UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

PROFESOR:
ALEXANDER
ALUMNA:
ELIZABETH
CICLO:
HORARIO:

ING. SNCHEZ GONZALES, JESS

MARTNEZ SALDAA, YURICO
IX
JUEVES 11-1PM

LABORATORIO N 03.

DETERMINACIN DE BIOMASA
PESO HMEDO, PESO SECO, TURBIDIMETRA

I.

OBJETIVOS
Determinar la concentracin en Peso hmedo (g mH/mL) y Peso Seco (g mS/mL) de una solucin
celular y ver que mtodo es ms efectivo.
Calcular el coeficiente de variabilidad de las tres repeticiones en Peso Hmedo y Peso Seco de la
levadura de pan.
Determinar la biomasa de una solucin celular desconocida mediante el mtodo de turbidimetra
Determinar la cantidad de microorganismos en una muestra mediante la aplicacin de diferentes
mtodos.
Hallar el factor de conversin para cada caso, mediante la Curva de Calibracin.
Determinar el Porcentaje de Error de los factores de Conversin, relacionando los datos.

II.

FUNDAMENTO TERICO

Biomasa es un trmino general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. A la vez
tambin se puede referir como la cantidad de clulas, de personas o masa de seres vivos. El objetivo de la
biomasa es la reproduccin de clulas.
La determinacin de la biomasa es una de las variables ms importantes de un bioproceso ya que su
determinacin nos lleva a la comprensin de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clave para
establecer las tasas de produccin, de consumo de nutrientes y el clculo de los balances de masa de
cualquier proceso biolgico. Los mtodos clsicos de determinacin de biomasa son mtodos directos que
se basan en el nmero de clulas o en el peso celular. Para determinar la biomasa es necesario calcular el
nmero de clulas en una determinada muestra. Esto es importante en ciertas circunstancias; por ejemplo,
para determinar la inocuidad de muchos alimentos o drogas se requiere cuantificar los microorganismos en
esos productos. Los mtodos para estimar el nmero de microorganismos pueden medir la cantidad de
clulas, la masa celular o la actividad celular. Los mtodos que cuantifican la cantidad de clulas son tiles
principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o
actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en
los que es difcil cuantificar las clulas individuales.
A. Medida de biomasa

La medida de la masa de los constituyentes de la clula bacteriana es utilizada frecuentemente como base
para la medida de una actividad metablica, o de un constituyente metablico o qumico. Algunos de los
mtodos para cuantificar la biomas son obvios y confiables, pero pueden volverse complicados si se
busca exactitud.
1. Peso hmedo
Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin de las clulas por
filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para grandes volmenes de muestra. La principal desventaja
es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La
cantidad de lquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas muy
empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la
forma y deformacin celular.
Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de lquido que queda retenida en el espacio
intercelular luego de una centrifugacin, para ello se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el
Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.
2. Peso seco
La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en trminos de peso seco por
unidad de volumen, ya sea como slidos en suspensin totales (SST) o slidos en suspensin voltiles
(SSV). Las clulas se separan del lquido bien por centrifugacin bien por filtracin. Se expresan en
g.m.s/mL.
La principal desventaja de estas tcnicas es que su determinacin incluye no slo microorganismos activos
sino microorganismos muertos, material inerte, polmeros extracelulares y materia orgnica adsorbida.
Adems, no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles. Los mtodos gravimtricos
son simples, pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles. A la vez este mtodo este mtodo
los componentes voltiles de las clulas pueden perderse en el secado y puede existir alguna degradacin.
Tambin la muestra seca pude recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene
humedad relativa alta.
3. Absorcin
Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte de la luz es reflejada,
parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometra mide la luz dispersada por
una solucin de partculas. La turbidimetra mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz

transmitida a travs de la solucin. Con relacin a la longitud de onda y al tamao de la partcula pueden
existir tres tipos de dispersin.
Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el crecimiento de los
cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden llevar a resultados errneos. Principalmente,
dan informacin sobre el peso seco (contenido macromolecular).
Turbidimetra
La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una suspensin y
cuantifica la luz residual transmitida. Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones
diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma
absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la
absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del
microorganismo.
Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partcula o por UFC (Unidad Formadora de
Colonia) cuando los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes. Por esta razn, para estimar el
nmero de microorganismos totales o el nmero de microorganismos viables de una suspensin
bacteriana debe realizarse una "curva de calibracin" con cada tipo de microorganismo, slo de esta forma
es posible relacionar Absorbancia (Densidad ptica) con el nmero de microorganismos totales o con
UFC.

Figura 1. Absorbancia en funcin del Peso Seco

K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del

microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0).

Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (g/ml-mg/ml).

La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones diluidas de
bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores
producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas
puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorcin.

Figura 2. Absorbancia en funcin del Peso Seco

III.

MATERIALES Y MTODOS
A. Materiales e instrumentos
Materiales

Levadura de panificacin Fleishmann

Agua destilada
Tubos de ensayo
Lminas cubreobjetos
Vaso de precipitacin
Pipeta
Jeringa

Equipos

Centrifugadora
Microscopio
Estufa (105C por 3 horas)
Balanza electrnica
Cmara de Neubauer
Espectrofotmetro

B. Metodologa
a) Para determinacin de Peso Hmedo

Figura 3. Absorbancia en funcin del

Nmero de Microorganismos Totales

Se tomaron muestras de 5 mL de la solucin inicial y se colocaron en tres tubos de

ensayos previamente pesados.
Luego los tubos son llevados a la centrifuga donde se hacen girar a 4 000 RPM, por un
tiempo de 10 minutos.
Luego pasamos a pesar cada tubo de ensayo en la balanza analtica, anotamos los
pesos y luego promediamos.
En Seco la solucin no tiene que estar muy
diluida, con este mtodo se mide la levadura
Fleischmann
Se tomaron muestras de 5 mL de la solucin inicial y se colocaron en tres tubos de
ensayos previamente pesados.
Los tubos de ensayo son llevados a la centrifuga donde se hacen girar a 4 000 RPM, por
un tiempo de 10 minutos.
Luego pasamos a pesar cada tubo de ensayo en la balanza analtica y anotamos los
pesos.
Posteriormente, se llevan los tubos a estufa, a una temperatura de 105 C por un tiempo
promedio de 3 horas.
Pasado el tiempo anotaremos, los pesos y luego pasamos a sacaremos un promedio.

b) Para determinacin de Peso Seco

Figura 4. Metodologa de Peso Hmedo y Peso Seco.

Las ecuaciones que se determinarn son:

Peso Hmedo g

mH ( Peso Tubo+ Muestra Hmeda )( Peso InicialTubo )

=
mL
Volumen de Muestra ( 5 mL)

mS ( Peso Tubo+ Muestra Seca )( Peso Inicial Tubo )

=
mL
Volumen de Muestra( 5 mL)

( )

Peso Seco g

Hallaremos el coeficiente de Variabilidad de las 3 repeticiones.

c) Para determinacin de turbidimetra

Mtodo Indirecto
Se prepar una solucin acuosa con levadura, a partir de la cual se procedi a preparar
diluciones ( 4/5, 3/5, 2/5, 1/10, 1/30, 1/50, 1/100)

De la muestra original se tom 5 ml en dos tubos para determinar la concentracin en

peso seco y peso hmedo.

Para determinar la concentracin por conteo celular se tom una muestra de la dilucin
1/100.
Con todas las diluciones y muestra original se procedi a colocarlas uno por uno en
celdas para leer la absorbancia en el espectrofotmetro.
Con estos datos se pas a realizar las siguientes graficas absorbancia vs peso seco,
absorbancia vs peso hmedo y absorbancia vs conteo celular.
Se prepar una solucin desconocida con la finalidad de determinar el porcentaje de
error (%Error), en la realizacin de la prctica, utilizando los diferentes mtodos
empleados.

Figura 5. Metodologa de Turbidimetra.

IV.

RESULTADOS Y DISCUSIONES
A. Para Peso Seco y Peso Hmedo
Tabla1. Peso Seco y Peso Hmedo de las muestras conocidas de 5ml

Muestra
Original

W Tubo
vaco(g)

W tubo + muestra
hmeda (g)

W tubo + muestra
seca (g)

Peso en
hmedo (g/mL)

Peso en seco
(g/mL)

7,4625

7,9003

7,5198

0,0876

0,01146

6,4196

6,8065

6,4859

0,0774

0,01326

9,7336

10,1598

9,80321

0,0852

0,0139

PROMEDIO

0,0834

0,0129

0,0053

0,00128

CV

0,0730

0,0357

Tabla 2. Peso hmedo y peso seco de las muestras desconocida de 5 ml

W Tubo
vaco(g)

W tubo + muestra
hmeda (g)

W tubo + muestra
seca (g)

6,5821

6,7484

6,5989

Peso en
Peso en seco
hmedo (g/mL)
(g/mL)

0,03326

0,00336

B. Para Turbidimetra
En la Cmara Neubauer se escogi 5 celdas al azar para
tener una muestra representativa de la cual se obtuvo una
muestra original de 1210000000 cel. /ml.

Tabla 3. Peso Hmedo, peso Seco, Absorbancia y Conteo Celular de la muestra original y de cada
dilucin.
Diluciones

Concentracin

Conteo celular
(cel/ml)

Absorbanci
a

Peso hmedo
(g/ml)

Peso hmedo
(g/ml)

Muestra
original

1210000000

2,499

0,083393333

0,012880667

4/5

0,80

968000000

2,413

0,066714667

0,010304533

3/5

0,60

726000000

2,268

0,050036

0,008243627

2/5

0,40

484000000

2,065

0,033357333

0,006594901

1/10

0,10

121000000

1,265

0,008339333

0,005275921

1/30

0,03

40333333,33

0,603

0,002779778

0,004220737

1/50

0,02

24200000

0,428

0,001667867

0,003376589

1/100

0,01

12100000

0,482

0,000833933

0,002701272

ABSORBANCIA vs. PESO HMEDO

3
f(x) = 25.93x + 0.7
R = 0.87

2
Absorbancia

1
0
0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

Peso hmedo (g/ml)

Figura 6. Relacin absorbancia vs peso hmedo.

De la Muestra problema se obtuvo una absorbancia de 1.671 y 179000000 cel. /ml. Esto se obtuvo igual
que para muestra original, escogiendo 5 cuadrados al azar en la cmara de Neubauer.

Tabla 4. Porcentaje de error Ecuacin y de la muestra en peso hmedo.

ECUACIN

25,93x + 0,701

ABSORBANCIA

1,671

PESO HMEDO REAL

0,03326

PESO HMEDO
TERICO

0,037408407

ERROR (%)

-12,47266161

ABSORBANCIA vs. PESO SECO

3
f(x) = 234.06x - 0.07
R = 0.84

2.5
2
Absorbancia

1.5
1
0.5
0
0

0.01

0.01

0.01

Peso seco (g/ml)

Figura 7. Relacin absorbancia vs peso seco

Tabla 5. Ecuacin y porcentaje de error de la muestra en peso seco
ECUACIN
ABSORBANCIA
PESO SECO REAL

234,0x - 0,065
1,671
0,00336

PESO SECO TERICO

0,007418803

ERROR (%)

-120,7977208

0.01

0.01

ABSORBANCIA vs. CONTEO DE CLULAS

Absorbancia

f(x) = 0x + 0.7
R = 0.87

Conteo de clulas (cel/ml)

Figura 8. Relacin absorbancia vs conteo celular

Tabla 6. Ecuacin y porcentaje de error de la muestra en conteo celular

ECUACIN
ABSORBANCIA

1,671

CONTEO DE
CLULAS REAL

179000000

CONTEO DE
CLULAS TERICO
ERROR (%)
Segn Arniz, et al (1992),

2E-09x +
0,701

4,85E-10
100
el peso hmedo se obtiene a

partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin de las clulas por filtracin o
centrifugacin. Demostrando una tcnica til para grandes volmenes de muestra. La principal desventaja
es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. Esto se
puede contrastar en la Tabla 1, hay una diferencia entre el peso hmedo y el peso seco debido a que el
primero contiene agua del diluyente de la solucin. Este peso hmedo tiene una masa de 0,0834 gramos lo
cual representa a 1210000000 clulas. De modo que las clulas estarn hidratadas y gran parte de ellas
podran ser visibles.
Segn Gil (2003), el recuento de clulas por rea presentes en una solucin, su coeficiente de variacin se
encuentra dentro de lo aceptable si no hay mucha diferencia significativa, ya que dentro de la
determinacin de biomasa, su variacin poda ser significativamente cuando es menor (CV= 12,3 %),
indicando que la exactitud de la determinacin vara con los laboratorios y el personal. Esto se comprueba
con las muestras de peso seco y hmedo calculadas donde se obtienen valores menores al mencionado:

7.304% en cuanto a peso hmedo y 3.57% en peso seco; de lo que hay un mnimo error significativo esto
se puede atribuir por el pesado y una buena maniobrabilidad con los objetos de laboratorio.
Segn Rodrguez, et al ( 2005), nos seala que para que sean visibles las trazas de turbidez es necesario
ms de un milln de clulas por ml., como para ser medida por un espectrofotmetro. Por lo que la
turbidimetra no es un mtodo til para medir la contaminacin de lquidos para un nmero relativamente
pequeo de bacterias y o levaduras. Se comprob en la prctica con xito en el experimento ya que tanto
la muestra original analizada como la muestra problema sobrepasaban dicha cantidad,; adems, todas las
muestras de concentraciones diferentes se leyeron 550nm de longitud de onda, cercano a 540 nm,
(longitud de onda comnmente utilizada para la determinacin de crecimiento por el mtodo de
turbidimetra en las investigaciones).
Segn Toro (2005), la relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones
diluidas de bacterias. Sus absorbancias no deben ser mayores a 0.3, ya que valores mayores producen
desviaciones. Esto se comprob con el peso Seco de la muestra problema, su peso real y su peso terico,
presentando estos un % de error mayores y donde su absorbancia result 1.671.
V.

CONCLUSIONES

Se determin la biomasa de la levadura Fleischamn mediante el mtodo de peso hmedo, peso seco y

por turbidimetra, encontrando su Absorbancia y su variabilidad.

La determinacin de biomasa mediante peso seco y peso hmedo es un mtodo fcil y rpido de
realizar pero que tambin es un mtodo impreciso debido a diversos factores que se presentan en

laboratorio.
Encontramos el factor de conversin para cada caso, logrando construir la curva de calibracin y hallar
el factor de conversin en los tres mtodos para determinar sus resultados tericos comparndolos con

los reales, obtenidos en laboratorio.

Determinamos el porcentaje de error.
VI.

RECOMENDACIONES

Para obtener una muestra homognea se debe agitar la muestra antes de colocarlas en las celdas

y de esta manera evitar errores en las lecturas del espectrofotmetro.

El llenado en las celdas de la cmara de Neubauer se debe hacer correctamente para evitar que

se pierda parte de la muestra.

Calibrar el espectofmetro antes de tomar las medidas, ya que este pudo haber sido utilizado con
otras sustancias en experimentos anteriores. Del mismo modo calibrar la balanza analtica par que
nuestro porcentaje de error sea mnimo.

El llenado correcto de la muestra en la cmara, se debe realizar de modo que no se derrame en la

lmina cubre objeto la solucin. De esta manera haremos el conteo.

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

ARNIZ,C., ISAC,L. Y LEBRATO, J. (2000).Determinacin de la biomasa en procesos biolgicos. Sevilla.

GIL, E. (2003). Elementos clave en la uniformidad de distribucin de abonos. Escuela superior de
agricultura de Barcelona.
RODRGUEZ, E., GAMBOA, M.,
HERNNDEZ, F Y GARCA, J.
(2005).

Bacteriologa

Principios

General:

prcticas

de

laboratorio. Editorial Universidad

de

Costa Rica.
TORO R. (2005), Manual de

Introduccin al Laboratorio De Microbiologa, editorial universidad de caldas,

2005.

ANEXOS