Derecho y Cambio Social

USO DAS TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR NA

GENTICA FORENSE
Viviane da Silva Leite 1
Mara Ilka Holanda de Medeiros Batista 2
Evelyne Pessoa Soriano 3
Marcus Vitor Diniz de Carvalho 4
Ana Paula Veras Sobral 5

Fecha de publicacin: 01/10/2013

RESUMO:
Os avanos nas tecnologias de DNA surtiram um enorme
impacto no campo da cincia forense. Com uma incrvel
sensibilidade e um alto poder de discriminao, a anlise de
DNA tem sido uma poderosa ferramenta para a identificao
humana e investigaes criminais. O presente estudo far uma
reviso sobre as tcnicas de Biologia Molecular mais
significativas RFLP, VNTR, PCR e STR que foram
desenvolvidas nas ltimas dcadas, tendo como princpio o
estudo de diferentes polimorfismos de DNA para a identificao
precisa de indivduos. Por um longo tempo, estes polimorfismos
foram detectados por tcnicas que possuam como base a
eletroforese. Outra tcnica que tambm ser exposta, Southern
Blotting, visa a identificao de uma sequncia de bases

Biomdica, aluna do Mestrado em Percias Forenses na Faculdade de Odontologia da

Universidade de Pernambuco (FOP-UPE), Camaragibe, PE.

Cirurgi-Dentista, aluna do Mestrado em Percias Forenses na Faculdade de Odontologia da

Universidade de Pernambuco (FOP-UPE), Camaragibe, PE. E-mail: marailka@hotmail.com

Professora do Mestrado em Percias Forenses na Faculdade de Odontologia da Universidade

de Pernambuco (FOP-UPE), Camaragibe, PE (BRASIL).

Professor do Mestrado em Percias Forenses na Faculdade de Odontologia da Universidade

de Pernambuco (FOP-UPE), Camaragibe, PE (BRASIL).

Professora do Mestrado em Percias Forenses na Faculdade de Odontologia da Universidade

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especificas do DNA, que foi por muito tempo aplicada tanto na

deteco de SNPs como de VNTRs e STRs. Alem disto, ser
descrita a reao em cadeia da polimerase (PCR), um mtodo
laboratorial capaz de copiar milhes de vezes um segmento do
DNA, que se destaca perante outras tcnicas por ser um
procedimento relativamente simples e fcil de realizar em
laboratrio, gerando resultados precisos e satisfatrios, em um
curto espao de tempo. Por fim, sero descritos os mtodos
automatizados que, a partir de PCR, permitem a deteco rpida
de marcadores moleculares, a fim de facilitar e tornar mais
precisa a identificao forense.
PALAVRAS-CHAVE - Tcnicas de biologia molecular,
Gentica forense, Perfil de DNA, Investigaes criminais.
USE OF MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES IN
FORENSIC GENETIC
ABSTRACT
The advent of DNA-based technologies promoted significant
impact in the field of forensic science. According to its high
sensibility and powerful discrimination, the DNA analyses have
been a powerful tool to human identification and criminal
investigations. The present study will be taken to produce a
review about the most important techniques of molecular
biology developed in recent decades, such as RFLP, VNTR,
PCR and STR. These techniques are based in the study of
different polymorphisms in the DNA and it could be used in the
precise subjects identification. For a period, these
polymorphisms were detected through techniques based in
electrophoresis. Besides, other procedures will be explained,
like Southern Blotting that aims to identify specific DNA
sequences and could be applied in the research of SNPs, VNTRs
and STRs. It will be also described the Polimerase Chain
Reaction (PCR), a laboratorial method able to amplify millions
of a short DNA segment. This technique has some advantages
through the others because it is a simple and easy procedure to
be done in laboratories, and could offer accurate and satisfactory
results in a short period of time. Concluding, automated
techniques based in PCR will be present that permit fast
detection of molecular evidences in order to facilitate and
promote reliable forensic identification.
KEYWORDS - Molecular Biology Techniques, Forensic
Genetic. DNA profiling, Criminal investigation.

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INTRODUO
Em meados dos anos 80, o primeiro mtodo de utilizao de anlise
de DNA para identificar indivduos foi desenvolvido, por Alec Jeffreys, da
Universidade de Leicester e, no incio, havia muitas dvidas quanto
reprodutibilidade e a confiabilidade dos mtodos1. Aps o avano da
cincia e tecnologia, a anlise do DNA a nvel forense, torrnou-se uma das
mais poderosas ferramentas para a identificao humana e investigaes
criminais2.
As primeiras tcnicas forenses de identificao humana eram
convenientes apenas para anlise de DNA de evidncias biolgicas que
contivessem clulas nucleadas. Atualmente, com a implementao do
sequenciamento do DNA mitocondrial, essa limitao tem sido superada.
Se antes, impresses digitais e outras pistas eram usadas para desvendar
crimes; hoje, so inmeros os espcimes biolgicos dos quais o DNA pode
ser extrado. Podemos encontr-lo em pequenas amostras de sangue, ossos,
smen, cabelo, dentes, unhas, saliva, urina, entre outros fluidos, e anlises
cuidadosas desse material ajudam a identificar criminosos2.
As aplicaes da Biologia Molecular no laboratrio criminal
centralizam-se, em grande parte, na capacidade da anlise do DNA em
identificar um indivduo a partir de cabelos, manchas de sangue e fluidos
corporais, entre outros itens recuperados no local do crime. Essas tcnicas
so conhecidas como datiloscopia gentica (genetic fingerprinting), embora
o termo mais preciso e utilizado para design-las seja perfil de DNA3.
Segundo Pena (2005)4, a determinao de identidade gentica pelo
DNA pode ser usada para demonstrar a culpabilidade dos criminosos,
exonerar os inocentes, identificar corpos e restos humanos em desastres
areos e campos de batalha, determinar paternidade com confiabilidade
praticamente absoluta, elucidar trocas de bebs em berrios e detectar
substituies e erros de rotulao em laboratrios de patologia clnica.
Sendo assim, entende-se que, existem quatro grandes vantagens que
devem ser citadas sobre a tipagem molecular do DNA: a primeira e de
maior importncia , sem sombra de dvida, a possibilidade de sua
extrao de qualquer fonte de material biolgico, a segunda que o DNA
possui um alto potencial discriminatrio, a terceira a alta estabilidade
qumica mesmo aps um longo perodo de tempo, estando presente em
todas as clulas nucleadas do organismo humano, e a quarta vantagem do
DNA, reside na possibilidade de separ-lo da clula espermtica, de
qualquer outro DNA celular5.
Atualmente a identificao humana forense por anlise do DNA j
aceita em processos judiciais em todo o mundo, sendo possvel inclusive
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identificao de pessoas mortas, h centenas de anos, utilizando DNA

obtido de ossos ou dentes6.
O nmero de tribunais que tm aceitado evidncias baseadas no
DNA cresce a cada dia, levando-nos a crer que, em um futuro muito
prximo, esta tecnologia ser empregada em todo o Sistema Legal. Porm
para que no ocorra nenhum tipo de erro e para a preciso dos resultados,
regras rgidas de coleta e processamento das amostras devem ser adotadas7.
Assim disposto, entende-se que a genotipagem forense se presta, no
ncleo principal de sua finalidade, a estabelecer os correspondentes
vnculos genticos entre amostras-questionadas, vestgios de origem
biolgica desconhecida, e amostras-referncia, de origem biolgica
conhecida, concluindo-se pela determinao da origem individual de cada
vestgio e, a partir desse ponto e mesmo coligado a outros meios de prova,
eventualmente reconstruir parcial ou totalmente a dinmica do ato
criminoso.
REVISO DA LITERATURA
Informao Gentica
As informaes genticas individuais esto armazenadas sob a forma
de cidos nuclicos. Os cidos nuclicos foram descobertos em 1869 por
Friedrich Miescher e no incio do sculo XX o bioqumico Kossel
evidenciou a existncia de dois tipos de cidos nuclicos: o cido
desoxirribonuclico (DNA) e o cido ribonuclico (RNA). O DNA contm
o gene enquanto que o RNA serve como agente intermedirio na atividade
do gene. O RNA mensageiro (mRNA) transcrito a partir do DNA e
traduzido em seqncias de aminocidos que formam as protenas8.
O DNA uma molcula extremamente longa, formada por duas
cadeias de polinucleotdeos enrolados de forma helicoidal e ligados
transversalmente atravs de pontes de hidrognio. Cada nucleotdeo
constitudo por trs unidades bsicas: uma base nitrogenada, uma molcula
de acar (desoxirribose) e um grupamento fosfato (PO4). A adenina e a
guanina contm dois anis carbnicos, sendo chamadas de purinas; a
citosina e a timina so conhecidas como pirimidinas. A adenina forma
pontes com a timina (ligaes de duas pontes de hidrognio); e a guanina
com a citosina (ligaes de trs pontes de hidrognio). Para cada
nucleotdeo de adenina existe um de timina (A-T), e para cada nucleotdeo
de guanina existe um de citosina (G-C), formando duas cadeias que so
designadas por complementares8, citado na Figura 1.
O DNA pode ser encontrado nos cromossomos do ncleo (DNA
genmico) e nas mitocndrias (DNA mitocondrial). O DNA genmico
encontrado no ncleo de cada clula do corpo humano e representa uma
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fonte de DNA para a maioria das aplicaes forenses. Sua molcula

linear, conforme citado na Figura 2. Neste DNA esto localizados os genes,
depositrios das informaes genticas responsveis pelas atividades da
clula. Por outro lado, o interesse nos estudos forenses pelo DNA
mitocondrial se deve principalmente ao fato deste apresentar resistncia
digesto enzimtica devido a sua estrutura circular, conforme citados na
Figura 3, e sendo desta forma a anlise desse tipo de DNA excepcional no
estudo de tecidos antigos e at arqueolgicos, como ossos, dentes e
cabelos9.

Figura 1: Representao esquemtica da Molcula de DNA

Figura 2: Representao esquemtica do DNA genmico humano.

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Figura 3: Representao esquemtica do DNA mitocondrial (mtDNA) e suas regies

hipervariveis

Aspectos Gerais da Anlise do DNA Forense

O exame de DNA foi apontado como a maior revoluo cientfica na
esfera forense, desde o uso e reconhecimento das impresses digitais como
uma caracterstica pessoal, onde as tcnicas de identificao fundamentadas
na anlise direta do cido desoxirribonuclico ostentam pelo menos duas
vantagens sobre os mtodos convencionais de identificao: a estabilidade
qumica do DNA, mesmo aps longo perodo de tempo, e a sua ocorrncia
em todas as clulas nucleadas do organismo humano, o que permite
condenar ou absolver um suspeito com vestgios encontrados na cena de
um crime.
Em estudo realizado por Luftig (2001)10, este mencionou, que em
agosto de 1986, na Inglaterra, um caso criminal envolvendo o estupro e
homicdio de duas adolescentes foi solucionado com a determinao da
autoria do delito aps toda a populao masculina de dois vilarejos do
condado de Leicester ter contribudo com a doao de amostras de sangue
para confronto com vestgios de smen coletados do corpo das vtimas.
Estava assim inaugurada uma nova pgina no emprego da biologia
molecular e sua utilizao na identificao humana criminal.
Desde 1989, a Sociedade Internacional de Gentica Forense, vem
demonstrando interesse em avaliar a reprodutibilidade e exatido das
metodologias utilizadas. O FBI (Federal Bureau of Investigation)
acrescenta alguns tens para o controle de qualidade dos laboratrios que
trabalham com evidncias de DNA forense, que inclui, alm desses
cuidados, a realizao de peridicos testes de proficincia (a cada 180 dias)
e auditorias anuais, para a manuteno da garantia de qualidade. O teste de
proficincia utilizado para monitorar o rendimento e identificar tpicos
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que devem ser aperfeioados e a auditoria para averiguar a qualidade das

atividades realizadas pelo laboratrio11.
Segundo Jobim (2006)12, o estudo do DNA possibilitou obter
informaes sobre a individualidade humana, iluminando a cincia da
investigao e da identificao em casos criminais. Uma mudana total na
tecnologia aconteceu a seguir, pois o estudo do polimorfismo do DNA
substituiu, em curto espao de tempo, as anlises sorolgicas dos
polimorfismos de protenas e grupos sanguneos, at ento, usados
exclusivamente na rea forense. Para o autor as tcnicas de amplificao do
DNA pela PCR na ltima dcada tiveram um enorme progresso. Foram
tambm desenvolvidos novos mtodos de extrao do DNA do sangue
perifrico, tecidos, ossos, cabelos, manchas de sangue, material vaginal,
entre outros.
O sucesso da tipagem de DNA depende basicamente da qualidade e
quantidade de DNA extrado das diversas fontes. Nos exames de
paternidade, o DNA geralmente extrado de amostras coletadas em
condies ideais. J na determinao de identidade, o material obtido nem
sempre est em boas condies. s vezes h pouco DNA, ou este est
contaminado ou degradado. Nesses casos a extrao de DNA adequado
para a anlise talvez seja a etapa mais importante do processo. So tambm
analisados polimorfismos presentes no DNA mitocondrial e no
cromossomo Y13.
Alm dos cuidados que devem ser tomados com todas as evidncias
criminais e civis, nos casos que envolvem anlises de DNA, deve-se ter
ateno em relao contaminao das evidncias criminais que
contenham material gentico. Por isso importante o uso de luvas
descartveis, mscaras e gorros cirrgicos quando for fazer a coleta,
manuseio e processamento das evidncias13.
Os exerccios propostos para laboratrios que realizam
caracterizao de vnculo gentico normalmente so constitudos de
amostras biolgicas de me, filho e suposto pai, com o intuito de comparar
as estratgias utilizadas, seus protocolos metodolgicos, assim como os
resultados obtidos entre os participantes14.
Tendo em vista assegurar uma gerao de dados corretos e
tecnologias adequadas, um apropriado programa de controle de qualidade
essencial para todos os laboratrios de anlises clnicas que realizam
identificao humana pelo DNA15.

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Fundamentos da Biologia Molecular

A Biologia Molecular o estudo da Biologia a nvel molecular, com
especial foco no estudo da estrutura e funo do material gentico e seus
produtos de expresso, as protenas. Mais concretamente, a Biologia
Molecular investiga as interaes entre os diversos sistemas celulares,
incluindo a relao entre DNA, RNA e sntese proteica. um campo de
estudo alargado, que abrange outras reas da Biologia e da Qumica, em
especial Gentica e Bioqumica.Nas ltimas dcadas, muitas tcnicas foram
desenvolvidas, objetivando a identificao gentica precisa de indivduos16.
Na Biologia Molecular frequentemente combinada tcnicas e ideias
provindas da Microbiologia, Gentica, Bioqumica e Biofsica.
Historicamente, a Microbiologia exerceu um papel fundamental no
desenvolvimento da Biologia Molecular, pois a maioria dos conceitoschave e das tcnicas de Biologia Molecular se originou a partir de estudos e
experimentos realizados principalmente com bactrias, fungos e vrus17.
Muito da investigao em Biologia Molecular relativamente
recente, e muitos trabalhos tm sido feitos recorrendo-se Bioinformtica e
Biologia Computacional. Estes recursos tornaram o estudo da estrutura e
funo de genes, ou Gentica Molecular, num dos campos mais
proeminentes em Biologia Molecular17.
Nos EUA o FBI implantou o CODIS Combined DNA Index
System, que se tornou operacional em 1998, e combina a biologia
molecular com a tecnologia eletrnica, formando um banco de dados de
perfis genticos de DNA extrado de evidncias biolgicas coletadas na
cena do crime e DNA de criminosos condenados por vrios tipos de
violncia fsica, possibilitando averiguar se o mesmo cometeu
anteriormente outra infrao11.
Um dos maiores progressos da cincia est relacionado a anlise do
DNA, onde a biologia molecular tem se tornado uma ferramenta
indispensvel na investigao criminal, desde a descoberta das impresses
digitais. Mtodos para determinar o perfil do DNA esto firmemente
embasados na tecnologia molecular. Quando a determinao do perfil
feita com cuidados adequados, os resultados so altamente reprodutveis1.
Metodologia Aplicada Identificao Humana:
A anlise do DNA em caracterizao de vnculo gentico engloba
desde o domnio da metodologia de coleta do material biolgico at a
interpretao dos resultados obtidos18.
Cada metodologia possui sua particularidade e cuidados inerentes
tcnica que podem favorecer vantagens e desvantagens, de acordo com o

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objetivo almejado. A anlise do DNA compreende diversas etapas,

independente da metodologia a ser empregada e do tipo de amostra que
ser analisada19.
O processo envolvendo a biologia molecular na forense inclui: 1)
coleta de amostras; 2) extrao, purificao e quantificao do DNA de
todas as amostras; 3) anlise dos loci; 4) visualizao dos fragmentos e
caracterizao (com o uso da Eletroforese); 5) interpretao e anlise
comparativa dos resultados20.
Coleta de Amostras para Anlise Forense
A coleta de amostras para o exame de DNA deve ser realizada logo
aps a identificao possvel pelos mdicos-legistas, odonto-legistas e
papiloscopistas, mesmo quando esta identificao for positiva, pois pode
ser necessrio um futuro confronto gentico para elucidao de dvidas
com relao identidade do indivduo e troca de corpos21.
A escolha do tipo de amostra a ser coletada depende da conservao
da amostra, onde os dentes e ossos so os materiais que se preservam por
mais tempo, mesmo quando submetidos a diferentes fatores de degradao.
A coleta e os mtodos de preservao das provas coletadas na cena
do crime tm um grande impacto no tribunal. Do ponto de vista tcnico e
criminalista, o DNA pode ser coletado da maioria dos espcimes
biolgicos, pois uma molcula estvel em ambiente seco e frio.
Se armazenado em tais condies, tem grandes chances de resultados
confiveis. Em geral, uma quantidade significativa de material deve ser
coletada para garantir a extrao de DNA suficiente para os testes2. No
entanto, importante preservar a coleta de sujeira adicional, gorduras,
fluidos e outros materiais que possam afetar o processo de tipagem de
DNA22.
O material biolgico recuperado na cena do crime pode sofrer
alteraes ambientais (luz, altas temperaturas, reativos qumicos, etc.) que
podero ocasionar quebras e alteraes da cadeia de nucleotdeos e, como
consequncia, modificar a composio e a estrutura normal do DNA,
impossibilitando a anlise23.
O armazenamento do material biolgico mido em sacos plsticos
deve ser de no mximo 2 horas ou, quando possvel, permitir que seque
antes do acondicionamento final. Cada tipo de amostra de material
biolgico (sangue, saliva, osso, dente, etc.) deve ter sua coleta e disposio
individualmente descrita. A degradao do DNA de amostras biolgicas,
utilizadas em investigao criminal, pode ocorrer decorrente de um
processo natural de exposio ao meio-ambiente. Luz, umidade,

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temperaturas elevadas, bem como contaminao bacteriana ou fngicas

levam degradao qumica do DNA humano24.
Extrao de DNA Forense
O DNA pode ser extrado de amostras de sangue, de esfregaos
bucais, de saliva, de osso, de dente, de tecidos e rgos, de fios de cabelos,
de smen, entre outros materiais biolgicos16.
A quantidade, a pureza e a integridade do DNA dependem de vrios
fatores, podendo ser influenciados pelas metodologias aplicadas para sua
extrao. Aps a coleta do material biolgico, o DNA da amostra dever
ser separado de outras substncias celulares antes de ser examinado.
Protenas celulares, contaminaes qumicas e microbiolgicas diminuem o
poder discriminatrio das anlises utilizando o DNA18.
A escolha do uso de diferentes mtodos de extrao de DNA est
relacionada ao tipo de material envolvido e influencia diretamente o
sucesso da anlise dos STRs. A maioria dos procedimentos de extrao de
DNA compreende a lise celular, seguida da remoo das protenas celulares
precipitadas e por fim a precipitao do DNA com sua final eleio.
A extrao orgnica, que o mtodo mais tradicional na gentica
forense, o qual consiste na remoo dos resduos de protenas do DNA
atravs da combinao de dois solventes orgnicos diferentes: Fenol e
Clorofrmio. Esse mtodo como qualquer outro, possui suas indicaes,
vantagens e desvantagens. Entre as principais vantagens temos: o baixo
custo e um alto grau de pureza do DNA a ser investigado. As desvantagens
so: demora em sua execuo e um mtodo altamente txico23.
A tcnica mais amplamente empregada envolve, em sua primeira
fase, a lise celular, seguida de desnaturao ou inativao de protenas, com
a utilizao de proteinase K. Com solventes orgnicos o DNA
posteriormente separado de macromolculas, como as protenas atravs de
solubilizao em gua, e em seguida precipitado com etanol. Outras
metodologias com o mesmo princpio, inclusive kits comerciais, podem ser
utilizadas para cada tipo de amostra biolgica24.
A quantidade, a pureza e a integridade do DNA dependem de vrios
fatores como condies da amostra e da conservao, sendo necessrio
utilizar critrios para escolha de metodologia de extrao para cada tipo de
amostra25.
A resina magntica outro mtodo de extrao de DNA muito
utilizado na gentica forense, sendo as mais utilizadas a DNA IQ TM, da
Promega e a ChargeSwitcha, da Invitrogen. Em ambos os casos, Uma
resina paramagntica usada para capturar uma quantidade consistente de

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DNA. A resina tem uma capacidade definida de ligao ao DNA, portanto,

mesmo em presena excessiva de DNA, a resina s se ligar a uma
quantidade definida de DNA. Uma vez que a recuperao depende do
mtodo de amostragem, apoio slido e tipo de amostra, os laboratrios
tero de determinar o rendimento mdio para um tipo de amostra nica.
Uma vez que esse rendimento foi determinado, o pesquisador pode ignorar
o passo de quantificao normalmente necessrio, com outros processos de
purificao26.
Extrao diferencial do DNA para crimes sexuais
A extrao diferencial, muito empregada em amostras provenientes
de crimes sexuais, uma variao da extrao orgnica e se baseia no fato
de que os espermatozides so clulas bem mais resistentes que as clulas
epiteliais da mucosa vaginal. Esta tcnica divide a etapa de lise celular em
duas: a primeira mais branda, onde ocorre a quebra das membranas
celulares das clulas epiteliais femininas, obtendo-se a frao no
espermtica (FNE), e a segunda, mais robusta, onde ocorre a lise das
clulas espermticas, obtendo-se a frao espermtica (FE).
Quantificao de DNA
A quantificao do DNA aps a sua extrao importante para o
aperfeioamento da qualidade do produto de DNA resultante da PCR 27. O
excesso de DNA em uma amostra de PCR poder saturar a reao, fazendo
com que apaream artefatos de tcnica e amplificaes inespecficas que
podem dificultar a sua anlise. J a sua falta poder acarretar a perda de um
dos alelos, quando o indivduo heterozigoto, ou mesmo na sua no
amplificao18.
A qualidade e quantidade de DNA devem ser examinadas aps a
extrao, alm de verificar a possibilidade de degradao. Quando se refere
s amostras utilizadas em investigao criminal ou passveis de degradao
e contaminao, recomenda-se a utilizao da quantificao de DNA
humano. Essa quantificao pode ser realizada por hibridizao de uma
sonda utilizando um determinado locus em uma amostra de DNA
imobilizada de uma membrana de nilon dot blot e por kits comerciais
como, por exemplo, o AluQuantTM human DNA quantitation system27.
Apesar dessas tcnicas serem mais complexas e caras que a
espectrofotometria, elas quantificam somente o DNA humano, pois
possuem sondas especficas para o mesmo. Tal caracterstica pode ser
imprescindvel em casos forenses que haja a possibilidade de contaminao
de DNA externo. No entanto, muitas vezes no utilizada, pois h a
necessidade de 5 a 10L de produto de DNA, o que muita vezes no
obtido28 .
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Uma metodologia que est substituindo as outras tcnicas de

quantificao por utilizar pouca quantidade de DNA, ser especfico para
DNA e inclusive possibilitando verificar a presena de inibidores da
enzima polimerase a quantificao de DNA por PCR em tempo real.
Principalmente em casos forenses que existe nfima quantidade de DNA,
est sendo altamente recomendada. Consiste no emprego de marcadores
com fluorescncia que so utilizados para a amplificao de regies do
genoma humano29.
A PCR em tempo real uma tcnica que deve ser relatada, pelo fato
de estar sendo aproveitada em cincias forenses para determinar a
quantidade de DNA humano vivel para amplificao. A PCR em tempo
real amplia regies especficas de DNA, conforme citado na figura 6. Essa
tcnica diferencia-se da PCR tradicional, por possuir sondas marcadas com
fluorforos propiciando deteco em tempo real dos fragmentos
amplificados, sendo simultaneamente quantificados. Dessa maneira, no h
necessidade de utilizao de gis e anlise por Sourthern blotting30.
Entretanto, para realizao da PCR em tempo real necessrio
equipamento especfico e sondas adequadas. O DNA humano pode ser
especificamente quantificado para posterior anlise do perfil gentico pelas
STRs, assim como verificar a presena ou no de inibidores da enzima
polimerase30.
Reao de Amplificao pela Polimerase PCR
Uma tecnologia que revolucionou o campo da biologia molecular foi
a PCR, tendo como seu inventor Kary Mullis, que recebeu o Prmio Nobel
em 1993, por essa descoberta. A PCR consiste na amplificao seletiva de
uma sequncia-alvo de DNA especfica a partir de uma coleo
heterognea de DNA, empregando-se um par de oligonucleotdeos
iniciadores que so complementares a uma certa extenso em ambas as
fitas do DNA a ser amplificado. A sequncia-alvo de DNA, cuja
continuao originalmente conhecida, denominada DNA molde31.
A enzima termoestvel denominada DNA polimerase direciona o
posicionamento dos precursores do DNA dNTP iniciando a sntese de
novas fitas de DNA. Com um novo aumento de temperatura, a enzima
DNA polimerase catalisa a reao, incorporando o nucleotdeo na posio
terminal ao iniciador, complementando as bases do DNA molde,
promovendo a extenso da fita32.
A reao de PCR preparada utilizando-se diversos reagentes que
devem possuir concentraes especficas para todo tipo de anlise.
Atualmente, existem diversos kits de PCR contendo todos os reagentes prpadronizados que facilitam a utilizao da PCR em laboratrios forenses. O
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reagente que vai direcionar a otimizao de cada reao ser o primer ou

iniciador, que flanquear a regio do DNA a ser copiada, sendo um
oligonucleotdeo sintetizado quimicamente e adicionado reao em altas
concentraes18.
Segundo BUTLER (2005)18, a PCR envolve trs etapas:
desnaturao, hibridizao e polimerizao. A desnaturao ocorre quando
a molcula de DNA aquecida acima da temperatura de 90oC, na qual as
pontes de hidrognio da dupla hlice se rompem, ocorrendo a separao
das cadeias complementares. O passo seguinte um o a hibridizao dos
primers, ligados a duas regies: direto e reverso, a uma temperatura que
pode variar de 45 a 72oC e deve ser previamente otimizada. O ltimo passo
a polimerizao onde a enzima DNA Polimerase catalisa a extenso da
fita na direo 5` 3`, comeando examente no primer incorporando o
nucleotdeo apropriado ( A T , C G ).
Marcadores Moleculares
O Single Sequence Length Polymorphism (SSLP) ou polimorfismo
de comprimento de sequncia nica englobam os VNTR ou repeties
consecutivas de nmero varivel33, ou minissatlites, e tambm os STR ou
repeties consecutivas curtas ou microssatlites, esses marcadores
funcionam como impresso digital, no genoma de cada indivduo34.
A diferena entre eles o tamanho da sequncia que se repete, sendo
que nos microssatlites essa estrutura menor, pois possuem repeties
constitudas de 2 a 9 pares de bases, e o minissatlite, de 10 a 64 pares de
bases. Esse DNA satlite na maioria das vezes no transcrito35.
O Single Nucleotide Polymorphism (SNP) ou polimorfismo de
nucleotdeo nico uma variao na sequncia de DNA que ocorre quando
um nucleotdeo alterado por outro em sequncias de DNA que podem ou
no codificar genes36.
Atualmente, os STRs e SNPs so empregados amplamente para a
identificao humana e possuem diferenas relevantes18,36. A anlise dos
SNPs tambm pode estar associada aos fentipos individuais, havendo uma
possibilidade futura de identificao de traos fsicos como, por exemplo, a
cor da ris37.
Jobim et. al., (2006)12 relatam que os melhores STRs utilizados na
identificao humana so aqueles com maior polimorfismo (maior nmero
de alelos), menor tamanho (100 a 200 pares de bases), elevado ndice de
discriminao e heterozigose, e baixa frequncia de mutaes. Para isso, h
a necessidade dos laboratrios realizarem a frequncia gentica em pelo
menos 100 indivduos no relacionados.

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Eletroforese
A eletroforese uma metodologia amplamente empregada para a
separao, isolamento, anlise e manipulao dos cidos nuclicos. Os
cidos nuclicos possuem uma carga geral total negativa, devido aos seus
grupamentos fosfato do arcabouo, consequentemente, quando aplicados
em um gel de agarose ou poliacrilamida, eles migraro em direo ao
nodo em um campo eltrico. Em condies apropriadas de tampo,
voltagem e miliamperagem, os fragmentos pequenos migraro mais
facilmente do que os maiores.
Atualmente, a eletroforese capilar38 amplamente utilizada e possui
o mesmo princpio que a eletroforese em gel analisados por Laser, com a
diferena de que possui capilares para a separao eletrofortica dos
fragmentos de DNA18.
Os fragmentos de DNA amplificados por PCR so identificados aps
a eletroforese em gel de poliacrilamida, seguido da colorao com prata, ou
pela deteco de sinal fluorescente, na qual os iniciadores utilizados no
PCR so marcados com fluorocromos, possibilitando a anlise por
sequenciador automtico39.
A variao do tipo e concentrao do gel propicia diferentes
caractersticas de separao, permitindo distintas resolues e anlises. Em
caracterizao de vnculo gentico utiliza-se eletroforese em gel de
poliacrilamida ou eletroforese capilar para a anlise de imagens. Em
incluso ou excluso de paternidade, comparam-se os alelos presentes no
filho com o do suposto pai, sendo que um seria o alelo obrigatrio materno
e o outro paterno. O mesmo acontece em incluso de suspeitos de um
crime, no qual se compara o DNA encontrado na vtima, como ocorre com
marcas de mordida ou presena de smen, ou na cena de um crime. Pode
ocorrer uma mistura de amostras biolgicas contendo DNA da vtima e do
agressor. Dessa maneira, confronta-se o DNA da vtima com o dos
suspeitos e, sucessivamente, com o DNA das amostras presentes na cena do
crime39.
Gis de agarose ou poliacrilamida podem ser feitos de uma variedade
de formas, tamanhos e porosidades e podem ser corridos em um nmero
diferente de configuraes. As escolhas desses parmetros dependem
primeiramente do tamanho dos fragmentos a ser separados40.
Gis de poliacrilamida so mais eficientes em separaes de
pequenos fragmentos de DNA (5-500pb), que o caso da anlise do DNA
forense, pelo seu poder de resoluo ser extremamente alto. Mas, apesar de
serem corridos rapidamente e acomodarem comparativamente grandes

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quantidades de DNA, gis de poliacrilamida possuem a desvantagem de

serem mais difceis de preparar e manusear do que eletroforese capilar32.
Gis de agarose possuem menor poder de resoluo do que gis de
poliacrilamida, mas possuem maior alcance de separao. DNAs de 50pb
at alguns megabases em extenso podem ser separados em gis de agarose
de diferentes concentraes e configuraes. Pequenos fragmentos de DNA
(50-20000pb) so melhores resolvidos em gis de agaroses corridos em
conformao horizontal em campo eltrico de fora e direo constantes.
Os fragmentos de DNA so comparados com marcadores de tamanho ou
ladders ou padres39.
Deve-se ressaltar que a eletroforese capilar amplamente utilizada
em anlise de DNA forense, por permitir que grandes quantidades de
amostras sejam analisadas de maneira automatizada, alm de necessitar de
poucas quantidades de amostra para o processo de injeo e podem ser
facilmente reinjetadas, se necessrio. Separao eletrofortica em capilar
realizada em menos de 1 hora, se comparando com as muitas horas
necessrias para quela realizada em gis de poliacrilamida para
identificao humana. Alm do tempo, a quantidade de passos para a
elaborao do gel de acrilamida faz com que possa haver uma chance maior
de erro durante a manipulao. A desvantagem o custo inicial para a
compra dos equipamentos, sendo bem mais alta do que aqueles empregados
na eletroforese em gel de poliacrilamida18.
Interpretao dos Resultados do Exame de DNA
Aps a visualizao, d-se a anlise dos resultados comparando os
fragmentos de DNA amplificados das amostras do pai, me e filho em caso
de paternidade; ou das amostras encontradas na cena do crime, em corpos
ou vtimas com as de suspeitos18.
No entanto, durante a PCR, um grande nmero de artefatos pode
ocorrer e interferir na interpretao e genotipagem dos alelos presentes na
amostra de DNA, sendo visualizadas somente aps a eletroforese18.
CONSIDERAES FINAIS
Com uma incrvel sensibilidade e poder de discriminao, a anlise
de DNA tem sido a figura-chave e promete grandes progressos da cincia
forense, fornecendo aos investigadores uma grande chance de excluir
suspeitos que no esto relacionados cena do crime.
Os mtodos baseados na PCR so imediatos, requerem apenas uma
pequena quantidade de material e podem fornecer identificao noambgua de alelos individuais. Assim, vrios mtodos de PCR,
particularmente os que usam os STRs, esto sendo cada vez mais usados.

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A tecnologia do perfil e os mtodos relacionados anlise de DNA

progrediram a ponto de no colocar em dvida a admissibilidade dos dados
sobre o DNA quando adequadamente coletados e analisados. No futuro,
espera-se que as tcnicas de biologia molecular existentes sejam
aprimoradas e que novos e melhores mtodos para anlise sejam
desenvolvidos, a fim de que a grande maioria dos casos de investigaes
forenses cveis e criminais tenha um desfecho que no possa ser
questionado nos tribunais.
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13 LIMA. Renata de Barros. Biolixiviao de Concentrado de Flotao de Sulfetos de Cobre.
Orientadores: Prof. Dra. Selma Gomes Ferreira Leite e Prof. Dr. Luis Gonzaga Santos
Sobral. Rio de Janeiro: UFRJ/EQ, 2006. Dissertao (Mestrado em Tecnologia de
Processos Qumicos e Bioqumicos).

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