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doi:10.15174/au.2015.906
RESUMEN
La ingeniera gentica de plantas permite la manipulacin directa del cido desoxirribonucleico (DNA, por sus siglas en ingls), posibilitando la creacin de nuevos genes (transgenes), usando elementos provenientes de varios organismos y la introduccin de stos en
plantas (plantas u Organismos Genticamente Modificados [OGM]) para conferirles nuevas
caractersticas. Los principales cultivos OGM son la soya, el maz y el algodn. Mxico est
expuesto a liberaciones no controladas de OGM. La relevancia de esta liberacin aumentar cuando se trate de especies cuyo centro de origen o diversidad se encuentre en nuestro
pas. Por lo tanto, es necesario disear estrategias que permitan detectar la presencia de
OGM. Este trabajo tiene como objeto desarrollar y validar metodologas para la deteccin
de OGM y sus subproductos, utilizando la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR, por sus siglas en ingls). La estandarizacin incluye procesos que incrementen la reproducibilidad y el uso de reactivos fcilmente accesibles para permitir su implementacin
en diferentes laboratorios.
ABSTRACT
Recombinant DNA technologies allow the assembly of new genes (transgenes) that can be
introduced into plants to confer them new characteristics. The new varieties are known
as transgenic crops and are included in the widely used generic term Genetically Modified Organism (GMO). Corn, soybean and cotton are the most important transgenic crops
whereas the most common traits are herbicide and insect tolerance. Mexico is exposed to
unintentional releases of GMO into the environment. It will cause a problem when diversity
is affected. Therefore, there is a need to develop procedures that will allow the detection
or identification of transgenes in GMO as well as in GMO-related products. The objective
of this study is to develop and validate some procedures to detect transgenes in GMO and
GMO-derived products using PCR-based assays. Increase reproducibility and the use of
accessible reagents are important part of the strategy in order to standardize and facilitate
its implementation through different laboratories.
INTRODUCCIN
Recibido: 25 de agosto de 2014
Aceptado: 23 de marzo de 2015
Palabras clave:
OGM; plantas transgnicas; PCR.
Keywords:
GMO; transgenic plants; PCR.
Cmo citar:
* Departamento de Ingeniera Gentica, Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados (Cinvestav) del Instituto Politcnico Nacional (IPN). Unidad Irapuato km. 9.6, Libramiento Norte, Apdo.
Postal 629, Irapuato, Guanajuato, Mxico, C.P. 36500, Tel.: (462) 623 9655. Correo electrnico: rrivera@ira.cinvestav.mx
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Como parte de esta preocupacin, en 1989 la Direccin General de Sanidad Vegetal (DGSV) conform
el Comit Nacional de Bioseguridad Agrcola (CNBA).
Este organismo estuvo supervisando y analizando las
solicitudes para la liberacin al ambiente de OGM en
Mxico. Posteriormente, por un acuerdo emitido en 1999
se crea la Comisin Intersecretarial de Bioseguridad y
Organismos Genticamente Modificados (Cibiogem),
cuyo objetivo es coordinar las polticas de la administracin pblica federal relativas a la bioseguridad y a
la produccin, importacin, exportacin, movilizacin,
propagacin, liberacin, consumo y, en general, uso y
aprovechamiento de OGM, sus productos y subproductos (Ley Mexicana de Bioseguridad de Organismos
Genticamente Modificados [LBOGM], 2005; Reglamento de la LBOGM, 2009; Cibiogem, 2012). Desde el punto
de vista internacional, en mayo del 2000 fue firmado y
aprobado por varios pases, incluyendo Mxico, el protocolo de Bioseguridad de Cartagena (Hassler, 1999; R. A.
lvarez-Morales, comunicacin personal, 16 de agosto
de 2013), el cual pone en efecto reglas que gobiernan
el comercio y transferencia de OGM en fronteras internacionales, y permite a los gobernantes prohibir la importacin de OGM cuando haya preocupacin sobre su
seguridad (Gupta, 2000). Siguiendo el principio precautorio emanado del Protocolo de Cartagena, Mxico emite
en 2005 la LBOGM para regular todas las actividades
relacionadas con OGM.
A pesar de los avances a nivel regulatorio, Mxico
sigue estando expuesto a liberaciones no controladas
de OGM. Por ejemplo, con la importacin de granos
desde pases productores de OGM se introducir una
mezcla de granos genticamente modificados (GM) y
no modificados. En algunas condiciones, estos granos
intencionados para fines industriales podran usarse
como semilla, generando as una liberacin al ambiente
de manera no intencional. La relevancia de una libera-
Figura 2. Ejemplos de genes quimricos utilizados en la trasformacin de plantas. Un gen quimrico consiste de una regin promotora, un marco de lectura abierta
(regin codificante) y una seal de terminacin de la transcripcin. En este ejemplo se muestra el gen de la neomicina transferasa NPTII (y de la -lactamasa,
bla), cuya expresin est regulada por el promotor 35S del CaMV y la seal de terminacin de la transcripcin tNOS. Se incluyen las estrategias diseadas
para la deteccin por medio de la amplificacin por PCR. Se ilustra su localizacin en el transgn y el tamao del producto esperado en pares de bases (pb).
Fuente: Elaboracin propia.
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MATERIALES Y MTODOS
Para la realizacin de este trabajo se utilizaron diferentes tipos de productos vegetales crudos, dentro de
los cuales se encuentran frutos como jitomate, tubrculos de papa, semillas de maz y soya, as como alimentos procesados, verduras y granos enlatados, jugo
de frutas, purs, harinas y frituras de diversas marcas
comerciales, adems de tejido vegetal fresco (tallos, hojas) de plantas de algodn, soya, tabaco, maz, jitomate
y chile.
Extraccin de DNA
Los mtodos de extraccin de DNA fueron seleccionados
de acuerdo con la facilidad de uso y costo, y se utilizaron soluciones comerciales para homogenizar resultados y evitar problemas por la elaboracin de soluciones.
Se evaluaron tres mtodos principalmente: Plant
DNAzol Reagent de Gibco (ahora Invitrogen Life Technologies), solucin con base de urea reportado por
Shure, Wessler & Fedoroff (1983) y Phytopure Kit de
Amersham Pharmacia Biotech.
Estos tres mtodos de extraccin fueron probados
con todo el material biolgico mencionado (semillas,
tejido vegetal, harinas, enlatados, congelados, jugos,
alimento de infantes, etc.).
Protocolo modificado (DNazol) para extraccin de DNA
genmico de plantas, frutos, semillas y productos procesados
Pesar la cantidad de muestra necesaria de acuerdo
con la tabla 1.
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Terminada la incubacin, agregar 600 l de cloroformo: alcohol isoamlico (24:1 v/v) a 20 C, y agitar
hasta mezclar por 5 seg.
Punto importante:
Si no se tiene nitrgeno lquido disponible, entonces colocar los tubos en hielo y agua (4 C).
Moler las muestras congeladas en homogenizador
con punta de metal, no dejar descongelar la muestra, colocando el tubo en un recipiente pequeo
con un poco de nitrgeno.
Nota: despus de moler cada muestra, lavar la punta con agua destilada y flamear con etanol.
Adicionar 300 l de la solucin de extraccin a 0.2 g
de muestra slida molida, para mayor cantidad de
muestra entonces aumentar proporcionalmente.
En muestras lquidas adicionar 500 l de la solucin.
Incubar de 5 min a 10 min a temperatura ambiente.
Adicionar la misma cantidad de fenol: cloroformo
(1:1 v/v) a 4 C y agitar vigorosamente hasta mezclar
por 5 seg de preferencia en un agitador tipo Vortex.
Incubar por 5 min a temperatura ambiente, y agitar cada minuto.
Centrifugar 5 min a 15 000 xg u 8 min a 12 000 xg.
Se formarn dos fases, quedando entre ellas las
protenas precipitadas.
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Tabla 1.
Ejemplos de tipos de muestras para extraccin de DNA.
Tejido vegetal
0.2
Frutos jugosos
0.4
Jugos
0.5
Nctares
0.3
Embriones de semillas
0.2
Alimento lquido
0.5
Harinas
0.3
Tipo de muestra
Peso (g)
Puntos importantes:
Para la deteccin del promotor 35S (p35) y terminador NOS (tNOS) se llev a cabo el anlisis con base
en lo reportado por Lipp et al. (1999). En este trabajo,
las condiciones de amplificacin fueron modificadas
tratando de mantener las temperaturas de alineamiento similares para cada uno de los iniciadores utilizados y as poder facilitar la deteccin de diferentes
transgenes en la misma corrida.
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Se utilizaron diferentes termocicladores Perkin Elmer, Mini cycler MJ Research, Robo cycler 40 Stratagene, iCycler Bio-Rad, para comparar resultados de
amplificacin entre cada uno de los termocicladores, ya
que hay gran diferencia en el tiempo del cambio de temperatura de los modelos ms recientes y los anteriores,
as como entre las diferentes marcas.
Las secuencias de los iniciadores utilizados para la
deteccin del gen 16S ribosomal, del gen b-lactamasa
(bla) y neomicina fosfotransferasa II (NPTII) fueron
analizadas con cada uno de los programas, Oligo 4.0,
Geneworks, LaserGene y MacVector para corroborar
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Tamao
esperado
(pb)
Orientacin
Secuencia
1.75 l (3.5 X)
MgCl2 50 mM
dNTPs
Polimerasa Taq
0.5 U
c.b.p. 5 l
tNOS *
118
(sentido)
GCATGACGTTATTTATGAGATGGG
tNOS
118
(antisentido)
GACACCGCGCGCGATAATTTATCC
p35S *
123
(sentido)
CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG
p35S
123
(antisentido)
TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC
tNOS*
176
(sentido)
GAATCCTGTTGCCGGTCTTG
tNOS
176
(antisentido)
TTATCCTAGTTTGCGCGCTA
p35S *
195
(sentido)
GCTCCTACAAATGCCATCA
p35S
195
(antisentido)
GATAGTGGGATTGTGCGTCA
16S **
315
(sentido)
TGAGAATGGATAAGAGGCTC
16S
315
(antisentido)
TGTTGTTCCCCTCCCAAGGG
bla **
233
(sentido)
AATAGACTGGATGGAGGCGG
bla
233
(antisentido)
TCAGTGAGGCACCTATCTCAGC
NPTII**
615
(sentido)
TATTCGGCTATGACTGGGCA
Desnaturalizacin
94 C
1.30 min
GCCAACGCTATGTCCTGATA
Inicial
94 C
30 seg
Desnaturalizacin
55 C
40 seg
Alineamiento
72 C
1 min
Sntesis
72 C
3 min
NPTII
615
(antisentido)
35 Ciclos
Cada alcuota deber tener las siguientes concentraciones para un volumen final de reaccin de 25 l:
Polimerasa Taq
0.5 U
2.5 l (0.25 X)
dNTPs
c.b.p. 5 l
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RESULTADOS
Establecimiento de tcnicas eficientes y
reproducibles para la extraccin de DNA
de diferentes muestras crudas (tejido fresco)
o procesadas (jugos, purs, enlatados,
congelados, horneados y harinas)
En un inicio se llevaron a cabo los mtodos conforme
al protocolo sugerido por cada fabricante. Posteriormente se hicieron algunas modificaciones para obtener algunos DNA de buena calidad, ya que el conseguido
inicialmente estaba degradado y con impurezas
que provocaron la inhibicin de la reaccin de PCR.
Despus de hacer las modificaciones se lleg a la
conclusin de que el mtodo por el cual se obtiene ma-
Figura 3. Extraccin de DNA utilizando diferentes mtodos. a) Tejido vegetal de 1, jitomate; 2, papa; 3, tabaco. En cada uno de los geles se cargaron 5 l del DNA extrado
de 200 mg de tejido. b) Extracciones de DNA con el mtodo DNAzol modificado, de diferentes productos procesados. 1, DNA de maz enlatado; 2, DNA de jugo de
frutas; 3, DNA de queso de soya; 4, DNA de pur de jitomate; 5, DNA de alimento de soya (AdeS); 6, DNA de papas fritas (Sabritas); 7, DNA extruido de papa para
fritura (sin marca); 8, tortilla comercial; 9, harina de maz (Maseca); 10, DNA de cereal de maz (Maizoro, CornPos, Zucaritas); 11, DNA de papas fritas (Pringles);
12, harina de semillas de soya; 13, Gerber de pollo con vegetales y/o pera. Se muestra el control 16S para todas las extracciones de DNA. c) Identificacin del
producto de PCR del gen de RNA ribosomal 16S. Corte de la amplificacin 16S con la enzima de restriccin Sty I. 1 y 2, amplificacin del 16S ribosomal; 3 y 4,
corte de la amplificacin del 16S ribosomal con la enzima Sty I. Se muestra un esquema de los sitios de restriccin Sty I. En todos los casos se utiliz el marcador
de peso molecular 1 Kb DNA Ladder de Invitrogen.
Fuente: Elaboracin propia.
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Figura 4. Amplificacin del promotor 35S y del terminador NOS. a) Estandarizacin de amplificacin usando DNA de referencia como controles positivos y negativos.
1, tabaco transformado con el plsmido PGVXYLRV; 2, coliflor infectada con el virus del mosaico de la coliflor (CaMV); 3, papa transformada con el plsmido
pMON X; 4, plsmido PBI121; 5, control negativo agua; 6, control negativo DNA de tabaco Xanthi nc; 7, DNA de coliflor infectada con CaMV como control
negativo; 8, DNA de tabaco transformado con el plsmido PGVXYLRV; 9, DNA de papa transformada con el plsmido pMONX. b) Amplificaciones del 35S 195
en productos varios. 1, frituras de papa; 2, extruidos de maz (Zucaritas); 3, papas fritas (Pringles); 4, harinas de maz (Maseca); 5, almidn de maz (Maizena);
6, Alimento de pollo para beb (Gerber); 7, polenta de maz (Argentina); 8, alimento de pera para beb (Gerber); 9, harina de trigo; 10, harina de maz (sin
marca); 11, control negativo agua; 12, control positivo DNA tabaco transformado con plsmido PGVXYLRV; 13, DNA de maz blanco enlatado de importacin
35S positivo; 14, control negativo DNA maz no GM; 15, control negativo sin DNA. c) Amplificacin del 35S, ter NOS, y 16S, en alimento lquido de soya. 1,
NOS118; 2, 35S195; 3, 16S 315; 4, control positivo DNA plasmdico con NOS118; 5, control positivo DNA tabaco con 35S195. Se muestra la hibridacin del
producto de las amplificaciones 35S195 de muestras de alimento lquido de soya con sonda 35S. d) Hibridacin de la amplificacin 35S123 para diferentes
muestras. 1 y 2, DNA de frituras de papa; 3, amplificacin de DNA de tabaco transformado con el plsmido PGVXYLRV; 4 y 5, DNA de harina de maz (Maseca). La sonda utilizada fue obtenida del plsmido pCambia 2300. Se hizo una restriccin con las enzimas Hind III y Bgl II para obtener el promotor doble 35S.
En todos los casos se utiliz el marcador de peso molecular 100pb DNA Ladder de Invitrogen.
Fuente: Elaboracin propia.
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Los resultados fueron los siguientes: la amplificacin observada fue inversamente proporcional con
el nmero de diluciones, es decir, la intensidad de la
banda observada disminuy hasta desaparecer, mientras ms grande fue la dilucin y la cantidad de iniciadores observados fue aumentando, ya que mientras
menor cantidad de DNA los iniciadores no utilizados
Figura 5. Amplificacin del gen de NPTII615 y bla233 en DNA vegetal. a) Carril 1, chile variedad Sonora Anaheim transformado por A. tumefaciens con el plsmido
PGVXYLRV; 2, jitomate UC82B transformado por A. tumefaciens con el plsmido PGVXYLRV; 3, DNA papa no GM; 4, control negativo agua. b) Corte de la
amplificacin de NPT II con la enzima de restriccin NcoI. 1, corte de la amplificacin de DNA de chile transformado con el plsmido PGVXYLRV; 2, corte de
la amplificacin de DNA de chile PGVXYLRV. Se muestra el esquema de los sitios de restriccin NcoI y la regin amplificada por los primers NPTII. c) Amplificacin
del gen bla. 1 y 2, DNA de callos de papaya transformada con un plsmido de resistencia a herbicida; 3, control maz no GM; 4, hoja de maz transgnico;
5, plsmido positivo para bla; 6, control negativo agua. d ) Restriccin del fragmento amplificado de bla con la enzima Hae III. 1, amplificacin de DNA de callo de
papaya; 2, plsmido PGVXYLRV; 3, DNA de callo de papaya; 4, DNA de Harina de maz (Maseca). Se muestra el esquema de los sitios de restriccin HaeIII y la
regin amplificada por los primers bla233. En todos los casos se utiliz el marcador de peso molecular 100pb de Invitrogen.
Fuente: Elaboracin propia.
Figura 6. Amplificacin del p35S195 en las diluciones de DNA obtenido de plantas de algodn transgnico. Se muestra el nmero de dilucin y la concentracin de DNA
utilizada en cada amplificacin. Como referencia se utiliz el marcador de peso molecular 100 pb de Invitrogen.
Fuente: Elaboracin propia.
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DISCUSIN
Este trabajo se bas en la necesidad de ofrecer metodologas validadas para la deteccin de OGM. El diseo
experimental se bas en las siguientes premisas: a)
los protocolos deben de ser lo suficientemente flexibles para evaluar tanto OGM (plantas, semillas, etc.)
como sus subproductos (por ejemplo alimentos procesados); b) los protocolos deben ser tiles para el mayor
nmero de OGM posible, es decir, abarcar la mayora
de los OGM disponibles en el mercado nacional o regional; c) al protocolo experimental debe ser fcilmente
reproducible en los diferentes laboratorios interesados,
por lo tanto, se preferir usar reactivos (por ejemplo
estuches o kits) ampliamente disponibles de manera
comercial (y de ser posible de bajo costo) para facilitar
la estandarizacin al mantener un control de calidad
homogneo; d ) utilizar en lo posible metodologas (por
ejemplo, PCR, elementos genticos a detectar) o diseos
experimentales (secuencias de oligos) que ya hayan sido
aprobadas o validadas por organismos internacionales
para que los resultados sean fcilmente aceptables de
manera universal.
Otra premisa importante fue el hecho que es prcticamente imposible establecer un mtodo nico que
detecte todos los OGM, por lo que fue necesario establecer metodologas casi universales basadas en los elementos genticos presentes en la primera generacin
de OGM. Por otro lado, el trabajo trat de establecer
los protocolos de deteccin similares para OGM y sus
subproductos, aunque proponiendo modificaciones especficas en aspectos puntuales como los protocolos de
extraccin de DNA.
Para la extraccin de DNA se seleccion la solucin
comercial Plant DNAzol que se utiliza especficamente
para extraccin de DNA de tejido vegetal. El hecho de
utilizar soluciones comerciales fue con el fin de disminuir al mximo posibles variables que pueden afectar
los resultados de la obtencin de DNA.
Como se mencion en los resultados, la extraccin
de DNA y la tcnica de PCR estn estrechamente relacionadas, pues si la extraccin de DNA no es adecuada,
los contaminantes presentes en la solucin de DNA inhibirn el anlisis por PCR. Dentro de los inhibidores ms
comunes se encuentran colorantes (ejemplo, la clorofila
en tejido vegetal), protenas tanto nativas (provenientes
del mismo OGM) como las adicionadas al producto en
el caso de alimentos procesados. Cabe mencionar que
en el caso de estos productos la diversidad de los procesos de manufactura (coccin, secado, fredo, extrusin,
etc.) y el agregado de aditivos (sales, carbohidratos, en-
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Con base en los resultados de experimentos llevados a cabo se puede decir que se cuenta ya con un
protocolo estandarizado que consta de bajo nmero de
pasos para su elaboracin, adems de ser relativamente barato, y que puede ser utilizado para extracciones
de diversas muestras.
Para la estandarizacin de la tcnica de PCR se tomaron como referencia algunas metodologas ya diseadas y validadas por algunos grupos europeos. Lipp
et al. (1999) disearon dos pares de iniciadores para
detectar el p35S y otros dos para el tNOS. En los resultados reportados aqu, el par 35S 195 y el par Nos118
mostraron una mayor sensibilidad de deteccin, es decir, bandas ms intensas en la electroforesis en agarosa. Estos datos coinciden con los resultados reportados
previamente (Lipp et al., 1999). Los otros dos pares, 35S
123 y NOS 176, aunque son aparentemente menos sensibles, fueron tambin utilizados para la corroboracin
de las amplificaciones hechas por el 195 y 118, ya que
amplifican diferente segmento de los genes. Este tipo de
controles internos es importante para descartar posibles
contaminaciones con el producto de amplificacin de
ensayos anteriores, principal problema en los laboratorios de diagnstico.
Las concentraciones de los reactivos varan segn el
fabricante. En este trabajo fueron utilizados dos marcas
registradas: Invitrogen y Roche. Cada fabricante tiene recomendaciones especficas sobre las cantidades
para cada uno de los reactivos. Estas concentraciones
pueden variar segn las necesidades especficas del ensayo en cuestin. Por ejemplo, generalmente los fabricantes recomiendan volmenes de reaccin de 50 l. En
el protocolo establecido aqu se muestra que el ensayo
se puede reducir a un volumen de 25 l sin afectar la
eficiencia o confiabilidad del ensayo. Otros autores han
reportado igualmente reacciones con volmenes similares (Matsuoka et al., 2000).
Como en todos los anlisis, es indispensable incluir los controles necesarios para garantizar que el
ensayo es confiable y preciso. En el protocolo estandarizado aqu se utilizaron plsmidos que tuvieran
insertado el gen especfico por analizar para verificar
constantemente la funcionalidad del ensayo y el tamao adecuado del producto esperado. Tambin se
utiliz DNA de plantas transgnicas para indicar que
los iniciadores fueran capaces de amplificar secuencia
insertadas en un genoma ms complejo. Como control
negativo se utiliz DNA de plantas no transgnicas
para indicar que los iniciadores no amplificaran errneamente un fragmento del genoma de la planta por
analizar. Finalmente, un control adicional pero igual-
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CONCLUSIONES
Se cuenta con tres mtodos establecidos para la extraccin de DNA de muestras vegetales y de productos
procesados: DNAzol modificado, Phytopure modificado
y urea modificado. De los tres mtodos evaluados para
la extraccin de DNA tanto en muestras vegetales
como en productos procesados, el DNAzol modificado fue en el que se obtuvieron mejores resultados. Se
tiene estandarizada la tcnica de PCR para la deteccin del promotor 35S, del terminador NOS, los genes
bla, NPT II y 16S ribosomal. Los iniciadores diseados
para las amplificaciones del 35S, tNOS, gen b-lactamasa y NPT II son adecuados y pueden ser empleados
con las mismas condiciones de corrida para facilitar la
amplificacin al mismo tiempo de uno o varios de los
transgenes. Los lmites de sensibilidad para la deteccin de los diferentes transgenes oscilan entre 5 g y
0.04 ng. Las tcnicas modificadas en este trabajo son
confiables para ser utilizadas en la deteccin de OGM
en alimentos procesados, as como en tejido vegetal.
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