADN en donde se evidencia un efecto favorable, en la cual
hasta los 360 minutos no hay presencia de fragmentacin de ADN.
Glin et al. (2004), determinaron la propiedad antioxidante del extracto acuoso de
ortiga (Urtica dioica L.) (WEN) mediante las pruebas de poder reductor, eliminacin
de radicales libres, eliminacin de aniones superxido, eliminacin de perxido de
hidrgeno y actividad quelante de metales. WEN tuvo potente actividad antioxidante.
Las concentraciones de 50, 100 y 250 g de WEN mostraron inhibicin 39, 66 y 98%
sobre la peroxidacin de emulsin de cido linoleico respectivamente, mientras que 60
g/ml de - Tocoferol, exhibiendo solo 30% de inhibicin.
Akbay et al. (2003), evaluaron la actividad inmunomoduladora in vitro de flavonoides
glucsidos de Urtica dioica, en Turqua, los principales componentes aislados del
extracto metanlico fueron quercetina-3-O-rutinosido, kanferol-3-O-rutinosido y
isoharmnetin -3 - O- glucsido por cromatografa, mtodos qumicos y espectrales, la
actividad inmunomoduladora se estudiaron in vitro por quimiotaxis y la actividad de
muerte intracelular, de acuerdo con las pruebas mencionadas antes se confirmaron la
actividad inmunoestimulante de la fraccin flavonoide en las dosis de 4, 8 y 16 g lo
que sugieren posibles tratamientos en pacientes que sufren deficiencia de la funcin de
neutrfilos y enfermedades granulomatosas crnicas.
Kang et al.(2003), detectaron y compararon la actividad antioxidante de los extractos de
hexano, acetato de etilo, n-butanol y de agua de diez hierbas medicinales utilizadas en
Corea, las diez plantas medicinales coreanas presentaron actividad antioxidante potente,
entre los cuatro disolventes de extractos, la actividad en disolventes ms polares (
17

extractos de butanol y agua) fue relativamente mayor que la de los extractos de

disolventes no polares (extracto de hexano y etanlico). Estos resultados son tiles para
analizar ms a fondo esos medicamentos a base de hierbas que contienen la actividad
ms antioxidante con el fin de identificar los principios activos.
Ryu et al. (2003), analizaron la actividad inhibitoria de extracto de plantas en la sntesis
de xido ntrico en macrfagos activados por LPS, utilizaron 83 extractos de plantas, de
las cuales 23 mostraron potente actividad de inhibicin de la produccin de xido
ntrico sobre el 60% en la concentracin de 80 g/ml, algunos extractos dosis
dependiente muestran una inhibicin de la produccin de xido ntrico en las
concentraciones de 80, 40, 20 g/ml, especialmente Artemisia iwayomogi y Machilus
thunbergii mostrando la ms potente inhibicin por sobre el 70% en la concentracin de
40 g/ml. Estas plantas son candidatas prometedoras para el tratamiento de
enfermedades inflamatorias acompaadas de endotoxemia y sobreproduccin de xido
ntrico.
Gutirrez (2002), realiz una revisin del chocolate, polifenoles y proteccin a la salud,
en donde indica que estudios in vitro e in vivo de los polifenoles del chocolate tienen la
capacidad de controlar reacciones claves implicadas en daos oxidativos al ADN, as
mismo los anillos aromticos con sustituyentes hidroxilos les brindan una estructura
especialmente adecuada para ejercer una accin antioxidante al poder actuar como
donadores de hidrgenos o electrones o servir como atrapadores de radicales libres.
Harput et al. (2002), estudiaron la actividad antinflamatoria y citotxica de cinco
especies de la planta Veronica sp. en Turqua, los extractos metanlicos muestran
actividad inhibitoria de la produccin del xido ntrico en macrfagos estimulados con
LPS, cuando los extractos metanlicos fueron divididos en fracciones de agua y
cloroformo, la fraccin de agua inhibi significativamente la produccin de xido
ntrico sin mostrar ninguna citotoxicidad, cuando la actividad inhibitoria del radical fue
determinado usando DPPH, la fraccin acuosa de las cinco especies de Veronica inhibi
efectivamente los radicales libres, se sugiere que el efecto inhibitorio de estas especies
en la produccin de xido ntrico fue debido a su actividad inhibitoria de radicales.
Mengoa (2002), determin el efecto citoprotector del extracto acuoso de Taya en
macrfagos aislados de ratas albinas inducidos por estrs oxidativo, para evaluar la
viabilidad utiliz el ensayo MTT en donde ha encontrado que el extracto de taya o
18

carqueja raz silvestre de los andes en cuya composicin se ha encontrado presencia de

flavonoides, sesquiterpenos principalmente ejerce un efecto protector a nivel celular
frente al perxido de hidrgeno alcanzando un 90.7% de viabilidad celular, as mismo
tiene un efecto favorable frente a la fragmentacin del ADN ocasionado por el perxido
de hidrgeno hasta los 90 minutos de observacin.
Wang y Mazza (2002), evaluaron los efectos inhibitorios de antocianinas y otros
compuestos fenlicos en la produccin de xido ntrico en macrfagos activados por
LPS/IFN, los compuestos fenlicos comunes, incluyendo cidos fenlicos,
flavonoides, isoflavonas y antocianinas presentes en frutas fueron investigados por sus
efectos sobre la produccin de xido ntrico en macrfagos activados por LPS, los
compuestos fenlicos en el rango de 16 a 500 M que inhibieron la produccin de xido
ntrico por 50 % sin mostrar citotoxicidad fueron los flavonoles quercetina y
miricetina, la isoflavona daidzeina, y las antocianinas pelargonidina, cianidina,
delphinidina, peonidina, malvidina, malvidina 3-glucosido y malvina 3,5-diglucosidos.
Las antocianinas tienen fuerte efecto inhibitorio en la produccin de xido ntrico.
Zhu et al. (2002), estudiaron las actividades antioxidantes de T Oolong en California,
as mismo se evalu la cantidad de compuestos fenlicos totales, el efecto inhibitorio en
FeCl2/H2O2 (sistema de reaccin fenton) inducida por dao al ADN, el extracto acuoso
de T tiene fuerte actividad antioxidante en todos los modelos estudiados. Cuando el
extracto acuoso fue separado en diferentes fracciones de acuerdo a su peso molecular, se
encontraron que las fracciones con alta cantidad de compuesto fenlicos tienen fuerte
actividad antioxidante. Tambin se determin el efecto del extracto acuoso de T
Oolong y sus fracciones sobre la formacin de 8-OHdG (bases de ADN oxidados)
iniciado por FeCl2 / H2O2. En las condiciones utilizadas, se observ que la reaccin de
fenton aument significativamente la formacin de 8-OHdG en el ADN y disminuy
con la aplicacin del extracto acuoso de T.

Capiro (2001), estudi el efecto protector del extracto acuoso de hojas de Cymbopogon
citratus (Caa santa) frente al dao gentico inducido por los agentes oxidantes H2O2 y
etilnitrosourea (ENU). Se utiliz para ello un modelo experimental in vitro y otro in
vivo: cultivo de clulas de ovario de Hamster Chino (CHO) y el insecto Drosophila
melanogaster, respectivamente. Los estudios citofluoresceina acetato en clulas CHO
permitieron demostrar la capacidad antioxidante de caa santa. Dosis no txicas de 0.1,
19

1 y 5 % produjeron reducciones significativas del estrs oxidativo causado por el H2O2.

Evidenciaron que las hojas de caa santa tiene un efecto protector frente al dao
provocado por el agente oxidante perxido de hidrgeno a nivel del ADN, evitando la
progresin de la fragmentacin del ADN.
Tamez et al. (2001), realizaron un estudio sobre la activacin de macrfagos y linfocitos
in vitro de extractos metanlicos de hojas de Plantago major llanten. Se encontraron
que los extractos metanlicos de P. major, libre de endotoxina, a concentraciones de 50,
100, 250, y 500 ug/ml, se asociaron con incrementos de 4.4 1.6, 1.12 0.4 y 18 0.4
veces en la produccin de xido ntrico (NO) e incrementos en la produccin de factor
de necrosis tumoral-alfa (TNF-) (621 31, 721 36, 727 36, y 1056 52 U/ml, con
respecto a las concentraciones antes mencionadas) por macrfagos peritoneales de rata,
en ausencia de interfern gamma (IFN-). No se detect produccin de NO y TNF-
por macrfagos sin tratar.
Riehemann et al. (1999), evaluaron los extractos de ortiga (Urtica dioica), un remedio
antirreumtico, la inhibicin de factor de transcripcin proinflamatorio NF-B, para lo
cual realizaron western blot para identificar la degradacin de la protena celular IB-,
donde concluyeron que la ortiga (Urtica dioica) es un potente inhibidor de la
activacin de NFB (factor nuclear) inhibiendo la expresin del gen IkB en cual activa
a NFB, ya que este factor nuclear controla la expresin de numerosos genes de
productos proinflamatorios como NOSi, esta inhibicin de NFB podra ser debido a las
propiedades antioxidantes de la ortiga.

20

2.2. MARCO TERICO:

2.2.1. Ortiga (Urtica dioica)
2.2.1.1. Clasificacin taxonmica (Segn Adolph Engler)
Reino

: Plantae

Subreino

: Embriofitas

Divisin

: Magnoliophyta o Angiospermae

Subdivisin
Clase

: Angiospermas
: Dicotiledneas

Subclase
Orden
Familia
Gnero
Especie

: Arquiclamideas
: Urticales
: Urticaceae
: Urtica
: dioica

Nombre cientfico: Urtica dioica

Nombre vulgar : Ortiga mayor (Berdonces, 2007)
2.2.1.2. Descripcin botnica:
Urticaceae es una familia de plantas herbceas, anuales o perennes, raras veces
leosas (en los trpicos); frecuentemente con pelos urticantes (cistolitos). Sin
ltex, las hojas son de color verde claro simples, opuestas o alternas, con frecuencia
estipuladas cubiertas al igual que el tallo por pelos urticantes. Flores verdosas,
generalmente unisexuadas, de disposicin monoica o dioica, monoclamdeas,
tetrmeras o pentmeras; gineceo supero-unicarpelar (un estigma), con un ovulo;
reunidas en inflorescencia axilares en panculas cimas, existe 550 especies, propias
sobre todo de las regiones clidas, tiene una altura de alrededor de 1.20 m (Corzo,
1993).
2.2.1.3. Hbitat y distribucin geogrfica:
La ortiga es una planta que crece en baldos, junto a los caminos, prxima a las
casas, en tierras hmedas y ricas en residuos orgnicos; en climas fros y secos a
una altura de 1000-3900 m.s.n.m., es originaria de Europa. En nuestro pas la ortiga
se encuentra en la regin sierra especialmente en los valles interandinos. Hoy en da
crece alrededor de todo el mundo, preferentemente en suelos ricos en nitrgeno,

21

esta especie nace por doquier, en especial sobre suelos nitrogenados (Soukup,
1983).
2.2.1.4. Composicin qumica:

cidos fenoles: steres del cido cafeico: especialmente el cido cafeil mlico
en Urtica dioica (hasta 1.6%), ausente en Urtica urens; cido clorognico
(0.5%) y pequeas cantidades de cido neoclorognico y cido cafeico libre en
ambas especies.

Flavonoides: Principalmente kanferol, quercetina e isorhamnetina. Tambin se

encuentran sus hetersidos: rutinsido del kanferol, de quercetina y glucsido
de isorhamnetina.

Sales Minerales (hasta un 18%): hierro, calcio, slicio, potasio y manganeso.

Otros

Constituyentes:

cido

13-hidroxioctadecatrienoico,

escopoletina,

sitosterol, glucoprotenas, aminocidos libres y una proporcin elevada de

clorofila.
Los pelos de las hojas contienen acetilcolina, histamina, serotonina y pequeas
cantidades de leucotrienos (INFITO, 2009).
As mismo tambin componentes fenlicos: miricetina, quercetina, kanferol, cido
sirngico, cido vanlico, rutinsido, cido ellgico, isorhamnetina, cido cafico
clorognico, cido cumrico, cido ferlico, naringina (Otles y Yalcin, 2012).
2.2.1.5. Accin farmacolgica:
Tiene numerosas aplicaciones medicinales e industriales, como homeosttico en el
caso de hemorragias nasales en virtud de sus propiedades vasoconstrictoras
(provoca la contraccin de los vasos sanguneos). Esta misma propiedad la hace
til, ingirindola en forma de infusin o jugo, en caso de menstruaciones
abundantes.
Hojas: Reconstituyente, remineralizante, diurtico, colagoga, antibacteriano,
analgsico, hipoglucemiante, hemosttica. Usado en afecciones genitourinarias,
hipertensin arterial, edemas, diabetes y anemia.
Races: Antiinflamatorio, antibacteriano, antiedematosa, astringente.
Semillas: Galactogogo, astringente, antiulceroso.
22

Presenta propiedades nutritivas, es de gran importancia por su riqueza en sales

minerales y vitaminas que benefician a todos incluso a las personas que hacen
dietas sin sal. Las ortigas contienen vitamina A y C, hierro, cido saliclico y
protenas. Tiene gran cantidad de propiedades medicinales: analgsica, antialrgica,
antianmica,
astringente,

antigotosa,
colagoga,

antihistamnica,
depurativa,

antiinflamatoria,

diurtica,

galactogena,

antirreumtica,
hemosttica,

hipoglucemiante y uricosrico (Bernat, 2003).

Contiene clorofila y cidos orgnicos, a los que se debe su marcado efecto diurtico
y uricosrico. Propiedades de la ortiga comprobadas cientficamente: los extractos
son ligeramente hipoglucemiantes. Tiene propiedades bactericidas y efectos
favorables en los tratamientos de las afecciones de la piel (Bernat, 2003).
2.2.2. Estrs oxidativo:
2.2.2.1. Definicin:
El estrs oxidativo es un estado de la clula en el cual hay un desbalance entre la
produccin de radicales libres y la accin de los mecanismos antioxidantes
conduciendo a un dao celular (Avello y Suwalski, 2000)
2.2.2.2. Radicales libres:
Son aquellas molculas que en su estructura atmica presentan un electrn
desapareado o impar en el orbital externo, generando una alta inestabilidad, tiene
vida media corta, con una enorme capacidad para combinarse inespecficamente en
la mayora de los casos con carbohidratos, lpidos, protenas, cidos nucleicos, y
derivados de cada uno de ellos (Martnez, 1998).
Los radicales libres son elaborados continuamente como un producto del
metabolismo normal de cada clula e inactivados por un conjunto de mecanismos
enzimticos y de atrapamiento (Basaga, 1989).
A) Especies reactivas de oxgeno (EROS)
El oxgeno es esencial para la vida, pero en determinadas condiciones pueden
producir diferentes reacciones, las cuales van a formar las EROS que llegan a
producir un dao celular.

23

 Anin superxido (O2)

Se forma por la reduccin univalente del O2, puede ser producido por enzimas
como la NADPH oxidasa durante el estallido respiratorio, y por vas no
enzimticas en diversos sitios celulares, por la reduccin incompleta del oxgeno
molecular cuando se adiciona un electrn (Guija, 2003). Este tambin, puede
reaccionar con el perxido de hidrgeno.
O2-

O2 + e Perxido de hidrgeno (H2O2)

Este no es propiamente un radical libre, pero puede reaccionar con metales de

transicin y dar origen al radical hidroxilo. La enzima superxido dismutasa
convierte el O2- en perxido de hidrgeno (H2O2) (Guija, 2003; Montero, 1996;
Martnez, 1998)
2O2- + 2H

H2O2+O2

El perxido de hidrgeno se constituye en un agente toxico a nivel celular

cuando se encuentra en concentraciones superiores a 3mM (Halliwell, 2000)
Radicales hidroxilo (OH)
Es el radical ms daino en el ser humano. Mediante la reaccin de fenton el
perxido de hidrgeno reacciona con el ion cuproso o el ion ferroso produciendo
el radical hidroxilo (Gonzles, 2000; Martnez 1998).
Fe 2+ +H2O2

Fe 3+ OH - +OH

Oxgeno singlete (1O2)

Es la forma excitada de la molcula de oxgeno diatmico puede originarse por
transferencia de energa desde otra molcula reactiva, por reacciones
fitoqumicas o por reacciones en ausencia de oxgeno (Gonzles, 2000).
Radical peroxilo (ROO)
Este radical acta en las membranas, se origina por la oxidacin de lpidos, y su
tiempo de vida es medio.
B) Especies reactivas de nitrgeno (ERNs)
xido ntrico (NO-)

24

Es una molcula sintetizada por la xido ntrico sintasa, que participa en

diferentes procesos del sistema inmune, cardiovascular, como traductor de
seales en diversos procesos celulares (Hernndez, 1996). Por otro lado el xido
ntrico, resulta toxico si este reacciona con anin superxido, dando lugar al
peroxintrito (ONOO-). As el xido ntrico contribuye enormemente al dao
oxidativo.
Dixido de nitrgeno (NO2)
Es un radical libre que puede estimular la peroxidacin lipdica, con la
produccin de ms radicales (Martinez, 1998).
Peroxinitrito (ONOO-)
Es una especie formada por la reaccin entre el anin superxido (O2-) y el
xido ntrico (NO), el peroxinitrito puede ocasionar dao directo a las protenas
y al ADN; tambin constituye un potente inductor de la peroxidacin lipdica
(Hernndez, 1996).
C) Fuentes de radicales libres:
La generacin de radicales libres es constante dentro de los seres vivos, y se
asocia fundamentalmente al metabolismo celular del oxgeno y las reacciones de
xido-reduccin. Se han descrito numerosos mecanismos bioqumicos celulares
responsables de la produccin de radicales libres a saber.
Las mitocondrias son las organelas donde se producen la mayor cantidad de
especies reactivas de oxgeno, para cuyo propsito utilizan el oxgeno de la
respiracin, este proceso se efecta a nivel de la cadena de transporte de
electrones, que utiliza aproximadamente el 90% del oxgeno que se consume en el
organismo. La respiracin celular es la principal fuente de energa en las clulas
aerbicas (generacin de adenosina trifosfato (ATP)). En este proceso de
fosforilacin oxidativa se promueve la reduccin tetravalente del oxgeno hasta
agua. Los radicales libres generados en las mitocondrias daan el genoma
mitocondrial y como consecuencia de ello se dificulta la expresin de protenas y
enzimas que son importantes para el normal funcionamiento de las mitocondrias
(Cceres, 2004).

25

Se destaca tambin el papel de los peroxisomas, que son organelas del citosol muy
ricas en oxidasas que generan H2O2, el cual es degradado por enzimas especificas
(catalasa y peroxidasa) en agua, tambin pueden dar lugar a pequeas cantidades
de aniones superxido.
Los neutrfilos en contacto con molculas extraas, fagocitables, invaginan su
membrana celular, envolviendo el material a destruir (fagosoma) aislndolo del
citoplasma, la estimulacin de estas y otras clulas fagociticas se acompaan de
un aumento en el consumo de O2 y activacin de una enzima de la membrana
como es la NADPH oxidasa (nicotinamida adenina dinucleotido fosfato oxidasa)
responsable de la produccin del radical anin superxido y por dismutacin de
este ltimo se genera el perxido de hidrgeno.
Dentro de otras fuentes de radicales libres in vivo, se incluyen:
El humo del tabaco, contiene un gran nmero de radicales libres y, adems, xido
ntrico, que es capaz de reaccionar con el oxgeno y generar dixido de nitrgeno;
este compuesto reacciona con los hidrocarburos insaturados presentes en el humo
del tabaco y produce distintos tipos de radicales libres, junto al radical hidroxilo
originado en su reaccin con el perxido de hidrgeno. Todas estas especies
reactivas son responsables, al menos en parte, de la toxicidad de este
contaminante ambiental.
Las dietas ricas en grasas producen ms radicales libres, ya que se oxidan ms
rpidamente que las protenas o los hidratos de carbono; malnutricin por carencia
de vitamina C, vitamina E, carotenoides, riboflavina (Cceres, 2004).
D) Efecto de los radicales libres sobre las biomolculas.
Los radicales libres de inters biolgico suelen ser extremadamente reactivos e
inestables, por lo que tienen un periodo de vida media muy corto, que se puede
medir incluso en fracciones de microsegundo. No obstante, cuando un radical
libre reacciona con un compuesto no radical pueden formarse otros radicales
libres, de manera que es posible que se creen reacciones en cadena y den lugar a
efectos biolgicos lejos del sistema que origino el primer radical.

26

Las protenas, los lpidos insaturados, los cidos nucletidos y los carbohidratos
son los blancos fundamentales de las reacciones de los radicales libres:
La accin de los radicales libres de oxgeno sobre las protenas se ejerce sobre los
enlaces insaturados, los anillos aromticos y los grupos tiol. De esta forma las
protenas ricas en aminocidos como el triptfano, tirosina, fenilalanina,
histamina, metionina y cistena, pueden sufrir modificaciones estructurales y
funcionales. Los grupos sulfhidrilo pueden ser transformados en puentes
disulfuro, lo que produce inactivacin enzimtica, los enlaces peptdicos pueden
romperse tras la oxidacin de residuos de prolina por radicales hidroxilo o
superxido (Guija, 2003).
La accin de los radicales libres de oxgeno sobre los lpidos, tiene accin
fundamentalmente sobre los cidos grasos poliinsaturados lo que provoca su
peroxidacin esta reaccin puede iniciarla el radical hidroxilo, radical
hidroxiperoxilo y el oxgeno singlete, estos extraen un tomo de uno de los
carbonos metileno de la cadena del cido graso y deja un electrn no apareado con
lo cual se genera un radical lipdico, y a partir de este a travs de diversas
reacciones se da lugar a los denominados hidroperxidos lipdicos que al ponerse
en contacto con iones metlicos de transicin la peroxidacin lipdica genera
aldehdos, cidos hidrocarbonados y varios residuos qumicos incluido el
malondialdehido, estos productos finales al difundirse provocan alteraciones en la
permeabilidad o la perdida de la integridad de la membrana plasmtica y la de los
organelos celulares (Migliore y Copped, 2009).
De otro lado los carbohidratos son daados tambin por radicales libres aunque en
menor proporcin que otras molculas. Azucares como la glucosa, el manitol o
ciertos desoxiazucares pueden reaccionar con el radical hidroxilo para producir
sustancias reactivas; as mismo el cido hialurnico, la condroitina y el dermantan
sulfato (polisacridos del grupo de los glucosaminoglucanos) son susceptibles a su
degradacin en presencia de especies reactivas de oxgeno particularmente
radicales superxido e hidroxilo (Gonzles, 2000; Guija, 2003)
Los radicales libres reaccionan con el ADN; a nivel del esqueleto azcar-fosfato
as como las bases, la reduccin de los radicales libres con azucares
(desoxirribosa) del ADN conduce a la fragmentacin del azcar, tres de las bases
27

modificadas importantes son la guanina que se oxida a 8 hidroxiguanina, la

adenina que se oxida a 8 hidroxiadenina y la timinaglicol ocasionando
alteraciones en la duplicacin y transcripcin que llevaran a la sntesis de
protenas defectuosas y posiblemente a la generacin de transformaciones
malignas (Gonzles, 2000; Guija, 2003; Leighton, 2000).

E) Patologas asociadas al estrs oxidativo:

En la actualidad se tienen evidencias que permiten postular mecanismos a travs
de los cuales un desbalance entre oxidantes y antioxidantes est asociado a la
fisiopatologa del cncer, ateroesclerosis, enfermedades de Parkinson, enfermedad
de Alzheimer, diabetes, artritis y otras. As mismo, el proceso biolgico del
envejecimiento se acelera en relacin directa con el estrs oxidativo.
Arterioesclerosis:
La arterioesclerosis, se considera una enfermedad multifactorial que resulta
de interacciones complejas entre el genotipo y ciertos factores biolgicos y
ambientales. Las especies reactivas del oxgeno atacan los cidos grasos
poliinsaturados (AGPI) y producen una reaccin de peroxidacin en cadena
que altera la membrana de las clulas del endotelio vascular y oxida las
lipoprotenas de baja densidad (LDL). Ambos procesos estn implicados en el
desarrollo y progresin de la arterioesclerosis por sus efectos sobre la
adhesin y agregacin plaquetaria, trombogenicidad y proliferacin celular
(Leighton, 2000; Velsquez, 2000).
Envejecimiento:
El envejecimiento es un proceso irreversible que afecta en forma heterognea
a las clulas de los seres vivos.
Numerosos autores han asociado el proceso de envejecimiento con un
acelerado proceso de lipoperoxidacin derivado de una perdida de la
capacidad celular para mantener un adecuado equilibrio entre la formacin y
destruccin de los radicales libres formados en el medio intracelular, quizs
es vlido decir que envejecemos porque nos oxidamos, al menos el
28

envejecimiento del eritrocito parece demostrarlo ya que claramente pierde la

actividad de la SOD, glutatin peroxidasa, catalasa, aumentan sus ndices
lipoperoxidativos, se alteran sus propiedades fisiolgicas y su membrana es
ms frgil y menos flexible (Guija, 2000; Leighton, 2000).
Harman sugiri que los radicales libres producidos durante la respiracin
aerbica (superxido y perxido de hidrgeno) causan dao oxidativo que se
acumula a travs del tiempo, y resulta en una prdida gradual de los
mecanismos homeostticos, en una interferencia de patrones de expresin
gentica y perdida de la capacidad funcional de la clula, lo que conduce al
envejecimiento y a la muerte; as mismo, se produce en las clulas postmitticas un acumulo de un pigmento denominado lipofucsina, compuesto
que se forma en las mitocondrias daadas (Zorrilla et al., 2004).
Cncer:
El dao oxidativo del ADN producido por las especies reactivas de oxgeno,
que en su mayora son radicales libres que se generan en forma continua en el
organismo durante el proceso de respiracin y por efectos de factores
externos conduce a mutaciones y perdida en el control celular. Estas especies
reactivas del oxgeno reaccionan con el ADN, oxidando el esqueleto azcarfosfato y las bases nitrogenadas la reaccin conduce a la fragmentacin del
azcar.
Durante la replicacin del ADN daadas, las ADN polimerasas incorporan
bases equivocadas al leer la base oxidada, perpetundose una mutacin. As
durante el proceso de replicacin se altera la estructura del material gentico,
la que se trasmite a las futuras generaciones celulares, contribuyendo
significativamente al desarrollo de algunos canceres relacionados con el
envejecimiento (Aldeoca, 1995; Gonzles, 2000).
F) DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl):
La molcula 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH) es conocida como un radical
libre debido a la deslocalizacin de un electrn desapareado sobre la molcula
completa, por lo cual la molcula no se dimeriza, como es el caso de la mayora
de los radicales libres. La deslocalizacin del electrn tambin intensifica el color
29

violeta intenso tpico del radical, el cual absorbe en metanol a 517 nm. Cuando la
solucin de DPPH reacciona con el sustrato antioxidante que puede donar un
tomo de hidrgeno como se muestra en la figura, el color violeta se desvanece.
El cambio de color es monitoreado espectrofotomtricamente y es utilizado para
la determinacin de los parmetros para las propiedades antioxidantes. Despus
de aproximadamente tres dcadas este ensayo comenz a utilizarse rutinariamente
para la caracterizacin de las propiedades antioxidantes. El procedimiento original
para el ensayo DPPH ha sido adoptado por muchos laboratorios y a pesar de que
existen modificaciones a conveniencia, una revisin detallada de la literatura ha
revelado que la mayora de los estudios estn basados en un tiempo de reaccin de
20-30 min en vez de un tiempo de reaccin total de 120 minutos requerido para
alcanzar el estado estacionario y completar la reaccin redox (Tovar del rio,
2013).

Figura 1. Estructura del DPPH antes y despus de la reaccin con el antioxidante

(Tovar del rio, 2013).
Los resultados del ensayo DPPH se han presentado de diferentes maneras. La
mayora de los estudios expresan los resultados como el valor de la concentracin
mxima de la media inhibitoria (IC50), definido como la cantidad de antioxidante
necesario para disminuir la concentracin inicial de DPPH al 50%. Este valor se
calcula graficando el porcentaje de inhibicin contra la concentracin del extracto.
Para extractos de plantas o compuestos puros el valor IC50 cambia de acuerdo a la
concentracin final del DPPH usado (Tovar del rio, 2013).

30

2.2.3. Antioxidantes:
2.2.3.1. Definicin:
Antioxidante es cualquier sustancia que a bajas concentraciones comparado con un
sustrato oxidable (protenas, carbohidratos, lpidos, ADN) retrasa o inhibe
significativamente la oxidacin de este sustrato (Boixareu, 1991; Gonzles, 2000)
The paper on Dietary Antioxidants define un antioxidante dietario como aquella
sustancia que retrasa significativamente los efectos adversos de especies reactivas
de oxgeno o de nitrgeno para favorecer el normal funcionamiento de las clulas en
humanos (Carr, 1999).
Los antioxidantes estn en permanente actividad en el organismo, puesto que la
produccin de energa es una de las principales causas de formacin de radicales,
necesitando estar presente en cantidades suficientes para neutralizar los efectos
adversos que pueden ocasionar los radicales libres normalmente producidos (Volnie,
2003).
Un antioxidante es una sustancia capaz de neutralizar la accin oxidante de los
radicales libres, que pueden actuar capturndolos, previniendo, inhibiendo y/o
reparando las lesiones provocadas en nuestro organismo. Los antioxidantes se
clasifican en primarios o enzimticos, secundarios o no enzimticos o scavengers y
terciarios, en dependencia de su funcin (Gonzles, 2000).
Los antioxidantes presentan las siguientes propiedades:
Agentes que remueven o degradan las especies reactivas en forma cataltica. Ej.
SOD, catalasa, glutatin peroxidasa.
Molculas que disminuyen la disponibilidad de prooxidantes como iones de
hierro, cobre. Ej. Transferrina, metalotioninas.
Molculas que protegen a otras molculas del dao frente a los radicales libres.
Agentes de bajo peso molecular que barren especies reactivas de oxgeno y/o de
nitrgeno. Ej. GSH, vitamina C, alfa tocoferol, beta caroteno, cido rico,
bilirrubina (Volnie, 2003).

31

2.2.3.2. Mecanismos de proteccin contra radicales libres:

Las clulas presentan mecanismos de proteccin contra los radicales libres
derivados del oxgeno y que pueden actuar capturndolos previniendo su formacin,
inhibiendo su propagacin y/o reparando las lesiones provocadas.
La primera lnea de defensa del organismo contra los radicales libres es la
prevencin, esto implica la accin de procedimientos que bloquean su
formacin, como sera la presencia de protenas como la ferritina,
ceruloplasmina, la albumina y las metalotioneinas, que se unen a metales (en
particular hierro y cobre), lo que controla eficientemente la lipoperoxidacin y
fragmentacin del ADN ya que de esta manera se evita la participacin de estos
metales en las reacciones donde se producen las diferentes especies reactivas de
oxgeno (Gonzles, 2000).
En un segundo nivel de defensa esta la accin de los antioxidantes (enzimticos
y no enzimticos), que eliminan a los radicales libres suprimiendo su actividad
nociva en la clula (Castillo, 2002).
2.2.3.3. Clasificacin de antioxidantes:
Existen mltiples tipos y clasificaciones de antioxidantes, pero las clasificaciones
que permiten tener un mejor enfoque son las siguientes:
A) De acuerdo a la accin sobre los radicales libres:
Scavenger:
Cuando un radical libre por accin de los antioxidantes es transformado en
otro menos reactivo. Ej. cido ascrbico, alfa tocoferol.
Quencher:
Cuando el antioxidante logra neutralizar completamente el radical libre a
travs de la absorcin de toda la energa de excitacin. Ej. Licopeno.
B) De acuerdo a su origen y estructura (Endgenos):
Enzimticos: El sistema enzimtico evita la acumulacin del radical
superxido y H2O2.
Superxido dismutasas:

32

Son metaloenzimas presentes en el citosol (dependiente de Cu-Zn) y en la

mitocondria (dependiente de Mn). Su accin est dirigida a la reaccin de
dismutacin del radical anin superxido (O2-) intracelular, catalizando la
conversin del superxido (O2-) a oxgeno (O2) y por otra parte la
conversin del superxido (O2-) con dos electrones a perxido de hidrgeno
(H2O2) (Murria, 1997; Roskoski, 1998; Volnie, 2003).
Catalasa:
La catalasa es una hemoproteina que contiene cuatro grupos hem, conforma
el principal sistema enzimtico intracelular de remocin de molculas de
H2O2 cuando se encuentra este ltimo en concentraciones elevadas, se
caracteriza por presentar una tasa de renovacin extraordinariamente
elevada (40000 molculas por segundo). Su actividad se localiza
bsicamente en los peroxisomas, en donde cataliza la conversin de
perxido de hidrgeno, en agua y oxgeno molecular (Gonzles, 2000;
Murria, 1997; Volnie, 2003).
2H2O2

Catalasa

2H2O +O2

Glutatin peroxidasa:
Al igual que la catalasa conforma el principal sistema enzimtico
intracelular de remocin de molculas de H2O2 cuando se encuentra este
ltimo en concentraciones bajas; es una enzima presente en mitocondrias,
citosol y peroxisomas; existen dos formas de esta enzima una de ellas est
formada por dos cadenas polipeptidicas no requiere de selenio y tiene la
propiedad de catalizar la oxidacin del glutatin reducido (GSH) utilizando
perxidos orgnicos (Gonzles, 2000; Volnie, 2003)
Glutatin
Peroxidasa
2GSH+ROOH

GSSG+ 2H2O2 +ROH

La otra forma de la enzima, es aquella que utiliza como cofactor al selenio,

es de naturaleza tetramerica y ejerce su accin cataltica removiendo al
H2O2 en presencia de glutatin reducido (GSH) l es oxidado hasta GSSG
(Gonzles, 2000; Guija, 2003; Volnie, 2003).

33

Durante el proceso el glutatin es oxidado (GSSG), para posteriormente ser

regresado a su estado natural, por la enzima glutatin reductasa, protegiendo
de esta manera a los lpidos de membrana y a la hemoglobina de la
oxidacin por perxido (Murria, 1997)
No enzimticos:
Glutatin:
En trminos cuantitativos es uno de los antioxidantes ms importantes en las
clulas humanas y agente reductor (Guija, 2003).
El glutatin juega un papel importante de proteccin contra el dao oxidativo
de lpidos, protenas y cidos nucleicos. Acta como atrapador de radicales
hidroxilo, perxido de hidrgeno, oxgeno simple, adems tiene la capacidad
de reactivar enzimas que son inhibidas al ser expuestas a altas
concentraciones de oxgeno, protege tambin del dao oxidativo reduciendo
las concentraciones de perxido. El glutatin regenera la vitamina C que a su
vez regenera la vitamina E (Gonzles, 2000; Guija, 2003).
Ubiquinona (Coenzima Q):
Es una quinona liposoluble que acta como sustrato en la cadena de
transporte de electrones mitocondrial, existe en las mitocondrias en forma de
quinona oxidada en condiciones aerbicas y en la forma de quinol reducido
en condiciones anaerbicas, posee una estructura muy semejante a las de la
vitamina K y E, constituye adems un importante antioxidante liposoluble y
con capacidad de regenerar a la forma oxidada de vitamina E (Robertis, 1997;
Murria, 1997).
cido rico:
Constituye un producto final del metabolismo de las purinas. Inhibe la
peroxidacin y elimina a los radicales libres de oxgeno por su habilidad de
ligar cobre y hierro firmemente (Murria, 1997).
Albumina: Es una protena que se encuentra en gran abundancia en el plasma
sanguneo, es la que capta el 10-50% del total de radicales libres que se

34

generan en el plasma humano. Tienen la capacidad de unirse al cobre y as

inhibir la formacin de radical hidroxilo (Gonzles, 2000).
C) De acuerdo a su origen y estructura (Exgenos):
Vitamina E ( toco - ferol):
Principal antioxidante lipoflico, debido que es liposoluble, su accin se
desencadena protegiendo los lpidos dndole estabilidad a la membrana celular.
Acta especficamente con el oxgeno singlete y el radical de cido graso
poliinsaturado (Velsquez, 2000).
Vitamina C:
Presenta una importante accin antioxidante, al ser hidrosoluble es el mayor
captador de elementos oxidantes de la fase acuosa, es considerado un inhibidor
de la peroxidacin lipdica, regenera la vitamina E, acta con el radical anin
superxido, y el radical hidroxilo (Carr, 1999; Gonzles, 2000).
Beta Caroteno:
Es el ms representativo del grupo de los carotenoides, es un antioxidante
lipoflico, tiene la propiedad de reaccionar directamente con el oxgeno singlete
y desactivar los radicales libres, tambin puede ser transformado en vitamina A
en el intestino humano (Noguchi, 2000; Volnie, 2003).
Compuestos fenlicos propiamente dichos:
Alcoholes y cidos fenlicos, cidos cinmicos, sus derivados y glucsidos,
cumarinas, flavonoides y sus glucsidos, catequinas, fenoles condensados o
taninos y otros no incluibles en estas familias de compuestos.
Los fenoles son importantes constituyentes de plantas por su habilidad para
inhibir grupos hidroxilos. Acorde a reportes recientes, hay una relacin
altamente positiva entre el total de fenoles y actividad antioxidantes encontrado
en muchas especies de plantas, alrededor de

25.3 g de pirocatecol

equivalente de fenoles fue detectado en 1mg de extracto acuoso de ortiga.

Los compuestos fenlicos pueden contribuir directamente a la accin
antioxidante. Esta es una sugerencia de que los compuestos polifenlicos

35

pueden tener actividad inhibitoria sobre la mutagnesis y carcinognesis en

humanos (Gulcin et al. 2004).
Flavonoides:
Estos ejercen su accin antioxidante al reaccionar con los radicales hidroxilos y
superxido, interactuando tambin con el radical peroxilo y el xido ntrico
(Guija, 2000; Gonzles, 2000).
Es sabido desde hace tiempo que varias clases de flavonoides muestran
actividad antioxidante para muchos, compuestos fcilmente oxidables. Estos
flavonoides estn ampliamente repartidos en las plantas, especialmente en
hojas, flores y plenes, s como en partes leosas, como pednculos y cortezas.
Las plantas crecidas a pleno sol tienen ms flavonoides que las crecidas a la
sombra, lo cual se ha interpretado como defensa de la planta de las oxidaciones
promovidas por la luz UV (Duran y Padilla, 1993).

Los flavonoides son oxidados por los radicales, lo que resulta en un radical ms
estable y menos reactivo. En otras palabras, los flavonoides estabilizan las
especies reactivas del oxgeno por reaccin con el compuesto reactivo de la
radical. Debido a la alta reactividad del grupo hidroxilo de los flavonoides, los
radicales se hacen inactivos, de acuerdo con la siguiente ecuacin (Nijveldt, et
al., 2001):

Donde R es un radical y O libre es un oxgeno de los radicales libres.

Flavonoides seleccionados pueden recoger directamente superxidos, mientras
que otros flavonoides pueden tambin captar el oxgeno del peroxinitrito que es
altamente reactivo. La epicatequina y la rutina son tambin potentes
eliminadores de radicales. La capacidad de eliminacin de la rutina puede ser
debido a su actividad inhibidora sobre la enzima xantina oxidasa (Nijveldt, et
al., 2001).
Algunos flavonoides, como la catequina y la quercetina pueden captar
directamente especies reactivas de oxgeno (ROS), como superxido (O2-),
agua oxigenada (H2O2) o cido hipocloroso (HOCl), que pueden ser muy
36

dainos

para

lpidos,

protenas

DNA.

Los

flavonoides

actan

fundamentalmente como tampones, capturando radicales libres con formacin

del radical flavnico, mucho menos reactivo ya que los electrones desapareados
estn ms deslocalizados (figura 2A). Los flavonoides tambin pueden quelar
iones metlicos de transicin (hierro y cobre) (figura 2B).

Figura 2. Captura de radicales con formacin de radical flavnico (A);

quelacin de hierro por falvonoides (B) (Luis y Aller, 2008).
Los flavonoides deben cumplir dos requisitos adicionales para ser considerados
molculas antioxidantes (Halliwell, 1995): (1) incluso a bajas concentraciones
deben proteger a los compuestos frente a la oxidacin o el dao inducido por
radicales libres y, (2) el radical flavonoide formado (llamado radical aroxilo),
debe ser lo suficientemente estable para que la funcin antioxidante sea
efectiva. El carcter inestable del radical aroxilo puede ocasionar un efecto
prooxidante mostrado por algunos flavonoides, sin embargo la colaboracin
entre molculas antioxidantes, favorece la recuperacin del radical aroxilo por
otros antioxidantes, como el ascorbato. Los flavonoides presentan mayor o
menor capacidad antioxidante en funcin del nmero y posicin de sus grupos
hidroxilo unidos a las estructuras de anillo. Los compuestos de naturaleza
flavonoide presentan una serie de caractersticas estructurales que permiten
valorar, a priori, su posible funcin antioxidante: i) presencia de un grupo
catecol (3', 4'-dihidroxi) en el anillo B; ii) presencia de un doble enlace
insaturado entre C2 y C3 en el anillo C y; iii) presencia de un grupo hidroxilo
en C3 en el anillo C. Tambin es importante la presencia de grupos
funcionales, capaces de unir iones de metales de transicin como el hierro o el
cobre. Como ejemplo de compuesto flavonoide que rene todas estas
37

propiedades qumicas descritas tenemos el flavonol quercetina (Mercader,

2010)

Figura 3. Estructura de quercetina, resaltando los grupos implicados en su

actividad antioxidante. En amarillo, el grupo catecol del anillo B; en rojo,
enlace insaturado del anillo C; en verde, funcin 4-oxo en el anillo C; en azul,
puntos con capacidad de quelacion de metales.
En general, a dosis normales que oscilan entre 25 mg a 1 g por da, los
flavonoides son seguros y sin efectos adversos, pero pueden ser txicos si su
ingestin est entre el 1 y el 5% del total de la dieta. Debido a su capacidad de
eliminar radicales libres, existe la posibilidad de que presenten propiedades
prooxidantes y mutagnicas, determinadas por su estabilidad/labilidad redox
del compuesto radical formado a partir del flavonoide original, es decir, el
radical aroxilo puede autooxidarse o bien formar compuestos cuaternarios entre
el ADN o el cobre (Saret, 2011).
Riboflavina:
Su funcin principal es ser la precursora de las coenzimas FMN y FAD
(dinucleotido de flavina y adenina) reconocindose as su potente actividad
antioxidante ya que las enzimas que requieren la presencia de FAD se encuentra
la glutatin reductasa. La deficiencia se asocia con un aumento de peroxidacin
lipdica.
Cofactores:
Selenio:

38

Acta sinrgicamente con la vitamina E, es un componente esencial de la enzima

glutatin peroxidasa, junto con la cistena forman parte del glutatin como va de
eliminacin de txicos celulares (Murria, 1997).
Zinc:
Es un constituyente de SOD ayuda a la absorcin de la vitamina A y E favorece
el buen funcionamiento de las glndulas del aparato reproductor y aumenta la
capacidad inmunitaria del organismo (Murria, 1997).
Magnesio:
Al igual que el selenio, interviene en la activacin de la enzima superxido
dismutasa (Murria, 1997).

2.2.4. Produccin de xido ntrico en macrfagos activados.

2.2.4.1. Definicin:
Los macrfagos y neutrfilos activados destruyen los microbios fagocitados
mediante la accin de las molculas microbicidas en los fagosomas. En los
macrfagos

diversos

receptores

para

productos

microbianos

como

los

lipopolisacaridos (LPS) reconocidos por receptores tipo toll (RTT), los que estn
acoplados a las protenas G, los dirigidos a la fraccin constante de los anticuerpos y
al C3 del complemento y los correspondientes a las citosinas, sobre todo el INF Y,
funcionan de forma conjunta en la activacin de los fagocitos para destruir los
microbios fagocitados, la fusin de las vacuolas fagocticas (fagosomas) a los
lisosomas propicia la formacin de fagolisosomas, donde se encuentran concentrados
la mayora de los mecanismos microbicidas. En uno de los cuales los macrfagos
activados convierten el oxgeno molecular en especies reactivas del oxgeno (ERO),
que son unos oxidantes con un carcter muy reactivo para la destruccin de los
microbios (y de otras clulas). Adems del ERO, los macrfagos producen
intermediarios reactivos del nitrgeno, en especial xido ntrico (NO), por una
enzima llamada sintasa inducible del xido ntrico (NOSi). La NOSi es una enzima
citolgica que falta de los macrfagos en reposo, pero puede inducirse como
respuesta a los productos microbianos que activan los RTT, sobre todo en conjuncin
con el IFN y. Cuando los neutrfilos y los macrfagos estn muy activados, pueden
daar los tejidos normales del husped debido a la liberacin de enzimas lisosmicas,
39

ERO y NO. Los productos microbicidas de estas clulas no distinguen entre tejidos
propios y los microbios. Por consiguiente, si penetran en el medio extracelular, son
capaces de provocar lesin tisular (Abbas et al., 2012).
2.2.4.2. Los macrfagos:
Juegan un papel crtico en el desarrollo de la respuesta inmunitaria, debido a que
actan como primera barrera de defensa, al detectar y eliminar partculas extraas
(microorganismos, macromolculas txicas, clulas propias daadas o muertas)
mediante fagocitosis o secrecin de enzimas, citoquinas o produccin de especies
reactivas de oxgeno (ERO) y nitrgeno (ERN). Durante la respuesta inmunitaria
adaptativa los macrfagos presentan antgenos a los linfocitos T en el contexto de
MHC-II y/o MHC-I, y colaboran con la respuesta humoral en la eliminacin de
agentes extraos. Adems, los macrfagos tienen un papel en procesos de reparacin
de heridas y resolucin de la inflamacin, promoviendo el reclutamiento de otras
clulas inflamatorias hacia los focos de inflamacin. En consecuencia, el trmino
macrfago agrupa una multiplicidad de clulas cuya finalidad es el mantenimiento
de la homeostasis y la integridad tisular (Ruano, 2008).
Macrfagos peritoneales:
En humanos, la concentracin de M-CSF (Factor estimulante de colonias de
macrfagos) en el fluido peritoneal es muy elevada y se correlaciona con el nmero
de macrfagos peritoneales. Estudios realizados con macrfagos aislados de
muestras de dilisis peritoneal han mostrado que dichas clulas son fenotpica y
funcionalmente similares a los macrfagos anti-inflamatorios generados in vitro, por
cuanto exhiben alta capacidad de fagocitosis, endocitosis y macropinocitosis,
produccin de elevadas cantidades de IL-10 tras estimulacin, y una disminuida
capacidad de estimulacin de clulas T (Ruano, 2008).
2.2.4.3. xido ntrico, xido ntrico sintasa y sus efectos:
A) xido ntrico:
El xido ntrico (NO) es una simple molcula biatmica, no cargada y con un
electrn desapareado, implicado en una amplia coleccin de funciones fisiolgicas
que incluyen la relajacin de la musculatura lisa, la inhibicin de la agregacin
plaquetaria, la neurotransmisin y la respuesta inmune. Es sintetizado a partir de la
40

L-arginina y el oxgeno molecular por accin de la enzima xido ntrico sintasa

(NOS) y con requerimientos adicionales de NADPH como donador de electrones.
La unin del NO a las protenas u otras molculas es la base qumica que le permite
ejercer diversas funciones en el organismo. Pese a su simplicidad qumica, el NO es
una molcula con gran versatilidad, lo que le permite regular de un modo fino y
complejo una gran variedad de funciones de importancia para la vida de los
organismos vivos. Adems, el NO reacciona rpidamente con el oxgeno molecular
(O2) y con diferentes formas reactivas de oxgeno, como son algunos radicales libres
(superxido e hidroxilo), lo que genera peroxinitrito y otras formas reactivas de
nitrgeno txicas. Teniendo en cuenta la abundancia de oxgeno intracelular, la
combinacin del NO con las formas reactivas del O2 constituye el principal
mecanismo mediante el cual el NO puede daar a las clulas (Ruano, 2008).

El NO tambin puede inducir apoptosis, principalmente a travs de stress oxidativo.

El NO adems puede inducir necrosis, principalmente por el agotamiento de la
energa (Brown y Borutaite, 2007)
El NO se puede medir bien directa o indirectamente. Los mtodos indirectos son los
ms utilizados para la deteccin de este mediador inflamatorio. Entre estos ltimos
podemos considerar los que detectan productos de su metabolismo (nitritos o
nitratos) o los que miden expresin de su enzima. Para medir los productos
metablicos (nitritos) se utiliza rutinariamente la tcnica de Griess, basada en la
propiedad que tienen los nitritos de reaccionar con aminas primarias aromticas en
medio cido, originando compuestos de diazonio. Estos compuestos poseen una
coloracin roscea que se mide por espectrofotometra. La deteccin de ONS se
puede realizar mediante inmunocitoqumica o Western-Blot, o analizando su
expresin gnica por PCR a tiempo real.
B) xido ntrico sintasa:
La produccin de NO en el cuerpo es catalizado por una familia de enzimas llamadas
xido ntrico sintasa (NOS) (130-160 kDa). Estas enzimas constan de diferentes
subtipos en funcin de los tipos de tejido (Alderton et al., 2001). Las isoformas de
NOS contienen nucletidos flavnicos como flavin mononucletido (FMN) y el
41

Flavn adenn dinucletido (FAD) debiendo recordar que la nica molcula mamfera
con contenido conocido de ambas flavinas y que muestra una identidad de secuencias
con las NOS es el NADPH-citocromo P-450 xido reductasa (Li y Poulos, 2005). De
esta manera todas las isoformas de NOS tienen una estructura molecular similar y
requieren para su accin como ya se describi por lo menos de tres sustratos:
arginina, NADPH y O2 as como cinco cofactores o grupos prostticos: FAD, FMN,
calmodulina, H4B y el grupo hemo (Ruano, 2008).
Se han aislado y clonado, tres tipos de ONS: xido ntrico sintasa endotelial (ONSe),
xido ntrico sintasa inducible (ONSi) y xido ntrico sintasa neuronal (ONSn). Las
isoformas de ONS tienen genes con estructura similar, que sugieren un gen
primitivo. La clonacin de genes que codifican la sntesis de estas protenas y los
requerimientos de calcio para su formacin y funcin han llevado a designar a dos de
ellas, ONSe y ONSn como constitutivas porque estn constantemente presentes en
las clulas en reposo, se activan por el calcio en presencia de calmodulina (CaM). La
ONSi se sintetiza en las clulas despus de la induccin de citosinas o endotoxinas
bacterianas y no depende de la concentracin de Ca++ o calmodulina (Alderton et
al., 2001).
2.2.4.4. Efectos del xido ntrico:
Las reacciones directas ms importantes desde el punto de vista biolgico de NO
son: La reaccin con oxgeno molecular, la reaccin con radicales superxidos, con
metales de transicin y con otros radicales libres, como el radical tirosilo de la
ribonucletido reductasa. La interaccin con radicales superxido forma radicales
libres peroxinitrilo. Finalmente, al interaccionar con metales de transicin forma
complejos habitualmente incluidos en la estructura de la metaloprotenas (Ruano,
2008).
El NO y sus derivados participan en casi todos los procesos fisiolgicos esenciales,
siendo los ms importantes el control del tono vascular, la neurotransmisin y la
defensa antiinfecciosa. Es muy til en la hipertensin arterial, disfuncin erctil,
sndrome de distrs respiratorio del adulto (SDRA), enfermedad de Alzheimer y
Parkinson; adems de ser citotxico tambin tiene actividad inhibitoria de la
agregacin plaquetaria que previene la formacin de trombos (Diaz et al., 2009).

42

La principal funcin del NO producido a altas concentraciones por la NOS-2 es

microbicida, pero se manifiestan efectos txicos producidos como consecuencia de
su interaccin con O2 molecular o el radical anin superxido (O2-) y de la
formacin de ERN. Bajo condiciones aerbicas el NO es rpidamente oxidado a
ERN, formndose el dixido de nitrgeno (NO2), el trixido de dinitrgeno (N2O3) y
el tetraxido de trinitrgeno (N2O4). El N2O3 es el principal producto de oxidacin en
disolucin acuosa y en los sistemas biolgicos. Cuando la clula est sometida a un
alto proceso de estrs oxidativo y nitrosativo, con altas concentraciones de NO y
anin superxido (O2-), estos dos radicales interactan para generar el anin
peroxinitrito (ONOO-) altamente reactivo y responsable de muchos de los efectos
txicos del NO (Ruano, 2008).
El NO regula adems la actividad funcional, el crecimiento y la muerte de clulas
diversas como macrfagos, linfocitos T, CPA, mastocitos, neutrfilos y clulas
asesinas naturales. En mastocitos, el NO suprime la desgranulacin inducida por el
antgeno, la liberacin de mediadores y la sntesis de citocinas; en clulas T inhibe la
produccin de citocinas Th1 y a la vez promueven la respuesta Th2 y la produccin
de IgE en clulas B, aunque otros autores plantean que el NO inhibe tanto la
produccin de citocinas tipo Th1 como Th2 (Diaz et al., 2009).
El papel del NO en la inflamacin no est finalmente esclarecido, pero se evidencia
una combinacin de efectos txicos, regulatorios, apoptticos y antiapptoticos en
diferentes tipos celulares y en diferentes momentos del proceso inflamatorio. Por
ejemplo, mejora o inhibe la activacin de los neutrfilos dependiendo de la
concentracin, inhibe la expresin de los genes de IL-1, IL-8, IL-6, IFN y TNF, la
unin al ADN del NFB e interfiere en varias vas de sealizacin intracelular
(Ruano, 2008).
A) Efectos en el sistema inmunolgico:
La produccin de xido ntrico (NO) por la xido ntrico sintasa inducible (NOSi)
producida principalmente por los macrfagos activados y los polimorfonucleares, se
ha identificado como el principal mecanismo de accin citosttica y citoltica de los
macrfagos activados sobre la clula diana, desempeado un papel importante en la
actividad microbicida. Esto se produce por la accin de la combinacin de NO con
centros de azufre-hierro en las enzimas clave del ciclo respiratorio y de la va de
43

sntesis del DNA en las clulas diana. Sin embargo, los mismos agentes y enzimas
oxidativas pueden ser liberados y atacar no slo los agentes patgenos intra y
extracelulares sino que tambin contribuyen a nitrosilacin, estrs y lesiones de
tejidos. Se ha demostrado que parte de este efecto txico tambin es producido por la
nitrosilacin elevada que parte de mecanismos producidos por clulas de primera
lnea de defensa como los macrfagos y polimorfonucleares neutrfilos sobre todo
cuando acta frente a patgenos como parsitos.
La inflamacin aguda depende de la liberacin de mediadores qumicos. Mltiples
estudios realizados con inhibidores e inductores de NO muestran que el NO acta de
forma importante en la extravasacin vascular incrementndola por el aumento del
flujo sanguneo local. Se ha estudiado la modulacin producida por la va L-arginina
en una enfermedad crnica inflamatoria caracterstica como la artritis experimental,
en la que se ha encontrado que la produccin de NO incrementa la artritis y sus
signos inflamatorios, edema, calor, rubor. Otra de las enfermedades en la que se ha
estudiado la accin del NO en la inflamacin crnica es el asma, demostrando el
papel importante de la molcula en la inflamacin pulmonar, ya que acta entre otras
funciones en la modulacin de las vas respiratorias y el tono del msculo liso
vascular. Se ha demostrado que la enzima inducible NOSi ha sido la principal
isoforma determinante de la accin y ha sido considerada como un objetivo
teraputico, aunque la funcin de la xido ntrico sintasa endotelial (NOSe) en la
enfermedad de la va area tambin se ha estudiado (Ruano, 2008).
Una primera respuesta inflamatoria innata a los componentes bacterianos, virales o
parasitarios comienza con una respuesta inmune adaptativa con el reclutamiento y la
activacin de macrfagos, fagocitos mononucleares y linfocitos T. La liberacin de
citocinas y mediadores de la inflamacin, como la bradicinina e histamina entre
otras, activan la produccin de NO por las clulas. Para que esto ocurra debe existir
una expresin gnica de NOSi. El NO entonces es una molcula efectora de las
acciones citotxicas de clulas como los macrfagos activados frente a
microorganismos invasores y clulas tumorales y por lo tanto NO sintetizado por
NOSi puede contribuir al dao tisular dependiente de la activacin de macrfagos,
como se ha demostrado en estudios experimentales (Moncada et al., 1991). Se ha
comprobado adems que la va L-arginina ayuda al desarrollo de linfocitos T
44

citotxicos y potencia la expresin de receptores de IL- 2 en linfocitos T activados,

determinado que el NO modula la sntesis de esta y otras citocinas y al hacerlo regula
la respuesta inmunolgica (Abbas et al., 2012).
B) Factor de transcripcin nuclear kB:
El NFkB se activa rpidamente por estimulacin de un amplio rango de receptores
involucrados en la respuesta inmune innata y adaptativa, tales como TLR, receptores
de citocinas para IL-1, TNF, IL-15, IL-17, receptores para antgenos de las clulas
B y T as como por accin de ERO y ERN. Est involucrado en importantes procesos
de la respuesta inmune como la proliferacin y activacin linfocitaria, el
reconocimiento inmune, el cambio de clase de los isotipos de Ig, la funcin de
citocinas y la expresin de sus receptores, la activacin de mecanismos efectores del
sistema inmune, la apoptosis, el reclutamiento celular, la inflamacin, entre otros
(Garca, 2006).

Figura 4. Esquema ilustrando la sealizacin de las vas del proceso inflamatorio en

macrfagos activados por lipopolisacarido (Bak et al., 2013).

45

2.2.4.5. Mecanismos inmunolgicos implicados en algunos tipos de respuesta

inmune:
A) Respuestas inmunes caracterizadas por activacin de macrfagos:
Los macrfagos estn implicados en la mayora de las respuestas inmunes que se
desencadenan en el organismo por la diversidad de funciones que desempean; sin
embargo, existen algunos tipos de respuestas inmunes en las que sus mecanismos
efectores estn ms involucrados (Garca, 2006).
La hipersensibilidad retardada (HR) es una forma de reaccin inmunitaria
mediada por clulas en la que la clula efectora final es el macrfago activado,
representado hasta el 90% de la poblacin celular infiltrada. Este tipo de
inmunidad mediada por clulas forma parte del mecanismo de defensa primario
frente a microorganismos bacterianos, para lo cual se requiere la estimulacin de
la funcin microbicida de los macrfagos por los alrgenos producidas por las
clulas Th1, fundamentalmente el IFN (Abbas et al., 2012).
La respuesta alrgica o de hipersensibilidad inmediata
El principal mecanismo involucrado en el desencadenamiento de la respuesta de
hipersensibilidad inmediata o de tipo alrgica es la estimulacin de los
mastocitos y basfilos por la interaccin de antgenos tipo alrgenos con la IgE
especfica unida a los receptores de alta afinidad FcR de la superficie celular
(Kenneth et al., 2009).
2.2.4.6. Modulacin de la sntesis o la expresin de mediadores de la respuesta
inmune por compuestos de origen natural:
Los productos naturales constituyen una gran fuente de compuestos capaces de
modular algunos de los mediadores o de los mecanismos de la respuesta inmune.
Entre los compuestos de origen natural con propiedades inmunomoduladoras
podemos citar a los polifenoles, alcaloides, quinonas, terpenoides, esteroles,
polisacridos, glicoprotenas, entre otros (Wagner, 1990).
Los polifenoles son un conjunto heterogneo de molculas que comparten la
caracterstica de poseer en su estructura varios grupos bencnicos sustituidos por
funciones hidroxlicas. Dentro de los polifenoles se incluyen las xantonas, los
46

diferentes tipos de flavonoides, las coumarinas, los taninos y otras molculas, las
cuales son importantes constituyentes de un gran nmero de extractos obtenidos de
fuentes naturales y poseen una gran variedad de actividades biolgicas relacionadas
con las funciones del sistema inmune. Las catequinas son flavonoides presentes en el
t capaces de disminuir la produccin de IL-1 e incrementar los niveles de IL-10, la
quercetina y la rutina inhiben la presentacin de pptidos por las CPA y tienen
efectos antioxidantes y anti-inflamatorios, las xantonas antagonizan los receptores
del factor activador de plaquetas, las coumarinas inhiben la actividad de la enzimas
COX-1 y COX-2, la produccin de PGE2 y la liberacin de NO (Garca, 2006).
Los terpenoides constituyen otro importante grupo de compuestos capaces de
modular funciones del sistema inmune. La literatura reporta que poseen actividad
inhibitoria sobre la produccin de TNF, IL-6, IL-8, IFN, IL-1, IL-2 e IL-4, en la
degradacin de IkB y consecuentemente en la activacin de NFkB, en la produccin
de ERO y en las concentraciones de NOS-2, COX-2 y PGE2 (Li, 2000).
2.2.5. Ensayo de citotoxicidad:
2.2.5.1. Definicin:
La definicin de citotoxicidad tiende a variar dependiendo de la naturaleza del
estudio, si las clulas mueren o simplemente tienen su metabolismo alterado. Estos
ensayos son empleados porque son baratos, fcilmente cuantificables y
reproducibles. Muchos experimentos in vitro, tienen el propsito de determinar la
potencial citotoxicidad de los compuestos estudiados, porque ellos van a ser usados
como frmacos, cosmticos y deben demostrar que no son txicos o porque van a ser
usados como agentes anticancer y la citotoxicidad es crucial para su accin (Castro,
2006).

La configuracin de los modelos experimentales empleados in vitro para valorar la

toxicidad de los compuestos qumicos se fundamenta en pilares bsicos, que son el
sustrato biolgico e indicador de toxicidad. El sustrato es el material generalmente
orgnico, vivo o no, sobre el que se aplica in vitro el xenobiotico. Estas alteraciones
se valoran mediante indicadores de toxicidad, que son los parmetros que se

47

determinan para cuantificar las modificaciones producidas

en la estructura o

fisiologa de los componentes del sustrato de ensayo.

En la dcada de los 90s el descubrimiento de agentes antitumor de origen natural

estuvo basado en tests de actividad citotxica contra lneas celulares de cncer
usando modelos in vitro o in vivo. Muchos agentes anti-cancer descubiertos usando
tales ensayos han mostrado ejercer su accin citotoxica a travs de la interaccin con
la tubulina o de la inhibicin de la topoisomerasa. Con la identificacin de un
nmero creciente de blancos moleculares asociados con canceres particulares
(Castro, 2006).
Segn fresney, los ensayos de citotoxicidad se pueden clasificar en ensayos de
viabilidad y ensayos de supervivencia, los primeros se emplean para determinar la
proporcin de clulas que inmediatamente despus de un tratamiento potencialmente
traumtico, se mantienen intactas. Mediante estos ensayos se puede evaluar la
citotoxicidad de un tratamiento en trminos de concentraciones letales (LC). La
concentracin letal 50 (LC 50) es la concentracin de la sustancia de tratamiento que
causa la muerte al 50% de las clulas presentes, evaluadas inmediatamente despus
del tratamiento (Castro, 2006).
2.2.5.2. Mtodo MTT:
Muchos ensayos biolgicos requieren medir la supervivencia y/o proliferacin de las
clulas de mamfero, esto puede lograrse por varios mtodos, para esto se desarroll
un ensayo colorimtrico rpido, verstil y cuantitativo, basado en una sal de
tetrazolio MTT (metil tiazol tetrazolio) o (3-(4,5- dimetiltiazol-2-yl)-2,5 difenil
tetrazolio

bromuro),

mide

solo

clulas

vivientes

puede

medirse

espectrofotomtricamente leyendo la absorbancia entre 540-570 nm (Mosmann,

1983).
El MTT es una sal de tetrazolio color amarillo que se utiliza para medir la actividad y
viabilidad celular por el rompimiento causado por la reduccin (aceptacin de un
H+) del anillo de la sal de tetrazolio MTT por accin de las enzimas deshidrogenasas
mitocondriales: succinato-deshidrogenas, para formar unos cristales azules de
formazan insolubles en agua, pero solubles en dimetil sulfoxido (DMSO). La
48

viabilidad celular es proporcional a la absorbancia, que presentan los cristales de

formazan en solucin (Castro, 2006).

Figura 5. Metabolismo del MTT a sales de formazn por clulas viables.

Este mtodo est basado en la capacidad de las enzimas mitocondriales de las clulas
viables de transformar la sal tetrazolio MTT en cristales de formazan (Castro, 2006).

2.2.6. Genotoxicidad:
2.2.6.1. Definicin:
Es la capacidad para causar dao al material gentico por agentes fsicos, qumicos
o biolgicos; el dao en el material gentico incluye no slo al ADN, sino tambin
a todos aquellos componentes celulares que se encuentran relacionados con la
funcionalidad y comportamiento de los cromosomas dentro de la clula. Este dao
puede ser de tipo mutgeno o carcingeno (Castro, 2006).
Los genotxicos son agentes fsicos (temperatura, luz ultravioleta, radiaciones
ionizantes, radiaciones electromagnticas, etc.) o productos qumicos (agentes
alquilantes, acridina, oxidantes, agentes redox, epxidos alifticos, etc.) capaces de
alterar la informacin gentica celular (Klassen et al., 2005)
2.2.6.2. Mecanismos de genotoxicidad:
Las sustancias genotxicas pueden unirse directamente al ADN o actuar
indirectamente mediante la afectacin de las enzimas involucradas en la replicacin
del ADN y causando, en consecuencia, mutaciones que pueden o no desembocar en
un proceso canceroso.
49

Los mutgenos y carcingenos genotxicos son compuestos electrfilos muy

reactivos y con gran afinidad por el ADN, como los derivados de compuestos
orgnicos nitrogenados o halogenados, epxidos, lactonas o compuestos
inorgnicos de nquel, cromo, uranio, etc. Los genotxicos pueden provocar
mutaciones por cambios en algunos nucletidos debidos a:
Sustituciones en las bases: purinas por otras purinas, pirimidinas por otras
pirimidinas o purinas por pirimidinas o viceversa.
Sustitucin de una base por una sustancia anloga originando un nucletido
intil para la duplicacin.
Alteracin qumica de las bases mediante oxidacin, desaminacin.
Alquilacin de la molcula del ADN incorporando grupos qumicos a las
bases, mediante enlaces covalentes, formando lo que se conocen como
aductos.
Desfases que consisten en la adicin o delecin de bases, modificando la
pauta de lectura. Tambin, pueden provocar aberraciones cromosmicas
como: Lesiones cromosmicas por rotura, delecin, intercambio o
reorganizacin del material cromosmico y translocaciones. Cambio en el
nmero de cromosomas.
Tras la lesin producida en el ADN, la clula puede sufrir tres procesos:
Impedimento de la replicacin produciendo la muerte por apoptosis.
Replicacin con nucletidos alterados, o con errores en la replicacin del
ADN, es decir, se trasmite una mutacin. Esta mutacin puede ocurrir en
una clula somtica dando por ejemplo un proceso canceroso o
malformaciones congnitas en el recin nacido; o en una clula germinal
produciendo una enfermedad hereditaria o generando en el individuo una
mayor susceptibilidad de contraer determinadas enfermedades.
Reparacin del dao en la molcula de ADN evitndose la mutacin
(Klassen et al., 2005).
2.2.6.3. Evaluacin de la genotoxicidad:
Los ensayos de genotoxicidad estn diseados para detectar compuestos que inducen
de manera directa o indirecta dao en el material gentico por diferentes
mecanismos, siendo un requisito fundamental la evaluacin mutagnica para la
50

caracterizacin toxicolgica de un producto qumico. El estudio de las mutaciones

genticas se lleva a cabo mediante diferentes ensayos in vitro e in vivo, de
complejidad variable, segn el mecanismo biolgico que vayamos a analizar. En la
actualidad, no existe un nico test de mutagenesis capaz de detectar por s solo todo
tipo de mutacin, por ello, las agencias reguladoras exigen una batera de estudios de
genotoxicidad antes de la autorizacin para realizar ensayos clnicos de Fase I con un
nuevo compuesto. Se pueden realizar diferentes ensayos in vitro o in vivo (Klassen et
al., 2005).
A. Ensayos in vitro:
Se emplean para tratar de establecer la potencia de un compuesto para provocar un
efecto mutagnico, el cual habra que tratar de confirmarlo mediante ensayos in
vivo. Algunos de los principales ensayos utilizados son:

Test de Ames

Ensayo de aberraciones cromosmicas en mamferos

Ensayo Cometa o tcnica de electroforesis unicelular:

La prueba del cometa es una herramienta muy util para detectar el efecto
genotxico inducido por agentes qumicos, fsicos o biolgicos, sobre las
clulas de un ser vivo. Se basa en una electroforesis en gel de clulas
individuales que permite cuantificar de forma sensible y rpida el dao
en el ADN celular.

B. Ensayos in vivo
Se emplean para investigar el dao citogentico.

El ensayo de microncleos en eritrocitos de mamferos

El ensayo citogentico in vivo (Klassen et al., 2005).

2.2.6.4. Fragmentacin de DNA:

Las rupturas de cadena simple y la formacin de sitios lbiles al lcali en el DNA
han sido parmetros ampliamente utilizados para la deteccin de genotoxicidad y
han sido demostradas sus implicaciones en enfermedades degenerativas, el cncer,
y vinculadas al estrs oxidativo (Arrebola y Fernndez, 2010)

51

Singh y colaboradores desarrollaron la variante alcalina de la electroforesis de

clulas individuales (ensayo comet), proporcionando por primera vez datos a nivel
de clula individual. Este ensayo consiste en embeber las clulas en agarosa de bajo
punto de fusin para formar un microgel, someterlas a lisis para eliminar todas las
protenas celulares y permitir el posterior desenrollamiento por la interrupcin de
los enlaces por puentes de hidrgeno entre las dobles cadenas del DNA bajo
condiciones alcalina/neutras (Klassen et al., 2005).
Al someter al DNA desenrollado a una electroforesis en tampn alcalino, los
fragmentos de DNA cargados negativamente o cromatina relajada migran fuera del
ncleo en direccin al nodo para formar un halo, aprecindose una estructura
parecida a la de un cometa al teir el DNA despus de la electroforesis. Las clulas
con un aumento de su DNA daado muestran un incremento de la migracin
microsomal del DNA siendo las rupturas de doble cadena las causantes de mayor
frecuencia de migracin del material gentico. Por otra parte las clulas controles
tienen un bajo nmero de rupturas, estas exhiben cometas de nivel 0 de acuerdo con
la clasificacin del grado de dao al DNA, pero existiendo siempre cierta
migracin, encontrandose un 10% de este en la cola. Para detectar y cuantificar el
dao al ADN este puede ser teido con diferentes agentes como el nitrato de plata
siendo ms frecuentemente usados los agentes fluorescentes o tambin bromuro de
etidio (Arrebola y Fernndez, 2010).
Un tipo de dao endgeno es de derivados de productos intermedios de la
reduccin de oxgeno (dioxgeno), radicales libre de oxgeno (RLO), que ataca no
slo a las bases, sino tambin a la columna vertebral de deoxiribosil del ADN.
Gracias a mejoras en tcnicas analticas, un logro importante en la comprensin de
la carcinognesis en las ltimas dos dcadas ha sido la identificacin y
cuantificacin de varios aductos de RLO con el ADN. RLO tambin son conocidos
por atacar a otros componentes celulares como lpidos, dejando especies reactivas
que a su vez se pueden acoplar a las bases de ADN. Lesiones de ADN endgenas
son genotxicos e inducen mutaciones. La lesin ms ampliamente estudiada es la
formacin de la 8-OH-dG. Esta lesin es importante porque se forma relativamente
fcilmente y es mutagnico y por lo tanto es un biomarcador potencial de
carcinognesis. Mutaciones que puedan derivarse de la formacin de la 8-OH-dG
52

implican Transversiones de GC TA. El efecto de RLO es equilibrado por la accin

antioxidante de los antioxidantes no enzimticos, as como enzimas antioxidantes.
Sin embargo, bajo ciertas condiciones, algunos antioxidantes pueden tambin
exhibir un mecanismo prooxidante de accin (Valko et al., 2004).
Cooke et al. (2003), en su investigacin mencionan que el metabolismo celular
normal est bien establecida como la fuente de especies reactivas del oxgeno
endgenas (ROS), y son estos (normalmente no patgenos) procesos celulares que
dan cuenta de los niveles de fondo de dao oxidativo del ADN detectado en el
tejido normal. Las cadenas de transporte de electrones poseen el potencial de los
electrones "fugas" a oxgeno que resulta en la formacin de superxido. Ciertas
actividades enzimticas generan superxido y, a travs de un estallido oxidativo,
ROS se libera de las clulas fagocticas destinados a destruir las clulas infectadas
con virus, o bacterias, aunque tejido circundante tambin puede verse afectada. Los
peroxisomas compartimentan el metabolismo oxidativo que conduce a productos
reactivos que de otro modo seran perjudiciales para la clula, aunque bajo ciertas
condiciones, estos productos pueden ser liberados.
2.3. MARCO CONCEPTUAL:
AGUA ULTRAPURA: Es la sustancia ms pura utilizada en un laboratorio, el agua
ultrapura slo contiene H20, iones H+ y OH- en equilibrio.
ANTIOXIDANTE: Es una molcula capaz de retardar o prevenir la oxidacin de otras
molculas. Los antioxidantes terminan estas reacciones quitando intermedios del radical
libre e inhiben otras reacciones de oxidacin oxidndose ellos mismos.
ABSORBANCIA: Medida de la atenuacin de una radiacin al atravesar una sustancia,
que se expresa como el logaritmo de la relacin entre la intensidad saliente y la entrante.
CONCENTRACIN: Es la proporcin o relacin que hay entre la cantidad de soluto y
la cantidad de disolvente, donde el soluto es la sustancia que se disuelve, el disolvente
es la sustancia que disuelve al soluto, y la disolucin es el resultado de la mezcla
homognea de las dos anteriores.

53

CITOPROTECTOR: Se denomina a las sustancias que protegen las clulas del

organismo frente a los efectos dainos del estrs oxidativo provocado por radiacin
ionizante o quimioterapia.
CITOTXICO: Poder destructor con respecto a las clulas.
CULTIVOS CELULARES: Es el proceso mediante el que clulas, ya sean clulas
procariotas o eucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la prctica el
trmino "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de clulas aisladas
de eucariotas pluricelulares, especialmente clulas animales.
ELECTROFORESIS: Es una tcnica para la separacin de molculas segn la
movilidad de stas en un campo elctrico.
DPPH: Es una abreviacin del compuesto qumico orgnico 2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl.
EXTRACTO: Es una sustancia obtenida por extraccin de una parte de una materia
prima, a menudo usando un solvente como etanol o agua.
ESTRS OXIDATIVO: Es causado por un desequilibrio entre la produccin de
especies reactivas del oxgeno y la capacidad de un sistema biolgico de detoxificar
rpidamente los reactivos intermedios o reparar el dao resultante.
ESPECTROFOTMETRO: Es un instrumento usado en el anlisis qumico que sirve
para medir, en funcin de la longitud de onda, la relacin entre valores de una misma
magnitud fotomtrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentracin o
reacciones qumicas que se miden en una muestra.
FRAGMENTACIN DEL ADN: Fenmeno que se da cuando el ADN empaquetado en
la cromatina, puede sufrir facturas, conocidas como nicks, tanto en la cadena simple
como en la doble hlice.
INMUNOREGULADOR: Un inmunoregulador es una sustancia que modifica (puede
aumentar o disminuir) la capacidad del sistema inmune de ejercer una o ms de sus
funciones.
INHIBICIN: Dificultad o imposibilidad de una reaccin qumica, especialmente un
catalizador, para transcurrir a su velocidad normal.
54

MURINO (Murinae): Son una subfamilia de roedores miomorfos perteneciente a la

familia Muridae, que incluye a los comnmente llamados ratones y ratas.
OXIDACIN: La oxidacin es una reaccin qumica donde un metal o un no metal
ceden electrones, y por tanto aumenta su estado de oxidacin.
XIDO NTRICO: Es una molcula altamente inestable en el aire ya que se oxida
rpidamente en presencia de oxgeno convirtindose en dixido de nitrgeno. Por esta
razn se la considera tambin como un radical libre.
RADICAL LIBRE: Los radicales libres son sustancias qumicas muy reactivas que
introducen oxgeno en las clulas, produciendo la oxidacin de sus partes, alteraciones
en el ADN, y que provocan cambios que aceleran el envejecimiento del cuerpo.
VIABILIDAD CELULAR: Es una determinacin de las clulas vivas o muertas, en
base a una muestra total de clulas. Mediciones de la viabilidad celular se puede utilizar
para evaluar la muerte o la vida de las clulas sometidas a estrs oxidativo.
III.
3.1.

MATERIALES Y MTODOS:

AREA DE ESTUDIO:

El estudio se realiz en la ciudad de Puno, regin ubicada a 3.827 msnm al extremo sur
este del Per, entre los 130000 y 17001730 de latitud sur, los 710657 y
684846 de longitud oeste del meridiano de Greenwich, la regin Puno se encuentra
en el Altiplano entre los 3,812 y 5,500 msnm, entre la ceja de selva y la selva alta entre
los 4,200 y 500 msnm, es de clima fro y semiseco. La temporada de lluvias se inicia en
octubre y concluye en abril. La temperatura media anual mxima es 14,4C (57,9F) y
la mnima 2,6C (36,7F); y la ciudad de Arequipa ubicada a 2.335 msnm, entre los
14366 de latitud sur, 715939 y 75552 longitud oeste del meridiano de
Greenwich, el clima es templado, clido y relativamente seco; su temperatura vara
entre los 21 C y los 10 C. De enero a marzo tiene lluvias moderadas. El sol brilla casi
todos los das del ao.
El estudio se dividi en dos etapas:

55

La primera se llev a cabo en la ciudad de Puno, donde se realiz el muestreo y la

recoleccin de la muestra de estudio, la cual fue preparada para su transporte a la ciudad
de Arequipa.
La segunda parte se llev a cabo en la ciudad de Arequipa, en la Universidad Nacional
de San Agustn se realiz la identificacin taxonmica, los bioensayos experimentales
para cada uno de los objetivos se realizaron en la Universidad Catlica Santa Mara de
Arequipa e Instituto de Biomedicina y Biotecnologa de Arequipa.
3.2.

TIPO DE ESTUDIO:

Experimental: se realiz comparaciones de la capacidad antioxidante y efecto

citoprotector (variables dependientes) con los grupos experimentales (concentraciones
de extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica)).
Analtico: Se estudi la causa efecto de las concentraciones del extracto metanlico de
ortiga (Urtica dioica) sobre la capacidad antioxidante y el efecto citoprotector, as
como tambin su interpretacin.
Prospectivo: El registro de la informacin se realiz a partir de la fecha de ejecucin
establecida en el cronograma.
Longitudinal: Se estudiaron las variables a lo largo del tiempo durante el periodo de
investigacin.
3.3.

POBLACIN Y MUESTRA:
A)

Poblacin:

Macrfagos obtenidos de 12 ratas de 8 a 12 meses de edad, machos (250 - 300

g). Mantenidas en un ambiente libre de patgenos, con temperatura aprox. de
24C, y se les proporcion agua y alimento ad libitum (maz, cebada y trigo).

B)

Muestra de estudio:

Los macrfagos peritoneales murinos residentes no activos, obtenidos del lavado

peritoneal con 20 ml de suero fisiolgico procedieron de una muestra censal, en
promedio total 84 x 106 macrfagos de las 12 rata.
- Criterios de inclusin: Macrfagos peritoneales murinos con viabilidad
al 80%
56

- Criterios de exclusin: Macrfagos peritoneales murinos con viabilidad <

al 80%.
3.4.

MATERIALES:

Para evaluar la capacidad inhibitoria del radical DPPH del extracto metanlico de
ortiga (Urtica dioica).

Tubos de ensayo

Vaso precipitado

Fiola

2,2 diphenyl 1 picrilhydrazil (DPPH)

Metanol para anlisis

Agua destilada

Balanza analtica

Espectrofotmetro

Para evaluar el efecto del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) a diferentes
concentraciones, sobre la produccin de xido ntrico en macrfagos murinos activados,
se emple:

Lisado de bacterias E. coli.

Agua estril.

Tubo de ensayo.

Jeringas de 5 ml.

5 Ratas de 250-300 g (Rattus novergicus cepa wistar).

Cocina elctrica.

Medio Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), suplementado con suero

fetal bovino al 10 %.

Alcohol etlico al 70 %.

Cloroformo.

Suero fisiolgico 0.9%

Jeringas de 20 ml.

Tubos falcon de 15 ml.

Tubos eppendorf de 1.5 ml.

Micropipetas y tips.
57

Cmara de Neubauer.

Centrifuga.

Azul de tripan.

Extracto metanlico seco en diferentes concentraciones (100, 200, 400 y 600

g/ml), disuelto en DMSO al 1%.

Medio de cultivo DMEN (suplementado con suero fetal bovino, penicilina y

estreptomicina, bicarbonato de sodio).

Placa de poliestireno de 24 pozos.

Incubadora de 5 % CO2.

Dimetil sulfxido (DMSO) al 1%.

Cmara de flujo laminar.

Solucin A: sulfanilamida 0.12 M en H3PO4 0.36 M.

Solucin B: dihidrocloruro de N-(1-naftil) etilendiamina 7.7 mM en H3PO4

0.36 M.

Curva estndar de NaNO2.

Espectrofotmetro.

Para la determinacin del porcentaje de viabilidad de los macrfagos segn la

concentracin del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) se emple:

Cultivos de macrfagos peritoneales murinos sin activar.

Extracto metanlico de ortiga diluido en DMSO al 1 %, para las diferentes

concentraciones (600, 400, 200 y 100 g/ml).

Perxido de hidrgeno (control positivo citotxico) en concentraciones de 10

mM, 5 mM y 0.5 mM.

Dimetil Sulfxido DMSO puro.

Medio de cultivo DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10 %.

MTT

(Bromuro

de

3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol)

la

concentracin de 5 mg/ml.

Hidrxido de potasio 2 M.

Agua destilada

58

3.5.

Agua ultrapura

Agarosa 2% P/V en TAE 10X

Buffer TAE 1X (Tampn de electroforesis)

Tris HCl 89 mM pH=8.3

EDTA 2 mM

Acetato

SYBER Safe DNA gel stain

TAE 10X

Buffer de carga

METODOLOGA:

3.5.1. DISEO DEL MUESTREO O EXPERIMENTO:

El diseo utilizado fue completamente aleatorizado, las muestras (macrfagos
peritoneales murinos) elegidas al azar para la aplicacin de cuatro tratamientos de
concentraciones crecientes del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) bajo
condiciones controladas en un ensayo in vitro.
Se utilizaron 4 concentraciones como tratamientos con 4 repeticiones para cada uno,
realizados en 2 bioensayos en momentos diferentes.
Tabla 1. Diseo de muestra para evaluar la capacidad inhibitoria del radical DPPH a
diferentes concentraciones del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica)
TRATAMIENTOS
600 g/ml
Concentraciones del
extracto metanlico
400 g/ml
de ortiga (Urtica
200 g/ml
dioica)
100 g/ml

Bioensayo 1
R1
R2
R1
R2
R1
R2
R1
R2

Bioensayo 2
R3
R4
R3
R4
R3
R4
R3
R4

59

Tabla 2. Diseo de muestra para determinar el efecto del extracto metanlico de

ortiga (Urtica dioica) a diferentes concentraciones, sobre la produccin de xido
ntrico en macrfagos murinos activados
TRATAMIENTOS
600 g/ml
Concentraciones del
extracto metanlico
400 g/ml
de ortiga (Urtica
200 g/ml
dioica)
100 g/ml
Medio de
Control
cultivo

Bioensayo 1
R1
R2
R1
R2
R1
R2
R1
R2
R1
R2

Bioensayo 2
R3
R4
R3
R4
R3
R4
R3
R4
R3
R4

Tabla 3. Diseo de muestra para determinar el efecto del extracto metanlico de

ortiga (Urtica dioica) a diferentes concentraciones, sobre la viabilidad celular en
macrfagos murinos.
TRATAMIENTOS
600 g/ml
Concentraciones del
extracto metanlico
400 g/ml
de ortiga (Urtica
200 g/ml
dioica)
100 g/ml
0.5 M
Concentraciones de
perxido de
5 M
hidrgeno
10 M
Medio de
Control
cultivo

Bioensayo 1
R1
R2
R1
R2
R1
R2
R1
R2
R1
R2
R1
R2
R1
R2
R1
R2

Bioensayo 2
R3
R4
R3
R4
R3
R4
R3
R4
R3
R4
R3
R4
R3
R4
R3
R4

Tabla 4. Diseo de muestra para evaluar el efecto del extracto metanlico de ortiga
(Urtica dioica) a diferentes concentraciones, sobre la fragmentacin del ADN de
macrfagos murinos sometidos a estrs oxidativo.
TRATAMIENTOS
Sistema I
Concentraciones del
extracto metanlico de
ortiga (Urtica dioica)
Sistema II
Perxido de hidrgeno
Control

600 g/ml
100 g/ml
600 g/ml
100 g/ml
10 M
Medio de cultivo
DMSO al 1%
600 g/ml del extracto

Bioensayo I
R1
R1
R1
R1
R1
R1
R1
R1

60

3.5.2.
3.5.3. DE LABORATORIO:
3.5.3.1.

Obtencin del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica):

Seleccin de hojas de ortiga:

A partir de las plantas recolectadas, se tomaron nicamente las hojas enteras sin
daos, se lavaron con agua destilada 2 veces y se las dej secar a temperatura
ambiente 12 horas envueltas en papel estraza.
Se colocaron las hojas en un mortero, se liofilizaron, molieron, pesaron y colocaron
en un frasco acaramelado.
Mtodo de maceracin con metanol (Otles y Yalcin, 2012):
Fundamento:
Se basa en la propiedad del solvente, el contacto prolongado de la estructura de la
planta con el disolvente (metanol) constituye un conjunto homogneamente
mezclado por agitacin que debe ser protegido de la luz para evitar reacciones, el
disolvente acta simultneamente sobre todas las proporciones de la planta,
circulando en todas las direcciones y sentidos disolviendo sus principios activos
hasta producirse una concentraciones en equilibrio con la del contenido celular. La
separacin de fase liquida y slida necesita una etapa final de evaporacin.
Procedimiento:

Se obtuvo el extracto al 31.126 % (p/v) en metanol para anlisis (grado

p.a.), mezclando para ello 31.126 g de peso seco de hoja en 100 ml de
metanol.

Se agit por 15 minutos seguido de una doble filtracin.

El volumen filtrado fue depositado en tubos falcon de 50 ml.

Se colocaron en la estufa a 37 C para su evaporacin y obtener el

extracto seco.

A partir del extracto seco de realizaron diluciones para llegar a las

concentraciones utilizadas en las diferentes pruebas.

61

3.5.3.2.

Evaluacin de la capacidad inhibitoria del radical DPPH del

extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica).

Mtodo de inhibicin de radicales libres (Cceres, 2004; Bellido, 2007):

Fundamento:
Est basado en la habilidad que tienen los agentes antioxidantes (donadores de
hidrgenos) para secuestrar al radical libre 2,2 diphenyl 1 picrilhydrazil (DPPH)
favoreciendo su reduccin, decolorando de color violeta intenso caracterstico de
este radical a un amarillo, disminuyendo la absorbancia a 517 nm lo que
proporciona el porcentaje de capacidad antioxidante o porcentaje de inhibicin del
radical libre.
Procedimiento:

Se prepar una solucin estndar de 2 mM de DPPH con metanol puro.

Se disolvi el extracto seco en metanol para obtener las concentraciones (600,

400, 200 y 100 g/ml).

Se mezcl 1 ml de cada concentracin de extracto metanlico de ortiga con 2

ml de DPPH a 2mM.

Se dej incubar a temperatura ambiente por 30 minutos (Khare et al. 2012,

Kukric et al.2012), tiempo que resulta ms ptimo en este tipo de ensayos.

Se lectur las absorbancias del blanco (metanol), control (solucin DPPH), las
reacciones de las concentraciones con DPPH (muestras) y los blancos de
concentracin (1 ml de concentracin en 2 ml de metanol) utilizando un
espectrofotmetro a una longitud de onda de 517 nm.

Se calcularon los porcentajes de inhibicin del radical DPPH utilizando la

siguiente formula:
% Capacidad = Abs. Control - (Abs. de la Muestra Abs. Blanco de la muestra) x 100
Antioxidante

Abs. Control

(Cceres, 2004).

Los datos obtenidos se analizaron mediante regresion lineal, concentracin

media inhibitoria (IC50), analisis de varianza y pruebas estadisticas para los
objetivos del experimento.

62

3.5.3.3.

Determinacin de la produccin de xido ntrico en los macrfagos

activados a diferentes concentraciones del extracto metanlico de
ortiga (Urtica dioica):

Mtodo de cultivo celular de macrfagos (Castro, 2006):

Fundamento:
Se mantienen las clulas vivas fuera de su organismo de origen, ofrecindoles las
mismas condiciones para estudiar su comportamiento sin el control normal ejercido
por el organismo vivo, para observarlas y estudiar la morfologa celular y comparar
el efecto de diferentes agentes o diferentes concentraciones de un agente sobre el
crecimiento y metabolismo, bajo un ambiente experimental controlado.
Procedimiento:
a) Activacin de macrfagos:

Se prepar el lisado de bacterias de E coli, colocando 2 UFC del cultivo

bacteriano en un tubo de ensayo con 5 ml de agua estril, y se hizo hervir
por 5 minutos).

Se inyect intraperitonealmente 1 ml del lisado bacteriano para cada rata.

Se dej pasar 48 horas (periodo de incubacin).

b) Extraccin de macrfagos:

Se anestesi al animal con cloroformo colocndolo en una campana de

vidrio.

Se coloc la rata en decbito supino sobre la tabla de diseccin

Se limpi con alcohol etlico al 70% la parte inferior.

Se incidi la piel y retir la musculatura y el tejido conjuntivo que rodea el

abdomen.

Se introdujo una jeringa de 20 ml en la luz del peritoneo y se inyect 20 ml

de suero fisiolgico al 0.9 %, seguidamente se extrajo suavemente el lquido
y deposit en tubos falcon de 15 ml.

El volumen obtenido se centrifug a 4000 rpm durante 5 minutos y

conserv el botn de clulas (pellet).

63

Se resuspendi el botn de macrfagos obtenidos en 1 ml de medio de

cultivo DMEN y se separar 20 l para realizar el recuento.

En un eppendorf se carg 10 l de suspensin con 10 l de azul de tripan y se

homogeniz.

El conteo se realiz en cmara de Neubauer y el resultado se expres en

millones de clulas por mililitro.

c) Cultivo de macrfagos peritoneales murinos:

Se trabaj en una cmara de flujo laminar vertical en donde los materiales

fueron desinfectados con etanol al 70%.

Se utilizaron placas de poliestireno de 24 pozos colocando 1x106 clulas

(macrfagos peritoneales murinos) en 0.9 ml de medio de cultivo por pozo.

Se agregaron 0.1 ml de las diferentes concentraciones del extracto metanlico

seco disuelto en DMSO al 1% de acuerdo al diseo del experimento.

Se incubaron a 37C, 5% de CO2 y humedad de 80% durante 24 horas.

Mtodo de Griess para medida de nitritos (Green et al., 1982; Campisi et al., 2002):
Fundamento:
Est basada en la propiedad que tienen los nitritos de reaccionar con aminas
primarias aromticas en medio acido, originando compuestos de diazonio que dan
coloracin rosada cuantificndose a 540 nm.
El xido ntrico que se forma in vitro como resultado de la accin de la enzima NOS2 (xido ntrico sintasa 2) experimenta una rpida oxidacin a nitritos, por lo que la
determinacin de estos ltimos constituye una va indirecta para evaluar la
produccin de xido ntrico (Jun et al., 1994).
Procedimiento:

Se recogi el sobrenadante del cultivo de cada pozo y se coloc en tubos

eppendorf de 1.5 ml,

Se aadieron 200 mg de carbn activado en cada tubo y se centrifug a 14.000

rpm 20 minutos.

Se extrajo 500 l del sobrenadante de cada tubo y se coloc a un nuevo tubo

eppendorf de 1.5 ml para cada uno.
64

Se prepar del reactivo de Griess mezclando la solucin A y B (1:1) antes de su

uso.

Se aadi 500 l del reactivo Griess a cada tubo.

Se esper 15 minutos y se lectur la absorbancia a 540 nm en un

espectrofotmetro.

Se prepararon concentraciones de 5, 10 20 y 40 M de nitrito de sodio como

estndar para obtener una curva de calibracin, las concentraciones de xido
ntrico fueron obtenidos interpolando las absorbancias con las absorbancias
conocidas de nitrito de sodio.

Los porcentajes
calcularon

de
IE (%) = 100 - [NO]a/[NO]b x 100

siguiente

inhibicin

mediante

se
la

formula:

(Wang y Mazza, 2002)

Donde IE: Porcentaje de efecto inhibitorio
[NO]a: Concentracin de xido ntrico producido en presencia del
extracto.
[NO]b: Concentracin de xido ntrico en el control.
3.5.3.4.

Determinacin del porcentaje de viabilidad de los macrfagos segn

la concentracin del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica).

Mtodo de viabilidad celular con MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5difeniltetrazol) (Castro, 2006):

Fundamento:
Se basa en la reduccin metablica del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5difeniltetrazol (MTT) por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa en un
compuesto coloreado de color azul (cristales de formazn), permitiendo determinar
la funcionabilidad mitocondrial de las clulas tratadas. La cantidad de clulas vivas
es proporcional a la cantidad de formazn producido, el cual es cuantificado en
espectrofotmetro a 550 nm.
Procedimiento:
65

Se extrajeron los macrfagos peritoneales murinos sin activar de animales sanos.

Se cultivaron en placas de poliestireno de 24 pozos, colocando 1x106

macrfagos no activados en 0.9 ml de medio DMEN por pozo.

Se agreg 0.1 ml de las concentraciones del extracto de ortiga (600, 400, 200 y
100 g/ml) y concentraciones de perxido de hidrgeno (0.5, 5 y 10 M) y se
incubaron 24 horas a 37C y 5% CO2.

Se agreg 100 l del reactivo MTT (5 mg/ml) a cada uno de los pozos y se agit
cuidadosamente para permitir la formacin de cristales de formazn.

Se incubaron 1 hora a 37C y 5% CO2.

Se form un precipitado purpura (cristales de formazn).

Con una micropipeta se resuspendieron los cristales de formazn de cada

muestra y se colocaron en tubos eppendorf de 1.5 ml.

Se centrifug a 14000 rpm por 5 minutos.

Se descart el sobrenadante y el pellet se trat con 250 l de hidrxido de

potasio al 2M y 250 l de DMSO puro.

Se resuspendi bien el pellet y se agreg 250 l de agua destilada, luego se

midi la absorbancia a 550 nm en un espectrofotmetro.

El

porcentaje

de

viabilidad

% viabilidad

se

obtiene

de

la

siguiente

formula:

DO clulas tratadas x 100

DO clulas control

Dnde: DO es la absorbancia.
3.5.3.5.

Evaluacin del efecto del extracto metanlico de ortiga (Urtica

dioica) sobre la fragmentacin del ADN de macrfagos murinos
sometidos a estrs oxidativo.

Mtodo estndar de electroforesis de gel de agarosa para la determinacin de la

fragmentacin de ADN (Bellido, 2007):
Fundamento:
La electroforesis en gel de agarosa, separa, identifica y purifica fragmentos de
ADN. Los geles de agarosa son corridos en forma horizontal en un campo elctrico
de fuerza y direccin constantes, las molculas de ADN expuestas a este campo
66

elctrico migran hacia el nodo debido a que los grupos fosfato estn cargados
negativamente a lo largo de la molcula de ADN.

Procedimiento:
a) Cultivo de macrfagos murinos:
Se cultivaron 18 x106 macrfagos en total para cada tratamiento.
Sistema I (Preventivo):

Se utilizaron placas de poliestireno de 24 pozos colocando 3x106

macrfagos no activados en 0.9 ml de medio DMEN por pozo.

Se utilizaron 6 pozos para cada tratamiento agregndole 0.1 ml de las

concentraciones de extracto.

Se incubaron por una hora a 37C y 5% de CO2.

Despus del tiempo de incubacin se realiz dos lavados con suero

fisiolgico.

Se le aadi 0.9 ml de medio de cultivo DMEN con 100 l de perxido de

hidrgeno al 10 mM, y se dej incubando a 37C y 5% CO2 por 24 horas.

Sistema II (Protector):

Se utilizaron placas de poliestireno de 24 pozos colocando 3x106

macrfagos no activados en 0.8 ml de medio DMEN por pozo.

Se utilizaron 6 pozos para cada tratamiento agregndole 100 l de las

concentraciones de extracto.

Se le aadi 100 l de perxido de hidrgeno al 10 mM, y se dej

incubando a 37C y 5% CO2 por 24 horas.

Se utilizaron los siguientes controles:

Control 1: Se cultiv 3 x 106 de macrfagos con 100 l de medio.

Control 2: Se cultiv 3 x 106 de macrfagos con 100 l de DMSO.

Control inducido: Se cultiv 3 x 106 de macrfagos con 100 l de perxido

de hidrgeno 10 mM.

67

Control negativo: Se cultiv 3 x 106 de macrfagos con 100 l de extracto

metanlico de ortiga.

b) Extraccin y aislamiento del ADN.

Transcurrido los tiempos de incubacin establecidos, las clulas fueron

retiradas y colocadas en eppendorf de 1.5 ml.

La suspensin celular (macrfagos peritoneales no activados incubados en

el medio DMEN) se centrifugaron a 13500 rpm por 1 min a una temperatura
de 4C y se elimin el sobrenadante.

Se lavaron las clulas con 1.5 ml de PBS frio y estril

Se centrifug a 13500 rpm durante 1 min y se descart el sobrenadante.

El precipitado celular se resuspendi en 500 l de buffer de lisis, una vez

homogenizada la muestra, se agreg 3 l proteinasa K.

Se dej en incubacin a 37 C durante 12 a 18 horas (la incubacin debe

realizarse en tubos hermticamente sellados y con agitacin suave).

Transcurrido el tiempo de incubacin, se procedi a agregar a cada una de

las muestras en volumen igual a la mezcla fenol cloroformo alcohol
isoamilico 25:24:1

Se mezcl bien por inversin durante 10 segundos.

Se centrifug las muestras durante 10 minutos a 13500 rpm en una

microcentrifuga.

Para la precipitacin del ADN, se transfiri la fase acuosa (parte superior) a

un nuevo vial de 1.5 ml, se adicion medio volumen de Isopropanol frio y
se dej precipitar el ADN durante toda la noche a -20C.

Pasado el tiempo de precipitacin se centrifug a 13500 durante 10 min. El

ADN form un pellet blanco.

Se elimin el sobrenadante y se enjuag el pellet de ADN con 500 l de

etanol 70% frio.

Se Invirti el tubo para resuspender el pellet.

Se centrifug a 13500 rpm durante 1 min, se elimin el sobrenadante y se

dej evaporar el etanol.

68

En las muestras evaporadas se resuspendi el pellet de ADN en 25 l de

agua ultrapura.

Se Incub a 65C durante 5 min para facilitar la resuspensin.

Se utiliz para la visualizacin en la corrida electrofortica, tambin se

puede guardar el ADN a -20C.

c) Visualizacin de la fragmentacin del ADN en gel de agarosa (electroforesis de

ADN):

Se prepar un gel al 2 % (se pes 2 g de agarosa y se disolvi en 100 ml de

buffer TAE 10X).

Se calent hasta ebullicin, se dej enfriar la solucin y se agreg 2 l de

SYBER Safe.

Se verti la agarosa al molde para dejar que la agarosa gelifique durante 15

a 20 minutos a temperatura ambiente.

Se coloc el gel en la cmara de electroforesis y se cubri el gel con el

buffer TAE 10 X.

Las muestras de ADN obtenidas de la incubacin con agua ultra pura se

mezclaron con buffer de carga (6:1).

Se calent las muestras a 50C durante 5 minutos.

Se cargaron las muestras y los controles en los pozos del gel.

Se realiz la corrida electrofortica durante 45 min, aplicando un voltaje de

100 voltios.

Finalmente se visualizaron las bandas y separacin de fragmentos de ADN

iluminando el gel con una lmpara de luz ultravioleta.

3.5.4. DISEO ESTADSTICO:

Se us ANDEVA para determinar si la inhibicin del radical DPPH era diferente a
medida que se aumenta la concentracin del extracto; la prueba de Tukey para
comparar el efecto de las concentraciones y determinar la concentracin ms
eficiente; y la prueba de Dunnett para comparar el efecto de las concentraciones con
el efecto de un tratamiento estndar (control).

69

As mismo se utiliz ANDEVA para determinar si la produccin de xido ntrico de

los macrfagos tratados con el extracto era diferente a medida que se aumenta la
concentracin; la prueba de Tukey para comparar el efecto de las concentraciones y
determinar la concentracin ms eficiente; y la prueba de Dunnett para comparar el
efecto de las concentraciones con el efecto de un tratamiento estndar (control).

Se emple ANDEVA para determinar si la viabilidad de los macrfagos tratados con

el extracto era similar a medida que se aumenta la concentracin; tambin se utiliz
ANDEVA para determinar si la viabilidad de los macrfagos tratados con perxido
de hidrgeno era diferente a medida que se aumenta la concentracin; la prueba de
Dunnett para comparar el efecto de las concentraciones con el efecto de un
tratamiento estndar (control).

El efecto protector de las concentraciones de extracto sobre la fragmentacin del

ADN en macrfagos sometidos a estrs oxidativo, fue analizado cualitativamente.

Se trabaj con un nivel de significancia de 0.05, utilizndose el paquete estadstico

SPSS versin 20.0

Modelo estadstico asociado al diseo:

Dnde:
Yij= Variable respuesta en la j-sima repeticin del i-simo tratamiento
= Media general
Ti= Efecto del tratamiento i -esimo tratamiento.
i = Error aleatorio

70

IV.
4.1.

RESULTADOS Y DISCUSIN:

Capacidad inhibitoria del radical DPPH a diferentes concentraciones del

extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica).

En la tabla 5 y figura 6 se muestran los promedios de 4 repeticiones (anexo 1) del

porcentaje de inhibicin del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) para 4
concentraciones del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica), donde la
concentracin de 600 g/ml alcanz el ms alto porcentaje de inhibicin con un
71.03%, la concentracin de 400 g/ml alcanz un 64.11%, la concentracin de 200
g/ml alcanz un 54.33% y la concentracin de 100 g/ml alcanz un 44.59%, el
control utilizado fue el reactivo DPPH en condiciones normales, sin porcentaje de
inhibicin.

Tabla 5. Inhibicin del radical DPPH a diferentes concentraciones del extracto

metanlico de ortiga (Urtica dioica).
Concentracin de extracto

metanlico de ortiga
(Urtica dioica) (g/ml)
% de Inhibicin
71.03
600
64.11
400
54.33
200
44.59
100
0
Control (DPPH en
condiciones normales)
Dnde: IC50 = Concentracin media inhibitoria.

IC50 (g/ml)

157.88

As mismo, se presenta el valor de IC50, con un valor de 157.88 g/ml.

71

Inhibicin del radical DPPH (%)

80

71.03

70

64.11

60

54.33
44.59

50
40
30
20

IC50=157.88

10
0
0

100

200

300

400

500

600

700

Concentracin del extracto metanlico de ortiga (g/ml)

Figura 6. Porcentaje de inhibicin del radical DPPH a diferentes concentraciones del
extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) y concentracin media inhibitoria (IC50).
El grado de variacin de los porcentajes de inhibicin de las diferentes concentraciones
del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica), mostraron diferencias altamente
significativas (F= 105.186; gl=3; p0.05), en la prueba de Tukey al 95% todas las
concentraciones mostraron diferencias significativas entre si, siendo 600 g/ml la
concentracin ms eficiente al inhibir al radical DPPH en un 71.03 %, y en la prueba
Dunnett se encontr que todas las concentraciones mostraron diferencias altamente
significativas, respecto al control (anexo 2).
Estos resultados a diferencia de otras investigaciones donde evaluaron la capacidad
antioxidante del extracto metanlico de Urtica dioica, reportados por Kataki et al.
(2012) en la India, encontraron valores de 57.54 y 98.35% para las concentraciones de
100 y 250 g/ml, con un IC50 de 105.16 g/ml. Nikolova y Dzhurmanski (2009) en
Bulgaria, encontraron un IC50 de 175 g/ml utilizando concentraciones de 10 a 300
g/ml, Otles y Yalcin (2012) en Turqua, obtuvieron un IC50 de 1.45 mg/ml, el elevado
valor de IC50 de estos resultados podra deberse al solvente utilizado en las
investigaciones y a los componentes naturales de la planta.
Ya que, estudios con extractos hidroalcohlicos (agua y etanol) de Urtica dioica
realizados por Khare et al. (2012) en la India, concluyen que el extracto hidroalcohlico
72

en la India, presentaron valores de 33, 54, 60, 61 y 63% para las concentraciones de 50,
100, 150, 200 y 250 g/ml respectivamente y un valor de IC50 de 88.33 g/ml; as
mismo Gder y Korkmaz (2012) en Turqua, presentaron un valor de 76.4% de
inhibicin para una concentracin de 100 g/ml del extracto hidroalcohlico de Urtica
dioica; adems, Kukric et al. (2012) en la Repblica de Srpska en Europa, evaluaron la
capacidad antioxidante del extracto etanlico de Urtica dioica en concentraciones de 20
a 80 g/ml, presentando un valor de IC50 de 31.38 g/ml, siendo uno de los valores de
IC50 ms bajos reportados, aduciendo la diferencia a que los extractos hidroalcohlicos
podran tener significativamente mayor capacidad antioxidante que algunos extractos en
metanol debido a la polaridad que presentan.
Sin embargo, Glcin et al. (2004) en Turqua, evaluaron la capacidad antioxidante del
extracto acuoso de Urtica dioica encontrando valores de 76, 66 y 98% de inhibicin
para concentraciones de 50, 100 y 250 g/ml, las diferencias de estos resultados con los
obtenidos en esta investigacin podra deberse a la polaridad del solvente utilizado, ya
que Tovar del Rio (2013) y Kang et al. (2003), mostraron que hay una fuerte
correlacin entre la polaridad de los extractos y su capacidad antioxidante, siendo los
extractos ms polares aquellos con un mayor potencial para capturar radicales libres. En
base a lo mencionado Caldern (2011), encontr que el extracto metanlico de Urtica
dioica alcanz un porcentaje de inhibicin de 20.56% a diferencia del extracto de
hexano, el cual alcanz un valor de16.86%, lo que indica que los mayores porcentajes
de capacidad antioxidante se presentaron con los extractos metanlicos, concluyendo
que los porcentajes ms altos de capacidad antioxidante estn en los extractos ms
polares.
Por otro lado, Otles y Yalcin (2012), analizaron la capacidad antioxidante de Urtica
dioica en tres regiones costeras de Turqua (Mediterrneo, Egeo, Mar negro y Marmara)
y encontraron que la capacidad antioxidante era diferente segn la procedencia de la
planta, es as que en Marmara y Mediterrneo alcanz la mayor capacidad antioxidante,
lo que podra deberse a que Urtica dioica tiene un mejor crecimiento en lugares con
riqueza de nutrientes, iluminados con clima clido y suave; esto demuestra que la
procedencia de la planta influira en los resultados obtenidos.
La capacidad antioxidante esta atribuida principalmente a la presencia de principios
antioxidantes en la ortiga (Urtica dioica) como fenoles (208.37 mg GAE/g de peso
73

seco), flavonoides (20.29 mg QE/ g de peso seco) y flavonoles (22.83 mg QE/g de peso
seco) (Kukric et al., 2012); as mismo, Kais et al. (2012), indica que la actividad
antioxidante significativa del extracto metanlico de Urtica dioica puede ser debido a
fenoles y compuestos fenlicos, los compuestos fenlicos tienen propiedades
antioxidantes debido a su capacidad de inhibicin de los radicales libres y especies
reactivas de oxgeno, tales como oxgeno singlete, radicales libres y radicales hidroxilo
(Gder y Korkmaz, 2012), siendo corroborado por Nikolova y Dzhurmanski (2009),
quienes identificaron que esta capacidad antioxidante se debe a los compuestos
fenlicos que presenta en su composicin como Kanferol 3-glucsido, kanferol 3rutinsido y quercetina 3-galactsido, la posicin del grupo hidroxil de estos
flavonoides son importantes para la capacidad antioxidantes (Gder y Korkmaz, 2012).
A lo mencionado contribuyen Akbay et al. (2003), quienes encontraron componentes
fenlicos del extracto metanlico de Urtica dioica, flavonoides especialmente los
hetersidos flavnicos (rutinsido de la quercetina, rutinsido del kanferol y glucsido
de la isorhamnetina), los cuales actan como agentes donadores de hidrogeniones
convirtiendo al radical libre DPPH en un compuesto estable y con menor absorbancia,
no descartando la presencia de otros antioxidantes como cido ferlico (Khare et al.,
2012), compuesto que fue aislado en la Urtica dioca por Otles y Yalcin (2012), adems
de otros componentes como cido sirngico, miricetina, quercetina, kanferol, cido
vanlico, rutina, cido elgico, isorhamnetina, cido p-cumrico, naringina, cido
cafico y clorognico. Estos dos ltimos tambin encontrados por Pinelli et al. (2008).
Por otro lado se encontraron otros compuestos como alcaloides, taninos y terpenoides
en Urtica dioica (Kais et al., 2012).
Considerando los resultados sobre la capacidad antioxidante mostrado por el extracto
metanlico de ortiga (Urtica dioica) observados a travs del mtodo de inhibicin del
radical libre DPPH, se acepta la hiptesis planteada en el estudio, ya que el extracto
metanlico de ortiga (Urtica dioica) mostr que a mayor concentracin aumenta el
porcentaje de capacidad antioxidante.

74

4.2.

Efecto del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) a diferentes

concentraciones, sobre la produccin de xido ntrico en macrfagos
murinos activados.

En la tabla 6 y figura 7, se muestran los promedios de las cuatro repeticiones (anexo 4),
de la produccin de xido ntrico (M) y porcentaje de inhibicin de xido ntrico para
las concentraciones del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica), la
concentracin de 600 g/ml alcanz un porcentaje de inhibicin del xido ntrico de
35.69% (10.02 M de xido ntrico), para 400 g/ml obtuvo 8.15% de inhibicin (14.31
M) y para las concentraciones de 200 y 100 g/ml no se obtuvieron porcentajes de
inhibicin, ya que aumentaron la produccin de xido ntrico (18.65 y 18.94 M
respectivamente), en contraste al control (15.58 M de xido ntrico).
Tabla 6. Produccin y porcentaje de inhibicin de xido ntrico en macrfagos murinos
activados, tratados con cuatro concentraciones de extracto metanlico de ortiga
(Urtica dioica) y control (macrfagos murinos activados sin tratamiento).

Concentracin de extracto
metanlico de ortiga (Urtica
Inhibicin de xido
Produccin de
dioica) (g/ml)
ntrico (%)
xido ntrico (M)
15.58
Control (macrfagos activados)
10.02
35.69
600*
14.31
8.15
400
18.65
0**
200
18.94
0**
100
* Diferencia significativa respecto al control (p0.05).
** Porcentaje con valor negativo, el tratamiento no muestra inhibicin.

75

25
18.65

Produccin de nitrito (M)

20
15.58

18.94

14.31

15
10.02
10

5
0
Control
Macrfagos
activados

600*
400
200
100
Concentraciones de extracto metanlico de
ortiga (g/ml)

Figura 7. Produccin de nitrito en macrfagos activados, tratados con cuatro

concentraciones de extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica). * Diferencia
significativa respecto al control (p0.05).
El anlisis de varianza de las cuatro concentraciones del extracto metanlico de ortiga
(Urtica dioica), mostr diferencia significativa (F= 35.186, gl=3, p0.05), siendo la
mejor concentracin la de 600 g/ml al ser evaluado en la prueba de Tukey 95%, y en la
prueba Dunnet mostr diferencia altamente significativa respecto al control. La
concentracin de 400 g/ml disminuy la produccin de xido ntrico; sin embargo en
la prueba de Dunnet no mostr diferencia significativa respecto al control. Con las
concentraciones de 200 y 100 g/ml, se observ un aument en la produccin de xido
ntrico no mostrando diferencia significativa respecto al control (anexo 5).
A diferencia de los resultados obtenidos, Harput et al. (2005) en Turqua, encontraron
que el extracto acuoso de Urtica dioica inhibe la produccin de xido ntrico en forma
de dosis dependiente, en macrfagos peritoneales murinos estimulados por polisacrido,
en concentraciones de 5, 25, 50, 125, 250 y 500 g/ml con valores de 20.74, 14.81,
3.70, 2.59, 4.07 y 3.33 g/ml de xido ntrico respectivamente, con porcentajes de
inhibicin de 0, 6.97, 76.76, 83.73, 74.43 y 79.08% al ser comparados con su control de
15.92 g/ml, mostrando altos valores de inhibicin de la produccin del xido ntrico,
que podra ser debido a la mayor capacidad antioxidante reportada en extractos acuosos
76

de Urtica dioica en este pas (Gulcin et al., 2004), ya que los autores mencionan que el
efecto inhibitorio, puede ser resultado de la presencia de altos contenidos de
componentes fenlicos como flavonoides y feniletanoides, as mismo en sus resultados
se observa que para concentraciones menores (5 y 25 g/ml) hay un aumento en la
produccin del xido ntrico al ser comparados con su control, esto podra estar
relacionado a que el extracto acuoso de Urtica dioica estimul la proliferacin celular.
Tambin Akbay et al. (2003) en Turqua, mencionaron que el efecto inhibitorio del
extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) sobre la produccin del xido ntrico
podra deberse a la presencia de un contenido alto de compuestos fenlicos como
flavonoides (quercetina-3-O-rutinosido, kanferol-3-O-rutinosido y isorhamnetina-3-Oglucosido), los cuales mostraron actividad inmunomoduladora.
Mediante un mtodo diferente, Kataki et al. 2012, evaluaron qumicamente el efecto
inhibitorio del xido ntrico del extracto metanlico de Urtica dioica y encontraron un
porcentaje de inhibicin de 63.76% para la concentracin de 250 g/ml y un valor de
IC50 de 176.39 g/ml; la diferencia con lo presentado en el presente estudio, se debera a
que utilizaron el compuesto qumico nitroprusiato de sodio para la obtencin de xido
ntrico, y no utiliz macrfagos activados, demostrando su efecto inhibitorio
directamente sobre el xido ntrico como radical libre.
El efecto de la ortiga (Urtica dioica) en la inhibicin de la produccin de xido
ntrico de macrfagos activados, se evidencia en el estudio de Riehemann et al. (1999),
donde indicaron que Urtica dioica es un potente inhibidor de la activacin de NFB
(factor nuclear), inhibiendo la expresin del gen IkB el cual activa a NFB, ya que este
factor nuclear controla la expresin de numerosos genes de productos proinflamatorios
como la enzima NOSi (xido ntrico sintasa inducible), esta inhibicin de NFB podra
ser debido a las propiedades antioxidantes de Urtica dioica, como ciertos flavonoides,
cidos fenlicos como quercetina y curcumina que presumiblemente inhiben la
activacin de NFkB por mecanismos antioxidantes, al igual que Garca (2006), en el
extracto acuoso de

Mangifera sp, y Bak et al. (2013) en procianidinas de Vitis

amurensis, quienes mencionan que antioxidantes como las procianidinas tienen un rol
en la supresin de la expresin de NOSi y COX-2 (ciclooxigenasa 2), que son enzimas
responsables en la formacin de xido ntrico, prostaglandina y citoquinas inflamatorias
como en TNF- y la IL-1, este efecto puede ser a travs de la inhibicin del NFB bajo
77

la va de sealizacin de p38, MAPK y Akt, lo que sustenta su uso como agente

antinflamatorio natural.
Investigaciones como las de Yang et al. (2009), evaluaron el efecto inhibitorio de la
produccin de xido ntrico del extracto etanlico de 260 plantas de la regin de Corea,
de las cuales 122 extractos mostraron efecto inhibitorio de la produccin de xido
ntrico, mayor a 25% a una concentracin de 100 ug/ml, demostrando que muchos de
los componentes naturales de las plantas medicinales han sido demostrados como
inhibidores de la expresin de la enzima NOSi en macrfagos activados y sus
estructuras pueden ser categorizadas como sesquiterpenos, flavonoides, poliacetilalenos
y lignanos. Adems Ryu et al. (2003), mencionan que algunos componentes de las
plantas medicinales han sido conocidos como inhibidoras de la expresin de la enzima
NOSi en macrfagos activados por lipopolisacrido. Sus estructuras pueden ser
categorizadas como sesquiterpenos, flavonoides, poliacetilenos y lignanos. Tambin
Harput et al. (2002), en un estudio en la especie vegetal Veronica sp., concluyen que el
efecto supresor de la planta sobre el xido ntrico es en parte debido a su actividad
inhibitoria de xido ntrico producido por macrfagos activados, y ste efecto
inhibitorio puede ser resultado de la presencia de altos contenidos de componentes
fenlicos como flavonoides y feniletanoides; sin embargo, el mismo autor en el 2005
mencionan que los antioxidantes presentes en el extracto acuoso de Urtica dioica, no
altera la expresin de la protena enzimatica NOSi evaluado mediante western blot.
Las plantas que muestran actividad inhibitoria sobre la produccin del xido ntrico,
pueden ser candidatas para aislar componentes activos sobre la actividad inhibitoria de
la enzima NOSi, la cual podra tener un potencial en el tratamiento de la endotoxmia e
inflamacin acompaada con sobreproduccin de xido ntrico.
Algunos de los compuestos antioxidantes presentes tambin en ortiga (Urtica dioica)
fueron evaluados en la inhibicin de xido ntrico, como Wang y Mazza (2002) en
Canad, quienes analizaron los compuestos fenlicos como flavonoles, isoflavonoles y
antocianinas previamente purificados, como inhibidores de la produccin de xido
ntrico en macrfagos activados, encontrando que en el rango de 16 - 500 M inhibieron
la produccin de xido ntrico mayor al 50%; Dupuy et al. (2011) en Panam, sealaron
que el efecto inhibitorio de la produccin de xido ntrico por compuestos naturales
como lupeol (30 g/ml), casearina G (2.5 g/ml), antocianina (7.5 g/ml),
78

columbianatina (7.5 g/ml) ms que inhibitorios, sugieren un efecto modulador, ya que

al elevar sus concentraciones, la produccin de xido ntrico disminuye y a
concentraciones intermedias no se ve afectada; esto tendra relacin con lo encontrado
en el presente estudio con las concentraciones de 100 y 200 g/ml de extracto
metanlico de Urtica dioica, las cuales no inhibieron la produccin de xido ntrico, por
el contrario se observ un aumento. Al respecto estudios de Alzamora (2007) y Tamez
(2001), realizaron sus evaluaciones en macrfagos peritoneales no activados, mostrando
induccin de la produccin de xido ntrico al ser tratados con maca (Lepidium
peruvianum) y llantn (Plantago major) respectivamente, lo cual se debe a efectos
inmunoestimulantes de varios polisacridos, alcaloides entre otros compuestos naturales
que poseen. Debido a esto no descartamos la presencia de estos compuestos en ortiga
(Urtica dioica).
Todo lo mencionado anteriormente sugiere que el efecto represivo del extracto de
ortiga (Urtica dioica) sobre la produccin xido ntrico es, en parte, debido a su
actividad de inhibitoria de xido ntrico por el efecto de sus compuestos antioxidantes
naturales sobre la produccin de xido ntrico lo cual parece reflejar su potencial
antiinflamatorio. Y que al aumentar la concentracin del extracto metanlico de ortiga
(Urtica dioica) la produccin de xido ntrico disminuye proporcionalmente, lo que se
hace ms evidente a la concentracin de 600 g/ml inhibiendo en un 35.69% (10.02
M) con respecto al control (15.58 M), aceptando la hiptesis planteada.

79

4.3.

Efecto del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) a diferentes

concentraciones, sobre la viabilidad celular en macrfagos murinos.

En la tabla 7 y figura 8 se muestran los promedios de cuatro repeticiones (anexo 6) del

porcentaje de viabilidad de los macrfagos peritoneales murinos para cuatro
concentraciones del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica), donde para la
concentracin de 600 g/ml se alcanz un porcentaje de viabilidad celular de 99.42%,
la concentracin de 400 g/ml alcanz un 98.49%, la concentracin de 200 g/ml
alcanz un 97.11% y la concentracin de 100 g/ml alcanz un 87.25%, los controles
inducidos de perxido de hidrgeno a las concentraciones de 10, 5 y 0.5 mM
presentaron porcentajes de viabilidad de 54.02, 74.56 y 98.48%, en contraste con el
control (macrfagos) el cual tuvo un valor de 100% de viabilidad celular.

Tabla 7. Promedio porcentual de viabilidad celular de macrfagos no activados tratados

con cuatro concentraciones de extracto metanlicos de ortiga (Urtica dioica),
controles inducidos con tres concentraciones de perxido de hidrgeno y control
(macrfagos en condiciones normales).
Concentracin de extracto
metanlico de ortiga (Urtica
dioica) (g/ml)
Control
600
400
200
100
H2O2 10 mM
H2O2 5 mM
H2O2 0.5 mM

Viabilidad celular (%)

100
99.42
98.49
97.11
87.25
54.02
74.56
98.48

80

120
100
Viabilidad celular (%)

100

99.42

98.49

97.11

98.48
87.25

80
60

74.56
54.02

40
20
0
Control 600
400
200
100
positivo
Concentraciones
de
extracto
Macrfagos
metanlico de ortiga
en condiciones
(g/ml)
normales)

10
5
0.5
Controles inducidos
(mM de Perxido de
hidrgeno)

Figura 8. Viabilidad celular de macrfagos tratados con cuatro concentraciones de

extracto metanlicos de ortiga (Urtica dioica), control y controles inducidos con
perxido de hidrgeno.
En la figura 8 se puede apreciar que para las concentraciones de 600, 400, 200 y 100
g/ml del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica), los porcentajes de viabilidad
celular de macrfagos fueron 99.42, 98.49, 97.11 y 87.25% respectivamente, que al ser
comparados con el control (100% de viabilidad celular) no alteran significativamente la
viabilidad de los macrfagos (F= 0.531; gl=3; p0.05), segn la prueba de Dunnet al
95%. Adems, en los controles inducidos con perxido de hidrgeno en tres
concentraciones, la concentraciones de 10 y 5 mM muestran diferencias significativas
respecto al control; la concentracin de 0.5 mM no mostr diferencia significativa
respecto al control, al ser evaluados en la prueba de Dunnet al 95% (anexo 7).
Los resultados obtenidos se asemejan al estudio de Harput et al. (2005), quienes
encontraron que el extracto acuoso de Urtica dioica a las concentraciones de 50 a 500
g/ml, no afectaron la viabilidad de macrfagos murinos. Adems estudios en otros
extractos de plantas mostraron altos porcentajes de viabilidad celular en macrfagos
murinos, como es el caso de Garca (2006), quien evalu la viabilidad de macrfagos
peritoneales murinos expuestos al extracto acuoso de Mangifera indica y Mangifera
mangiferina, a concentraciones inferiores a 800 g/ml y 900 g/ml respectivamente no
81

resultaron citotxicas, mantenindose la viabilidad celular por encima del 95%; al igual
que Castro et al. (2013), quien encontr que los macrfagos murinos mostraron una
viabilidad del 100%, cuando fueron expuestos al efecto del extracto de Merremia
umbellata a una concentracin de 100 g/ml; y tambin lo obtenido por Lin et al.
(2013) en seis extractos acuosos de plantas de Taiwan (Bidens alba, Lycium chinense,
Mentha arvensis, Plantago asiatica, Houttuynia cordata, y Centella asitica) las que no
resultaron citotxicos a las concentraciones de 25, 50 y 100 g/ml, manteniendo valores
de viabilidad celular mayores a 98%.
Por otro lado, algunos extractos naturales podran provocar una disminucin de la
viabilidad en macrfagos murinos, como lo reportaron Ryu et al. (2003), quienes
encontraron que para los extractos metanlicos de 6 especies de plantas (Artemisia
iwayomogi, Machilus thunbergii, Morus bombycis, Populus davidiana Pruns
maximowiczii, Rhus verniciflua) la viabilidad de macrfagos murinos fueron de
alrededor del 85% para concentraciones de 80 g/ml de sus extractos metanlicos; al
igual que Napolitano et al. (2005), quienes evaluaron el efecto citotxico de los
extractos etanlicos de hojas de Casearia sylvestris, Cupania vernalis y Serjania
lethalis sobre macrfagos murinos, estos alcanzaron un porcentaje de viabilidad del 50
% a las concentraciones de 113.6 g/ml, 117.2 g/ml y 149.8 g/ml respectivamente;
Velsquez y Posada (2013) obtuvieron una viabilidad celular 70% con respecto a su
control positivo con una concentracin de 2.5 g/ml del extracto en hexano, acetato
etilo, cloroformo de corteza interna de Tabebuia chrysantha, y extracto en butanol que
presenta una mayor viabilidad (89%) a una concentracin menor o igual a 1.1 g/ml.
El efecto citotxico de algunos extractos puede ser explicado por Yang et al. (2009)
quienes mencionan que el nmero de macrfagos activados viables en su investigacin
no fueron alterados significativamente al exponerse a 122 extractos de plantas en
concentraciones de 100 g/ml durante 24 horas, alcanzando porcentajes de viabilidad de
85.84 a 125.84%, sin embargo Sorbus alnifolia, Cudrania tricupidata, Carpinus
turczaninowii, Zanthoxylum ailanthoides e Idesia polycarpa, mostraron moderado
efecto citotxico con porcentajes de viabilidad de 78.44 a 80.63%, poniendo en
conocimiento que algunas plantas pueden producir citotoxicidad en mayores
concentraciones, lo cual estara relacionado a los componentes de la planta, al respecto,
Jakhar (2013), evalu la citotoxicidad de la diferentes concentraciones de PMF
82

(Pentametoxiflavona), un derivado de querecetina de Kaempheria parviflora en

macrfagos, usando el ensayo MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5difeniltetrazol), en donde la viabilidad celular fue alrededor de 96% en todos los casos;
sin embargo difiere de Wang y Mazza (2002) quienes evaluaron el efecto de
compuestos fenlicos (Flavonoles y isoflavonoles) y antocianinas, dentro de los cuales
mostraron efecto citotxico significativo para kanferol en concentraciones de 63 a 500
M, sin efecto citotxico significativo para Quercetina (125 M) y Miricetina (250 M)
con porcentajes mayores a 100%, as mismo Isoflavonas como daidezina, genestina,
daidzina y genistina, obtuvieron citotoxicidad en concentraciones de 250 a 500 M, con
porcentajes de viabilidad de 5 a 53%, esto podra revelar que algunos extractos de
plantas a mayores concentraciones pueden producir citotoxicidad ya que algunos de sus
componentes antioxidantes a mayores concentraciones inducen citotoxicidad.
El efecto citotxico de algunos componentes antioxidantes, puede ser explicado por
Granado (2010), quien en relacin al efecto de los polifenoles sobre los procesos de
proliferacin/supervivencia y muerte celular, menciona que ste puede variar en funcin
de la dosis utilizada. As, las bajas concentraciones de quercetina, polifenoles del t
verde (Camellia sinensis) y EGCG (epigaliocatequina) pueden promover mecanismos
de supervivencia mediante la activacin de la va de las protenas quinasas activadas por
mitgenos (MAPKs ERKs, JNKs) o el incremento de los niveles de p-AKT. Por el
contrario, las altas concentraciones de los polifenoles, como la quercetina, pueden
ejercer un efecto pro-apopttico mediante la activacin de la cascada de caspasas y la
reduccin de los niveles fosforilados de AKT y ERKs.
Los resultados obtenidos en esta investigacin evidencian que la viabilidad celular de
macrfagos peritoneales murinos, no es alterada significativamente en presencia de
concentraciones de 100 a 600 g/ml de extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica),
por lo tanto se rechaza la hiptesis planteada, ya que el extracto a mayores
concentraciones no disminuy la viabilidad de macrfagos murinos.

83

4.4.

Efecto del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) a diferentes

concentraciones, sobre la fragmentacin del ADN de macrfagos murinos
sometidos a estrs oxidativo.

En la figura 9 se muestra el efecto del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica)

sobre la fragmentacin del ADN, se utiliz cultivos de macrfagos peritoneales murinos
sometidos a estrs oxidativo con perxido de hidrgeno al 10 mM, en los cuales se
aadieron 2 concentraciones (600 y 100 g/ml) del extracto metanlico de ortiga
(Urtica dioica), en 2 sistemas diferentes (Bellido, 2008; Cceres, 2004). Pasado el
tiempo de incubacin se extrajo el ADN de los macrfagos, y se utiliz electroforesis
para observar la fragmentacin del ADN producida por las concentraciones y controles.
Los resultados se evaluaron en forma cualitativa.

C1

CI

C2

CI

S1
S1
S2 S2
CN (600) (100) (600) (100) CI

Figura 9. Efecto protector del extracto metanlico ortiga (Urtica dioica) sobre la
fragmentacin del ADN de macrfagos peritoneales murinos en gel de agarosa al 2%.
Control 1 (C1): Macrfagos en condiciones normales incubados en medio.
Control inducido (CI), Macrfagos incubados en medio con perxido de hidrgeno al
10 mM.
Control 2 (C2): Macrfagos incubados en medio con dimetil sulfxido al 1% (DMSO).
Blanco (B): Medio de cultivo sin clulas.

84

Control negativo (CN): Macrfagos incubados en medio con extracto metanlico de

ortiga (Urtica dioica) (600 g/ml).
Sistema 1 (S1): Preventivo. Se incubaron macrfagos murinos por una hora con las
concentraciones de extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica), luego se lavaron
dos veces con suero fisiolgico y se incubaron por 12 horas con perxido de hidrgeno
al 10 mM.
S1 (600): Concentracin de 600 g/ml para el sistema 1.
S1 (100): Concentracin de 100 g/ml para el sistema 1.
Sistema 2 (S2): Protectora. Se incubaron macrfagos murinos con las concentraciones
de extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) y perxido de hidrgeno al 10 mM
todas al mismo tiempo por 12 horas.
S2 (600): Concentracin de 600 g/ml para el sistema 2.
S2 (100): Concentracin de 100 g/ml para el sistema 2.
En la figura 9 se muestra el anlisis electrofortico con gel de agarosa al 2%. Se puede
observar que el control 1 (C1) no produce bandas de fragmentacin de ADN. Sin
embargo en los controles inducidos con perxido de hidrgeno al 10 mM (CI) se
observan produccin de bandas de fragmentacin de ADN. Adems se evalu como
control la actividad del Dimetil Sulfxido al 1% sobre los macrfagos murinos (C2) con
el cual no se observ bandas de fragmentacin de ADN. As mismo se evalu el efecto
del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) a 600 g/ml en macrfagos sin
estrs oxidativo (CN), con el cual no se observan bandas de fragmentacin de ADN.
Sistema 1:
Se puede observar que no hay presencia de bandas de fragmentacin del ADN, para las
concentraciones de 600 y 100 g/ml de extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica)
(S1 (600) y S1 (100) respectivamente), utilizadas con el sistema 1.
Sistema 2:
Se puede observar que no hay presencia de bandas de fragmentacin del ADN, para las
concentraciones de 600 y 100 g/ml de extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica)
(S2 (600) Y S2 (100) respectivamente), utilizadas con el sistema 2.
85

El sistema denominado control Inducido (CI) en el cual los macrfagos estuvieron

expuestos a estrs oxidativo, se muestra el efecto del perxido de hidrgeno 10 mM que
estara ejerciendo sobre la fragmentacin del ADN, evidencindose un barrido
electrofortico con fragmentos de ADN. Al respecto cabe sealar que el perxido de
hidrgeno se constituye en un agente toxico a nivel celular cuando se encuentra en
concentraciones superiores a 3mM (Halliwel, 2000; Cooke et al. 2003), por tanto la
concentracin usada en el presente estudio resulta ser el adecuado para que actu como
un agente oxidante con capacidad de generar estrs oxidativo
En el sistema 1 donde los macrfagos fueron preincubados con extracto metanlico de
ortiga (Urtica dioica) y luego incubados 12 horas con perxido de hidrgeno, se
observa la ausencia de bandas de fragmentacin evidenciando su accin como agente
preventivo sobre la fragmentacin del ADN. Y en el sistema 2 donde los macrfagos
fueron incubados 12 horas con extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) y
perxido de hidrgeno al mismo tiempo, tambin se ve ausencia de bandas de
fragmentacin, evidenciando el efecto protector durante la induccin de estrs
oxidativo.
Para evaluar la accin protectora de la ortiga (Urtica dioica) sobre la fragmentacin
del ADN, se consider un control (C1) al cultivo de macrfagos incubados solamente
con medio DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10 %, dado que este es un
medio que rene las condiciones necesarias (pH, nutrientes) para mantener la viabilidad
celular y evitar la fragmentacin del ADN, por tanto fue considerado un patrn
referencial para evaluar el efecto protector del extracto metanlico de ortiga (Urtica
dioica). As mismo se utilizaron macrfagos no inducidos incubados con dimetil
sulfxido al 1 % (C2) y 600 g/ml de extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica)
(CN) para descartar el efecto de estos como inductores de fragmentacin del ADN.
Al comparar los resultados obtenidos con el extracto acuoso de Carryocactus
brevistylus sancayo (3, 3.5, 4 y 4.5% equivalente a 30, 35, 40 y 45 mg/ml) que tienen
un efecto preventivo y protector sobre la fragmentacin del ADN inducido por perxido
de hidrgeno, atribuyendo esta actividad a los antioxidantes que presenta este fruto; y el
extracto acuoso de Passiflora mollissima tumbo a la concentracin de 100% (1 g/ml)
que tambin tiene un efecto favorable frente a la fragmentacin de ADN ocasionado por
perxido de hidrgeno al 10 mM; se observa que ambos autores llegaron a utilizar
86

concentraciones mucho mayores, lo que sugiere que los resultados del presente estudio
son mejores debido a la diferencia de concentraciones.
En relacin al efecto de los antioxidantes Capiro et al. (2001), evidenciaron que la
decoccin de las hojas de caa santa tiene un efecto protector frente al dao provocado
por el agente oxidante perxido de hidrgeno a nivel del ADN, evitando la progresin
de la fragmentacin del ADN; la presencia de catequinas y componentes derivados de
las procianidinas en el cacao convierte en un poderoso barredor de especies reactivas de
oxgeno y nitrgeno, por lo que Gutirrez (2002), concluye que el chocolate posee una
excelente capacidad de controlar los daos oxidativos evitando la fragmentacin del
ADN; Zhu et al. (2002) concluyeron que el t verde provee proteccin contra el dao
oxidativo del ADN ocasionado despus de los 30 min por FeCl2/perxido de hidrgeno;
Wang (2003), concluye que el Lotus plumule, planta acutica de Taiwan que contiene
varios alcaloides, betacarotenos, tiene un fuerte efecto protector del ADN sometido al
agente oxidante perxido de hidrgeno hasta 6 horas. Estas investigaciones sostienen
que los antioxidantes son capaces de minimizar los efectos letales que puedan ocasionar
agentes oxidantes.
Otros investigadores como Lin et al. (2013), estudiaron la proteccin de 6 plantas
nativas de Taiwan frente al dao al ADN inducido por perxido de hidrgeno, en la cual
Mentha arvensis y Houttuynia cordata mostraron inhibicin de la fragmentacin de
ADN, indicando que se debera a los compuestos antioxidantes como flavonoides como
quercetina y morina, ya que estos previenen el dao oxidativo del ADN; As tambin Li
et al. (2013), concluyeron que Citrirticulatae pericarpium presenta efecto protector del
dao al ADN inducido por perxido de hidrgeno, debindose esta actividad a la
actividad antioxidante del total de flavonoides encontrados especialmente hesperidina y
narirutina; y Lai et al. (2012), indicaron que el principal componente de Cajanus cajan
Gandul (cianidina-3-monoglucsido), una antocianina, previene el dao en el ADN de
macrfagos tratados por 24h con perxido de hidrgeno (H2O2). Estos datos sustentan
que el efecto de los antioxidantes son capaces de minimizar los efectos nocivos del
perxido de hidrgeno sobre el ADN.
Tambin Darukhshan (2010), mostr la actividad preventiva al dao oxidativo del ADN
con tres extractos de plantas a saber C. icosandra, R. damascena y C. scariosus.
Snchez et al. (2005), en las condiciones experimentales de su investigacin, el extracto
87

de frutos enteros de granada Punica granatum fue capaz de secuestrar especies reactivas
del oxgeno producidas por el perxido de hidrgeno, mecanismo mediante el cual
ejerce su accin protectora del ADN frente a las lesiones causadas por este agente; y
Mengoa (2002), quien concluye que el extracto de taya o carqueja raz silvestre de los
andes en cuya composicin se ha encontrado presencia de flavonoides y sesquiterpenos
principalmente, ejerce un efecto protector a nivel celular frente al perxido de
hidrgeno.
As, podemos inferir que el efecto del extracto de ortiga (Urtica dioica) frente a la
fragmentacin del ADN estara siendo contrarrestado por la presencia de flavonoides
como quercetina y kanferol encontrados en la ortiga (Urtica dioica), en la
investigacin de Akbay (2003), Otles y Yalcin (2012), entre otros.
Lo mencionado en prrafos anteriores pone en evidencia que el extracto metanlico de
ortiga (Urtica dioica) est ejerciendo un efecto preventivo y protector a nivel del
ADN, sin embargo se necesitan ms pruebas, como el ensayo comet, cromatografa de
alta performancia, entre otras tcnicas ms sensibles y especficas que permitiran
identificar, aislar y describir el mecanismo de accin de los componentes antioxidantes
especficos que estaran ejerciendo su efecto sobre la fragmentacin del ADN inducida
por radicales como el perxido de hidrgeno.

88

V.

CONCLUSIONES:

El extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) posee capacidad antioxidante

y efecto citoprotector en la viabilidad de macrfagos murinos.

Las concentraciones de 600, 400, 200 y 100 g/ml del extracto metanlico de
ortiga (Urtica dioica), poseen capacidad antioxidante, al inhibir 71.03, 64.11,
54.33, 44.59 % al radical DPPH de manera proporcional a las concentraciones,
presentando un IC50 de 157.88 g/ml.

El extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) a la concentracin de 600

g/ml, presenta una disminucin de la produccin de xido ntrico en
macrfagos murinos activados con una concentracin de 10.02 M, respecto al
control (15.58 M).

El extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) a diferentes concentraciones

(600, 400, 200 y 100 g/ml) evidenci un efecto favorable sobre la viabilidad
celular en macrfagos murinos mostrando porcentajes mayores a 87 %.

El extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) a las concentraciones de 600

y 100 g/ml tienen efecto preventivo y protector sobre la fragmentacin del
ADN de macrfagos murinos sometidos a estrs oxidativo por perxido de
hidrgeno.

89

VI.

RECOMENDACIONES

Evaluar la capacidad antioxidante de diferentes partes (tallo, raz y flor) de la

planta de ortiga (Urtica dioica).

Se recomienda el uso del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) en

macrfagos no activados, para observar su posible efecto estimulador de la
produccin de xido ntrico.

Utilizar un marcador molecular para determinar los pesos moleculares de los

fragmentos de ADN.

Utilizar mayor tiempo de incubacin para los mtodos de viabilidad celular y

proteccin sobre fragmentacin del ADN en macrfagos murinos.

Aplicar los mtodos de este estudio en 5 o ms concentraciones mayores a 600

g/ml y menores a 100 g/ml del extracto metanlico de ortiga (Urtica
dioca), para conocer la tendencia real de los resultados.

Evaluar la expresin de la enzima NOSi en macrfagos peritoneales murinos

tratados con extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) para complementar
el resultado de inhibicin del xido ntrico.

90

VII.

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99

VIII. ANEXOS:

100

ANEXO 1. Promedio de las 4 repeticiones de las absorbancias y promedio porcentual de

inhibicin del radical DPPH de las 4 concentraciones del extracto metanlico de ortiga
(Urtica dioca).

CONCENTRACIONES
(g/ml)
600
400
200
100

CONCENTRACIONES
(g/ml)

600
400
200
100

1
0.213
0.260
0.329
0.396

Absorbancias
2
3
0.203
0.197
0.241
0.257
0.316
0.317
0.372
0.396

Porcentaje de inhibicin de DPPH

(Repeticiones)
1
69.26
62.48
52.53
42.86

2
70.71
65.22
54.40
46.32

3
71.57
62.91
54.25
42.86

4
72.58
64.10
56.13
46.32

4
0.190
0.206
0.304
0.372

PROMEDIO
(%)

71.03
64.10
54.33
44.59

Primera repeticin:
Concentracin
(g/ml)
600
400
200
100
DPPH

Abs.
muestra
0.286
0.329
0.354
0.412
0.693

Abs. blanco
muestra
0.073
0.069
0.025
0.016

Abs. final
0.213
0.260
0.329
0.396

% de
inhibicin
69.26
62.48
52.53
42.86

Segunda repeticin:
Concentracin
(g/ml)
600
400
200
100
DPPH

Abs.
muestra
0.261
0.298
0.336
0.39
0.693

Abs. blanco
muestra
0.058
0.057
0.02
0.018

Abs. final
0.203
0.241
0.316
0.372

% de
inhibicin
70.71
65.22
54.40
46.32

101

Tercera repeticin:
Concentracin
(g/ml)
600
400
200
100
DPPH

Abs.
muestra
0.27
0.326
0.342
0.412
0.693

Abs. blanco
muestra
0.073
0.069
0.025
0.016

Abs. final

Abs. blanco
muestra
0.058
0.057
0.02
0.018

Abs. Final

0.197
0.257
0.317
0.396

% de
inhibicin
71.57
62.91
54.25
42.86

Cuarta repeticin:
Concentracin
(g/ml)
600
400
200
100
DPPH

Abs.
muestra
0.248
0.263
0.324
0.390
0.798

0.190
0.206
0.304
0.372

% de
inhibicin
72.58
65.80
56.13
46.32

102

ANEXO 2. Anlisis estadstico para 4 concentraciones del extracto metanlico de ortiga

(Urtica dioica) y su capacidad inhibitoria del radical DPPH.

DESCRIPTIVOS:
Concentraciones
del extracto
metanlico
(g/ml)
600
400
200
100
Total

Media

Desviacin
tpica

4
4
4
4
16

0.2007
0.2410
0.3165
0.3840
0.2856

Error
tpico

0.00974
0.02478
0.01021
0.01386
0.07408

0.0487
0.01239
0.00511
0.00693
0.01852

Mnim
o

Mxim
o

0.19
0.21
0.30
0.37
0.19

0.21
0.26
0.33
0.40
0.40

ANOVA
Suma de

gl

cuadrados

Media

Sig.

cuadrtica

Inter-grupos

0.079

0.026

Intra-grupos

0.003

12

0.000

Total

0.082

15

105.187

6.977x10-09

PRUEBAS POST HOC

COMPARACIONES MLTIPLES
Variable dependiente: capacidad antioxidante
(I)
concentracin
HSD
de
Tukey

600

400

200

100

(J)
concentracin
400
200
100
600
200
100
600
400
100
600
400
200

Diferencia de
medias (I-J)
-0.04025*
-0.11575*
-0.18325*
0.04025*
-0.07550*
-0.14300*
0.11575*
0.07550*
-0.06750*
0.18325*
0.14300*
0.06750*

Error
tpico

Sig.

0.01121
0.01121
0.01121
0.01121
0.01121
0.01121
0.01121
0.01121
0.01121
0.01121
0.01121
0.01121

0.017
0.000
0.000
0.017
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
103

*. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.

SUBCONJUNTOS HOMOGNEOS
concentracin

600
400
200
100
Sig.

4
4
4
4

HSD de
Tukeya

Subconjunto para alfa = 0.05

1
2
3
4
0.2007
0.2410
0.3165
0.3840
1.000
1.000
1.000
1.000

Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogneos.

a. Usa el tamao muestral de la media armnica = 4.000.
PRUEBA DE DUNNETT:
COMPARACIONES MLTIPLES
Variable dependiente: capacidad antioxidante
t de Dunnett (<control)
(I) concentracin

(J) concentracin

600
400
200
100

Control
Control
Control
Control

Diferencia de
medias (I-J)
-0.51850*
-0.47825*
-0.40275*
-0.33525*

Error
tpico
0.01939
0.01939
0.01939
0.01939

Sig.

0.000
0.000
0.000
0.000

*. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.

a. Las pruebas t de Dunnett tratan un grupo como control y lo comparan con todos los
dems grupos.
Intervalo de confianza al 95%

104

Diagrama comparativo de promedios del porcentaje de inhibicin del radical DPPH de

las cuatro concentraciones del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) y
desviacin estndar.

105

ANEXO 3. Absorbancias de las 4 repeticiones de cada una de las 4 concentraciones

extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) y el control (macrfagos activados).
CONCENTRACIONES
(g/mL)

ABSORBANCIAS ( Repeticiones)
1
0.218
0.121
0.175
0.261
0.253

CONTROL
600
400
200
100

2
0.194
0.16
0.179
0.232
0.246

3
0.182
0.113
0.193
0.211
0.216

4
0.198
0.131
0.184
0.235
0.238

Curva estndar de Nitrito de Sodio, utilizada para interpolar la concentracin de nitritos

de cada muestra.
NITRITO DE SODIO
Absorbancia Concentracin en micromolar (M)
5
0.066
10
0.131
20
0.251
40
0.480

Concentracin (M)

Nitrito de Sodio
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0

0.1

0.2

0.3
0.4
Absorbancias

0.5

0.6

106

ANEXO 4. Concentracin de nitritos de cada una de las concentraciones de extracto

metanlico de ortiga (Urtica dioica) y control (macrfagos activados).

CONCENTRACIONES
(g/mL)

Control
600
400
200
100

REPETICIONES
CONCENTRACION DE
NITRITOS (M)
1
2
3
4
17.25
15.25 14.25
15.58
9.17
12.42
8.5
10.00
13.67
14
15.17
14.42
20.83
18.42 16.67
18.67
20.17
19.58 17.08
18.92

PROMEDIO
(%)

15.58
10.02
14.31
18.65
18.94

107

ANEXO 5. Anlisis estadstico para 4 concentraciones del extracto metanlico de ortiga

(Urtica dioica) y su capacidad inhibitoria de la produccin del xido ntrico, por cultivos
de macrfagos murinos activados.
DESCRIPTIVOS:
Concentraciones
del extracto
metanlico
(g/ml)
600
400
200
100
Total

Media

Desviacin
tpica

4
4
4
4
16

10.0225
14.3150
18.6475
18.9375
15.4806

1.71204
0.64738
1.70549
1.33946
3.97219

Error
tpico

Mnim
o

Mximo

8.50
13.67
16.67
17.08
8.50

12.42
15.17
20.83
20.17
20.83

0.85602
0.32369
0.85274
0.66973
0.99305

ANOVA:
Concentraciones del
extracto metanlico
(g/ml)
Inter-grupos
Intra-grupos
Total

Suma de
cuadrados

gl

Media
cuadrtica

Sig.

212.516
24.159
236.675

3
12
15

70.839
2.013

35.186

3.1691x 10-06

PRUEBAS POST HOC

COMPARACIONES MLTIPLES

HSD de
Tukey

(I)
Concentracione
s del extracto
metanlico
600

400

200

100

(J)
Concentraciones
del extracto
metanlico
400
200
100
600
200
100
600
400
100
600
400
200

Diferencia
de medias
(I-J)

Error
tpico

Sig.

-4.29250*
-8.62500*
-8.91500*
4.29250*
-4.33250*
-4.62250*
8.62500*
4.33250*
-0.29000
8.91500*
4.62250*
0.29000

1.00331
1.00331
1.00331
1.00331
1.00331
1.00331
1.00331
1.00331
1.00331
1.00331
1.00331
1.00331

0.005
0.000
0.000
0.005
0.005
0.003
0.000
0.005
0.991
0.000
0.003
0.991
108

*. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.

SUBCONJUNTOS HOMOGNEOS

HSD de
Tukeya

Concentracin del
extracto metanlico
(g/ml)
600
400
200
100
Sig.

Subconjunto para alfa = 0.05

1
2
3

4
4
4
4

10.0225
14.3150

1.000

1.000

18.6475
18.9375
0.991

Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogneos.

a. Usa el tamao muestral de la media armnica = 4.000.

PRUEBA DE DUNNETT:
Variable dependiente: xido ntrico
t de Dunnett (<control)
(I) Concentracin
del extracto
metanlico

(J) Concentracin
del extracto
metanlico

600

Control

Diferencia de
medias (I-J)

Error
tpico

Sig.

-5.56000*

0.98023

0.000

-1.26750
400
Control
3.06500
200
Control
3.35500
100
Control
*. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.

0.98023
0.98023
0.98023

0.270
1.000
1.000

a. Las pruebas t de Dunnett tratan un grupo como control y lo comparan con todos los
dems grupos.

109

ANEXO 6. Repeticiones de las absorbancias de las concentraciones de extracto

metanlico de ortiga (Urtica dioica), las concentraciones de perxido de hidrgeno y
el control, luego de ser evaluados en la prueba de MTT para medir la viabilidad celular
en macrfagos peritoneales murinos.

CONCENTRACIN
(g/mL)
600
400
200
100
H2O2 10mM
H2O2 5mM
H2O2 0.5mM
Control

1
1.09
1.2
1.17
1.045
0.606
0.835
1.1
1.18

ABSORBANCIAS
(REPETICIONES)
2
3
1.09
1.19
1
1.09
1.005
1.005
1.025
0.955
0.646
0.635
0.935
0.855
1.32
1.006
1.06
1.37

PROMEDIO
4
1.26
1.29
1.32
1.025
0.626
0.838
1.12
1.09

1.1575
1.145
1.125
1.0125
0.62825
0.86575
1.1365
1.175

Repeticiones de los porcentajes de viabilidad celular:

CONCENTRACIN
(g/mL)

600
400
200
100
H2O2 10mM
H2O2 5mM
H2O2 0.5mM
Control

PORCENTAJE DE VIABILIDAD
CELULAR (%)
Repeticiones
1
2
3
4
92.37
102.83
86.86
115.60
101.69
94.34
79.56
118.35
99.15
94.81
73.36
121.10
88.56
96.70
69.71
94.04
51.36
60.94
46.35
57.43
70.76
88.21
62.41
76.88
93.22
124.53
73.43
102.75
100
100
100
100

Promedio

99.42
98.49
97.11
87.25
54.02
74.56
98.48
100.00

110

ANEXO 7. Anlisis estadstico para 4 concentraciones del extracto metanlico de ortiga

(Urtica dioica) y su efecto sobre la viabilidad celular en macrfagos murinos.

DESCRIPTIVOS:
Concentraciones
del extracto
metanlico
(g/ml)
600
400
200
100
Total

Media

4
4
4
4
16

99.4150
98.4850
97.1050
87.2525
95.5644

Desviacin
tpica

12.66065
16.12686
19.57068
12.17613
14.68374

Error
tpico

Mnim
o

Mxim
o

86.86
79.56
73.36
69.71
69.71

115.60
118.35
121.10
96.70
121.10

6.33033
8.06343
9.78534
6.08806
3.67094

Intervalo de confianza para la media al 95%

ANOVA
Concentraciones del
extracto metanlico
(g/ml)
Inter-grupos
Intra-grupos
Total

Suma de
cuadrados
379.273
2854.912
3234.184

gl

Media
cuadrtica
3
12
15

126.424
237.909

Sig.

0.531

0.669

PRUEBAS POST HOC

Comparaciones mltiples
Variable dependiente: viabilidad celular
(I) concentracin
600

400

200

100

(J) concentracin
400
200
100
600
200
100
600
400
100
600
400
200

Diferencia de
medias (I-J)
.93000
2.31000
12.16250
-.93000
1.38000
11.23250
-2.31000
-1.38000
9.85250
-12.16250
-11.23250
-9.85250

Error
tpico
10.90663
10.90663
10.90663
10.90663
10.90663
10.90663
10.90663
10.90663
10.90663
10.90663
10.90663
10.90663

Sig.
1.000
0.996
0.688
1.000
0.999
0.736
0.996
0.999
0.803
0.688
0.736
0.803
111

Subconjuntos homogneos
Concentracin

100
200
400
600
Sig.

HSD de
Tukeya

4
4
4
4

Subconjunto
para alfa =
0.05
1
87.2525
97.1050
98.4850
99.4150
0.688

Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogneos.

a. Usa el tamao muestral de la media armnica = 4.000.
ANOVA con las concentraciones de perxido de hidrgeno:

DESCRIPTIVOS
Concentracin
(mM)
CP1
CP2
CP3
Total

Media

4
4
4
12

54.0200
74.5650
98.4825
75.6892

Desviacin
tpica
6.46578
10.85921
21.22895
22.94777

Error
tpico
3.23289
5.42960
10.61448
6.62445

Mnim
o
46.35
62.41
73.43
46.35

Mximo
60.94
88.21
124.53
124.53

ANOVA:
Concentracin
(mM)
Inter-grupos
Intra-grupos
Total

Suma de
cuadrados
3961.410
1831.192
5792.602

gl
2
9
11

Media
cuadrtica
1980.705
203.466

Sig.

9.735

0.006

PRUEBAS POST HOC

HSD
de

(I)
concentracin

(J)
concentracin

CP1

CP2
CP3
CP1

CP2

Diferencia
de medias
(I-J)
-20.54500
-44.46250*
20.54500

Error
tpico

Sig.

10.08627
10.08627
10.08627

0.159
0.004
0.159
112

Tuke
y

CP3
CP1
CP2

CP3

-23.91750
44.46250*
23.91750

10.08627
10.08627
10.08627

0.096
0.004
0.096

*. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.

ANOVA de las concentraciones del extracto metanlico y perxido de hidrgeno:

Viabilidad

Suma de

celular

cuadrados

gl

Media

Sig.

5.265

0.002

cuadrtica

Inter-grupos

7049.418

1174.903

Intra-grupos

4686.104

21

223.148

Total

11735.522

27

PRUEBAS POST HOC

Comparaciones mltiples
Variable dependiente: viabilidad celular
HSD de Tukey
(I)
concentracin
600

400

200

100

(J)
concentracin
400
200
100
CP1
CP2
CP3
600
200
100
CP1
CP2
CP3
600
400
100
CP1
CP2
CP3
600
400

Diferencia de
medias (I-J)
0.93000
2.31000
12.16250
45.39500*
24.85000
0.93250
-0.93000
1.38000
11.23250
44.46500*
23.92000
0.00250
-2.31000
-1.38000
9.85250
43.08500*
22.54000
-1.37750
-12.16250
-11.23250

Error tpico
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285

Sig.
1.000
1.000
0.904
0.005
0.266
1.000
1.000
1.000
0.932
0.006
0.306
1.000
1.000
1.000
0.963
0.008
0.370
1.000
0.904
0. 932
113

200
CP1
CP2
CP3
600
400
200
100
CP2
CP3
600
400
200
100
CP1
CP3
600
400
200
100
CP1
CP2

CP1

CP2

CP3

-9.85250
33.23250
12.68750
-11.23000
-45.39500*
-44.46500*
-43.08500*
-33.23250
-20.54500
-44.46250*
-24.85000
-23.92000
-22.54000
-12.68750
20.54500
-23.91750
-.93250
-.00250
1.37750
11.23000
44.46250*
23.91750

10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285
10.56285

0.963
0.062
0.886
0.932
0.005
0.006
0.008
0.062
0.475
0.006
0.266
0.306
0.370
0.886
0.475
0.306
1.000
1.000
1.000
0.932
0.006
0.306

*. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.

PRUEBA DE DUNNETT:
Variable dependiente: viabilidad celular
t de Dunnett (<control)
(I) concentracin
600
400
200
100
CP1
CP2
CP3

(J) concentracin
CONTROL
CONTROL
CONTROL
CONTROL
CONTROL
CONTROL
CONTROL

Diferencia de
medias (I-J)
-0.58500
-1.51500
-2.89500
-12.74750
-45.98000*
-25.43500*
-1.51750

Error
tpico
9.88065
9.88065
9.88065
9.88065
9.88065
9.88065
9.88065

Sig.
0.860
0.833
0.787
0.351
0.000
0.041
0.833

*. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.

a. Las pruebas t de Dunnett tratan un grupo como control y lo comparan con todos los
dems grupos.

114

ANEXO 8. ABREVIATURAS:
ABTS

: Acido 2,2-azino-bis-3-etilbenzoitiazolin-6-sulfonico

ADN

: cido desoxirribonucleico

ATP

: Adenosin trifosfato

Akt

: Protena quinasa

BHA

: Hidroxibutilanisol

BHT

: Butil hidroxitolueno

CAT

: Catalasa

COX-2

: Ciclooxigenasa 2

DPPH

: 2,2- difenil-1-picrylhidrazil

DSBH

: Disolucin salina balanceada

EGCG

: Epigaliocatequina

EDTA

: cido Etilendiaminotetraactico

EROs

: Especies reactivas de oxgeno

ERNs

: Especies reactivas de nitrgeno

GAE

: Equivalente acido glico

GSH

: Glutatin reducido

GSSG

: Glutatin oxidado

GPx

: Glutatin peroxidasa

IC50

: Concentracin media inhibitoria

IkB

: Inhibidor del gen kB

IL

: Interleukina

LPS

: Lipopolisacarido

MAPK

: Protenas quinasas activadas por mitgenos

M- CSF

: Factor estimulante de colonias de macrfagos

MDA

: Malondialdehido

MHC

: Complejo mayor de histocompatibilidad

115

MPO

: Mieloperoxidasa

MTT

: Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol

NADH

: Nicotinamina adenina dinucleotido

NF

: Factor de transcripcin o factor nuclear

NaNO2

: Nitrito de sodio

NO

: xido ntrico

NOSi

: xido ntrico sintasa inducible

O2-

: Radical superxido

OH-

: Radical oxidrilo

OCl-

: Hipoclorito

: Oxgeno singlete

O2

ONOO-

: Peroxinitrito

PBS

: Tampn fosfato salino

PMF

: Pentametoxiflavona

QE

: Equivalente de quercetina

R-

: Radical lipdico

RL

: Radicales libres

ROO-

: Radical peroxilo

ROOH

: Hidroperxido

SOD

: Superxido dismutasa

TNF-

: Factor de necrosis tumoral

116

ANEXO 9. Obtencin del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica):

seleccin de la muestra:

Planta de ortiga (Urtica dioica)

Recoleccin

Seleccin de hojas

117

ANEXO 10. Evaluacin la capacidad inhibitoria del radical DPPH a diferentes

concentraciones del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica).

Elaboracin del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica):

Liofilizado de las hojas

Pesaje

Molido de las hojas

Maceracin

118

Filtracin

119

Determinacin

600

400

de

capacidad

200

antioxidante

100

de

250

Concentraciones de ortiga (g/ml)

+DPPH

ortiga

600

(Urtica

400

dioica):

200

100

Blancos de las muestras

Concentracin + metanol

Espectrofotmetro

120

ANEXO 11. Determinacin el efecto del extracto metanlico de ortiga (Urtica

dioica) a diferentes concentraciones, sobre la produccin de xido ntrico en
macrfagos murinos activados.

Activacin y extraccin de macrfagos murinos:

Recuento celular con azul de Tripan.

121

Cultivo de los macrfagos murinos con los extractos de ortiga (Urtica

dioica)

Incubacin

122

Mtodo de Griess:

Extraccin del sobrenadante

Centrifugacin

Carbn activado.

Solucin A y B (reactivo de Griess)

123

Produccin de xido ntrico en presencia de las cuatro concentraciones de

ortiga (Urtica dioica) en macrfagos murinos:

CONTROL

600

400

200

100

124

ANEXO 12. Determinacin el efecto del extracto metanlico de ortiga (Urtica

dioica) a diferentes concentraciones, sobre la viabilidad celular en macrfagos murinos.

cultivo de macrfagos

Tratamiento con concentraciones del extracto

Incubacin

125

Cristales de formazn

Hidrxido de potasio al 2 M

126

ANEXO 13. Evaluacin el efecto del extracto metanlico de ortiga (Urtica dioica) a
diferentes concentraciones, sobre la fragmentacin del ADN de macrfagos murinos
sometidos a estrs oxidativo.

Cultivo de macrfagos

Orden de los tratamientos.

Extraccin y acondicionamiento del ADN

Buffer de lisis aplicado en los macrfagos.

127

Aplicacin de cloroformo sobre el lisado.

Separacin del ADN

Centrifuga a 13200 rpm

Extraccin del ADN (sobrenadante)

128

Refrigeracin a -20C

Centrifugada para separar ADN del

Lavado con etanol al 70%

ADN en isopropanol.

Formacin del pellet

Evaporacin del etanol

129

Bao mara a 65C

ADN en buffer de carga para electroforesis

Preparacin del gel de agarosa:

130

Carga de la muestra en el gel de agarosa:

Lectura con lmpara UV:

131