Produccin de n-Butanol en Saccharomyces

cerevisiae est limitada por la disponibilidad

de la coenzima A y acetil-CoA citoslica
ANTECEDENTES: Butanol ismeros son considerados ms adecuados
sustitutos de combustible de bioetanol. n-butanol es producida
naturalmente por algunas especies de clostridios, pero debido a
problemas inherentes con clostridial las fermentaciones, industrialmente
ms los organismos pertinentes han sido modificadas genticamente
para la produccin de n-butanol. Aunque la levadura Saccharomy- ces
cerevisiae tiene ventajas significativas en trminos de las
fermentaciones industriales escalables, n-butanol rendimientos y ttulos
obtenidos hasta el momento son slo una baja.
Resultados: Presentamos un anlisis exhaustivo y mejoras significativas
de n-butanol, produccin de glucosa con levadura a travs de la deriva
acetoacetyl-CoA-ruta. En primer lugar, hemos establecido una mejor va
de n-butanol por test- ing varias isoenzimas de va diferentes reacciones.
Esto result en el n-butanol ttulos alrededor de 15 mg/L en medio
sinttico despus de 74 h. Como el sustrato inicial del n-butanol
pathway es acetil-coenzima A (acetil-CoA) y la mayora de los
intermediarios estn enlazados a la Coenzima A (CoA), aumentamos CoA
sntesis por sobreexpresin del pantothen- comi kinasa del gen coaA de
Escherichia coli. La suplementacin con pantotenato aument la
produccin de n-butanol de hasta 34 mg/L. Reduccin adicional de
formacin de etanol por la eliminacin de la alcohol deshidrogenasa
genes ADH1-5 condujo a n-butanol ttulos de 71 mg/L. Expresin de una
forma mutante de un ATP acetylating independiente acetaldehdo
un267T/E568K deshidrogenasa, la adhE , convirtiendo el acetaldehdo en
acetil-CoA, traducido en 95 mg/L de n-butanol. En la CEPA, el final del nbutanol pathway genes coaA y adhEA267T/E568K, fueron integrado de
manera estable en el genoma de la levadura, suprimiendo otro alcohol
deshidrogenasa, gen ADH6 y GPD2 Codificacin de Glicerol-3-fosfato
deshidrogenasa.
Esto condujo a una nueva disminucin en etanol y glicerol subproducto
formacin y elevada potencia redox en forma de NADH. Con la adicin
de pantotenato, esta cepa produce n-butanol hasta un ttulo de 130
20 mg/L y un rendimiento de 0,012 g/g de glucosa. Estos son los valores
ms altos registrados hasta la fecha para S. cerevisiae en medio
sinttico a travs de un acetoacetyl-CoA-derivado del n-butanol sendero.
Conclusiones: Al aumentar gradualmente el sustrato y suministro de
energa redox en forma de CoA, acetil-CoA y NADH, y disminuyendo la
formacin de etanol y glicerol, podramos aumentar paulatinamente la
produccin de n-butanol en S. cerevisiae.
Sin embargo, an ms los cuellos de botella en el n-butanol camino debe
ser descifrado y mejorado de inters industrial n-butanol, los niveles de
produccin.

Palabras clave: n-butanol, Saccharomyces, Abe fermentacin, acetilCoA, Coenzima A, Pantotenato

Antecedentes
Los biocombustibles producidos por fermentaciones microbianas de los
recursos renovables representan una importante sustitucin de
combustibles fsiles. Hoy en da, el bioetanol es el sustituto de la
gasolina renovable ms importante. Sin embargo, los alcoholes
superiores como butanol son considerados ms adecuados sustitutos de
combustible, debido a su mayor densidad energtica, baja
higroscopicidad, y por lo tanto menor agresividad [1].
n-butanol es producida por diversas especies de Clostridium a travs de
la acetona, butanol etanol (ABE) proceso de fermentacin con una
proporcin de 1:3:6 y ttulos de hasta 13 g/l
Sin embargo, clostridial las fermentaciones se asocia con varios
problemas, entre ellos la esporulacin, el lento crecimiento, bacterifago
infecciones, y anaerobias estrictas cultivos. Por esta razn, otros
industrialmente ms los organismos pertinentes han sido diseados para
la produccin de n-butanol por la introduccin de las variantes del
camino clostridial [5] o utilizando las vas de degradacin ketoacid [6].
Aunque el n-butanol ttulos de hasta 15 g/l [7] fueron alcanzados en E.
coli, fermentaciones industriales a gran escala con esta bacteria tambin
sufren el alto riesgo de infecciones y contaminaciones bacterianas fago,
por ejemplo [8, 9].
En comparacin con E. coli, S. cerevisiae tiene ventajas significativas en
trminos de fermentaciones industriales escalables, debido a la larga
experiencia con esta levadura en los procesos de fermentacin, alta
robustez y tolerancia contr compuestos inhibitorios [10].
S. cerevisiae es capaz de producir pequeas cantidades de n-butanol en
rich media a travs de vias endgenas dependientes de treonina o
glicina el catabolismo, el primero estimulado por la supresin de la ADH1
[11, 12]. Mediante la mejora de estas vas, n-butanol ttulos de hasta
242.8 y 92 mg/L, respectivamente, podran lograrse. Combinando el
aminocido-vias endgenas dependientes con un sinttico ABE pathway
y una versin mutante del factor de iniciacin de la traduccin eIF2B en
un adh1 mutante produjo hasta 300 mg/L de n-butanol, pero slo en
medio YEPD despus de 15-20 das [13]. Sin embargo, como la
produccin de biocombustibles a partir de los aminocidos no es
econmicamente viable, para uso industrial treonina o glicina
sobreproduccin cepas sera necesario que, sin embargo, muestran
menores rendimientos mximos tericos [1].
Por lo tanto, es ms prometedor para mejorar la produccin de n-butanol
por mejoras de variantes del n-butanol pathway expresada en S.
cerevisiae. En esta ruta, dos molculas de acetil-CoA se condensan a
acetoacetylCoA, que se reduce a 3-hydroxybutyryl-CoA y luego se
deshidrata para crotonyl-CoA. Esto se redujo a butyraldehyde butyryl-

CoA, y, finalmente, n-butanol (Fig. 1). Ampliar la ruta al nivel de

butyrylCoA en una inversin de la -oxidacin ciclo permitira incluso la
produccin de molculas ya [14, 15].
Adems de alcoholes, tambin los intermediarios de la ruta son
compuestos valiosos o que pueden ser utilizados para producir las
correspondientes aldehdos, cidos grasos, y alcanos con diferentes
longitudes de cadena. Los primeros intentos para establecer la
produccin de n-butanol en levaduras mediante esta va derivados
acetoacetylCoA result en n-butanol ttulo tan bajos como de slo 2,5
mg/L [16]. Adems de ingeniera y optimizacin de ruta de suministro
del substrato podra aumentar el n-butanol ttulos de hasta 120 mg/L [9,
17]. Sin embargo, estos ttulos fueron obtenidos slo en completa de
material sinttico de alta densidad celular fermentaciones y se revisaron
crticamente en [1].
Como n-butanol en levadura de rendimiento es todava mucho menor
que en
E. coli, se pens que el citosol acetil-CoA como sustrato inicial del nbutanol pathway es un factor limitante [9]. En la levadura, acetil-CoA
est presente en cuatro diferentes compartimentos: el citosol,
mitocondrias, peroxisomes y el ncleo. Citosol acetil-CoA es producida a
travs de la decarboxylation de piruvato en acetaldehdo, el cual es
oxidado a acetato por las aldehdo deshidrogenasas y finalmente
convertidos en acetil-CoA, a expensas de los dos
ATPs. Esta ruta es conocida como piruvato deshidrogenasa
(PDH) bypass. Las aldehdo deshidrogenasas competir con alcohol
dehydrogenases (ADH) debido a que el efecto crabtree convertir la
mayora del azcar derivada de acetaldehdo en etanol [18]. Por otro
lado, acetil-CoA mitocondrial obtenido a travs de piruvato
deshidrogenasa obviamente no puede ser transportado al citosol [19].
Se probaron distintas estrategias para aumentar el nivel de la acetil-CoA
citoslico. En un enfoque, el alcohol dehydrogenases fueron eliminados,
las reacciones de la PDH fueron derivacin sobreexpresado, y la retirada
de acetil-CoA en el ciclo de glioxilato fue impedido [18]. En otro enfoque,
un independiente de ATP complejo piruvato deshidrogenasa de
Enterococcus faecalis fue expresada en el citosol de la levadura la
sustitucin de la PDH bypass, pero depende de la suplementacin con el
cido lipoico [20]. Otra posibilidad de
ATP citoslico independiente acetil-CoA es el uso de la produccin de
acetaldehdo dehydrogenases acetylating piruvato o formiato lyases [21,
22].
Desde la produccin de acetil-CoA citoslico procede de dos sustratos,
acetato y la coenzima A (CoA), el nivel de CoA puede limitar la
produccin de acetil-CoA.
Adems, casi todos los intermediarios de la n-butanol pathway existen
como steres CoA que podra adems disminuir la disponibilidad de CoA.
herefore, presumimos que la ingeniera de CoA biosntesis podra

incrementar an ms la concentracin de acetil-CoA en la levadura, el

resultado- ing en una elevada produccin de n-butanol. CoA biosynthesis se inicia desde el pantotenato. En la levadura, pantotenato puede
producirse a travs de un sendero endgena a partir del 2ketoisovalerate valina, derivada de la va metablica, y espermina,
derivada del -ornitina y metionina [23]. Adems, puede tomarse desde
el medio por el transportista Fen2 [24]. Pantotenato entonces se
convierte en 4-phosphopantothenate por Panto- quinasa thenate Cab1,
que se postula para catalizar el paso limitante de la velocidad en la
biosntesis
del
CoA.
La
Cistena
es
incorporated
por
phosphopantothenate cisteina ligasa Cab2, el cual es dbilmente
reprimida de glucosa como CAB1 [23]. l producto resultante se
convirti finalmente en CoA en tres nuevas medidas [25].
En el presente estudio, se estableci por primera vez y la mejora de la
produccin de n-butanol en S. cerevisiae probando diferentes

Fig. 1 va metablica para la produccin de n-butanol por revertir la -oxidacin en la levadura. La

produccin de n-butanol y revertir la -oxidacin se muestra como un proceso de una o varias rotaciones,
respectivamente, de una acetoacetyl-CoA-ruta de sntesis derivada. Esta ruta puede generar diversos
compuestos
Ss con diferentes longitudes de cadena. Las isoenzimas diferentes utilizados en este estudio (Fig. 2, Tabla 2)
se muestran para cada reaccin. La reaccin de nphT7 (uso de malonil-CoA y acetil-CoA para produccin de
acetoacetyl-CoA) se muestra en azul

Las variantes del acetoacetyl-CoA-derivados sendero. Nos n-butanol

ttulos y rendimientos de hasta 130 20 mg/L y luego mejora la sntesis
de la CoA por la sobreexpresin de 0,012 g/g de glucosa,
respectivamente. Estas son las mayores val- pantotenato cinasa coaA de
E. coli, lo cual no es ues nunca inform de S. cerevisiae en medio
sinttico inhibida por acetil-CoA [23], o a travs de la sobreexpresin de
la acetoacetyl-CoA-derivados de

levadura itinerario Fen2 pantotenato transporter. l nivel de CoA podra

aumentarse aadiendo pantotenato a los resultados y la discusin de
mediano. Por la eliminacin de alcohol y dehydrogenases glycDiscusin y Resultados
Comparacin de diferentes variantes de un
erol-3-fosfato deshidrogenasa genes,
hemos incrementado la acetoacetyl-CoA-derivado del n-butanol pathway
en levadura
disponibilidad de acetaldehdo y NADH como fuerzas impulsoras para el
ingeniero S. cerevisiae para n-butanol pro- para el n-butanol sendero. La
sobreexpresin de un mutante de duccin, nos presenta diferentes
variantes de una ace- forma de acetaldehdo deshidrogenasa toacetyl
acetilante-CoA-derivado del n-butanol va en cen.
podra mejorar an ms la produccin de n-butanol, resultando en
PK113-5D (Figs. 1, 2, 1 archivos adicionales: Figura S1). En

Fig. 2 n-butanol produccin con diferentes variantes de acetoacetyl-CoA-derivado del n-butanol pathways en
S. cerevisiae cepa CEN.PK113-5D. La
Ce Ce eutE eutE EceutE eutE concentraciones de n-butanol despus de 74 h de semi-anaerobios
fermentaciones en medio de SMD son mostradas. Barras de error representan la desviacin estndar de tres
repeticiones independientes. b La enzima respectivas combinaciones de n-butanol pathway vectores son
mostrados. Genes de Saccharomyces cerevisiae (SC), Clostridium acetobutylicum (Ca), la Escherichia coli
(EC), Euglena gracilis (EG), Streptomyces collinus (SCO), Streptomyces sp. CL190 (Ss) y Treponema denticola
(Td) se indica mediante prefijos en superndice

nuestros primeros experimentos, elegimos vectores multicopia por alto

nivel de expresin de genes heterlogos, pero pronto reconoci que el
uso de vectores centromrico gener- aliado result significativamente
mayor en el n-butanol ttulos (datos no mostrados) y tambin un
incremento en la actividad enzimtica de la mayora de las enzimas en
la ruta de los extractos crudos (Tablas 1 y 2).

De hecho, dichos problemas mediante vectores multicopia tambin han

sido reportados por otros [9, 20, 26]. l podra estar relacionado con
problemas de inestabilidad, carga de vectores, o tran- scriptional
obstculos debido al alto nmero de copias y las fuertes promotores.
Por otro lado, incluso sin una ruta heterlogos, adh1 de S. cerevisiae
mutantes son capaces de pro- duce el n-butanol en medio YEPD va
endgena de cido 2-ceto-derivados camino de treonina [11]. Como
observamos resultados comparables en medio con adh YEPD1-5 (VSY0)
y (JDY adh1,3,54) cepas mutantes (n-butanol produccin de 50 mg/l a
120 mg/L; los datos no se muestran), ms todas las fermentaciones se
realizaron en medio mnimo sinttico con 20 g/l de glucosa (SMD), donde
la produccin de n-butanol no fue observado por VSY0 (archivo adicional
1: Figura S2). Para la mayora de las reacciones de los acetoacetyl-CoAderivados pathway, hemos probado sev- eral isoenzimas de diferentes
organismos. Hemos realizado
experimentos de fermentacin (Fig. 2, archivo adicional 1: Figura S1) y
tambin prob la actividad enzimtica en los extractos crudos (Tabla 2).
Hemos probado las diferentes isoformas en diversas combinaciones,
siempre combinadas en un nico plsmido centromrico (Tabla 1). Varias
de las fuertes promotores y termina- tores fueron utilizadas para la
expresin (el archivo adicional 2: Tabla S1).
Combinaciones fueron elegidos debido a la medicin de la actividad
enzimtica y enzimas tambin se cambiaron si fueran asumidas para
catalizar pasos crticos.
Todas las fermentaciones se inici con un OD600 de 0,3 y se realizaron
al menos 100 h con semi-anaer- obic condiciones a 30 C. mayor nbutanol ttulos fueron alcanzados en aproximadamente 74 h con cerca
de 20 mg/L (adicio- nales: Archivo 1 figura S1) l combinaciones de
genes en plas- MID pVS1, 6, 9, 10 y 11 salieron a realizar mejores (Fig.
2). l mal rendimiento de la pVS7 y pVS8 parece ser debido a la baja
actividad de butanol deshidrogenasa codificados por bdhB [27]. Para la
reaccin, la levadura thiolase Erg10 y la enzima C. acetobutylicum thlA
result en la produccin de n-butanol comparable aunque la actividad in
vitro de la enzima bacteriana parece ser considerablemente mayor. Sin
embargo, el anlisis enzimtico se realiza en la reaccin inversa por
conversin de acetoacetyl-CoA en dos acetil-CoA. NphT7 como un
malonil-CoA-dependiente

Tabla 1 Genes de Saccharomyces cerevisiae (SC), Clostridium acetobutylicum (Ca), la Escherichia coli (EC),
Euglena gracilis (EG), Streptomyces collinus (SCO), Streptomyces sp. CL190 (Ss) y Treponema denticola (Td)
se indican mediante preixes en superndice. El MET25 promotor est indicado como "PM25"; otros
promotores estn indicadas en ile adicional 2:
Tabla S1
r kanMX G418 resistencia, resistencia hygromycin hphNT12 nourseothricin natNT, resistencia, resistencia a
ampicilina

acyltransferase Amp, que cataliza una reaccin irreversible con la

enzima combinaciones de pVS6, a causa de [28], slo mejor
ligeramente la produccin de n-butanol pero acetil-CoA-dependiente del
propio levadura thiolase (Erg10) reac- trabaja en detrimento de un ATP
adicional por malo- cin, que es superior a ATP- y malonil-CoA-de--CoA
nyl sntesis. Para la conversin de suming NphT crotonyl-CoA7 de pVS9.
Para butyryl-CoA, el trans-2-enoyl-CoA reductasa enzimas ter [9]
parecen ser superiores a crotonyl-CoA reducSobreexpresin de pantotenato cinasa coaAtase ccr [29] (COMPARE
pVS10 y pVS9). Aunque la adicin de pantotenato aumento y n-butanol

Aunque podramos demostrar la produccin de n-butanol razonable a

partir de la glucosa con la heterloga de acetoacetyl-CoA-derivados

desenderos, los rendimientos y los ttulos son an bajos. Como el

sustrato acetil-CoA y tambin la mayora de los intermediarios de la ruta
estn enlazados a la Coenzima A (CoA)
Hemos especulado sobre la posibilidad de que limitar la disponibilidad
de CoA puede ser una razn para la baja produccin de n-butanol. Por lo
tanto, tratamos de aumentar el CoA descubierta por la optimizacin de
su ruta de sntesis anablica. En la levadura, CoA puede ser producida a
travs de la ruta de sntesis de pantotenato endgena [23] o de forma
exgena pantotenato suministrado.
Hemos sobreexpresado pantotenato cinasa como este paso ha sido
reportado para limitar CoA sntesis [25]. Elegimos la enzima coaA de E.
coli como este no es inhibida por acetil-CoA [30]. Por otro lado, hemos
sobreexpresado la levadura pantotenato transporter Fen2. CoaA y
FEN2
fueron
expresadas
bajo
el
control
del
promotor
methioninerepressible MET25 [31]. El MET25 promotor es el ms activo
en la ausencia de la metionina y gradualmente est reprimida hasta 1
mM la metionina, mientras que 2 mM como una concentracin final fue
escogido para garantizar la represin.
Por lo tanto, las fermentaciones se realizaron en medio de SMD con cepa
CEN.PK113-5D transformada con el PVS6 (n-butanol pathway) y pVS5_4
(coaA) o pVS5_6 (FEN2), con la presencia de diferentes cantidades de
metionina. Con la disminucin de las concentraciones de metionina y por
consiguiente aumentar la expresin de coaA o FEN2, en ambos casos, la
produccin de n-butanol aument hasta 19 y 16 mg/L, respectivamente
(Fig. 3, archivo adicional 1: Figura S3). En realidad, la SMD medio
contiene 0,84 M
pantotenato originarias de la levadura base de nitrgeno (Difco BD YNB).
Sorprendentemente,
la
sobreexpresin
de
adicionales
phosphopantothenoylcysteine sintetasa Cab2 o co-sobreexpresin de
coaA y Fen2 condujo a una disminucin en la produccin de n-butanol
(datos no mostrados). Por razones desconocidas, no fue posible obtener
la levadura transformants que sobreexpresan los tres genes juntos,
incluso cuando se expresa detrs de otros promotores. No obstante, los
resultados indican que la disponibilidad de CoA es ciertamente un factor
limitante para la produccin de n-butanol. Sin embargo, es posible que
tambin otros productos derivados de los CoA aumentara.
Pero,
como
hemos
sobreexpresan
acetylating
acetaldehdo
deshidrogenasa, que necesita CoA para la sntesis de acetil-CoA, la
mayora de los CoA acetil-CoA aumentar la produccin.
Adems, un montn de CoA est enlazado a los intermediarios de nbutanol pathway y no est disponible para otras reacciones.
Para investigar si las concentraciones ms altas de pantotenato pueden
aumentar an ms la produccin de n-butanol, fermentaciones se realiza
con la cepa coaA-que sobreexpresan CEN.PK113-5D (pVS6, pVS5_4) tras
la adicin de 0-50 M pantotenato a SMD mediano (sin la metionina). n-

butanol, la produccin aument ms de 15 mg/L (0 M pantotenato) a

34 mg/l en un pantotenato concentracin de 25 M, pero disminuy
ligeramente a 50 M pantotenato (Fig. 4). No obstante, para aplicaciones
industriales pantotenato adems sera demasiado caro y no es
aceptable. Por lo tanto, nuestros resultados indican que para entornos
industriales que podran ser prometedoras para aumentar el flujo a
travs de la ruta de sntesis de pantotenato endgena junto con
sobreexpresin coaA.
Para todas las fermentaciones importantes en este estudio, n-butanol
ttulos (mg/L) se comparan en la Fig. 5, n-butanol rendimientos (g/g
glucosa) consumidos en el archivo adicional 1: Figura S4, el consumo de
glucosa y la glucosa residual en el archivo adicional 1: Figura

Fig. 3 n-butanol produccin con n-butanol pathway (pVS6) y sobreexpresin coaA bajo control del MET25
promotor (pVS5_4) en el CEN.
PK113-5D con la adicin de metionina. Cinco diferentes concentraciones de metionina se agregaron a SMD
medio: 0 mM (diamante), 0,125 mM (transversal), 0,25 mM (crculo), 0,5 mM (tringulo) y 2 mM (cuadrado).

Fig. 4 n-butanol produccin con n-butanol pathway (pVS6) y sobreexpresin coaA (pVS5_4) en el CEN.PK1135D con adicin de pantotenato.

Cinco diferentes concentraciones de pantotenato fueron aadidos a SMD medio: 0 M (cuadrado), 0,5 M
(tringulo), 5 M (crculo), 25 M (cruz), y 50 M (Diamond). Barras de error representan la desviacin
estndar de tres repeticiones independientes

S5, el etanol y la produccin de glicerol en el archivo adicional 1:

reduccin de acetaldehdo y la consiguiente formacin de valores en el
archivo adicional 1: la figura del etanol. Como era de esperar, se observ
menos etanol pro- figura S6 y S7 de OD600. duccin, pero, por tanto,
una mayor formacin de glicerol como resultado de un aumento de la
oxidacin de NADH alternativa
Eliminacin de alcohol dehydrogenases crea una ruta de
insercin de la levadura
Fermen-para la produccin de n-butanol tations de VSY0 (adh1-5)
transformada con el PVS6 l prximo paso era para redirigir el flujo
metablico de distancia (n-butanol pathway) result en n-butanol de
produccin de los productos de fermentacin predominante a etanol a
30 mg/L (archivo adicional 1: Figura S2), el cual es un signif- n-butanol, y
para aumentar la potencia de redox en forma de icant incremento con
respecto a la cepa de referencia (13 mg/L). herefore NADH, la alcohol
deshidrogenasa genes ADH1- (Fig. 5) efecto de la CoA elevado
suministro tambin fue probado 5 fueron eliminados para reducir el
NADH-dependiente en esta cepa introduciendo pVS5_4 (coaA) junto con

Fig. 5 Comparacin de n-butanol con diferentes cepas de produccin. n-butanol concentraciones despus de
74 h de semi-anaerobios fermentaciones en SMDA267T/E568K medio son mostradas. En comparacin son las
fermentaciones del wildtype CEN.PK VSY113-5D0 (adh1-5), y VSY8 (adh1-5 SFA1 con adhE ) con el
plsmido SPV6 (n-butanol pathway), con o sin sobreexpresin coaA (pVS5_4) y la CEPA VSY10 (adh1-6 SFA1
gpd2, con n-butanol caminoUn267T/E568K forma genes de pVS6, coaA y adhE ), la ausencia o la presencia de ms de 25 M
pantotenato, en medio de SMD. Barras de error representan la desviacin estndar de tres repeticiones
independientes y un anlisis estadstico se muestra en el archivo adicional 2: Tabla S4

pVS6. n-butanol produccin fue significativamente mayor en el adh1-5

supresin cepa con sobreexpresin coaA (52 versus 30 mg/L) (archivo

adicional 1: Figura S2, Fig. 5). Despus de la adicin de 25 M

pantotenato, el final de n-butanol ttulo incluso aument hasta 71 mg/L
en el adh1-5 (pVS6, pVS5_4) cepa (archivo adicional 1: Figura S8, Fig.
5). Estos resultados indican que la provisin de ms sustrato en forma
de acetaldehdo y ms se reduce la potencia en forma de NADH puede
aumentar la produccin de n-butanol.
Mejorar la produccin de n-butanol con acetilante acetaldehdo
deshidrogenasa
En la levadura, el citosol acetil-CoA se produce principalmente por acetilCoA sintetasas ACS1 y 2 [18]. Se ha demostrado antes que la acetil-CoAproductos dependientes formadora puede incrementarse aumentando la
formacin de acetil-CoA [8, 32]. Sin embargo, acetil-CoA sintetasas
utilice hydroly- sis de ATP a AMP que no es favorable para la produccin
de n-butanol anaerbica, ya que slo la gluclisis y no res- piration
puede proporcionar ATP. herefore, probamos si la expresin de un ATP
acetylating independiente acet- aldehdo deshidrogenasa de E. coli,
adhE, pueden aumentar an ms la produccin de n-butanol.
Normalmente, la enzima cataliza la adhE reduccin de acetil-CoA en
etanol.
Membrillo-Hernandez y colaboradores [33] logr en ingeniera la enzima
realizan principalmente la reaccin inversa de la conversin de
acetaldehdo en acetil-CoA.
l acetaldehdo deshidrogenasa especfica actividad podra aumentarse
cambiando dos aminocidos: A267T y
A267T/E568K E568 K. Por esta razn, hemos optado por utilizar adhE
para aumentar la acetil-CoA citoslico piscina. l
un mutante267T/E568K alelo adhE podra complementar el defecto de
crecimiento de una cepa mutante acs2 en medio de glucosa, indi- cating
que es funcional en levadura (datos no mostrados) [21, 22]. Hemos
integrado este alelo, expresada bajo el control de la fuerte mediante
gliclisis PFK1 promotor, en la SFA1 locus resultantes de la cepa VSY8.
Como SFA1 codifica un adicional pero menor alcohol deshidrogenasa
[34], elegimos este locus de integracin para estabilizar la tensin y
para pre- venir la ocurrencia de supresor de productores de etanol de
mutantes. Sorprendentemente, las fermentaciones de VSY8 express- ing
el n-butanol pathway (pVS6) mostraron casi ninguna produccin de nbutanol, pero el aumento de la produccin de etanol en su lugar (Fig. 5,
archivo adicional 1: Figura S6). Una razn
un267T/E568K podra ser que convierte principalmente adhE acetalde hyde o acetil-CoA en etanol si no hay suficiente espacio en la CoA, el
segundo sustrato para el acetylating acet- aldehdo deshidrogenasa,
disponibles. De hecho, los biocombustibles Biotechnol Schadeweg y
boles (2016) 9:44

sobreexpresin de coaA concomitante de etanol y reducido aumento del

n-butanol formacin (archivo adicional 1: Figura S9, archivo adicional 1:
Figura S6). Por otro lado, podra ser posible que el alcohol dehydroge
adicionales- nase gen ADH6 es upregulated bajo esas condiciones.
De hecho, cuando la ADH6 fue eliminado por integracin de coaA, una
reduccin an mayor en la formacin de etanol podra ser observada
[Rendimiento calculado para etanol: 0,1 g/g de glucosa en VSY10 y 0,13
g/g en VSY8 (pVS6, pVS5_4)] (archivo adicional 1: Figura S6). En
fermentaciones del adh1-5, un267T/ adhE
E568K-cepa que sobreexpresan VSY8 (pVS6, pVS5_4), n-butanol
produccin fue aumentada hasta 75 mg/L, lo que supone una importante
mejora en comparacin con la A267T/E568K de tensin sin adhE
sobreexpresin (52 mg/L) (Fig. 5). Para aumentar an ms la
disponibilidad de CoA, hemos agregado 25 M pantotenato que result
en hasta 95 mg/L de n-butanol produccin (Fig. 5, archivo adicional 1:
Figura S9).
Estos resultados muestran que el aumento del citosol acetilUn267T/E568K CoA sntesis por adhE mejore la produccin de n-butanol,
especialmente cuando se combinan con niveles elevados de sntesis de
CoA. Debe sealarse que, aunque hemos utilizado butyraldehyde
deshidrogenasa eutE en pVS6, que tambin fue demostrado para
convertir el acetaldehdo en acetil-CoA [22], no hemos podido observar
una clara mejora en la produccin de n-butanol debido a esta actividad.
Interrupcin de la sntesis de glicerol a travs de integracin
cromosmica del n-butanol pathway genes en GPD2 aumenta an ms
la produccin de n-butanol GPD2 codifica el Glicerol-3-fosfato
deshidrogenasa II, que es la principal enzima para produccin de glicerol
en levadura en condiciones anaerobias [35]. La produc- cin de glicerol
se utiliza para re-oxidar un excedente de NADH. Eliminacin de GPD2
podran aumentar an ms los niveles de NADH en el adh supresin
mutantes [36] y por lo tanto poda empujar la produccin de n-butanol.
Adems, a fin de superar los efectos negativos del uso de diferentes
plsmidos decidimos inte- rallar coaA en el ADH6 locus de VSY8
(resultante de la cepa VSY9), y el n-butanol pathway genes de pVS6 en
el GPD2 locus de cepa VSY9, que finalmente resultan en tensiones
VSY10. Las fermentaciones de cepa VSY10 result en n-butanol ttulos
de hasta 108 mg/L, que es significativamente ms elevada en
comparacin con la cepa parental basado en plsmidos VSY8 (pVS6,
pVS5_4; 75 mg/L) (Fig. 5) l aumento podra deberse tanto a la
integracin estable de n-butanol pathway genes en el genoma, as como
la reduccin de glyc- erol produccin [Rendimiento calculado para
glicerol: 0,17 g/g de glucosa en VSY10 y 0,27 g/g en VSY8 (pVS6,
pVS5_4)] (archivo adicional 1: Figura S6). No obstante, VSY10 no
consumen toda la glucosa (archivo adicional 1: Figura S5).
Esto puede ser debido a la supresin de la adh1-6, sfa1 y gpd2,
resultando en la oxidacin de NADH ineficientes. l introdujo la

capacidad del n-butanol pathway obviamente no es fuerte lo suficiente

como para compensar esta deficiencia. Su tambin puede ser visto por
los valores medidos OD600. Sin supresiones, el wildtype es capaz de
llegar a un OD600 de alrededor de 6, pero todas las cepas de dele- cin
no alcanz ms de un OD600 de alrededor de 2, a excepcin de VSY8
(pVS6), que produce etanol en lugar de n-butanol (archivo adicional 1:
Figura S7). Como resultado del consumo de glucosa incompleto el nbutanol, rendimiento de VSY10 (0,01 g/g de glucosa) es mucho mayor
que la de todas las fermentaciones con VSY8 (hasta 0,0057 g/g) (archivo
adicional 1: Figura S4), adems de 25 M pantothen- comi aument el
rendimiento de n-butanol de cepa VSY10 de hasta 0.012 g/g (archivo
adicional 1: Figura S4), resultando en un ttulo de 130 20 mg/L (Fig. 5,
archivo adicional 1: Figura S10). La suya es a nuestro conocimiento el
ttulo ms alto hasta ahora reportada para la produccin de n-butanol en
material sinttico en la levadura a travs de un acetoacetyl-CoAderivado del n-butanol sendero.

Conclusiones
En comparacin con sistemas bacterianos, n-butanol en S. cerevisiae a
travs de produccin heterloga de acetoacetyl-CoA-derivados pathways
es muy baja. l razn para esto no est totalmente comprendida.
Nuestros resultados confirman que varias razones contribuyen a la baja
eficiencia del n-butanol de produc- cin en la levadura. Por ingeniera
gradual de diversos aspectos de la produccin de n-butanol, podramos
aumentar gradualmente el n-butanol ttulos y rendimientos. Por
supuesto, un aspecto muy importante fue la composicin de la ruta
heterlogos.
Probando diferentes para las distintas reacciones de las isoenzimas,
podramos establecer una va funcional. n-butanol de pro- duccin se
increment posteriormente por la estabilidad de la expresin de los
genes heterlogos. Expresin de centromrica plas- MID era claramente
superior a la expresin de plsmidos multicopia (Tabla 2). Otros aspectos
importantes fueron la ele- vacin de acetaldehdo y niveles de NADH por
reduccin de la alcohol deshidrogenasa actividades y sntesis de glicerol.
Adems, la creciente disponibilidad de acetil-CoA por medio de una
forma mutante de acetaldehdo dehydroge acetilante- nase de E. coli
mejor an ms la produccin de n-butanol.
Sin embargo, nuestros resultados indican que los niveles de CoA libre
obviamente en S. cerevisiae estn limitando la produccin de n-butanol.
Por Aumento de la sntesis de la CoA a travs de la sobreexpresin de
pan-quinasa tothenate coaA de E. coli y alimentando pantoth- enate al
medio, n-butanol podra aumentar los niveles de produccin de hasta

130 20 mg/L, el nivel ms alto jams alcanzado en la levadura a

travs de un derivado de acetoacetyl-CoA va en medio sinttico.
Mtodos
Cepas y media
Todas las cepas de levaduras utilizadas en este trabajo se enumeran en
la Tabla 1.
l had cepas de eliminacin se basa en cepa JDY4 (MATa; ura3-52; PRT1289; leu2-3_112; su3 1; MAL2-8C; Suc2 adh1::loxP adh3::loxP
adh5::kanMX) (lab existencias y boles Boles Schadeweg Biotechnol
Biocombustibles (2016) 9:44 group), que fue construido a partir de la
cepa CEN.PK484 (EUROSCARF, Frankfurt).
S. cerevisiae fue cultivada en YEPD medio (10 g/L de extracto de
levadura, 20 g/L de peptona bacteriolgica, 20 g/L de glu- cose sinttico)
o mnima (SMD), Mediano (1,7 g/L de levadura sin base de nitrgeno
aminocidos, 5 g/L el amonio sul- suerte, 20 mM fosfato monopotsico,
complementado con el uracilo (0,171 mM), leucina (0,439 mM),
triptfano (0,093 mM), y la histidina (0.227 mM), 20 g/l de glucosa) a
30. Medios sintticos se han ajustado a pH 6,3 con hidrxido potassium. l era fuente de carbono autoclavar sepa- rado y agregado
posteriormente. Si es necesario, el medio suplementado con G418 (200
g/mL), hygromycin B (200 g/mL), y/o clonNAT/nourseothricin (100
g/mL) para la seleccin de kanMX, hphNT1 y/o marcadores natNT2,
respectivamente.
Escherichia coli DH10b se utiliza para procedimientos de clonacin y se
cultiva en el caldo lysogeny (LB) a 37 C con 100 g/ml de ampicilina
para seleccin de plsmidos.
El plsmido y cepa construccin
Plsmidos fueron reunidos a travs de la recombinacin homloga en
levaduras con hasta 20 fragmentos superpuestos con superposiciones
de 50 pb. Todos los genes heterlogos fueron codn optimizadas segn
las levaduras mediante gliclisis codn uso [37]. l Eg focalizacin
mitocondrial secuencia de ter fue excluido
Ca [38] y el codn de inicio y bdhB Scoccr fue cambiado de GTG en ATG.
En el archivo adicional 2: Tabla S2, una lista de genes utilizados con
identificadores est disponible. Restringir- cin de sitios fueron incluidos
en el pedido para cambiar secuencias. Si las secuencias dentro de un
plsmido fueron cambiados, la Asamblea de la correspondiente columna
vertebral y la nueva secuencia se realiza a travs de Gibson General
mtodo [39]. La levadura fue transformada segn protocolos por Gietz y
Schiestl [40, 41] con solo fragmentos generados por PCR usando
cebadores se muestra en el archivo adicional 2: la tabla S3. junt
plsmidos fueron recuperados por DNA prepa- raciones y transformado
en E. coli para amplificacin por procedimientos estndar. Restriccin

digestin anlisis de secuenciacin de ADN y verificado los constructos.

l plsmidos integrativos fueron generados por los sucesivos de la
escisin de 2 o CEN6ARS4 origen y la regin AmpColE1 y el casete fue
integrado a travs de la recombinacin homloga con 400 bp salientes.
Marker rescate fue llevada a cabo por el sistema Cre/loxP recombinase
con kanMX, hphNT1 o natNT2 marcadores. Integraciones de genoma y
eliminaciones fueron confirmados por anlisis de PCR; cartillas estn
enumerados en el archivo adicional 2: la tabla S3.
Fermentaciones y n-butanol, anlisis de produccin
Para probar la produccin de n-butanol de las diferentes cepas, preculturas fueron inoculadas en medios YEPD y crecido en aerobiosis en
fase exponencial. Despus de lavados,
Pgina 10 de 12 a 40 mL de medio SMD fue inoculado con un inicio
OD600 de 0,3 y cultivados durante al menos 100 h. estos lotes se
realizaron fermentaciones semi-anaerbicamente con un tapn de
caucho y un bloqueo de fermentacin selladas matraces de 100 mL en
un agitador magntico con 120 rpm a 30. Las muestras fueron
colectadas en 0, 6, 25, 50, 74 y 100 h para determin- nacin de
densidad celular y para el anlisis por HPLC, insertado a travs de una
aguja y jeringa estril.
Para cuantificar las concentraciones de n-butanol, las muestras fueron
centrifugadas y 450 l del sobrenadante fue mezclado con 50 l del 50
% (p/v) de 5-cido sulfosalicylic y se centrifuga de nuevo (10 min, 4 C,
16.000g). l Sam- ples fueron analizados en un sistema + UHPLC por
hermo cientfico (Dionex UltiMate 3000) equipado con un carbohidrato
XP HyperREZ H + 8 m de columna y un detector de ndice de refraccin
(hermo Shodex RI-101). l HPLC fue operado a 65 C con 5 mM de cido
sulfrico y un caudal de 0,6 ml/min. el n-butanol, glucosa, etha- nol,
glicerol y piruvato fueron utilizados como normas con concentraciones
de 0,5 a 20 g/L. Estndar adicional de las concentraciones de n-butanol
fueron de 0,0125 hasta 0,25 g/L.
Los ensayos enzimticos
Para los ensayos enzimticos, CEN.PK113-5D con las respectivas
plsmido fue inoculado en 50 ml de medio lquido YEPD con antibiticos
correspondientes y crecido en aerobiosis a un OD600 de 0,8-1. que las
clulas fueron centrifugadas y lavada con agua. l pellet celular fue
resuspendido en 500 l de tampn de enzima respectivos y luego
lisadas por la adicin de volmenes 2/3 perlas de vidrio ( 0,25-0,5 mm)
y a 10 minutos de agitacin en un VXR Vibrax bsica (IKA) a 2000 rpm.
Restos celulares fue peleteado por centrifugacin (10 min, 16.000g, 4
C) y el sobrenadante fue utilizado como un extracto celular.
Concentracin de protenas se midi por el mtodo de Bradford con un
kit (Carl-Roth Roti-Quant GmbH y Co). Todos los ensayos enzimticos se

realizaron utilizando Ultro- spec 2100 pro espectrofotmetro (GE

Healthcare, EE.UU.) a 30 C en condiciones aerobias. Para cada reaccin,
un volumen de 200 l fue utilizado, mientras que 10 l de extracto
celular de protenas con concentraciones de 0,05 a 5 g/l.
l se utiliz la determinacin de la actividad enzimtica se llev a cabo
mediante el clculo de la pendiente de las secciones lineales de
absorbancia ver- sus tiempo, utilizando GE Healthcare\Datrys\Resolucin
y los respectivos coeficientes de extincin molar.
hiolase (Erg10, thlA) se midi la actividad con acetoacetyl-CoA de 0,2
mM y 0,2 mM CoA como sustratos y la disminucin de acetoacetyl-CoA
concentracin se mide a 303 nm. l tampn de reaccin contena 100
mM Tris-HCl 10 mM de MgCl2 y 1 mM de TDT con pH 8. l reaccin fue
iniciado por la adicin de extracto celular. Para determin- nacin de la
actividad enzimtica, el factor de extincin molar -1 -1 = 14 mM cm
fue utilizado (basado en [5, 15]).
Hydroxybutyryl-Couna deshidrogenasa (hbd) se midi la actividad con
0,1 mM de acetoacetyl-CoA como sub - strate y 0,23 mM NADH como
cofactor. l disminucin en la concentracin de NADH a 340 nm fue
monitoreada. l tampn de reaccin contena 50 mM, 15 mM de MOPS
MgCl , 2 de
1 mM y 5 mM EDTA, pH 7,3 con TDT. l reaccin fue iniciado por la
adicin de acetoacetyl-CoA [42].
Crotonase (CRT), la actividad se mide con 0,1 mM crotonyl-CoA como
sustrato. l disminucin de absorcin a 263 nm (interrupcin de la -
saturacin de croto - nyl-CoA) fue monitoreada. l tampn de reaccin
contena 100 mM Tris-HCl, pH 7.6. l reaccin fue iniciado por la adicin
de extracto celular. Para la determinacin de la
actividad de la enzima -1, el factor de extincin molar = 6.7 mM - 1 cm
fue utilizado [7].
Trans-2-enoyl-CoA reductasa (TER), la actividad se mide con 0,5 mM
crotonyl-CoA como sustrato y 0,46 mM como cofactor NADH y FAD 2 M.
La disminucin en la concentracin de NADH a 340 nm fue monitoreada.
El tampn de reaccin contena 100 mM fosfato de potasio, pH 6,2. La
reaccin fue iniciado por la adicin de crotonyl-CoA [38]. Butyraldehyde
deshidrogenasa (adhE2, eutE) se midi la actividad con 1 mM butyrylCoA como sustrato y 300 M NADH como cofactor. La disminucin en la
concentracin de NADH a 340 nm fue monitoreada. El tampn de
reaccin contena 100 mM Tris-HCl y 5 mM la TDT a pH 7.5. La reaccin
fue iniciado por la adicin de butyryl-CoA [7].
El butanol-deshidrogenasa (adhE2, bdhB) se midi la actividad de 50 mM
butyraldehyde como sustrato y 300 M NADH como cofactor. La
disminucin en la concentracin de NADH a 340 nm fue monitoreada. El

tampn de reaccin contena 100 mM Tris-HCl y 5 mM la TDT a pH 7.5.

La reaccin fue iniciado por la adicin de enfriado
butyraldehyde [7]. A:Acetyl-Comalonil-CoA (nphT acyltransferase7) se
midi la actividad con acetil-CoA de 0,4 mM y 0,4 mM de malonil-CoA
como sustratos y el aumento de acetoacetyl-CoA concentracin se mide
a 303 nm. El tampn de reaccin contena 100 mM Tris-HCl 10 mM de
MgCl2 y 1 mM de TDT con pH 8. La reaccin fue iniciado por la adicin
de extracto celular. Para la determinacin de la actividad enzimtica, el
factor de extincin molar
= 14 mM-1 cm-1 fue utilizado (sobre la base de [5, 28]). CrotonylCouna reductasa (CCR) se midi la actividad con 0,5 mM crotonyl-CoA
como sustrato y 0,46 mM NADPH como cofactor. La disminucin en la
concentracin de NADPH a 340 nm fue monitoreada. El tampn de
reaccin contena 100 mM fosfato de potasio, pH 6,2. La reaccin fue
iniciado por la adicin de crotonyl-CoA (sobre la base de [38])