Ingeniera metablica de

Saccharomyces cerevisiae para la

produccin de nuevos compuestos de
lpidos
Resumen
La
levadura
Saccharomyces
cerevisiae ha sido modificada con
xito para la produccin de
numerosos metabolitos y protenas
teraputicas mediante ingeniera
metablica, pero no se ha utilizado
hasta la fecha para la produccin
de compuestos derivados de
lpidos. Hemos desarrollado una
estrategia de ingeniera en el
metabolismo de los lpidos en S.
cerevisiae basados en tcnicas de
cultivo
que
se
emplean
tpicamente
para
estudios
de Biognesis
peroxisomal;
clulas
fueron
cultivadas
en
medios que contienen cidos
grasos como nica fuente de
carbono,
la
cual
promueve
la proliferacin peroxisomal y la
induccin de enzimas relacionadas
con la -oxidacin de cidos
grasos.
Nuestros
resultados
indican que el crecimiento de la
levadura en cidos grasos como
oleato resultados
en
amplia
aceptacin de estos cidos grasos
a partir de los medios de
comunicacin y un posterior
aumento de lpidos celulares total
del 2% al 15% de peso de celda
seca. Tambin mostramos que la
co-expresin
de
planta
desaturases cidos grasos 2 y 3
(FAD2 y FAD3), utilizando un cido
graso-inducible del promotor del
gen peroxisomal, junto a los
procesos de absorcin de cidos
grasos con la induccin de una

nueva va metablica que conduce

de cido oleico (18:1) a cido
linolnico (18:3). Por ltimo, nos
muestran que el cultivo de clulas
de
levadura
en
presencia
de triacilgliceroles y
lipasa
suministrado de forma exgena
promueve
una
amplia
incorporacin de triglicridos de
cidos grasos en clulas de
levadura. Colectivamente, estos
resultados proporcionan un marco
para la bioconversin de aceites
de bajo costo en valor aadido
productos de lpidos.

Introduccin
Ingeniera metablica es un campo
emergente de la biotecnologa que
ofrece un enorme potencial para la
produccin
de
metabolitos
deseado. El enfoque experimental
se basa en la manipulacin de
genes endgenos o la introduccin
de
genes
extraos
en
un
organismo de inters con el fin de
redistribuir las vas metablicas
para la produccin de compuestos
especficos
(Stephanopoulos,
1999). El xito en el desarrollo de
un proceso de ingeniera depende
de un profundo conocimiento del
funcionamiento de los genes y de
sus metabolitos en cuestin y la
disponibilidad
de
un
slido
conjunto de herramientas para
analizar los cambios fisiolgicos en
el organismo husped. La levadura
Saccharomyces
cerevisiae
ha
servido
como
un
organismo

modelo para el desarrollo de la

ingeniera metablica estrategias
orientadas hacia la produccin de
ciertos metabolitos y protenas
teraputicas (Ostergaard et al.
2000). Sin embargo, se ha
prestado
poca
atencin
al
desarrollo de tecnologas basadas
en lpidos, principalmente debido
al bajo contenido de lpidos de S.
cerevisiae (Jacob, 1993). Nuestro
trabajo anterior se ha centrado en
la comprensin de los mecanismos
moleculares
implicados
en
la biognesis peroxisomal, con
nfasis en la focalizacin y
ensamblaje
de protenas
de
membrana peroxisomal (Dyer et
al. 1996; Mullen y Trelease 2000).
Para estos estudios, plantas y S.
cerevisiae fueron utilizados como
sistemas modelo. En S. cerevisiae,
los cidos grasos son degradados
exclusivamente
dentro
peroxisomes y la identificacin de
levaduras mutantes que ya no
crecen en cidos grasos como
nica fuente de carbono ha
permitido la identificacin de
muchos genes implicados en
la biognesis peroxisomal (los
genes PEX) (Subramani et al.
2000). Durante nuestros estudios
con
S.
cerevisiae,
hemos
observado
que
las
clulas
cultivadas en cidos grasos libres
tales como cido oleico que
contienen grandes cantidades de
gotas lipdicas no observados en
las clulas crecen en simples
fuentes de carbono como la
glucosa. El actual estudio fue
iniciado
para
caracterizar
el
contenido
en
lpidos
de
S.
cerevisiae y, adems, determinar
si ciertos lpidos Enzimas de
modificacin podra ser expresado
bajo el control del promotor del
gen
PEX
para
modificar
la
composicin de cidos grasos y

producir
lpidos.

nuevos

productos

de

Materiales y mtodos
Las condiciones de cultivo y de
cepas de levadura Saccharomyces
cerevisiae cepas MMYO11 (MAT
ade 2-1 su3-11,15 leu2-3.112 Trp11
ura3-1
puede1-100+
Ole),
MMPX5 (MAT pex5::SU32::Ppgk
ade-GFPAKL-URA3 su3-11,15 leu23.112 Trp1-1 ura3-1 puede1-100+
Ole) o sus derivados (vase ms
adelante), fueron utilizadas en
estos estudios. Las clulas de
levadura
se
mantuvieron
inalteradas en YPD media (1% de
extracto de levadura, peptona,
2%, 2%) dextrosa agar solidificado
con 2%. Celdas que contengan
plsmidos fueron mantenidos en
placas SD (2% de dextrosa, 0,67%
de levadura sin base de nitrgeno
aminocidos, 2% de agar) con
suplementos
de
aminocidos
adecuados. Solo las colonias
fueron inoculados en medios
lquidos SD y crecido durante la
noche a 30C y 300 rpm. Las
celdas se diluyeron en una
variedad
de
medios
de
comunicacin (vase infra) y ha
crecido a 20C y 300 rpm en una
forma modelo cientfico 4580
refrigerados/agitador incubador de
la consola. El cultivo a 20C fue
escogido
desde
una
ptima
actividad
de
la
Brassica
napus cidos grasos 3 desaturase
(FAD3) expresa la enzima en la
levadura
fue
observado
anteriormente a esta temperatura
(Dyer et al. 2001). Las celdas se
diluyeron a 0,1 OD600 en soporte
SD
y
cultivados
durante
aproximadamente 20 h, diluida a
0.25 OD600 en SGal medios (2%
galactosa, 0,67% de levadura base
de nitrgeno) y cultivados durante
aproximadamente 40 h, o diluido

al 1.0 OD600 en SGd (3% de

glicerol, 0,1% de dextrosa, 0,67%
de levadura base de nitrgeno)
durante
40
h.
Las
clulas
cultivadas en medio cido oleico
(composicin,
infra)
se
precultivados
en SGd durante
la
noche en lugar de SD. Al da
siguiente,
las
culturas
se
"refuerza" aadiendo 0,1 volumen
de 10% y 20% de extracto de
levadura,
peptona
y
luego
cultivadas durante 4 h. Las clulas
fueron
cosechadas
por
centrifugacin y re-inoculados en
1.0 OD600 en medio mineral (van
Dijken et al. 1976) que contiene
0,1%
v/v
oleico,
linoleico
o linolnico y
apropiada,
los
suplementos de aminocidos y
cultivados por 40 h. Las clulas
fueron cultivadas a diferentes
longitudes
de
tiempo
para
acomodar las diferencias en la
tasa de crecimiento de las diversas
fuentes de carbono. Todos los
cultivos se cosechan a finales de
registro/fase
estacionaria.
En
algunos experimentos, los cidos
grasos libres fueron sustituidos por
0,1% trilinolein e incubadas con o
sin detergente (1% v/v de Tween
40
- polyoxyethylenesorbitan
monopalmitate) y lipasa (1 mg/ml
de lipasa, tipo VII aislados de
Candida rugosa; Sigma).
Determinacin del peso seco
de clulas de levadura
La extraccin de lpidos de clulas
obtenidas de 100 ml de cultivo se
divide en dos porciones de 45 ml,
uno para la determinacin del
peso de clulas de levadura seca y
la otra para la extraccin de lpidos
de la levadura. Para determinar el
peso de celda seca, las clulas
fueron
colectadas
por
centrifugacin, lavadas dos veces
con agua, luego congelado a -80C

y con un liofilizado sistemas FTS

lyophilizer Flexi-Dry MP. Para la
extraccin de lpidos, clulas de
levadura en la otra porcin de 45
ml
se
convirtieron
a
spheroplasts por
digestin
enzimtica de paredes celulares,
como se ha descrito anteriormente
(Dyer et al. 1996), luego los lpidos
se
extrajeron
utilizando
el
cloroformo-metanol procedimiento
de Bligh y Dyer (1959). Todos los
disolventes orgnicos contenidos
en
0,01%
hidroxitolueno butilado como
un
antioxidante. Contenido de lpidos
totales de clulas de levadura fue
calculada como el porcentaje de
peso de celda seca.
Capa Fina y cromatografa de
gas
Clases de lpidos fueron separados
por cromatografa en capa fina de
gel de slice 60 utilizando placas
de HPTLC (1010 cm) y una fase
mvil
compuesta
de hexano:ter:cido actico
glacial
(80/20/1
v/v/v).
Componentes
lipdicos
fueron
visualizados por pulverizacin con
3.3% de acetato cprico en 8%
cido fosfrico y carbonizando a
140C durante 10 minutos en una
sala de visualizacin (Analtech
VPF),
luego
identificado
por
comparacin con Rf de lpidos
estndares. Los steres metlicos
de cidos grasos (FAME) fueron
preparados a partir de extractos
de lpidos totales de levadura con
sodio, grasos
derivatizes
methoxide
acilglycerolipids incluidos los lpidos
neutros y los fosfolpidos, pero no
de los cidos grasos libres. Cuando
est
indicado,
la
fama
se
prepararon utilizando una solucin
metanlica 1 M-HCl (Alltech) para
asegurarse de que los cidos

grasos libres celular se incluyeron

en el anlisis composicional. La
Fama se extrajeron con hexano,
pasan a travs de sulfato de sodio
y hexano volumen fue reducida
bajo una suave corriente de
nitrgeno. Fama fueron analizados
en un Hewlett Packard 5890
Serie II Cromatgrafo de gases
equipado con un autoinjector y sin
dividir la inyeccin, un detector de
ionizacin de llama y un 30 m 0,53
mm Supelco SP-2380
columna,
utilizando gas
helio
como
transportista. Un programa de
temperatura de 110 a 160C a
15C/min, a 170C a 5C, luego a
200C a 22,5C/min con un final
mantenga a 3,3 min estaba
empleada.
Fama
fueron
identificados por comparacin de
los tiempos de retencin a los
estndares,
utilizando
bromuro heptadecanoate como
patrn interno, y el % de la Fama
fue calculado sobre la base de
recuentos del rea del pico.

Fig. 1 vectores de cido grasoinducible de la expresin gnica en

levaduras. Un cassette de expresin
basada en el cido graso de levaduraPEX11
promotor
inducible
fue
construido en una serie de baja y alta
copia de levadura que contiene
cuatro vectores lanzadera diferentes
marcadores seleccionables (Sikorski
y Hieter 1989; Christianson et al.

1992), lo que se traduce en ocho

diferentes plsmidos de expresin

Construccin de vectores
cepas de levadura

Una serie de vectores de expresin

de levadura fue construido por
transferencia de un fragmento de
ADN que contiene la levadura
PEX11 gen promotor y terminador,
separados
por
un
corto polylinker de
sitios
de
restriccin,
la serie
pRS
de
levadura
vectores
lanzadera
(Sikorski
y Hieter 1989;
Christianson et al. 1992). Cada
PEX11 vector lanzadera contiene
uno de cuatro marcadores de
levadura seleccionable (SU3, Trp1,
LEU2, URA3), y est disponible en
baja y alta copiar varias versiones
(Fig. 1). El PEX11 promotor y
terminador
fragmento
fue
obtenida de plsmido pKS-27poly
(Dyer et al. 1996), que contiene el
PEX11
promotor,
un polylinker (5'- EcoRI
SmaI
HindIII,,,, y PstI BglII-3'), y el
terminador
clonado
en
el
ClaI/BamHI sitios
de pBluescript KS(Stratagene).
Los sitios de restriccin en el
polylinker entre el PEX11 promotor
y terminador no son nicos dentro
de todos los vectores de pRS
(Sikorski
y Hieter 1989;
Christianson et al. 1992). El PEX11
casete de expresin fue suprimida
de
pKS-27poly
utilizando KpnI/SacI, gel, purificada
y ligarse en igualmente digerido
levadura vectores lanzadera pRS314, pRS-424, pRS-316 y pRS-426
para generar plsmidos pEX11314 (CEN6 ARSH4, Trp1), pEX11424 (2, Trp1), pEX11-316 (CEN6
ARSH4, URA3) y pEX11-426 (2,
URA3), respectivamente. El chasis
fue transferida al pRS-313 y pRS-

315 con XbaI XhoI/ generar pEX11313 (CEN6 ARSH4, SU3) y pEX11315
(CEN6
ARSH4,
LEU2),
respectivamente. Por ltimo, la
cinta fue transferida al pRS-423 y
pRS-425 utilizando XhoI/SacI para
generar pEX11-423 (2, SU3) y
pEX11-425
(2,
LEU2),
respectivamente.
Vectores
de
expresin
que
contienen levadura PEX11-driven
desaturases
cidos
grasos
vegetales
(DCP)
fueron
construidos utilizando myc-eptopo
tagged Arabidopsis thaliana FAD2
y
hemagluttinin (HA)-tagged
Brassica napus FAD3,
que
anteriormente se utilizaban para
caracterizar
desaturase
localizacin subcelular (Dyer y
Mullen, 2001) y la regulacin posttranscripcional (Dyer et al. 2001).
El micnico-tagged FAD2 ORF se
ligaban entre la levadura PEX11
promotor
y
terminador
por
transferencia
de
un fragmento
EcoRI/PstI de pKS-mycFAD2 (Dyer
y Mullen 2001) similarmente
digerido pEX11-424. La final fue
llamado
plsmido
pEX11-424mycFAD2 (2, Trp1). La ha-tagged
FAD3 ORF fue clonado entre el
PEX11 promotor y terminador por
transferencia de un fragmento
EcoRI/PstI del plsmido pKS-HAB1
(Dyer
et
al.
2001)
a
la EcoRI/PstI sitios de pKS-27poli.
El
plsmido
resultante
se
denomina pKS-27HAB1. La casete
gnico fue trasladado desde este
plsmido
como SalI/SacI al
fragmento SalI/SacI sitios de pRS425 para generar el plsmido
pEX11-425-HAFAD3 (2, LEU2).
Los plsmidos Se transfectaron
separadamente o en combinacin
en MMYO11 o MMPX5 en clulas
de levadura usando el mtodo de
acetato de litio Gietz y Woods
(1994). Cepas de levaduras fueron

depositados en la Coleccin de
Cultivos
del
Servicio
de
Investigacin
Agrcola
(Centro
Nacional para la Investigacin de
Utilizacin
Agrcola,
1815
N.
Universidad St., Peoria, IL 61604,
EE.UU.) y estn disponibles bajo
peticin.
La
cepa
nombres,
descripciones
y
nmeros
de
adhesin
son:
MM-424,
S.
cerevisiae cepa MMYO11 albergar
vector control pRS-424 (2, Trp1),
NRRL
Y-27443;
MM-F2,
MMYO11 albergando el plsmido
pEX11-424- mycFAD2, NRRL Y27444;
MM-F3,
MMYO11 albergando el plsmido
pEX11-425-HAFAD3,
NRRL
Y27445;
MM-F2/F3,
MMYO11 albergar
plsmidos
pEX11-424-mycFAD2 y pEX11-425HAFAD3, NRRL Y-27446; MMPX5424, S. cerevisiae cepa MMPX5
control de albergar el plsmido
pRS-424, NRRL Y-27447; MMPX5F2/F3,
MMPX5
albergan
plsmidos pEX11- 424-mycFAD2 y
pEX11-425-HAFAD3,
NRRL
Y27448.
Preparacin
de
extractos
proteicos, SDS-PAGE y Western
blotting
Los extractos de protenas totales
fueron obtenidos a partir de
levaduras usando el mtodo
de Veenhuis y Goodman (1990),
con
ligeras
modificaciones.
Brevemente, las clulas fueron
incubadas en un 5% de cido
tricloroactico antes de glass bead
interrupciones. No fueron lisados
hervidas,
sin
embargo,
para
mejorar la recuperacin de la
planta de cidos grasos protenas
desaturase (observacin personal).
Se determin la concentracin de
protenas en muestras triplicadas
utilizando el ensayo con protena
de BioRad BSA como estndar. 15

microgramos de protenas de cada

conjunto lisado celular fueron
separados en 10% SDS-geles de
poliacrilamida
y
teidos
con Coomassie R-250
o
transferidos a la nitrocelulosa para
Western blotting. Deteccin de
quimioluminiscencia mejorada se
realiz
utilizando
sustrato
y Hyperfilm desde AmershamPharmacia,
descrita
por
el
fabricante.
Los
anticuerpos
utilizados
en
estos
estudios
incluyeron
el
anti-ratn
ha
mAb 12CA5 (1 g/ml) (Boehringer
MannheimRoche),
anti-cmyc ratn mAb 9E10
(1:1,000)
(BabCo),
antidolichol manosa
fosfato sintasa mAb mouse 5C5-A7
(4 g/ml) (Molecular Probes) y de
cabra anti-ratn conjugado con
peroxidasa de rbano picante de
Igs (1:10.000) Biosource dilucin
( Internacional).

Resultados
La captacin de cidos grasos
por S. cerevisiae
S.
cerevisiae
clulas
fueron
cultivadas en la presencia de
mltiples fuentes de carbono, los
cidos grasos o solos, para
determinar los efectos de los
medios sobre la absorcin y la
asimilacin de composicin de
cidos grasos de los medios de
crecimiento.
Las
clulas
de
levaduras
cultivadas
en
la
galactosa contenan cantidades
bajas del total de los lpidos
celulares, que se distribuyen
principalmente en fosfolpidos y
neutrales fracciones lipdicas (Fig.
2). Adicin de cido oleico a la
galactosa media condujo a un
pequeo aumento en el total de
lpidos celulares y un aumento de
triacilglicerol y contenido de
cidos grasos libres se observ. El

incremento en el contenido de
cidos grasos celulares fue ms

Fig. 2 La absorcin de cidos grasos

de los medios de cultivo
por
Saccharomyces
cerevisiae
y
el
subsiguiente aumento en el total de
la levadura el contenido lipdico. Cepa
de levadura MM-424 fue crecido en
medios
lquidos
que
contengan
galactosa, galactosa y oleato, glicerol
y oleato, oleato o solos. cido oleico
fue incluido en los medios de
comunicacin en el 0,1% (v/v),
cuando se agregan. El panel inferior
muestra los sobrenadantes obtenidos
despus de la centrifugacin de los
medios para eliminar las clulas de la
levadura. El panel central muestra el
contenido en lpidos totales de
clulas de levadura cultivada en los
respectivos medios de comunicacin.
El
panel
superior
muestra
un
representante TLC separacin de 6 g
de lpidos obtenidos de cada extracto
lipdico de levadura. Posiciones de
lpidos estndares son mostradas a la
izquierda: TAG triacilglicerol, FFA los
cidos
grasos
libres,
DAG diacylglycerol fosfolpido, PL.
Todos los experimentos se llevaron a
cabo al menos tres veces

pronunciado cuando las clulas

fueron cultivadas en una mezcla
de glicerol y cido oleico (Fig. 2).
Cultivo de S. cerevisiae en medios

que contienen cido oleico como

nica fuente de carbono, sin
embargo, result en ms extensa
de oleato de absorcin a travs de
los medios de comunicacin, con
un aumento de siete veces en
total contenido en lpidos celulares
aproximadamente del 2% al 15%
de peso de celda seca. TLC
separacin de lpidos obtenidos de
cido oleico-crecido clulas revel
que la mayora de los cidos
grasos
fueron
esterificados
en triglicridos.
Adems,
la
cantidad de cidos grasos libres
celular fue sustancialmente menor
en comparacin con otras fuentes
de
carbono,
especialmente
mezclas
de
galactosa/oleato y
glicerol/oleato.
Cultivo
de
S.
cerevisiae
en
medios
que
contienen
cido
linoleico
o
linolnico como nicas fuentes de
carbono
dieron
resultados
similares a los cultivados en cido
oleico (resultados no mostrados)
Las clulas cultivadas en S.
cerevisiae
galactosa
media
exhiben una simple composicin
de cidos grasos dominado por el
palmtico
(16:0), palmitoleic (16:1),
esterico (18:0) y Oleico (18:1)
cidos (Fig. 3). La inclusin de
cido oleico en la galactosa o
medios de glicerol se tradujo en un
aumento en la telefona celular
cido oleico (18:1) y la reduccin
del contenido de cido palmitoleic
(16:1). Crecimiento en cido oleico
como nica fuente de carbono
provocado incluso una mayor
incorporacin de cido oleico, que
representa aproximadamente el
95% del total de cidos grasos de
levaduras (Fig. 3). Cultivo de S.
cerevisiae en presencia de cido
linoleico
(18:2)
o cido
linolnico (18:3) cidos result
similar en la absorcin y la

incorporacin de los cidos grasos

suministrado de forma exgena,
representando el 85%-90% de la
composicin de cidos grasos (Fig.
3). La absorcin de esos cidos
grasos insaturados de los medios
de crecimiento condujo a una
severa reduccin de la cantidad de
cidos grasos monoinsaturados
sintetizado endgenamente (16:1
y 18:1), que fue probablemente
debido a la represin de la
actividad de la levadura endgena
desaturase Trotter (2001). Para
determinar si S. cerevisiae podra
tambin utilizar triacilglicerol de
lpidos, que son los principales
componentes
de
los
aceites
vegetales comunes, las clulas de
levadura fueron cultivadas en la
presencia de trilinolein, entonces
las clulas fueron cosechadas y la
composicin de cidos grasos
determinada utilizando GC (Fig. 4).
Clulas
de
S.
cerevisiae
tpicamente no contienen cido
linoleico, y el aspecto de este
cido graso en la levadura los
lpidos pueden ser utilizados para
medir la absorcin de cidos
grasos. Detergente fue tambin
incluido en estos estudios para
ayudar
a
solubilizar
triacilgliceroles.
Las
clulas
cultivadas en la presencia de cido
linoleico libre como nica fuente
de carbono contenan ms de 80%
de cido linoleico, mientras que las
clulas cultivadas en la presencia
de trilinolein contena slo un 1%
de cido linoleico (Fig. 4). Inclusin
de una lipasa inespecfica en los
medios de comunicacin que
contengan trilinolein, sin embargo,
ha facilitado la absorcin de cido
linoleico, lo que representa el 30%
del total de cidos grasos. Anlisis
de la composicin de cidos
grasos totales de estas clulas
revel que el contenido de cido

palmtico fue anormalmente alto,

representando ms del 40% del
total de cidos grasos (datos no
mostrados). Esto sugiere que la
lipasa hidroliza preferentemente
la fraccin palmitoil fuera del
detergente, que fue aadido en
diez veces por encima del
triacilglicerol en los medios de
crecimiento. La incubacin de
clulas de levadura en presencia
de trilinolein y
lipasa,
sin
detergente, dieron lugar a una
absorcin
de
cido
linoleico
comparable al observado cuando
el cido linoleico se present como
un cido graso libre en los medios
de comunicacin (Fig. 4). As pues,
la inclusin de un detergente no es
ni necesario ni deseable para la
hidrlisis y la absorcin de los
triglicridos de los cidos grasos.
Expresin de lpido-Enzimas de
modificacin
en
la
levadura
usando
un
cido
graso-gen
promotor inducible
A la par de los procesos de
absorcin de cidos grasos en
clulas de S. cerevisiae y la

Fig. 3 composicin en cidos grasos

de S. cerevisiae clulas cultivadas en
presencia de diferentes fuentes de
carbono. Clulas de S. cerevisiae
(cepa MM-424) fueron cultivadas en
medios
que
contienen
indicaron
fuentes de carbono, entonces las
clulas
de
levadura
fueron
cosechadas y la composicin de
cidos grasos determinada utilizando

la cromatografa de gases. La Fama

se
prepararon
utilizando methanolicHCL celular para
asegurarse de que los cidos grasos
libres se incluyeron en el anlisis
composicional. Los valores indicados
representan
el
promedio
y
la
desviacin
estndar
de
cuatro
experimentos independientes. Las
barras
representan
palmtico
(vaco), palmitoleic (sombreado),
esterico (rayas diagonales), oleico,
linoleico (slida) (rayas diagonales
hacia abajo), linolnico (manchas)

expresin
de
enzimas
de
modificacin de lpidos, cidos
grasos vegetales desaturases 2 y
3 (FAD2, FAD3) fueron expresados
en clulas de levadura con el cido
graso-inducible PEX11 promotor
del gen de la levadura. El PEX11
gen codifica una protena (Pex11P)
que
est
implicado
en
la
proliferacin de peroxisomes en
respuesta
a
ciertas
seales
ambientales
(Erdmann
y Blobel 1995; Marshall et al.
1995). El PEX11 gen es expresado
a bajos niveles basales de glucosa
y inducido aproximadamente 100
veces cuando las clulas se
desplazan a los medios que
contengan cidos grasos como
nica fuente de carbono (Marshall
et al. 1995). La planta FAD2
enzima convierte el cido oleico
(18:1) para el cido linoleico
(18:2), y FAD3 convierte el cido
linoleico (18:2) a cido linolnico
(18:3) (Covello y Reed 1996; Reed
et al. 2000). Ambas enzimas son
protenas
de
membrana
dependiente ubicado en

protenas dentro de las clulas de

la levadura (Fig. 5). Expresin de la
FAD2 y/o FAD3 no influye en la
cantidad de estado estacionario
dolichol manosa fosfato sintasa,
una protena marcadora de la
levadura de la membrana reticular
retculo
Horazdovsky y EMR
( 1993).

Fig. 4 Influencia de una lipasa

inespecficos en la absorcin de
cidos grasos en un medio de
crecimiento
que
contengan
triglicridos. Las clulas de levadura
(cepa MM-424) fueron cultivadas en
la
presencia
de
cido
linoleico
(gratis),
Lin (TriLin
trilinolein.),
detergente
(1%
v/v
polyoxyethylenesorbitan
monopalmitate - Tween 40) o lipasa
(1 mg/ml), y luego se extrajeron los
lpidos y la composicin de cidos
grasos determinada utilizando la
cromatografa de gases. Contenido de
cido linoleico en levadura lpidos es
mostrado. Los valores representan la
media y la desviacin estndar de
tres experimentos independientes

el cuarto doplasmic endoplsmico

(Dyer y Mullen 2001). El eptopo
desaturases fueron marcados y
expres individualmente o en
combinacin, en S. cerevisiae
celdas usando el PEX11 Promotor,
entonces los niveles de protena
fueron evaluados por anlisis de
Western blot. El micnico-Fad2
protena fue detectado en lisados
obtenidos de clulas cultivadas
tanto en dextrosa y cido oleico
mediano (Fig. 5). Resultados
similares fueron observados por
ha-Fad3 obtenido a partir de
clulas cultivadas en dextrosa y
cido
linoleico
(el
substrato
fisiolgico de la FAD3). Coexpresin de myc-Fad2-Fad3 y ha
provocado la aparicin de ambas

Tabla 1 Lpidos ingeniera metablica

en Saccharomyces cerevisiae

Ingeniera metablica de lpidos en

S. cerevisiae
S. cerevisiae celdas albergan
PEX11-driven FAD2 y FAD3 alta
copiar
plsmidos
mostraron
cambios en la composicin de
cidos grasos en consonancia con
el establecimiento de una nueva
va metablica que conduce de
cido
oleico
(18:1)
a cido
linolnico (18:3), a travs del cido
linoleico (18:2) (Tabla 1). Controlar
las clulas de levaduras cultivadas
en
dextrosa
contiene
aproximadamente un 54% de
cido oleico, mientras que las
clulas de levadura expresando
planta FAD2 y FAD3 genes
mostraron una reduccin en el
contenido en cido oleico y la
apariencia de los cidos linoleico
y linolnico , que representaron
aproximadamente el 18% y el
1,1% del total de cidos grasos,
respectivamente (tabla 1). El
crecimiento de las clulas de
control en medios que contienen
cido oleico como nica fuente de

carbono
producido
sustancial
incorporacin de cido oleico en
levadura de lpidos, representando
el 98% del total de cidos grasos
celulares (Tabla 1). Co-expresin
de la FAD2 y FAD3 llev a la
conversin de una parte del cido
oleico en linoleico y linolnico ,
que representan el 12% y el 0,3%
del total de cidos grasos,
respectivamente (tabla 1). La FAD2
y
FAD3 Adnc se
expresaron
tambin en S. cerevisiae celdas
que contengan una alteracin del
gen PEX5 (cepa MMPX5). Estas
clulas
mutantes,
perturbado
en biognesis peroxisomal, son
incapaces de crecer en cidos
grasos como nica fuente de
carbono, pero son capaces de
crecer en fuentes de carbono
fermentables como la dextrosa
(Subramani et
al.
2000).
La composicin en cidos grasos
de la cepa de control MMPX5424, cultivada en dextrosa, fue
similar a la composicin de la cepa
de control tipo salvaje, MM-424,
con
cido
oleico
representa
aproximadamente el 55% del total
de la composicin en cidos
grasos (Tabla 1). Co-expresin de
planta FAD2 y FAD3 en MM
desaturasesPX5 celdas llev a la
conversin de una parte del cido
oleico
en lino
leic y linolnico ,
representando aproximadamente
el 22% y el 1,3% del total de
cidos grasos, respectivamente
(tabla 1).

Fig. 5 SDS-PAGE y Western blot

anlisis de planta FAD2 y FAD3
expresados en clulas de levadura
con el promotor del gen PEX11. Las
cepas
de
levadura
individuales,
designado en la parte superior de la
figura, son: cepa de control Neg. MM424, Myc-CEPA MM F2-F2 (contiene
myc-eptopo tagged FAD2), la CEPA
HA-F3-F3 (mm contiene HA-tagged
FAD3), Myc/hectrea cepa MM-F2/F3
(contiene tanto myc-tagged FAD2 y
HA-tagged FAD3). Las clulas fueron
cultivadas en medios que contienen
indic fuente de carbono (que se
muestran en la parte superior de
cada carril), protenas totales fueron
extrados, separadas por SDS-PAGE y
teidas con azul de Coomassie (panel
superior)
o
transferidos
a
la
nitrocelulosa para Western blotting
con el indicado anticuerpos (paneles
inferiores). Las posiciones de los
marcadores de peso molecular (kDa)
se muestran a la izquierda. Dex Ole
dextrosa, cido oleico, cido linoleico
Lin, -myc anticuerpos anti-myc, -HA
de
anticuerpos
anti-HA,
-DPMS
antidolichol manosa fosfato sintasa
anticuerpo, una protena marcadora
de la levadura de la membrana
reticular retculo

Discusin
Aqu presentamos una estrategia
de ingeniera en el metabolismo
de los lpidos en S. cerevisiae que
parejas los procesos de absorcin
de cidos grasos de los medios de
crecimiento con la expresin de
enzimas de modificacin de cidos

grasos. Un componente clave en

este proceso fue el cultivo de
clulas de levadura en medios que
contienen cidos grasos como
nica fuente de carbono, que
aumenta la absorcin de cidos
grasos libres y se tradujo en un
aumento de siete veces en el
celular total contenido lipdico.
Aunque el crecimiento de S.
cerevisiae en cidos grasos como
nica fuente de carbono induce la
proliferacin de peroxisomes y las
enzimas
asociadas
de
la oxidacin de cidos grasos, las
clulas de levadura crecen muy
bien en esta fuente de carbono,
con un tiempo de duplicacin de
aproximadamente 20 h. Esto
proporciona un amplio margen de
tiempo para la modificacin de la
composicin de cidos grasos por
transgenically-expresadas
las
enzimas. Informacin significativa
en
los
cambios
fisiolgicos
asociados con el crecimiento de S.
cerevisiae sobre los cidos grasos
pueden ser obtenidos a partir de
los estudios de Kal et al. (1999),
quien ya realiz un amplio anlisis
del genoma de los cambios en la
expresin gentica cuando las
clulas
fueron
cultivadas
en
glucosa o cido oleico como nica
fuente de carbono. Los resultados
revelaron que el cultivo de clulas
en cido oleico induce la expresin
de muchos genes implicados en el
metabolismo de cido graso,
incluyendo
transportadores
de
metabolitos
y
enzimas
relacionadas con la degradacin
de los cidos grasos. Entre los
genes
inducidos
fueron
los
cidos acil-CoA sintetasas, que
han
sido
implicados
en
la
adquisicin de los cidos grasos de
los
medios
de
crecimiento
(Fargeman et al. 2001). Estas
enzimas catalizan la formacin de

cidos acylCoAs de cidos grasos

libres y CoA, permitiendo que los
cidos grasos obtenidos a travs
de los medios de comunicacin
para entrar en la piscina celular de
acil-COA. Los cidos acil-COA son
fcilmente incorporadas en los
lpidos neutros y fosfolpidos
(Walenga y tierras, 1975), lo que
podra explicar el aumento del
total
de
lpidos
celulares
observadas aqu (Fig. 2). Induccin
de
cidos acil-CoA
sintetasa actividad tambin puede
ser responsable de la reduccin de
contenido de cidos grasos libres
en las clulas cultivadas en cido
oleico como nica fuente de
carbono (Fig. 2). Expresamos dos
plantas de cido graso en S.
cerevisiae desaturases utilizando
el PEX11 gen promotor, ya que
este gen est expresado en
niveles bajos pero detectables en
dextrosa y inducida de 100 veces
cuando las clulas se cultivan en
cido oleico como nica fuente de
carbono
(Marshall
et
al.
1995; Kal et
al.
1999).
Sorprendentemente,
la
investigacin
del
estado
de
equilibrio los niveles de protenas
mediante
Western
blotting
desaturase revel que los importes
de desaturase protenas vegetales
no aumentar considerablemente
cuando
las
clulas
fueron
trasladados de dextrosa a cido
oleico media (Fig. 5). Aunque la
razn de esta falta de incentivo es
actualmente desconocida, podra
reflejar diferencias en el arnm de
la FAD estabilidad, eficiencia
traslacional, o tasas de rotacin de
protenas
entre
las
clulas
cultivadas en dextrosa versus
cido
oleico.
No
obstante,
expresin de la desaturases en
dextrosa- oleato
o
clulas
cultivadas era suficiente para

remodelar la composicin de
cidos grasos, coherente con la
introduccin de una nueva va
metablica que conduce de cido
oleico (18:1) a cido linolnico
(18:3)
(Tabla
1).
Tambin
expresamos la planta desaturases
cidos grasos en una cepa de S.
cerevisiae perturbado en el PEX5
gen. El PEX5 gen codifica el
receptor para la mayora de las
protenas destinadas a la matriz
peroxisomal y celdas que carecen
de este gen son incapaces de
crecer en cidos grasos como
nica fuente de carbono debido a
su incapacidad para degradar los
cidos grasos (Subramani et al.
2000). La justificacin para la
realizacin
de
nuestros
experimentos
en
un
PEX5perturbado cepas de levadura fue
que, en ciertas estrategias de
ingeniera en el metabolismo de
los lpidos, puede preverse que el
cido graso deseado productos
finales podra ser selectivamente
hidrolizado de membranas y
dirigidos por la degradacin dentro
de
Eccleston y Ohlrogge
peroxisomes ( 1998; Millar et al.
2000). En tales casos, la ingeniera
de lpidos podra realizarse en
cepas de levadura alterada en su
capacidad para degradar los
cidos grasos por completo. Los
resultados presentados en el
cuadro
1
indican
que
el
metabolismo de los lpidos se
pueden realizar experimentos de
ingeniera en PEX5-perturbado S.
cerevisiae clulas que se cultivan
en dextrosa como una fuente de
carbono, con productos cidos
grasos
acumular
a
niveles
comparables a los observados en
las
clulas
de
tipo
salvaje
expresando las enzimas de las
plantas.
Sin
embargo,
la
incapacidad
de
los
PEX5-

perturbado en clulas de levadura

para sobrevivir en los cidos
grasos como nica fuente de
carbono
podran
limitar
su
utilizacin a ingeniera de lpidos
estrategias
centradas
en
la
conversin de lpidos levaduras
endgenas, en lugar de lpidos
suministrados de forma exgena,
en nuevos productos de lpidos.
Alternativamente,
PEX5perturbado en clulas de levadura
que se podra seguir diseado para
evitar esta limitacin. Por ejemplo,
constitutivos,
alto
nivel
de
expresin acil-CoA graso ligasas
podra
permitir
la
absorcin
robusto y asimilacin de los cidos
grasos
de
los
medios
de
crecimiento, aun cuando una
fuente adicional de carbono, como
la dextrosa, est incluido en los
medios de comunicacin. Por
ltimo, uno de nuestros objetivos a
largo plazo es desarrollar un
sistema de expresin microbianos
para la bioconversin de aceites
vegetales de bajo costo en
productos de valor aadido. Los
aceites vegetales se componen
principalmente de triacilgliceroles
y S. cerevisiae normalmente es
incapaz de crecer en estos
compuestos como fuente de
carbono. Aqu, nos demuestran
que la inclusin de una lipasa
inespecfica
en
medios
que
contienen triglicridos facilita la
hidrlisis y posterior absorcin de
los cidos grasos en S. cerevisiae
clulas (Fig. 4). Esto sugiere que S.
cerevisiae podra ser diseado
para secretar grandes cantidades
de lipasa para la descomposicin
de
los
triglicridos
y
la
incorporacin de componentes de
cidos grasos. Esas cepas de S.
cerevisiae
ha
sido
descrito
previamente (Okkels 1996). Una
combinacin de los mtodos de

cultivo
descrito
aqu,
y
la
expresin de los genes por tanto la
incorporacin de cidos grasos y
su modificacin, podr permitir la
utilizacin a escala industrial de S.

cerevisiae de bioconversin de
bajo costo de las materias primas
en productos de valor agregado de
lpidos.