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Universidade de So Paulo
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz
Piracicaba
2009
Orientador:
Prof. Dr. JORGE HORII
Piracicaba
2009
Permitida a cpia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte O autor
DEDICO
A minha filha, Nicole, que
mesmo antes de nascer j se
fez presente na realizao
desde projeto.
AGRADECIMENTOS
Deus pela oportunidade de dar continuidade aos meus estudos e conhecimentos.
Aos meus pais pelo exemplo de vida e incansvel torcida pelo meu sucesso.
Ao meu esposo, Daniel, pelo incentivo, carinho e ajuda em todos os momentos, inclusive
nas horas mais difceis.
Aos meus irmos: Alexandre, Camilla e Diego, por todo o apoio oferecido.
minha av Maria Luiza e minha Tia Nice por toda torcida e orao.
A todos meus familiares que mesmo distncia acompanharam meu desenvolvimento.
Heloisa, Miguel, Giovani e Raquel por tambm estarem presentes e torcendo pelo meu
sucesso.
Aos meus sobrinhos Joo Pedro, Patrick e Sophia por s trazerem alegria a esse momento
de tenso.
Ao meu orientador, Jorge Horii, por toda informao e amizade.
s colegas de mestrado, Adna, Carla, Denise, Luciana, Milla, Paula, que compartilharam
comigo momentos de tenso, discontrao e amizade.
As minhas amigas Luciana e Brbara por me acolherem na Repblica Simbora com tanto
carinho.
Aos meus demais amigos (as) que estiveram presentes mesmo distncia com palavras de
amizade.
A todos aqueles que torceram pelo meu sucesso, me incentivando cada vez mais na busca
da justia e da perfeio.
Aos tcnicos do laboratrio, Sylvino e Rose, pelo auxlio nas tarefas do laboratrio
sempre que necessrio.
Ao auxiliar de laboratrio, Pedro Lucentini, por toda sua dedicao e entrega ao trabalho
estando sempre presente na coleta das amostras e demais atividades.
Aos demais funcionrios da ESALQ USP que de forma direta ou indireta contriburam
para a realizao deste projeto.
Ao Prof Dcio Barbin pelo auxlio nas anlises estatsticas.
Aos professores: Antnio Baptista, Cludio Aguair, Cludio Gallo, Jorge Lopes, Jorge
Horii e Octvio Valsechi pelas sugestes dadas ao trabalho.
Fermentec Ltda (Piracicaba, SP), pelo apoio e concesso das linhagens bacterianas.
SUMRIO
RESUMO ............................................................................................................................ 9
ABSTRACT ...................................................................................................................... 11
LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................... 13
LISTA DE TABELAS ...................................................................................................... 15
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ....................................................................... 17
1 INTRODUO .............................................................................................................. 19
2 REVISO BIBLIOGRFICA ....................................................................................... 21
2.1 lcool no Brasil ........................................................................................................... 21
2.1.1 lcool combustvel ................................................................................................... 21
2.1.2 lcool bebida............................................................................................................ 22
2.2 lcool no Mundo ......................................................................................................... 22
2.3 Matria-prima .............................................................................................................. 23
2.4 Etapas de produo ...................................................................................................... 24
2.5 Fermentao................................................................................................................. 27
2.6 Contaminantes ............................................................................................................. 29
2.7 Alternativas ao controle da contaminao ................................................................... 31
3 MATERIAL E MTODOS ............................................................................................ 35
3.1 Material ........................................................................................................................ 35
3.1.1 Caldo de cana-de-acar ........................................................................................... 35
3.1.2 Culturas de bactrias................................................................................................. 36
3.1.3 Meio para crescimento e manuteno ...................................................................... 37
3.1.4 Meio de cultura para contagem de clulas................................................................ 37
3.1.5 gua peptonada ........................................................................................................ 37
3.1.6 Soluo Alcolica ..................................................................................................... 37
3.1.7 cido Sulfrico ........................................................................................................ 37
3.2 Mtodos ....................................................................................................................... 37
3.2.1 Manuteno das culturas .......................................................................................... 37
3.2.2 Contagem de colnias............................................................................................... 38
3.2.3 Caldo de cana-de-acar clarificado......................................................................... 38
3.2.3.1 Caldo clarificado por aquecimento ........................................................................ 38
3.2.3.2 Clarificado por adio de NaH2PO4.H2O .............................................................. 39
3.2.4 Tratamentos trmicos ............................................................................................... 39
3.2.5 Contagem de colnias............................................................................................... 41
3.2.6 Soluo alcolica ...................................................................................................... 41
3.2.7 Soluo alcolica cida ............................................................................................ 41
3.2.8 Sensibilidade de Lactobacillus ao etanol ................................................................. 41
3.2.9 Contagem de clulas viveis de levedura ................................................................. 42
3.2.10 Delineamento estatstico ......................................................................................... 42
4 RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................... 43
4.1 Resultados.................................................................................................................... 43
4.1.1 Tratamento do caldo ................................................................................................. 43
4.1.2 Comparativo entre resultados obtidos para os Lactobacillus ................................... 57
4.1.3 Tratamento do fermento por etanol .......................................................................... 63
4.2 Discusso ..................................................................................................................... 70
4.2.1 Tratamento trmico do caldo de cana-de-acar ...................................................... 70
RESUMO
Tratamento trmico do caldo de cana-de-acar visando a reduo de contaminantes
bacterianos Lactobacillus - na produo de etanol e eficincia de tratamento do fermento
por etanol
Na produo do etanol a etapa mais importante e crtica a fermentao, por isso, h
necessidade de focar a ateno ao processo e contaminaes. Os contaminantes bacterianos de
maior presena nessa etapa so os Lactobacillus. Com essa preocupao os objetivos deste
trabalho so mostrar alternativas a reduo desses contaminantes sendo eles no caldo ou no
fermento (leveduras). Para isso amostras de caldo de cana-de-acar contaminados in vitro,
individualmente, com sete diferentes espcies de Lactobacillus foram submetidas ao tratamento
trmico visando confirmar a sensibilidade das mesmas temperatura da gua em ebulio.
Amostras do caldo de cana-de-acar foram colocadas em uma cuba de clarificao com a gua
em ebulio. Foram retiradas amostras em diferentes tempos (0, 2, 3, 4 e 5 minutos) para que
realizasse contagens (UFC/mL). Como j era esperado, as bactrias em questo se mostraram
sensveis altas temperaturas no sobrevivendo por mais de 4 minutos. E com isso levantou-se a
hiptese destas estarem presentes em dornas de fermentao devido falhas de processamento
(como uma clarificao ineficiente) e recontaminaes posteriores. O projeto teve como objetivo
tambm buscar uma alternativa ao tratamento cido (cido sulfrico), utilizado como forma de
descontaminao das leveduras (fermento). Foram utilizadas diferentes solues alcolicas (15,
20, 25, 30 e 35 % v/v) e em diferentes pH (2,5 e 6,0). Estas foram contaminadas,
individualmente, com as mesmas sete diferentes espcies de Lactobacillus para verificao de sua
sensibilidade ao etanol. Nos tempos (0, 30, 60, 90 e 120 minutos) foram retiradas amostras para
contagens (UFC/mL). Os Lactobacillus se mostraram sensveis ao etanol sendo mais evidente a
concentraes maiores que 20% v/v.
Palavra-chave: Fermentao; Contaminao; Lactobacillus; Etanol; Tratamento trmico;
Tratamento do fermento
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ABSTRACT
Heat treatment in sugar cane broth to rise bacterias contaminats Lactobacillus in the
ethanol production and eficciency on alternative of treatment of yeast
In the ethanol production the most important and critical stage is the fermentation,
therefore the necessity of focusing the attention to the process and contaminations. The
contaminants of bigger presence in this stage are the Lactobacillus. With this concern the
purpose of this work are shown alternatives to these contaminants. For that, samples of sugar
cane broth contaminated in vitro, with seven different Lactobacillus species were subjected to the
thermal treatment aiming to confirm the sensitivity of them at temperature of boiling water.
Samples of sugar cane broth were placed in clarification vat with boiling water and were
withdrawn in different times (0, 2, 3, 4 and 5 minutes) so that it carried out counting (UFC/mL),
checking the sensitivity of microorganisms to temperature. As was expected, the bacteria in
question were sensitive not survive for more than 4 minutes. And with that raised the possibility
of they were present in fermentation tanks due to the failure of processing (like an inefficient
clarification) and subsequent recontamination. The purpose of the project is also find an
alternative to acid treatment (sulphuric acid), used as decontamination form of the yeast (leaven).
Were used different alcoholic solutions (15, 20, 25, 30 and 35 % v/v) and in different pH (2,5 and
6,0). These were contaminated (separately) in laboratory with the same seven different
lactobacillus genus for checking their sensitivity to ethanol. At times (0, 30, 60, 90 and 120
minutes) samples were withdrawn for counts (UFC / mL). The Lactobacillus were sensitive to
ethanol, being more evident at 20% v / v.
Keywords: Fermentation; Contamination; Lactobacillus, Heat treatment, Ethanol, Microbiology,
Yeast treatment
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fluxograma de produo de etanol e acar ................................................................. 25
Figura 2 - Grfico referente ao aumento de produo de cido ltico .......................................... 35
Figura 3 - Caldo clarificado por aquecimento ............................................................................... 38
Figura 4 - Caldo clarificado por adio de fosfato mono hidratado de sdio ............................... 39
Figura 5 - Cuba de clarificao ..................................................................................................... 40
Figura 6 - Cuba de clarificao com amostras de caldo clarificado por aquecimento e adio de
fosfato mono hidratado de sdio ................................................................................... 40
Figura 7 - Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 188 - Caldo clarificado por
aquecimento .................................................................................................................. 44
Figura 8 - Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 188 - Caldo clarificado por adio
de fosfato mono hidratado de sdio ............................................................................ 45
Figura 9 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 209 - Caldo clarificado por
aquecimento ................................................................................................................ 46
Figura 10 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 209 - Caldo clarificado por
adio de fosfato mono hidratado de sdio .............................................................. 47
Figura 11 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 282 - Caldo clarificado por
aquecimento ............................................................................................................. 48
Figura 12 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 282 - Caldo clarificado por
adio de fosfato mono hidratado de sdio .............................................................. 49
Figura 13 Mdia (UFC/mL) x tempo (min)- Lactobacillus FT 337 - Caldo clarificado por
aquecimento ............................................................................................................. 50
Figura 14 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 337 - Caldo clarificado por
adio de fosfato mono hidratado de sdio .............................................................. 51
Figura 15 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 401 x Caldo clarificado por
aquecimento ............................................................................................................. 52
Figura 16 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 401 - Caldo clarificado por
adio de fosfato....................................................................................................... 53
Figura 17 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 421 - Caldo clarificado por
aquecimento ............................................................................................................. 54
Figura 18 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 421 x Caldo clarificado por
adio de fosfato....................................................................................................... 55
Figura 19 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 432 x Caldo Clarificado por
Aquecimento ............................................................................................................ 56
Figura 20 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 432 x Caldo clarificado por
adio de fosfato....................................................................................................... 57
Figura 21 - Mdia da contagem (UFC/mL) no inicial (tempo de zero) dos Lactobacillus em caldo
clarificado por aquecimento ..................................................................................... 59
Figura 22 - Mdia da contagem (UFC/mL) no inicial (tempo de zero) dos Lactobacillus em caldo
clarificado por adio de fosfato mono hidratado de sdio ..................................... 60
Figura 23 - Mdia da contagem (UFC/mL) no tempo de dois minutos dos Lactobacillus em caldo
clarificado por aquecimento ..................................................................................... 60
Figura 24 - Mdia da contagem (UFC/mL) no tempo de dois minutos dos Lactobacillus em caldo
clarificado por adio de fosfato mono hidratado de sdio ..................................... 61
Figura 25 - Mdia da contagem (UFC/mL) no tempo de trs minutos dos Lactobacillus em caldo
clarificado por aquecimento ..................................................................................... 62
14
Figura 26 - Mdia da contagem (UFC/mL) no tempo de trs minutos dos Lactobacillus em caldo
clarificado por adio de fosfato mono hidratado de sdio ...................................... 62
Figura 27 - Mdia da contagem (UFC/mL) nos tempos quatro e cinco minutos dos Lactobacillus
em caldo clarificado por aquecimento ...................................................................... 63
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Mdia (UFC/mL) Lactobacillus FT 188 - Caldo clarificado por aquecimento e adio
de fosfato mono hidratado de sdio ............................................................................ 44
Tabela 2 - Mdia (UFC/mL) Lactobacillus FT 209 - Caldo clarificado por aquecimento e adio
de fosfato mono hidratado de sdio ............................................................................ 46
Tabela 3 - Mdia (UFC/mL) Lactobacillus FT 282 - Caldo clarificado por aquecimento e adio
de fosfato mono hidratado de sdio ............................................................................ 48
Tabela 4 - Mdia (UFC/mL) Lactobacillus FT 337 - Caldo clarificado por aquecimento e adio
de fosfato mono hidratado de sdio ............................................................................ 50
Tabela 5 - Mdia (UFC/mL) Lactobacillus FT 401 - Caldo clarificado por aquecimento e adio
de fosfato mono hidratado de sdio ............................................................................ 52
Tabela 6 - Mdia (UFC/mL) Lactobacillus FT 421 - Caldo clarificado por aquecimento e adio
de fosfato mono hidratado de sdio ............................................................................ 54
Tabela 7 - Mdia (UFC/mL) Lactobacillus FT 432 - Caldo clarificado por aquecimento e adio
de fosfato mono hidratado de sdio ............................................................................ 56
Tabela 8 - Valores referentes mdia (UFC/mL) das sete linhagens Lactobacillus em caldo
clarificado por aquecimento ....................................................................................... 58
Tabela 9 - Valores referentes mdia (UFC/mL) das sete linhagens Lactobacillus em caldo
clarificado por adio de fosfato mono hidratado de sdio ........................................ 59
Tabela 10 - Mdias (UFC/mL) de valores referentes inativao do Lactobacillus FT 188 em
solues alcolicas (pH 2,5 e 6,0) nos diferentes tempos (min) .............................. 64
Tabela 11 - Mdias (UFC/mL) de valores referentes inativao do Lactobacillus FT 209 em
solues alcolicas (pH 2,5 e 6,0) nos diferentes tempos (min) .............................. 65
Tabela 12 - Mdias (UFC/mL) de valores referentes inativao do Lactobacillus FT 282 em
solues alcolicas (pH 2,5 e 6,0) nos diferentes tempos (min) .............................. 66
Tabela 13 - Mdias (UFC/mL) de valores referentes inativao do Lactobacillus FT 337 em
solues alcolicas (pH 2,5 e 6,0) nos diferentes tempos (min) .............................. 67
Tabela 14 Mdias (UFC/mL) de valores referentes inativao do Lactobacillus FT 401 em
solues alcolicas (pH 2,5 e 6,0) nos diferentes tempos (min) .............................. 68
Tabela 15 - Mdias (UFC/mL) de valores referentes inativao do Lactobacillus FT 421 em
solues alcolicas (pH 2,5 e 6,0) nos diferentes tempos (min) .............................. 69
Tabela 16 - Mdias (UFC/mL) de valores referentes inativao do Lactobacillus FT 432 em
solues alcolicas (pH 2,5 e 6,0) nos diferentes tempos (min) .............................. 70
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1 INTRODUO
A agroindstria est em crescimento e desenvolvimento, sendo que novas tecnologias
esto surgindo para aumentar a eficincia dos processos industriais. Entre as culturas do setor, a
cana-de-acar vem sendo alvo de pesquisas devido aos seus produtos de grande importncia
econmica como o lcool (biocombustvel), o acar e a energia eltrica (cogerao). Com o
crescimento econmico, busca-se o aumento do rendimento industrial e melhorias das
tecnologias de produo.
O Brasil um pas pioneiro no uso do etanol como energia renovvel, quando
desenvolveu tecnologias eficientes de produo onde obtm o lcool em grande escala, com
menores custos e emprego de matria-prima com grande potencial energtico.
O setor sucro-alcooleiro vem crescendo visando a busca por uma maior produo de
etanol. Esse aumento produtivo oriundo de uma maior procura por veculos flex fuel, com a
possibilidade de escolher o combustvel, o consumidor em sua grande maioria vem optando pelo
lcool. Pases do mundo todo buscam tecnologias alternativas de energia renovvel. A matriaprima utilizada variada: cana-de-acar, milho, trigo, beterraba, e mandioca.
Para uma maior eficincia do processo, novas tecnologias esto sendo pesquisadas e
desenvolvidas em universidades e no setor privado. Entre essas, merece destaque linhagens de
leveduras selecionadas, dornas fechadas, variedades de cana-de-acar, antibiticos, alternativas
de processamento entre outras.
No caso do etanol um dos parmetros principais a ser controlado a fermentao, para
isso necessita-se de um ambiente e meio de fermentao asspticos utilizando apenas os
microrganismos desejveis, responsveis pela maior eficincia fermentativa. Para isso so
utilizadas leveduras selecionadas que utilizam os nutrientes presentes no caldo da melhor forma
possvel e transformando-os na maior quantidade de etanol.
A fermentao uma das etapas mais importantes e sem dvida a mais crtica do
processo, por isso h necessidade de focar ateno. As leveduras so os microrganismos mais
utilizados para tal fim. Linhagens da espcie Saccharomyces cerevisiae so as mais utilizadas por
serem as mais adaptados s condies industriais. A maioria dos estudos realizados mostrou que
os principais contaminantes bacterianos do caldo so do gnero Lactobacillus e Bacillus sendo
eles um dos grandes responsveis pela floculao das leveduras diminuindo a eficincia da
produo.
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Este programa fez com que se diversificasse a atuao da indstria aucareira com
grandes investimentos apoiados pelo Banco Mundial, possibilitando a ampliao da rea plantada
com cana-de-acar e a implantao de destilarias de lcool. A experincia serviu como
alternativa para diminuir a vulnerabilidade energtica do Pas, devido crise mundial do petrleo
(Unio da Indstria de Cana-de-acar, 2008).
2.1.2 lcool bebida
A aguardente se destaca no cenrio nacional como sendo a bebida alcolica mais
consumida no pas gerando uma elevada receita no mbito nacional, alm de servios diretos e
indiretos mas, infelizmente, ainda sendo consumida predominantemente pelas classes sociais
menos favorecidas. Assim, se torna indispensvel o aumento de conhecimento das tcnicas de
produo, possibilitando assim, um produto de melhor qualidade, que se possam agregar valores
e obtm em maior amplitude de comercializao dentro das classes sociais e do mercado externo
(BRAGA, 2006).
Pode-se dizer que o grande esforo de promoo da cachaa, em todo o Brasil, que
aglutinou governos, entidades de ensino e pesquisa, entidades privadas e apreciadores da bebida,
diminuiu sensivelmente o preconceito contra a cachaa (Servio Brasileiro de Apoio s Micro e
Pequenas Empresas, 2001). A globalizao tem influenciado consideravelmente nos hbitos de
consumo de pessoas do mundo todo. Isto faz com que se necessite de um maior controle e
conhecimento de produtos comercializados no mercado interno e externo, devendo se efetuar
tcnicas de padronizao, especificao e certificao (FERNANDES et al., 2005).
2.2 lcool no Mundo
Com o objetivo de reduzir as emisses de CO2 os pases esto buscando alternativas para
obteno de biocombustveis. As matrias-primas so variadas: cana-de-acar, milho, arroz,
trigo, mandioca e beterraba. Os EUA so os maiores produtores e consumidores de etanol no
mundo. Mas, ao contrrio do Brasil, onde o etanol utiliza a cana-de-acar como matria prima,
na Amrica do Norte, a produo de combustveis renovveis vem do milho. Comparando a
eficincia energtica dos dois, o brasileiro superior ao americano, pois requer consumo muito
baixo de energia fssil para ser fabricado. Cada unidade de energia fssil consumida durante o
23
ciclo de produo do etanol de cana gera mais de oito unidades de energia renovvel. Com isso, o
balano energtico do etanol brasileiro quase cinco vezes superior ao produzido de milho
(UNICA, 2009).
Vrios pases esto promovendo o uso de energia limpa para mitigar o aquecimento
global, estabelecendo legislao necessria para tal. Os problemas relacionados com o
aquecimento da Terra fizeram conhecida a importncia da energia renovvel, estimulando
diversos pases a adotar medidas para mitig-lo. Um importante item seria a promoo do uso de
biocombustvel, aumentando assim a dependncia sobre a energia renovvel (JBIC, 2006).
O Protocolo de Kyoto um acordo internacional para reduzir as emisses de gases do
efeito estufa emitidos pelos pases industrializados visando um modelo de desenvolvimento
limpo aos pases em desenvolvimento. O documento prev que, entre 2008 e 2012, os pases
desenvolvidos reduzam suas emisses em 5,2% em relao aos nveis medidos em 1990. O
acordo impe nveis diferenciados de redues para 38 dos pases considerados os principais
emissores de dixido de carbono e de outros cinco gases. Para alcaarem a diminuio das
emisses, os pases devem implementar e/ou aprimiorar tecnologias de acordo com as
circunstncias nacionais, a fim de promoverem o desenvolvimento sustentvel (GODOY, 2005;
MENEGUELLO, CASTRO, 2007; ANDRADE; COSTA, 2008;).
2.3 Matria-prima
A cana-de-acar (Saccharum officinarum), uma planta do gnero poceae mais
cultivadas nas regies tropicais e subtropicais do globo terrestre devido a enorme contribuio
scio-econmica que representa a sua explorao, conseqncia da propriedade que essa planta
apresenta de sintetizar e armazenar significativa quantidade de sacarose em seus tecidos de
reserva. Define-se caldo de cana como sendo uma soluo diluda e impura de sacarose. O caldo
tem sua composio dependente da cana que lhe deu origem, sendo constitudo de gua (80%) e
de slidos solveis (20%). Os teores de slidos solveis (Brix) podem ser caracterizados como
acares e no-acares orgnicos e inorgnicos (NOGUEIRA; VENTURINI-FILHO, 2005).
O caldo de cana se constitui em timo substrato para o crescimento de muitos
microrganismos, em funo dos teores de nutrientes orgnicos e inorgnicos que apresenta, alta
atividade de gua e pH favorveis. Assim, uma ampla e variada microbiota bacteriana encontrase normalmente presente no mosto utilizado para a produo de lcool. Esses contaminantes so
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Recepo da Cana
Lavagem
Fermentao
Moagem
Caldeiras
Co-gerao
Preparo do caldo
Secagem
ACAR
Destilao
Armazenamento e
Comercializao
ETANOL
Armazenamento e
comercializao
26
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Zimase
2 C6H12O6
4 CH3 CH2OH + 4 CO2 + 47,0 cal
Etanol
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Em trabalho realizado por Maciel (2001), foi observado contaminao por bactrias
lticas em amostras lticas no solo de canaviais, na gua da bainha das folhas e na superfcie dos
colmos de cana-de-acar. Na fermentao alcolica industrial freqente a contaminao por
essas mesmas bactrias, principalmente, do gnero Lactobacillus.
Dentre os microrganismos que causam a biodeteriorao da cana cortada, os que maiores
prejuzos causam so as bactrias produtoras de cido ltico, comumente denominadas de
30
bactrias do cido ltico (BAL); sendo estimada a perda diria de sacarose recupervel da ordem
de 4,75% (VALSECHI, 2000).
Gallo (1990) mencionou o fato do caldo de cana-de-acar possuir quantidades variveis
de nutrientes orgnicos e inorgnicos, alta atividade de gua, pH e temperatura favorveis que
proporcionam o crescimento de uma grande flora microbiana. Citou ainda que as prprias
condies de cada etapa do processo de produo de lcool selecionam o desenvolvimento de
microrganismos, sendo que todo o processo est sujeito contaminao, desde a cana-de-acar
no campo at a fermentao do seu caldo.
Em trabalho realizado por Gallo (1990), foi feito o levantamento da microbiota
predominante de amostras de dornas de fermentao. Os resultados obtidos revelaram que
98,52% das bactrias isoladas eram do grupo das Gram + sendo em sua grande maioria do gnero
Lactobacillus (59,75%) e Bacillus (26,58%). E entre eles L. fermentum (15,04%), L. helveticus
(14,08%), L. plantarum (5,69%), L. animalis (4,55%), L. buchneri (3,76%), L. acidophilus
(3,07%), L. vitulinus (2,96%), L. viridescens (2,35%), L. amylophilus (1,88%), L. agilis (1,25%),
L. reuteri (1,22%), L. delbrueckii subsp. Lactis (1,04%), L. murinus (1,02%), L. delbrueckii
subsp bulgaricus (0,71%), L. coryniformis subsp torquens (0,71%) e L. sakei (0,42%), B.
coagulans (15,09%), B. stearothermophilus (6,91%), B. megaterium (2,43%), B. brevis (1,23%),
B. lentus (0,70%) e B. pasteurii (0,22%).
Nem todas as linhagens de Lactobacillus so capazes de causar o problema da floculao.
Dentre as diversas espcies e linhagens, apenas algumas linhagens de L. fermentum e as
linhagens de L. plantarum, L. fructivorans, L. fructosus e L. buchneri, se mostraram eficientes
em provocar a floculao de leveduras enquanto que B. subtilis e B. coagulans no (YOKOYA e
OLIVA-NETO, 1991, ALCARDE; YOKOYA, 2003). Zarattini et al. (1993) e Yokoya (2001)
citaram como agentes causadores da floculao alm dos Lactobacillus, os Sporolactobacillus.
Os produtos metablicos de L. fermentum podem causar grandes prejuzos s leveduras da
fermentao, j que a toxidez de seus produtos se manifesta, mesmo atenuados por um tratamento
trmico ou antimicrobiano (OLIVEIRA-FREGUGLIA; HORII, 1998).
Em destilarias de lcool importante avaliar os microrganismos contaminantes e seus
reflexos sobre o processo fermentativo. A presena de contaminantes na fermentao resulta em
srios prejuzos para as leveduras refletindo-se de modo direto sobre a produtividade e o
rendimento do processo fermentativo (CAMOLEZ; MUTTON, 2005). Oliva-Neto e Yokoya
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Estado de So Paulo, que representa importante rea canavieira. As coletas foram realizadas no
perodo de Julho a Setembro de 2008.
A variedade da cana-de-acar utilizada no experimento foi a SP 832847.
Logo que colhida a cana-de-acar passou pelo processamento (moagem), no dando
tempo para deteriorao ou novas contaminaes, portanto em condies diferentes de uma
escala industrial convencional.
O caldo foi extrado em moenda composta de um nico terno e sem embebio. O caldo
foi filtrado em algodo, e ento diludo a 14 obrix com o auxilio de gua destilada.
3.1.2 Culturas de bactrias
Foram utilizadas cepas de diferentes espcies de Lactobacillus, gentilmente cedidas pela
Fermentec Ltda, Piracicaba, SP, identificadas como:
FT 188 B - Lactobacillus buchneri;
FT 209 B - Lactobacillus vaccinostercus;
FT 282 B - Lactobacillus fermentum;
FT 337 B - Lactobacillus plantarum;
FT 401 B - Lactobacillus fructivorans (classificao inicial) - Lactobacillus plantarum
(reclassificao);
FT 421 B - Lactobacillus fructivorans (classificao inicial) - Lactobacillus fermentum
(reclassificao);
FT 432 B - Lactobacillus fructosus (classificao inicial) - Lactobacillus fermentum
(reclassificao).
Segundo o cedente as cepas foram obtidas e isoladas de dornas de fermentao alcolica
de unidades sucroalcooleiras do Estado de So Paulo e apresentam caractersticas distintas
inclusive com relao a resistncia.
37
38
39
40
Figura 6 - Cuba de clarificao com amostras de caldo clarificado por aquecimento e adio de
fosfato mono hidratado de sdio
Fonte: Arquivo pessoal.
41
42
43
Densmetro DMA 4500 Density Meter (Anton Paar), para confirmao do teor alcolico. As
amostras de concentraes iguais foram divididas em duas alquotas, metade das amostras
permaneceram com o pH 6,0 e a outra foi acidificada com cido sulfrico (pH 2,5). Inoculou-se 1
mL de suspenso de Lactobacillus (sete linhagens diferentes uma por vez). Foram retiradas
amostras nos tempos de 0, 30, 60, 90 e 120 minutos. As amostras foram plaqueadas em
profundidade e incubadas em aerobiose temperatura de 35 C por 48h para ento se proceder a
contagem (UFC/mL). Com isso foi verificada a sensibilidade dos mesmos ao etanol nas
concentraes mencionadas.
Para o delineamento estatstico dos experimentos foi utilizado o teste de Friedman. Dentro
da estatstica no-paramtrica o mtodo de anlise para experimentos casualizados em blocos
(CAMPOS, 1979; DOWNING; CLARK, 2002).
Os dados foram analisados pelo programa SAS e a um nvel de significncia de p 0,05
(HERZBERG, 1990).
4 RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 Resultados
4.1.1 Tratamento do caldo
Nas Tabelas 1 a 7 esto os resultados referentes as mdias do tratamento trmico para as
diferentes clarificaes do caldo e para os sete isolados de Lactobacillus. Esto tambm os
resultados do tratamento estatstico (Teste de Friedman). E nas Figuras de 1 a 14 esto expostos
graficamente esses valores.
Na Tabela 1 esto os dados da mdia das contagens (UFC/mL) do Lactobacillus FT 188
(em caldo clarificado por aquecimento e fosfato mono hidratado de sdio) referente a triplicata
do experimento e das placas. No tempo 0 (zero) a contagem inicial de 3,0 109 e 2,28 109
UFC/mL (respectivamente). Verifica-se em ambos os casos uma reduo brusca em seus valores
de contagens (UFC/mL). Aos 2 minutos, 128,88 e 65 UFC/mL, - respectivamente, e a partir de 4
minutos a mdia igual a zero.
44
Pelo teste de Friedman, verificou-se que as formas como os caldos foram clarificados no
interferiu no resultado de contagem de unidades formadoras de colnias, as amostras nos tempos
0, 2, 3, 4 e 5 no apresentaram diferenas significativas (p 0,05).
Tabela 1- Mdia (UFC/mL) Lactobacillus FT 188 - Caldo clarificado por aquecimento e
adio de fosfato mono hidratado de sdio
FT 188
Clarificado por adio de fosfato
Clarificado por aquecimento
mono hidratado de sdio
Tempo (min)
Mdia total (UFC/mL)
Mdia total (UFC/mL)
9 a
0
3,003 10
2,283 109 a
2
128,88889 a
65 a
3
0,3333333 a
0,89 a
4
0a
0a
5
0a
0 a
Valores seguidos por letras diferentes na mesma linha (a, b, c...) diferem entre si estatisticamente a 5% pelo
Teste de Friedman
Conc (UFC/mL)
Tempo (min)
Mdia total
Figura 7 - Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 188 - Caldo clarificado por
aquecimento
Na Figura 6 verifica-se com clareza a diminuio brusca da contagem (UFC/mL) do
Lactobacillus FT 188 (caldo clarificado por aquecimento) tendo valores de contagem (UFC/mL)
prximos de 0 (zero) em poucos minutos.
45
Conc (UFC/mL)
2,50E+09
2,00E+09
1,50E+09
1,00E+09
5,00E+08
0,00E+00
0
Tempo (min)
Mdia total
Figura 8 - Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 188 - Caldo clarificado por
adio de fosfato mono hidratado de sdio
Na Figura 7 possvel observar dados referentes ao Lactobacillus FT 188 (caldo
clarificado por adio de fosfato mono hidratado de sdio). Como se pode observar na Tabela 1
os valores de contagem (UFC/mL) no apresentam diferenas significativas para p 0,05. O
comportamento do caldo clarificado por adio de fosfato mono hidratado de sdio similar ao
clarificado por aquecimento, ocorrendo da mesma forma a diminuio brusca em sua contagem
(UFC/mL).
Na Tabela 2 esto os dados da mdia das contagens (UFC/mL) do Lactobacillus FT 209
(em caldo clarificado por aquecimento e fosfato mono hidratado de sdio) referente a triplicata
do experimento e das placas. No tempo 0 (zero) a contagem inicial de 1,02 1010 e 1,16 109
UFC/mL (respectivamente). Verifica-se em ambos os casos uma reduo brusca em seus valores
de contagens (UFC/mL). Aos 2 minutos 186,88 e 138,67 UFC/mL, respectivamente, e a partir de
4 minutos a mdia igual a zero.
Pelo teste de Friedman, verifica-se que as formas como o caldo foi clarificado no
interfere no resultado de contagem de unidades formadoras de colnias e as amostras nos tempos
0, 2, 3, 4 e 5 no apresentaram diferenas significativas entre si (p 0,05).
46
Conc (UFC/mL)
1,20E+10
1,00E+10
8,00E+09
6,00E+09
4,00E+09
2,00E+09
0,00E+00
0
Tempo (min)
Mdia total
Figura 9 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 209 - Caldo clarificado por
aquecimento
Na Figura 8 verifica-se com clareza a diminuio brusca da contagem (UFC/mL) do
Lactobacillus FT 209 (caldo clarificado por aquecimento) tendo valores de contagem (UFC/mL)
prximos de 0 (zero) em 3 minutos e igual a zero em 4 e 5 minutos.
47
1,20E+10
1,00E+10
8,00E+09
6,00E+09
4,00E+09
2,00E+09
0,00E+00
0
Tempo (min)
Mdia total
Figura 10 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 209 - Caldo clarificado por
adio de fosfato mono hidratado de sdio
Na Figura 9 possvel observar dados referentes ao Lactobacillus FT 209 (caldo
clarificado por adio de fosfato mono hidratado de sdio), onde o comportamento similar ao
caldo clarificado por aquecimento ocorrendo da mesma forma a diminuio brusca em sua
contagem (UFC/mL), tendo seus valores de contagem atingindo zero nos tempos de 4 e 5
minutos.
Na Tabela 3 esto os dados da mdia das contagens (UFC/mL) do Lactobacillus FT 282
(em caldo clarificado por aquecimento e fosfato mono hidratado de sdio) referente a triplicata
do experimento e das placas. No tempo 0 (zero) a contagem inicial de 4,79 109 UFC/mL e 1,12
1010 (respectivamente). Verifica-se em ambos os casos uma reduo brusca em seus valores de
contagens (UFC/mL), sendo aos 2 minutos 250,67 e 116,67 UFC/mL, respectivamente, e a partir
de 4 minutos a mdia igual a zero.
Pelo teste de Friedman, verifica-se que as formas como o caldo foi clarificado no
interfere no resultado de contagem de unidades formadoras de colnias e as amostras nos tempos
0, 2, 3, 4 e 5 no apresentaram diferenas significativas entre si (p 0,05).
48
5,00E+09
4,00E+09
3,00E+09
2,00E+09
1,00E+09
0,00E+00
0
Tempo (min)
Mdia total
Figura 11 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 282 - Caldo clarificado por
aquecimento
Na Figura 10 verifica-se a diminuio brusca da contagem (UFC/mL) do Lactobacillus
FT 282 (caldo clarificado por aquecimento) tendo valores de contagem (UFC/mL) prximos de 0
(zero) em poucos minutos e igual a zero nos tempos de 4 e 5 minutos.
49
1,00E+10
8,00E+09
6,00E+09
4,00E+09
2,00E+09
0,00E+00
0
Tempo (min)
Mdia total
Figura 12 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 282 - Caldo clarificado por
adio de fosfato mono hidratado de sdio
Na Figura 11 possvel observar dados referentes ao Lactobacillus FT 282 (caldo
clarificado por adio de fosfato mono hidratado de sdio), onde o comportamento similar ao
caldo clarificado por aquecimento, ocorrendo da mesma forma a diminuio brusca em sua
contagem (UFC/mL), tendo seus valores de contagem atingindo zero nos tempos de 4 e 5
minutos.
Na Tabela 4 esto os dados da mdia das contagens (UFC/mL) do Lactobacillus FT 337
(em caldo clarificado por aquecimento e fosfato mono hidratado de sdio) referente a triplicata
do experimento e das placas. No tempo 0 (zero) a contagem inicial de 9,3 109 UFC/mL e 2,41
109 (respectivamente). Verifica-se em ambos os casos uma reduo brusca em seus valores de
contagens (UFC/mL), sendo aos 2 minutos (146,7 e 124,7 UFC/mL, respectivamente, e a partir
de 4 minutos a mdia igual a zero.
Pelo teste de Friedman, verifica-se que as formas como o caldo foi clarificado no
interfere no resultado de contagem de unidades formadoras de colnias e as amostras nos tempos
0, 2, 3, 4 e 5 no apresentaram diferenas significativas entre si (p 0,05).
50
Conc (UFC/mL)
Tempo (min)
Mdia total
Figura 13 Mdia (UFC/mL) x tempo (min)- Lactobacillus FT 337 - Caldo clarificado por
aquecimento
Na Figura 12 verifica-se com clareza a diminuio brusca da contagem (UFC/mL) do
Lactobacillus FT 337 (caldo clarificado por aquecimento) tendo valores de contagem (UFC/mL)
prximos de 0 (zero) em 3 minutos e igual a zero em 4 e 5 minutos.
51
Conc (UFC/mL)
3,00E+09
2,50E+09
2,00E+09
1,50E+09
Mdia total
1,00E+09
5,00E+08
0,00E+00
0
Tempo (min)
Figura 14 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 337 - Caldo clarificado por
adio de fosfato mono hidratado de sdio
Na Figura 13 possvel observar dados referentes ao Lactobacillus FT 337 (caldo
clarificado por adio de fosfato mono hidratado de sdio), onde o comportamento similar ao
caldo clarificado por aquecimento, ocorrendo da mesma forma a diminuio brusca em sua
contagem (UFC/mL), tendo seus valores de contagem atingindo zero nos tempos de 4 e 5
minutos.
Na Tabela 5 esto os dados da mdia das contagens (UFC/mL) do Lactobacillus FT 401
(em caldo clarificado por aquecimento e fosfato mono hidratado de sdio) referente a triplicata
do experimento e das placas. No tempo 0 (zero) a contagem inicial de 3,62 109 UFC/mL e 2,67
109 (respectivamente). Verifica-se em ambos os casos uma reduo brusca em seus valores de
contagens (UFC/mL), sendo aos 2 minutos 179,1 e 96,33 UFC/mL, respectivamente, e a partir de
4 minutos a mdia igual a zero.
Pelo teste de Friedman, verifica-se que as formas como o caldo foi clarificado no
interfere no resultado de contagem de unidades formadoras de colnias e as amostras nos tempos
0, 2, 3, 4 e 5 no apresentaram diferenas significativas entre si (p 0,05).
52
Conc. (UFC/ml)
3,50E+09
3,00E+09
2,50E+09
2,00E+09
1,50E+09
1,00E+09
5,00E+08
0,00E+00
0
Tempo (min)
Mdia total
Figura 15 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 401 x Caldo clarificado por
aquecimento
Na Figura 14 verifica-se com clareza a diminuio brusca da contagem (UFC/mL) do
Lactobacillus FT 401 (caldo clarificado por aquecimento) tendo valores de contagem (UFC/mL)
prximos de 0 (zero) em 3 minutos e igual a zero em 4 e 5 minutos.
53
2,50E+09
2,00E+09
1,50E+09
1,00E+09
5,00E+08
0,00E+00
0
Tempo (min)
Mdia total
Figura 16 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 401 - Caldo clarificado por
adio de fosfato
Na Figura 15 possvel observar dados referentes ao Lactobacillus FT 401 (caldo
clarificado por adio de fosfato mono hidratado de sdio). Onde o comportamento similar ao
caldo clarificado por aquecimento ocorrendo da mesma forma a diminuio brusca em sua
contagem (UFC/mL), tendo seus valores de contagem atingindo zero nos tempos de 4 e 5
minutos.
Na Tabela 6 esto os dados da mdia das contagens (UFC/mL) do Lactobacillus FT 421
(em caldo clarificado por aquecimento e fosfato mono hidratado de sdio) referente a triplicata
do experimento e das placas. No tempo 0 (zero) a contagem inicial de 6,35 109 e 1,40 1010
UFC/mL (respectivamente). Verifica-se em ambos os casos uma reduo brusca em seus valores
de contagens (UFC/mL), sendo aos 2 minutos, 94,67 e 135,89 UFC/mL, respectivamente, e a
partir de 4 minutos a mdia igual a zero.
Pelo teste de Friedman, verifica-se que as formas como o caldo foi clarificado no
interfere no resultado de contagem de unidades formadoras de colnias e as amostras nos tempos
0, 2, 3, 4 e 5 no apresentaram diferenas significativas entre si (p 0,05).
54
Conc. (UFC/ml)
6,00E+09
5,00E+09
4,00E+09
3,00E+09
2,00E+09
1,00E+09
0,00E+00
0
Tempo (min)
Mdia total
Figura 17 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 421 - Caldo clarificado por
aquecimento
Na Figura 16 verifica-se com clareza a diminuio brusca da contagem (UFC/mL) do
Lactobacillus FT 421 (caldo clarificado por aquecimento) tendo valores de contagem (UFC/mL)
prximos de 0 (zero) em 3 minutos e igual a zero em 4 e 5 minutos.
55
Conc. (UFC/ml)
1,40E+10
1,20E+10
1,00E+10
8,00E+09
6,00E+09
4,00E+09
2,00E+09
0,00E+00
0
Tempo (min)
Mdia total
Figura 18 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 421 x Caldo clarificado por
adio de fosfato
Na Figura 17 possvel observar dados referentes ao Lactobacillus FT 401 (caldo
clarificado por adio de fosfato mono hidratado de sdio), onde o comportamento similar ao
caldo clarificado por aquecimento, ocorrendo da mesma forma a diminuio brusca em sua
contagem (UFC/mL), tendo seus valores de contagem atingindo zero nos tempos de 4 e 5
minutos.
Na Tabela 7 esto os dados da mdia das contagens (UFC/mL) do Lactobacillus FT 432
(em caldo clarificado por aquecimento e fosfato mono hidratado de sdio) referente a triplicata
do experimento e das placas. No tempo 0 (zero) a contagem inicial de 3,03 109 UFC/mL e 1,52
1010 (respectivamente). Verifica-se em ambos os casos uma reduo brusca em seus valores de
contagens (UFC/mL), sendo aos 2 minutos 185,33 e 113,78 UFC/mL, respectivamente, e a partir
de 4 minutos a mdia igual a zero.
Pelo teste de Friedman, verifica-se que as formas como o caldo foi clarificado no
interfere no resultado de contagem de unidades formadoras de colnias e as amostras nos tempos
0, 2, 3, 4 e 5 no apresentaram diferenas significativas entre si (p 0,05).
56
Conc. (UFC/ml)
3,00E+09
2,50E+09
2,00E+09
1,50E+09
1,00E+09
5,00E+08
0,00E+00
0
Tempo (min)
Mdia total
Figura 19 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 432 x Caldo Clarificado por
Aquecimento
Na Figura 18 verifica-se com clareza a diminuio brusca da contagem (UFC/mL) do
Lactobacillus FT 432 (caldo clarificado por aquecimento) tendo valores de contagem (UFC/mL)
prximos de 0 (zero) em 3 minutos e igual a zero em 4 e 5 minutos.
57
Conc. (UFC/ml)
Tempo (min)
Mdia total
Figura 20 Mdia (UFC/mL) x tempo (min) - Lactobacillus FT 432 x Caldo clarificado por
adio de fosfato
Na Figura 19 possvel observar dados referentes ao Lactobacillus FT 432 (caldo
clarificado por adio de fosfato mono hidratado de sdio), onde o comportamento similar ao
caldo clarificado por aquecimento, ocorrendo da mesma forma a diminuio brusca em sua
contagem (UFC/mL), tendo seus valores de contagem atingindo zero nos tempos de 4 e 5
minutos.
4.1.2 Comparativo entre resultados obtidos para os Lactobacillus
Na Tabela 8 esto os valores das mdias (triplicata do experimento e das placas) das
contagens (UFC/mL) das sete espcies diferentes de Lactobacillus utilizadas no experimento em
caldo clarificado por aquecimento. possvel visualizar de forma comparativa a resistncia
desses microrganismos nos diferentes tempos (0, 2, 3, 4 e 5 minutos). Tendo os sete
microrganismos valores de contagem inicial (tempo zero minutos) com ordem de grandeza de 109
e 1010 (UFC/mL) e uma reduo brusca aos dois minutos passando a ter sua contagem prximo
de 102 UFC/mL, aos trs minutos contagem (UFC/mL) com valores prximos de zero e aos
quatro e cinco minutos se igualando a zero.
58
FT188
FT 209
FT 282
FT 337
FT 401
FT 421
FT 432
(UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL)
3,00 109 b/x 1,02 1010 a/x 4,79 109 b/x 9,30 109 a/x 3,62 109 b/x 6,35 109 b/x 3,03 109 b/x
128,889 a/x 186,889 a/y 250,670 a/y 146,700 a/y 179,100 a/y 94,670 a/y 185,330 a/x
0,333 a/x
0,556 a/y
4,110 a/y
1,600 a/y
1,000 a/y
65,000 a/y
2,330 a/x
0,000 a/x
0,000 a/y
0,000 a/y
0,000 a/y
0,000 a/y
0,000 a/y
0,000 a/x
0,000 a/x
0,000 a/y
0,000 a/y
0,000 a/y
0,000 a/y
0,000 a/y
0,000 a/x
Valores seguidos por letras iguais entre si no diferem estatisticamente a 5% pelo teste de Friedman. Entretanto,
valores seguidos por letras diferentes entre si, diferem.
Na Tabela 9 esto os valores das mdias (triplicata do experimento e das placas) das
contagens (UFC/mL) das sete espcies diferentes de Lactobacillus utilizadas no experimento em
caldo clarificado por adio de fosfato mono hidratado de sdio. possvel visualizar de forma
comparativa a resistncia desses microrganismos nos diferentes tempos (0, 2, 3, 4 e 5 minutos).
Tendo os sete microrganismos valores de contagem inicial (tempo zero) com ordem de grandeza
de 109 e 1010 e uma reduo brusca aos dois minutos, passando a ter sua contagem prximo de 102
UFC/mL, aos trs minutos tem seus valores prximos de zero e aos quatro e cinco minutos se
igualando a zero.
Pelo Teste de Friedman, ndice de significncia de p 0,05, os valores de contagem
(UFC/mL) apresentam diferenas significativas apenas do tempo zero para os demais tempos (2,
3, 4 e 5 minutos) e para estes tempos no h diferena significativa entre si.
59
Tabela 9 - Valores referentes mdia (UFC/mL) das sete linhagens Lactobacillus em caldo
clarificado por adio de fosfato mono hidratado de sdio
Clarificao por adio de fosfato mono hidratado de sdio
Tempo(min)
FT188
FT 209
FT 282
FT 337
FT 401
FT 421
FT 432
(UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL) (UFC/mL)
2,28 109 c/x 1,16 1010 b/x 1,12 1010 b/x 2,42 109 c/x 2,57 109 c/x 1,40 1010 b/x 2,22 1010 a/x
65,000 a/x 138,670 a/y 116,670 a/y 124,778 a/x 96,330 a/x 135,890 a/y 113,780 a/y
0,890 a/x
0,560 a/y
0,890 a/y
0,889 a/x
1,440 a/x
1,670 a/y
1,560 a/y
0,000 a/x
0,000 a/y
0,000 a/y
0,000 a/x
0,000 a/x
0,000 a/y
0,000 a/y
0,000 a/x
0,000 a/y
0,000 a/y
0,000 a/x
0,000 a/x
0,000 a/y
0,000 a/y
Valores seguidos por letras iguais entre si no diferem estatisticamente a 5% pelo teste de Friedman. Entretanto,
valores seguidos por letras diferentes entre si, diferem.
Mdia UFC/ml
FT 188
FT 209
FT 282
FT 337
FT 401
FT 421
FT 432
Lactobacillus
60
Mdia UFC/ml
1,60E+10
1,40E+10
1,20E+10
1,00E+10
8,00E+09
6,00E+09
FT 188
4,00E+09
2,00E+09
0,00E+00
FT 421
FT 209
FT 282
FT 337
FT 401
FT 432
Lactobacillus
Mdia UFC/ml
250,000
FT 209
200,000
FT 282
FT 337
150,000
FT 401
100,000
FT 421
50,000
FT 432
0,000
Lactobacillus
61
Mdia UFC/ml
FT 188
FT 209
FT 282
FT 337
FT 401
FT 421
FT 432
Lactobacillus
62
Mdia UFC/ml
60,0
FT 188
50,0
FT 209
40,0
FT 282
FT 337
30,0
FT 401
20,0
FT 421
10,0
FT 432
0,0
Lactobacillus
Mdia UFC/ml
2,0
FT 188
FT 209
1,5
FT 282
1,0
FT 337
FT 401
0,5
FT 421
FT 432
0,0
Lactobacillus
63
Mdia UFC/ml
FT 188
0,800
FT 209
FT 282
0,600
FT 337
0,400
FT 401
FT 421
0,200
FT 432
0,000
Lactobacillus
Figura 27 - Mdia da contagem (UFC/mL) nos tempos quatro e cinco minutos dos
Lactobacillus em caldo clarificado por aquecimento
Na Figura 26 observa-se graficamente as comparaes das contagens (UFC/mL) nos
tempos de quatro e cinco minutos das sete diferentes espcies de Lactobacillus utilizados no
experimento em caldo clarificado por aquecimento ou adio de fosfato mono hidratado de sdio.
Nesse grfico possvel observar que todos os microrganismos possuem valores iguais a zero
para a contagem (UFC/mL) nesses tempos.
4.1.3 Tratamento do fermento por etanol
Com relao ao tratamento do fermento foram feitos dois ensaios: um utilizando apenas a
soluo alcolica e o outro com soluo alcolica com pH corrigido para 2,5.
Na seqncia so apresentadas as Tabelas de 10 a 16 com os resultados obtidos para as
mdias das contagens de unidades formadoras de colnias por mL (UFC/mL) para as sete
64
65
66
25% v/v ou concentraes maiores. Em pH 2,5, concentrao de 20% v/v e tempo de 60 minutos
observa que a contagem (UFC/mL) possui valores prximos de zero (1,11 UFC/mL) chegando
zero no tempo de 90 minutos. E para o pH 6,0 os valores de contagem chegam prximos de zero
(0,66 UFC/mL) concentrao de 20% v/v no tempo de 60 minutos chegando a zero no tempo de
120 minutos.
Pelo Teste de Friedman, verifica que os resultados apresentam diferenas significativas,
ndice de significncia (p 0,05), para concentraes diferentes, no mesmo pH e tempo, o que j
era de se esperar, pois, os Lactobacillus se mostram mais sensveis maiores concentraes. Para
as solues alcolicas em pH 2,5 no houve em sua grande maioria, diferena significativa (p
0,05) nas contagens (UFC/mL) entre as concentraes (25, 30 e 35% v/v). E para o pH 6,0 no
houve diferenas significativas (p 0,05) nas contagens (UFC/mL) entre as concentraes (15 e
20% v/v), onde no foi relevante a ao do etanol, e nas concentraes (25, 30 e 35% v/v), onde
foi evidente o efeito do etanol sobre os microrganismos de forma similar.
Tabela 12 - Mdias (UFC/mL) de valores referentes inativao do Lactobacillus FT 282
em solues alcolicas (pH 2,5 e 6,0) nos diferentes tempos (min)
FT 282
Concentrao inicial
(UFC/mL)
1,54 108
Tempo (min)
30
60
90
120
pH
pH
pH
pH
Teor alcolico
2,5
6,0
2,5
6,0
2,5
6,0
2,5
6,0
(% v/v)
a
a
a
a
a
a
a
[15]
+300 +300 +300 +300 +300 +300 +300 +300 a
[20]
222,2 b +300 a 1,11 b +300 a 0 b +300 a 0 b +300 a
[25]
0 c 72,33 b 0 c 0,66 b 0 b
0b
0b
0b
[30]
0 c 5,66 c 0 c
0c
0b
0b
0b
0b
[35]
0c
0d
0c
0c
0b
0b
0b
0b
Valores seguidos por letras diferentes na mesma coluna (a, b, c...) diferem entre si estatisticamente a 5%
pelo Teste de Friedman
67
zero no tempo de 90 minutos. E para o pH 6,0 os valores de contagem chegam prximos de zero
(0,11 UFC/mL) concentrao de 25% v/v no tempo de 60 minutos chegando a zero no tempo de
90 minutos.
Pelo Teste de Friedman, verifica que os resultados apresentam diferenas significativas,
ndice de significncia (p 0,05), para concentraes diferentes, no mesmo pH e tempo, o que j
era de se esperar, pois, os Lactobacillus se mostram mais sensveis maiores concentraes. Para
as solues alcolicas em pH 2,5 no houve em sua grande maioria, diferena significativa (p
0,05) nas contagens (UFC/mL) entre as concentraes (25, 30 e 35% v/v). E para o pH 6,0 no
houve diferenas significativas (p 0,05) nas contagens (UFC/mL) entre as concentraes (15 e
20% v/v), onde no foi relevante a ao do etanol, e nas concentraes (25, 30 e 35% v/v) onde
foi evidente o efeito do etanol sobre os microrganismos de forma similar.
Tabela 13 - Mdias (UFC/mL) de valores referentes inativao do Lactobacillus FT 337
em solues alcolicas (pH 2,5 e 6,0) nos diferentes tempos (min)
FT 337
Concentrao inicial
(UFC/mL)
2,56 108
Tempo (min)
30
60
90
120
pH
pH
pH
PH
Teor alcolico
2,5
6,0
2,5
6,0
2,5
6,0
2,5
6,0
(% v/v)
a
a
a
a
a
a
a
[15]
+300 +300 +300 +300 +300 +300 +300 +300 a
[20]
99,66 b +300 a 2,11 b +300 a 0 b +300 a 0 b +300 a
[25]
1,55 c 49,99 b 0 c 0,11 b 0 b
0b
0b
0b
[30]
0,33 d 20,11 c 0 c 0,22 b 0 b
0b
0b
0b
[35]
0e
0d
0c
0c
0b
0b
0b
0b
Valores seguidos por letras diferentes na mesma coluna (a, b, c...) diferem entre si estatisticamente a 5%
pelo Teste de Friedman
68
(0,77 UFC/mL) concentrao de 25% v/v no tempo de 60 minutos chegando a zero no tempo de
90 minutos.
Pelo Teste de Friedman, verifica que os resultados apresentam diferenas significativas,
ndice de significncia (p 0,05), para concentraes diferentes, no mesmo pH e tempo, o que j
era de se esperar, pois, os Lactobacillus se mostram mais sensveis maiores concentraes. Para
as solues alcolicas em pH 2,5 no houve em sua grande maioria, diferena significativa (p
0,05) nas contagens (UFC/mL) entre as concentraes (25, 30 e 35% v/v). E para o pH 6,0 no
houve diferenas significativas (p 0,05) nas contagens (UFC/mL) entre as concentraes (15 e
20% v/v), onde no foi relevante a ao do etanol, e entre as concentraes (25 e 30% v/v), onde
foi evidente o efeito do etanol sobre os microrganismos de forma similar.
Tabela 14 Mdias (UFC/mL) de valores referentes inativao do Lactobacillus FT 401
em solues alcolicas (pH 2,5 e 6,0) nos diferentes tempos (min)
FT 401
Concentrao inicial
(UFC/mL)
2,83 108
Tempo (min)
30
60
90
120
pH
pH
pH
pH
Teor alcolico
2,5
6,0
2,5
6,0
2,5
6,0
2,5
6,0
(% v/v)
a
a
a
a
a
a
a
[15]
+300 +300 +300 +300 +300 +300 +300 +300 a
[20]
266,95 b +300 a 14,44 b +300 a 0,11 b +300 a 0 b +300 a
[25]
0,44 c 277,4 b 0 c 0,77 b 0 b
0b
0b
0b
[30]
0 d 81,55 b 0 c 1,66 b 0 c 0,11 b 0 b
0b
[35]
0d
0c
0c
0c
0c
0b
0b
0b
Valores seguidos por letras diferentes na mesma coluna (a, b, c...) diferem entre si estatisticamente a 5%
pelo Teste de Friedman
69
70
4.2 Discusso
4.2.1 Tratamento trmico do caldo de cana-de-acar
Para o tratamento trmico (em cuba de clarificao) do caldo de cana-de-acar foram
utilizados dois mecanismos de clarificao: aquecimento (presena de borras e colides) e adio
de fosfato mono hidratado de sdio (caldo lmpido) com o objetivo de verificar se a presena de
borras e colides so interferentes na eliminao de microrganismos quando submetido ao
tratamento trmico. Essa hiptese foi descartada visto que a morte trmica dos microrganismos se
71
deu de forma similar, verificada pelo Teste de Friedman (Tabelas 1 a 7), no ocorrendo
diferenas significativas na contagem (UFC/mL) para ndice de significncia de p 5%.
Observou-se o comportamento das sete linhagens de espcies diferentes de Lactobacillus
com relao a resistncia trmica. Todas se mostraram sensveis temperatura da gua em
ebulio, tendo valores prximos de zero a partir da terceira amostra (trs minutos). Nas Figuras
6 a 19 observa-se graficamente (separadamente) a reduo brusca dos valores de contagem
(UFC/mL) para cada linhagem dos sete Lactobacillus, no importando a forma de clarificao,
tendo valores de contagens iniciais da ordem de grandeza de 109 e 1010 UFC/mL para valores
prximos ou iguais a zero.
Nas Tabelas 8 e 9 e nas Figuras de 20 a 26 possvel visualizar as redues dos
microrganismos de forma comparativa mostrando como seus comportamentos foram similares
(valores de UFC/mL semelhantes) nos diferentes tempos 0, 2, 3, 4 e 5 minutos. A semelhana foi
confirmada pelo Teste de Friedman (anlise estatstica) onde no foram encontradas diferenas
significativas (p 5%) entre as contagens (UFC/mL) nos diferentes tempos (2, 3, 4 e 5 minutos),
diferindo estes apenas do tempo inicial (zero minuto).
Pouco se encontra em literatura sobre morte trmica de Lactobacillus. Franchi et al. (2003
a, b), encontraram valores de D60C (ndice de reduo decimal a 60 oC (unidades de tempo)) para
as espcies testadas: a L.confusus, se mostrou a mais sensvel no sendo possvel a determinao
do valor D60C para esse contaminante, enquanto o Leuconostoc foi mais resistente. Os dados
obtidos foram: 0,75 minutos para L. fermentum, 0,29 minutos para L. plantarum e 1,57 minutos
para Leuconostoc mesenteroides. Casadei et al. (2001) encontraram o valor D60C para L.
delbrueckii de 2,4 minutos.
Nolasco (2005), verificou que algumas bactrias do gnero Sporolactobacillus e Bacillus
apresentam baixa resistncia trmica. Verificou tambm em experimento que o processo de
decantao assegura a total eliminao dos lactobacilos contaminantes da fermentao alcolica,
de forma que se eles aparecem posteriormente na fermentao por recontaminao. Seus
experimentos foram realizados em decantadores rpidos sem bandeja (tempo mdio de residncia
de 1,15 horas) e decantadores convencionais com bandeja (tempo de residncia de 2,5 horas) e a
temperatura avaliada para a letalidade foi de 93,61 oC (obtida subtraindo do valor mdio de
temperatura obtida no decantador 96,55 oC pelo intervalo de confiana 2,94 oC). Os pontos
escolhidos para o estudo foram os de temperatura mais frias detectadas no decantador.
72
Utilizando dados j encontrados por Franchi et al. (2003b), Nolasco (2005) encontrou o
parmetro de resistncia D120C para L. fermentum de 1,21 10-8 minutos. Com esses dados a
letalidade calculada do decantador convencional foi 4,6 108 redues decimais sobre L.
fermentum e 0,17 redues decimais nos esporos termoflicos, enquanto que no decantador rpido
a letalidade calculada foi 3,43 106 redues decimais sobre L. fermentum e 0,11 redues
decimais nos esporos termoflicos. Quanto a letalidade do processo de decantao, o decantador
tipo convencional ou rpido conferem em mdia 4,0 106 redues decimais em Lactobacillus
fermentum e 0,14 redues decimais em B. stearothermophillus ATCC 1518 em caldo.
Valsechi (2005), preocupado com a contaminao microbiana (na produo de etanol)
especialmente, as bactrias produtoras de cido ltico props uma metodologia que propiciasse a
eliminao desses agentes. Utilizando linhagens de Lactobacillus fermentum (CCT4143;
CCT4144; CCT4145; CCT4146 e FT038B) que foram submetidas ao aquecimento gerado por
radiaes eletromagnticas (microondas) e aquecimento convencional, pode verificar a
eliminao total de L. fermentum quando irradiadas com microondas (2450 MHZ) durante 9
segundos quando a temperatura atingia 58,3 oC; ao passo que essas linhagens de Lactobacillus
quando submetidas ao aquecimento convencional nesta mesma temperatura a diminuio foi de
80% aps 10 minutos.
Chen (1985), relata que nos difusores o caldo exposto a condies ideais para
crescimento microbiano, visto que o pH normalmente acima de seis devido a calagem. De
acordo com o grfico, a temperatura no difusor no deve ser menor que 75 C para evitar
contaminaes bacterianas. Nestas temperaturas ocorrem o crescimento de bactrias lticas que
consomem o acar, diminuindo o Brix e aumentando a concentrao de cido ltico.
Sabe-se que o cido ltico produzido por bactrias lticas. Como no caso do
experimento em questo em outros experimentos os autores possuem a preocupao em eliminar
contaminantes da fermentao (em sua grande maioria bactrias lticas). Os Lactobacillus e
outras bactrias se mostram sensveis temperatura. Com uma sensibilidade to grande ao calor
fica a ressalva com relao eficincia da etapa de clarificao no processo de obteno de
lcool em escala industrial. Na clarificao, o caldo submetido temperaturas prximas a 105
o
colaborando com uma fermentao eficiente. A presena destas nas dornas de fermentao se do
por uma possvel clarificao ineficiente e por recontaminaes posteriores.
73
Em estudos realizados por Maciel (2001), foram identificadas bactrias lticas no solo de
canaviais, na gua da bainha das folhas e na superfcie dos colmos de cana-de-acar. Gallo
(1990), em seu estudo identificou tambm bactrias lticas em dornas de fermentao (ver
reviso bibliogrfica). O fato de estarem presentes bactrias do mesmo gnero na cana-de-acar
e dornas indicam a possibilidade dos microrganismos serem frutos de uma clarificao ineficiente
ou recontaminaes por falta de higiene das etapas da produo, causando prejuzos
fermentao. O objetivo deste projeto foi alertar para esse fato visando melhorias dessa etapa
(clarificao) em pesquisas futuras.
4.2.2 Tratamento do fermento
A produo de etanol no Brasil atualmente realizada pelo processo de fermentao em
batelada alimentada ou contnuo, com reciclo de clulas de leveduras (fermento), de forma que
contaminantes bacterianos so tambm reciclados e podem causar problemas devido
competio pelo mesmo substrato. O controle bacteriano feito pela adio de cido sulfrico na
lavagem das clulas do fermento ou utilizando-se biocidas (MENEGHIN et al., 2008).
O cido sulfrico utilizado nesse processo considerado um problema operacional visto
sua toxicidade, sendo agressivo aos manipuladores, s leveduras e necessitando cuidados no
armazenamento e transporte. O etanol foi testado como alternativa ao tratamento cido
verificando a sensibilidade das sete diferentes espcies de Lactobacillus s solues alcolicas.
Nas Tabelas 10 a 16 esto os resultados das mdias de contagens (UFC/mL) para os
tratamentos onde as linhagens entram em contato com as solues alcolicas de 15 a 35% v/v
durante os tempos de 30, 60, 90 e 120 minutos.
Ocorreram variaes com relao s contagens (UFC/mL) entre as diferentes espcies de
Lactobacillus, mas todas se mostraram sensveis ao etanol tendo seus valores de contagem
(UFC/mL) prximos ou iguais a zero em concentraes maiores que 20% v/v. As contagens
iniciais (tempo zero) da ordem de grandeza de 107 e 108 UFC/mL atingem valores iguais a zero
aps o tratamento com as solues alcolicas de concentraes maiores que 20% v/v.
Fica claro pelos resultados mostrados nas Tabelas (10 a 16) que apenas o tratamento
alcolico com concentrao de 15% v/v em pH 2,5 ou concentraes de 15 e 20% v/v em pH 6,0
apresentam pouca ou nenhuma ao sobre a viabilidade das bactrias em estudo sendo as
linhagens menos sensveis as FT 401 e FT 421 (Tabelas 14 e 15).
74
75
76
77
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80
81
82
83
84
85
APENDICES
86
87
FT 188
Aquecimento
3,7 109
FT 188
Aquecimento
4,1 109
FT 188
Aquecimento
3,1 109
FT 188
Aquecimento
4,8 109
FT 188
Aquecimento
4,7 109
FT 188
Aquecimento
4,5 109
FT 188
Aquecimento
7,2 108
FT 188
Aquecimento
7,3 108
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
0
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2
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2
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3
1
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3
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3
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2
6,9 108
113
143
97
93
111
136
141
167
159
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0
1
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0
0
0
0
0
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0
0
0
0
0
88
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
FT 188
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
Aquecimento
5
5
5
5
5
5
5
1
2
2
2
3
3
3
3
1
2
3
1
2
3
0
0
0
0
0
0
0
FT 188
Fosfato
4,1 109
FT 188
Fosfato
4,0 109
FT 188
Fosfato
4,4 109
FT 188
Fosfato
1,5 109
FT 188
Fosfato
1,8 109
FT 188
Fosfato
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