HPLC

Principles of Instrumental Analysis

Skoog, West, Holler, Nieman
Thomson Learning; ISBN: 0030020786
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HPLC o que ?
High Pressure Liquid Chromatography
High Performance Liquid Chromatography
High Price Liquid Chromatography
High Problems Liquid Chromatography

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Porque que apareceu?

Resinas Soft
Resinas Hard
Tamanho das partculas da resina
Homogeneidade da resina
Microprocessadores
Mtodos de Deteco
Reproductibilidade
Rapidez do Mtodo
Automatizao
Os sistemas de tratamento de dados

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Efeito do tamanho da partcula, do empacotamento e do caudal

na altura dos pratos tericos, H, na cromatografia lquida.

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Equipamento de HPLC

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As curiosidades dos HPLC

As seringas
Os loops
As dimenses internas da tubagem
O corte das tubagens metlicas
Os cones dos parafusos
O desarejamento
Backpressure
Os caudais
A lavagem exterior dos pistons das bombas
As paragens dos sistemas
Os problemas e o troubleshoting
Os limites de deteco (10-12)
Os auto-samplers
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Vlvula de injeco para HPLC

detector de ultra-violeta

Existem loops de diferentes tamanhos, desde 2l a 5 ml.

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Cuidados a Ter

Presso mxima de trabalho (depende das colunas)

Pureza dos Reagentes
Limpeza
Bolhas de ar
Corroso

Modos de funcionamento
Eluio isocrtica a eluio feita com um s solvente ou com uma
mistura constante de solventes.
Eluio com gradiente variao contnua da composio do solvente.

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Separao de uma mistura

de compostos aromticos
eluio isocrtica
eluio por gradiente

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Condies iniciais na cromatografia de fase reversa

fase estacionria: C8 ou C18
coluna: 0.46 x 15 cm (partculas 5 m)
0.46 x 7.5 cm (partculas entre 3 e 5 m)
caudal: 2.0 ml/min
fase mvel: CH3CN / H2O para solutos neutros
CH3CN / tampo fosfato (25-50 mM, pH 2-3) para solutos inicos
5% - 100% CH3CN em H2O para eluio com gradiente

temperatura: 35 - 40 C
tamanho da amostra: 25 50 l contendo 25 40 g de soluto

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Optimizao da fase mvel

Combinaes de acetonitrilo, metanol e tetrahidrofurano (THF) com
gua (ou num tampo aquoso) originam uma gama suficientemente vasta
de interaces dipolares ou ligaes de hidrognio com os solutos de
modo a permitir a separao de um vasto nmero de compostos em
cromatografia de fase reversa.
A primeira mistura de solventes a tentar acetonitrilo com gua. O
acetonitrilo tem uma baixa viscosidade o que permite trabalhar a
presses relativamente baixas e permite a deteco na zona do ultravioleta a cerca de 190 nm.
O metanol a segunda escolha uma vez que possue uma viscosidade
mais elevada.
O THF a terceira escolha pois lentamente oxidado e o seu
equilbrio com a fase estacionria lento.

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 Muitas vezes recorre-se ao mtodo do tringulo, que est

ilustrado no acetato seguinte. Neste mtodo a optimizao da
separao atingida com uma combinao de dois ou trs
solventes orgnicos.
Existem vrios softwares comerciais que permitem uma
simulao do mtodo do tringulo, permitindo a seleco das
condies otpimas num tempo relativamente curto.

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Aplicao do mtodo do tringulo, para separar 7 componentes aromticos.

A 30% acetonitrilo/70% tampo
B 40% metanol/60% tampo
C 32% THF/68% tampo
Os pontos D, E, F tm condies
intermdias dos vrtices:
D 15% acetonitrilo/20% metano/
65% tampo
E 15% acetonitrilo/16% THF/ 69%
tampo
F 20% metanol/16% THF/64 %
tampo
O ponto G obtido por mdia dos 3
vrtices:
G 10% acetonitrilo/13% metanol/
11% THF / 66% tampo
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Grfico que mostra a percentagem de volume de solventes

que possuem a mesma fora de eluio

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Um Detector fora do habitual Diode Array

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Uma Aplicao de Elevada Resoluo

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Uma aplicao do arco-da-velha

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UPLC Ultra Performance Liquid Chromatography (Waters)

A Technique Built Around
a Novel Chemistry.
Com uma fase estacionria
com partculas de 1.7 m,
capaz de suportar ainda mais
altas presses, a UPLC
estende a teoria e os
princpios do HPLC. Estas
partculas conseguem cumprir
a promessa de um aumento
de eficincia para vrios
caudais. Consegue-se, assim,
um novo nvel de Velocidade,
Resoluo e Sensibilidade.

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