53 Desbloqueado

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
CENTRO DE BIOTECNOLOGA GENMICA
TTULO:
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN
MOLECULAR Y AGRONMICA DE Trichoderma spp.
NATIVOS DEL NORTE DE TAMAULIPAS.
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRA EN

CIENCIAS EN BIOTECNOLOGA GENMICA
PRESENTA:
Q. F. B. MARA ISABEL SNCHEZ PREZ
DIRECTOR DE TESIS:
DR. JOS LUIS HERNNDEZ MENDOZA
Diciembre 2009
Cd. Reynosa, Tamp. Mxico
Aislamiento y caracterizacin molecular y agronmica de Trichoderma spp. nativos del norte de Tamaulipas.
NDICE
AGRADECIMIENTOS .........................................................................................................iv
LISTA DE CUADROS ........................................................................................................... v
LISTA DE FIGURAS............................................................................................................vi
LISTA DE APNDICES .................................................................................................... viii
ABREVIATURAS.................................................................................................................ix
RESUMEN. ............................................................................................................................ x
SUMMARY. ..........................................................................................................................xi
1. INTRODUCCIN. ............................................................................................................. 1
2. ANTECEDENTES ............................................................................................................. 3
2.1 Generalidades de Trichoderma spp .................................................................................. 3
2.2 Identificacin de Trichoderma spp ................................................................................... 5
2.2.1 Identificacin taxonmica .......................................................................................... 6
2.2.2 Identificacin por mtodos moleculares .................................................................... 8
2.3 Caractersticas deseables de cepas de Trichoderma spp.. ............................................... 11
2.3.1 Competencia por nutrientes y espacio...................................................................... 11
2.3.2 Produccin de antibiticos ....................................................................................... 12
2.3.3 Hiperparasitismo ...................................................................................................... 12
2.3.4 Hipovirulencia .......................................................................................................... 14
2.3.5 Degradacin de agrotxicos ..................................................................................... 15
2.3.6 Promocin del crecimiento vegetal .......................................................................... 16
2.4 Usos y aplicaciones......................................................................................................... 18
2.4.1Agente de control biolgico ...................................................................................... 18
2.4.2 Uso Industrial ........................................................................................................... 19
2.5 Problemtica actual de fitopatgenos en cultivo y alternativas de control. .................... 20
2.5.1 Macrophomina phaseolina....................................................................................... 21
2.5.2 Aspergillus parasiticus ............................................................................................. 23
3. JUSTIFICACIN ............................................................................................................. 27
4. HIPTESIS. ..................................................................................................................... 29
5. OBJETIVOS ..................................................................................................................... 30
i
5.1 General ............................................................................................................................ 30

5.2 Especficos ...................................................................................................................... 30
6. METODOLOGA ............................................................................................................. 31
6.1 Muestreo. ........................................................................................................................ 31
6.2 Aislamiento e identificacin de microorganismos.......................................................... 32
6.2.1 Aislamiento de Trichoderma spp ............................................................................. 32
6.2.2 Identificacin morfolgica de Trichoderma spp ...................................................... 33
6.3 Caracterizacin molecular .............................................................................................. 33
6.3.1 Obtencin de biomasa de aislados de Trichoderma spp .......................................... 34
6.3.2 Extraccin ADN genmico ...................................................................................... 34
6.3.3 Amplificacin ITS .................................................................................................... 35
6.3.4 Secuenciacin ........................................................................................................... 37
6.3.5 Identificacin a nivel de especie .............................................................................. 37
6.4 Caracterizacin agronmica ........................................................................................... 37
6.4.1 Pruebas de antagonismo ........................................................................................... 37
6.4.2 Evaluacin de promocin de crecimiento vegetal ................................................... 38
6.4.3 Deteccin de promotores de crecimiento por HPLC ............................................... 39
6.5 Diseo experimental. ...................................................................................................... 40
7. RESULTADOS................................................................................................................. 42
7.1 Muestreo. ........................................................................................................................ 42
7.2 Aislamiento e identificacin de microorganismos.......................................................... 43
7.2.2 Identificacin morfolgica de Trichoderma spp ...................................................... 44
7.3 Caracterizacin molecular .............................................................................................. 46
7.3.1 Amplificacin de ITS ............................................................................................... 47
7.3.2 Secuenciacin ........................................................................................................... 47
7.3.3 Identificacin a nivel de especie .............................................................................. 48
7.4 Caracterizacin agronmica ........................................................................................... 50
7.4.1 Pruebas de antagonismo ........................................................................................... 50
7.4.1.1 Cintica de crecimiento ..................................................................................... 51
7.4.1.1.1 Caso Trichoderma spp ................................................................................ 51
7.4.1.1.2 Caso M. phaseolina ..................................................................................... 55
ii
7.4.1.1.3 Caso A. parasiticus ..................................................................................... 55

7.4.1.2 Interacciones fngicas ....................................................................................... 59
7.4.2 Evaluacin de promocin de crecimiento vegetal ................................................... 63
7.4.2.1 Altura de la planta ............................................................................................. 64
7.4.2.2 Biomasa de la planta .......................................................................................... 66
7.4.2.2.1 Peso seco del follaje de la planta. ................................................................ 66
7.4.2.2.2 Peso seco de la raz de la planta. ................................................................. 68
7.4.2.2.3 Peso seco total de la planta. ......................................................................... 70
7.4.3 Deteccin de promotores de crecimiento por HPLC ............................................... 72
7.4.3.1 Sustancias promotoras de crecimiento vegetal producidos por Trichoderma sp
en medio de cultivo ....................................................................................................... 73
7.4.3.2 Sustancias promotoras de crecimiento vegetal detectados durante la Interaccin
de Trichoderma spp con semillas de maz (Zea mays).................................................. 77
7.4.3.3 Efecto de los metabolitos en la promocin de crecimiento vegetal .................. 83
8. DISCUSION ..................................................................................................................... 84
8.1. Aislamiento e identificacin de Trichoderma spp ......................................................... 84
8.2. Caracterizacin molecular: Identificacin a nivel de especie ........................................ 84
8.3. Caracterizacin agronomica: Pruebas de antagonismo ................................................. 86
8.3.1. Cineticas de crecimiento ......................................................................................... 86
8.3.2. Interacciones fungicas ............................................................................................. 87
8.4. Caracterizacin agronomica: Promocin del crecimiento vegetal ................................ 89
8.5. Caracterizacin agronomica: Deteccin de promotores de crecimiento ....................... 90
8.5.1. Efecto de los metabolitos en la promocion del crecimiento vegetal ....................... 92
9. CONCLUSION ................................................................................................................. 93
10. RECOMENDACIONES ................................................................................................. 94
11. BIBLIOGRFIA ............................................................................................................ 95
12. GLOSARIO .................................................................................................................. 108
13. APNDICE ................................................................................................................... 110
iii
AGRADECIMIENTOS
Al Centro de Biotecnologa Genmica del Instituto Politcnico Nacional, por facilitarme el
uso de sus instalaciones, el manejo de los equipo.
Al CONACYT y al programa Institucional de Formacin de Investigadores (PIFI-IPN), por
el apoyo econmico brindado durante el periodo de la maestra y su preocupacin en la
formacin de los recursos humanos.
Al Dr. Jos Luis Hernndez Mendoza por compartir sus conocimientos, su gua, su apoyo y
paciencia durante este periodo.
Al Dr. Juan Manuel Gonzlez Prieto por su apoyo en la realizacin de este estudio, y sus
palabras de conocimiento y nimo.
Al comit tutorial de este trabajo Dr. Xian Guo, Dr. Raymundo Rosas Quijano y MC Jess
Di Carlo Quiroz Velsquez, por las observaciones que permitieron enriquecer este trabajo.
Al Ing. Jess Gerardo Garca Olivares por su apoyo y tiempo dedicado en la recoleccin de
muestras.
Al numeroso grupo del Laboratorio de Biotecnologa Vegetal por su apoyo en la
realizacin de la caracterizacin molecular de este estudio y que muy amablemente me
reciban en su rea de trabajo. En particular a Vctor Hugo Resendz por compartir conmigo
su experiencia y su paciencia, Vctor Manuel Hernndez y Fredy Enrique Velasco por su
ayuda incondicional.
Al Tcnico Juan Rodrguez Silva y Zuridai Santes Hernndez por su apoyo en las pruebas
realizadas en el invernadero.
Al Laboratorio Nacional de Genmica para la Biodiversidad del CINVESTAV-Irapuato
por el apoyo brindado en la realizacin de secuenciacin, y al laboratorio de servicios del
CBG.
Al patronato de Investigacin, Fomento y Sanidad Vegetal por su apoyo en la elaboracin
de este estudio.
A Yazmn, Iras y Alberto por su amistad y los momentos compartidos. Al Tcnico ngel
Salazar por su ayuda y apoyo en todo este proceso. A todas aquellas personas que directa e
indirectamente ayudaron a la realizacin de este trabajo, a mis compaeros de generacin, a
los profesores que ayudaron a enriquecer mis conocimientos.
Sin su apoyo este trabajo no seria realidad.
iv
LISTA DE CUADROS
Cuadro 1. Origen de muestras de suelo y sitios con presencia de Trichoderma spp. ......... 42
Cuadro 2. Identificacin a nivel especie de las 16 cepas de Trichoderma spp. .................. 50
Cuadro 3. Deteccin de metabolitos en medio de cultivo lquido. ...................................... 76
Cuadro 4. Deteccin de TRP y KIN en interaccin entre las cepas de Trichoderma spp con
la semilla de maz. ................................................................................................. 79
Cuadro 5. Deteccin de Acido Giberlico en interaccin entre las cepas de Trichoderma
spp con la semilla de maz. .................................................................................... 80
Cuadro 6. Deteccin de AIA, AIB y AA en interaccin entre las cepas de Trichoderma spp
con la semilla de maz. ........................................................................................... 82
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Microfotografa de Trichoderma sp.. ..................................................................... 4

Figura 2. Diferentes tipos de colonia de Trichoderma sp, en medio PDA. ........................... 5
Figura 3. Caractersticas morfolgicas de Trichoderma sp ................................................... 7
Figura 4. Regiones en el ITS 1 y 2, para la identificacin a nivel especie con el programa
TrichOkey. ............................................................................................................. 15
Figura 5. Parasitismo de Trichoderma spp. en Phytium . .................................................... 13
Figura 6. Tratamiento de Trichoderma sp en Pinus radiata. .............................................. 17
Figura 7. Esclerocios de M. phaseolina. .............................................................................. 17
Figura 8. Fotomicrografa de esclerocios de M. phaseolina . .............................................. 22
Figura 9. Imagen de conidiforos de Aspergillus sp ........................................................... 24
Figura 10. Colonia de Aspergillus sp ................................................................................... 24
Figura 11. Mazorca infectada por Aspergillus ..................................................................... 25
Figura 12. Municipios muestreados en la regin norte de Tamaulipas. .............................. 31
Figura 13. Dispositivo para la obtencin de cepas de Trichoderma spp. ............................ 32
Figura 14. Deteccin de Trichoderma spp en zona de germinacin del maz. .................... 44
Figura 15. Caractersticas de la colonia de los 16 aislados de Trichoderma spp. ............... 45
Figura 16. Morfologa microscpica de los aislados de Trichoderma spp. ......................... 45
Figura 17. Visualizacin de ADN genmico en gel de agarosa al 1%. ............................... 45
Figura 18. Visualizacin de productos de PCR purificados en gel de agarosa al 1%. ........ 45
Figura 19. Imagen del electroferograma de la secuencia de la cepa HTE808. .................... 48
Figura 20. Dendrograma de las 16 cepas de Trichoderma spp............................................ 49
Figura 21. Cintica de crecimiento de Trichoderma solo y frente a M. phaseolina............ 53
Figura 22. Cintica de crecimiento de Trichoderma solo y frente a A. parasiticus ............ 54
Figura 23. Cintica de crecimiento de M. phaseolina solo y frente a Trichoderma spp ..... 57
Figura 24. Cintica de crecimiento de A. parasiticus solo y frente a Trichoderma spp ...... 58
Figura 25. Confrontacin de Trichoderma spp en M. phaseolina y A. parasiticus ............ 60
Figura 26. Antibiosis de Trichoderma spp en contra M. phaseolina y A. parasiticus ....... 61
Figura 27. Hiperparasitismo que presenta T. harzianum en M. phaseolina. ....................... 62
vi
Figura 28. Hiperparasitismo que presenta T. koningiopsis en A. parasiticus ...................... 62

Figura 29. Estimulacin de crecimiento de la planta de maz con las diferentes cepas de
Trichoderma spp a los 15 das despus de tratamiento. ........................................ 62
Figura 30. Estimulacin de crecimiento de la planta de maz con las diferentes cepas de
Trichoderma spp a los 30 das despus de tratamiento. ........................................ 62
Figura 31. Peso seco del follaje de la planta de maz con las diferentes cepas de
Trichoderma spp a los 15 das despus de su plantacin. ..................................... 62
Figura 32. Peso seco del follaje de la planta de maz con las diferentes cepas de
Figura 33. Peso seco de la raz de la planta de maz con las diferentes cepas de
Figura 34. Peso seco de la raz de la planta de maz con las diferentes cepas de
Trichoderma spp a los 30 das despus de su plantacin ...................................... 70
Figura 35. Peso seco total de la planta de maz con las diferentes cepas de Trichoderma
spp de la planta a los 15 das despus de su plantacin ......................................... 62
Figura 36. Peso seco total de la planta de maz con las diferentes cepas de Trichoderma
spp de la planta a los 30 das despus de su plantacin ......................................... 62
Figura 37. Cromatograma mostrando los estndares de los promotores de crecimiento
vegetal que fueron evaluadas en este trabajo ......................................................... 73
Figura 38. Cromatograma del medio de cultivo LB sin inocular ........................................ 74
Figura 39. Cromatograma de los promotores de crecimiento vegetal de HTE813 de T.
harzianum en medio LB ........................................................................................ 75
Figura 40. Cromatograma mostrando los estndares de los promotores de crecimiento
vegetal que fueron evaluadas en la interaccin ..................................................... 77
vii
LISTA DE APNDICES
A 1. Promedio de la cintica de crecimiento, medida cada 12 h , de las cepas de

Trichoderma spp ................................................................................................................. 110
A 2. Promedio de la cintica de crecimiento medida cada 12 h de las cepas de Trichoderma
spp en confrontacin con M. phaseolina ............................................................................ 111
A 3. Promedio de la cintica de crecimiento medida cada 12 h de las cepas de M.
phaseolina. .......................................................................................................................... 112
spp en confrontacin con A. parasiticus. ............................................................................ 113
A 5. Promedio de la cintica de crecimiento medida cada 12 h de las cepas de A.
parasiticus. .......................................................................................................................... 114
A 6. Pruebas de Tukey (P>0.05) realizadas a la cintica de crecimiento de M. phaseolina
cuando esta sola y en presencia de las 16 cepas de Trichoderma sp a las 72 horas de
incubacin ........................................................................................................................... 115
A 7. Pruebas de Tukey (P>0.05) realizadas a la cintica de crecimiento a distintas horas de
incubacin de M. phaseolina frente a la cepa HTE801 de T. harzianum ........................... 116
A 8. Pruebas de Tukey (P>0.05) realizadas entre tiempo de contacto de las 16 cepas de
Trichoderma sp frente a M. phaseolina .............................................................................. 117
A 9. Pruebas de Tukey (P>0.05) realizadas a las cinticas de crecimiento de las 16 cepas de
Trichoderma sp y cuando stas se desarrollan frente a M. phaseolina............................... 118
A 10. Pruebas de Tukey (P>0.05) realizadas a la cintica de crecimiento de A. parasiticus
cuando esta sola y en presencia de las 16 cepas de Trichoderma sp a 72 h de incubacin 119
A 11. Pruebas de Tukey (P>0.05) realizadas a las cinticas de crecimiento de las 16 cepas
de Trichoderma sp y cuando stas se desarrollan frente a A. parasiticus .......................... 120
A 12. Medias obtenidas por el mtodo de Tukey (P>0.05) de los datos de Promocin de
crecimiento vegetal en cepas pares ..................................................................................... 121
crecimiento vegetal en cepas nones .................................................................................... 122
A 14. Resultados del anlisis de correlacin mltiple de los efectos de los metabolitos en la
promocin del crecimiento vegetal ..................................................................................... 123
viii
ABREVIATURAS
AA
Acido Antranlico
AG
Acido Giberlico
AIA
Acido-Indol-Actico
AIB
BPCV
Acido-Indol-Butrico
Bacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal
Grados Centgrados
cm
Centmetros
ddt
ADN
Das Despus de Tratamiento

Acido Desoxirribonucleico
gr
Gramos
Horas
HM
HTE
Hongo Micorrzicos
Hongo Trichoderma Experimental
ITS
Espacio interno transcrito
ISTH
International Subcommission on Trichoderma and Hypocrea Taxonomy
KIN
LB
Kinetina
Caldo Laura-Bertani
MA
Micorrizacin Arbuscular
ml
Mililitros
mm
NCBI
Milmetros
National Center for Biotechnology Information
PACRT
Porcentaje de Aceleracin de Crecimiento Radial de Trichoderma sp.
pb
Pares de Bases
PCR
PDA
Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Agar Papa Dextrosa
pH
Potencial de Hidrgeno
PICR
Porcentaje de Inhibicin de Crecimiento Radial
ppm
rpm
Partes Por Milln

Revoluciones Por Minuto
TRP
Triptfano
ix
RESUMEN
Se realiz un muestreo en suelos agrcolas del norte de Tamaulipas, para obtener
Trichoderma spp nativos, con el fin de hacer la caracterizacin gentica y conocer su
efectividad biolgica como antagonista de dos fitopatgenos de importancia en la regin,
Macrophomina phaseolina y Aspergillus parasiticus, y evaluar su capacidad de promocin
del crecimiento vegetal en plantas de maz hibrido (Pionner 30P49). Los muestreos
quedaron distribuidos en unos 170 Km lineales sobre la franja fronteriza con los EUA. Se
aislaron colonias con las caractersticas tpicas de Trichoderma spp y se utilizaron los
oligonucleotidos ITS1 e ITS4 del 18s ribosomal para su identificacin molecular a nivel
especie. Posteriormente, se evalu in vitro, su actividad antagonista en contra de M.
phaseolina y A. parasiticus usando el mtodo de confrontacin en placa. Sobre los aislados
obtenidos, se evalu su capacidad de promocin del crecimiento vegetal, inoculando
semillas de maz (Pioneer 30P49), que posteriormente, fueron sembradas y se determin
su efecto a los 15 y 30 das despus de tratamiento, por la altura y produccin de biomasa.
Tambin se analiz la presencia de promotores de crecimiento vegetal en medio de cultivo
y en interaccin con la semilla de maz durante el proceso de germinacin.
Como resultados del trabajo se obtuvieron 16 aislados, los cuales al ser analizados
con las secuencias obtenidas de la amplificacin de los ITSs, permitieron determinar que
12 aislados corresponden a Trichoderma harzianum; otro como T. koningiopsis y el ltimo
a T. virens. En las pruebas de antagonismo, los 16 aislados mostraron el fenmeno de
competencia, pues detuvieron el crecimiento de M. phaseolina y A. parasiticus. El
fenmeno del hiperparasitismo solo se detect en la cepa HTE808 de T. koningiopsis para
ambos fitopatgenos, por lo que se estima que tiene un alto potencial de uso para el control
de estos agentes. En lo que respecta a la promocin del crecimiento vegetal, se observa que
algunas cepas incrementan la altura de la planta y la produccin de biomasa slo en los
primeros 15 das despus de tratamiento, no detectndose esto a los 30 das. La deteccin
de metabolitos en medio de cultivo muestra que algunas cepas de Trichoderma spp son
capaces de metabolizar el TRP para producir AA, AIA, AG, KIN y AIB. Resulta necesario
estudiar ms a fondo los metabolitos que produce Trichoderma sp y su impacto en la
promocin de crecimiento en las plantas.
x
SUMMARY
In order to know the genetic characterization and biological efficiency of native
Trichoderma spp as the antagonists on two important pathogens, Macrophomina
phaseolina and Aspergillus parasiticus and evaluate their ability to promoter plant growth
in hybrid corn plants (Pioneer 30P49), samples were obtained from agricultural soils of
north Tamaulipas distributed in about 170 km on the border with the USA. Colonies were
isolated with the typical characteristics of Trichoderma spp and with molecular
identification to species level by sequences of 18S ribosomal intergenic region that were
amplified by PCR technique with the use of oligonucleotides ITS1 and ITS4. Subsequently
we in vitro evaluated their antagonist activity against M. phaseolina and A. parasiticus
using the method of confrontation on petri dish. The isolates obtained were evaluated their
ability to promote plant growth: its effect on height and production biomass of maize plant
(Pioneer 30P49) at 15 and 30 days after treatment. Also analyzed the presence of plant
growth promoters in culture and in interaction with maize seed during the germination
process.
The 16 isolates were obtained, of which 12 isolates belong to Trichoderma harzianum;
others as T. koningiopsis and T. virens with the help of analysis on the ITS sequences. In
the tests of antagonism, the 16 isolates showed the feature of competition, as it stopped the
growth of M. phaseolina and A. parasiticus. The hyperparasitic phenomenon has been
detected in the strain HTE808 of T. koningiopsis for both phytopathogens, indicating that
this strain could have a high potential for use to control these agents. Regarding the
promotion of plant growth, it appears that some strains increase plant height and biomass
production only in the first 15 days after treatment. The detection of metabolites in culture
medium shows that some strains of Trichoderma spp are able to metabolize the TRP to
produce AA, IAA, AG, KIN and AIB. It is necessary to study further the metabolites
produced by Trichoderma sp and its impact on promotion of plant growth.
xi
1. INTRODUCCIN
Las enfermedades producidas por microorganismos patgenos en plantas son
debidas principalmente a hongos, bacterias y virus, y causan severas prdidas en la
agricultura (Rey et. al., 2000). Estas mermas implican la reduccin de la calidad y/o la
cantidad de la produccin obtenida y en varios casos, el aumento en el precio de los
alimentos (Monte, 2001). La forma tradicional para el manejo de las enfermedades en
cultivos es la aplicacin de productos qumicos, los cuales son txicos e inespecficos ya
que adems de eliminar los organismos fitopatgenos, daan a los organismos benficos
del suelo (Vinale et. al., 2008). Debido a su composicin, dichos productos han
deteriorado el ambiente y por ello, las investigaciones actuales se enfocan a la bsqueda de
nuevas alternativas orientadas al manejo de los principales fitopatgenos, que sean de bajo
costo, eficientes y compatibles con el ambiente, por lo que el control biolgico con
microorganismos se ofrece como una solucin (Cupull et. al., 2003).
Los microorganismos realizan diferentes funciones qumicas las cuales se reflejan
en formacin de humus, degradacin de materia orgnica, control microbiano, fijacin de
nitrgeno, etc. Existen 2 tipos de microorganismos utilizados en la agricultura, bacterias
promotoras del crecimiento vegetal (BPCV) y los hongos micorrizicos (HM).
Las BPCV, producen metabolitos como fitohormonas, permiten la fijacin del
nitrgeno e indirectamente ejercen control de fitopatgenos con la produccin de enzimas
degradadoras de la pared celular, produccin de siderforos y la produccin de elicitores.
(Olalde-Portugal y Serratos, 2007).
La asociacin micorrcica que se calcula existe desde hace ms de 400 millones de
aos (Taylor et. al., 1995), est en al menos el 90% de las plantas descritas (Smith y Read
1997). La micorrizacin arbuscular (MA) ocurre de manera natural, por la presencia de
hongos capaces de formar este tipo de asociacin con la planta, y se reportan unas 130
especies de hongos formadores de MA. Este tipo de asociacin incrementa la absorcin de
nutrimentos y la activacin rpida de los estomas, permite una mayor velocidad en el
desarrollo de las plantas (Walker, 1992).
1
En el Norte de Tamaulipas, anualmente se cultiva maz (Zea mays L.) entre 80 y

100 mil hectreas y anualmente se inoculan entre 10 y 12 mil hectreas (SIAP, 2008; Com.
Pers. Vargas-Camplis, 20081) con hongos micorrzicos (Glomus intraradices) y se ha
usado en menor escala, los biofertilizantes basados en la BPCV Azospirillum brasilense.
La aplicacin de HM y BPCV incrementan de 12 a 36 % y de 15 a 35 % respectivamente
el rendimiento de grano del maz en comparacin con testigos no inoculados (Daz-Franco
et. al., 2005; Garca-Olivares et. al., 2007). La inoculacin de plantas con HM y BPCV es
promisoria dado que favorece la fijacin de nitrgeno y la movilizacin de fsforo,
adems, paulatinamente promueve la reduccin del uso de fertilizantes qumicos y del
impacto ambiental que conllevan.
En los ltimos aos, se ha incrementado el uso de un hongo micorrizognico
perteneciente al gnero Trichoderma spp. En la industria se utiliza debido a las enzimas
hidrolticas que secreta, especialmente las celulasas y las xilanasas, pues ayudan a degradar
la hemicelulosa, celulosa y algunos polisacridos complejos, difciles de romper. En la
agricultura se utiliza como agente de control biolgico y se ha observado que posee la
capacidad de promover el crecimiento vegetal. Esto debido a que algunas especies de este
gnero son capaces de estimular el crecimiento y desarrollo de races, as como la
produccin de biomasa y el rendimiento de los cultivos (Kleifeld y Chet, 1992; Cruz y
Cisterna, 1998).
El presente trabajo consisti en obtener aislados de Trichoderma spp. nativos del norte
de Tamaulipas, estimando que ellos estn adaptados a las condiciones de la regin, para
despus, determinar la especie a la cual pertenecen y evaluar su actividad como antagonista
de dos fitopatgenos de importancia como son, Macrophomina phaseolina y Aspergillus
parasiticus. Adems, determinar la presencia de fitohormonas que sean sintetizadas por
Trichoderma sp. a travs de las cuales estn asociadas a la promocin de crecimiento
vegetal o aumento en la biomasa de las plantas.
Dr. Jess Vargas Camplis. Gerente del Patronato de Investigacin y Fomento en Sanidad Vegetal A.C.
Matamoros, Tamaulipas. Septiembre, 2008.
2. ANTECEDENTES
2.1 Generalidades de Trichoderma spp.

Trichoderma spp. pertenece a la subdivisin Deuteromicete y es un hongo anaerobio
facultativo, anamorfo y de reproduccin asexual, la cual se caracteriza por la formacin de
conidios (Domsch et. al., 1993), su estadio sexual es conocido como Hypocrea.
Trichoderma spp. es un hongo de vida libre en suelos y ecosistemas de raz (Harman et
al., 2004a) y puede estar presente en la materia orgnica de los suelos y en residuos de
cultivos (Rincn, 1992; Cupull et. al., 2003).
Su morfologa al microscopio corresponde a hifas hialinas septadas, conidiforos,
fialides y conidios. Los conidiforos son hialinos, generalmente ramificados, se forman de
las hifas en un ngulo de 90 y en ocasiones llegan a tener una disposicin piramidal. Las
fialides son hialinas, en forma de matraz, se adhieren a los conidiforos por la parte ms
amplia, pueden ser solitarias o dispuestas en racimos y producen los conidios en el extremo
(Kubicek y Harman, 1998). Los conidios son unicelulares de forma redonda o elipsoidal,
con 3 m de dimetro aproximadamente, los cuales poseen una pigmentacin verdosa.
Algunas especies de Trichoderma sp. cuando se desarrollan en medios de cultivo con
condiciones restringidas (pH, humedad, fuente de carbono, nutrimentos) son capaces de
producir clamidosporas (Kubicek y Harman, 1998). En la figura 1 se muestra imgenes
vistas en microscopio, de hifas, fialides y conidios redondos y oblongos.
Figura 1. Microfotografa de Trichoderma sp. d) se observa codioforos de T. viridescens, las flechas

muestran proliferacion de la fialide. f) T. viride muestra conidioforos mal definidos y sinuosos. m) conidios
elipsoidales. i) conidios subglobosos (Tomado de Jaklitsch et. al., 2006).
Las mejores condiciones de crecimiento para este hongo son:
Temperatura: se desarrolla en un rango de 15-35C, siendo la ptima de 25C.
Humedad relativa: capaz de crecer entre el 20 y 80% siendo de 70% la mejor.
pH: de 6 a 6.5 es el adecuado para su desarrollo pero puede sobrevivir en rangos

mayores, debido a la capacidad que tiene de acidificar el medio en el que se
encuentra, mediante secrecin de cidos orgnicos.
Carbono: La principal fuente de carbono que asimila es celulosa.
En medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA) Trichoderma spp, presenta un

crecimiento colonial rpido, de 5 das a 25 C. En este medio, las colonias son de aspecto
algodonoso que se compactan con el tiempo. Cuando su desarrollo es alternado con
perodos de luz y oscuridad, se aprecian las zonas de crecimiento correspondiente a cada
perodo. En ausencia de luz el micelio es de color blanco algodonoso y en presencia de luz
se observa la esporulacin con tonalidades verdosas, dando la apariencia de anillos en
4
forma concntrica. Al crecer en medio de cultivo, se observa en el reverso de la caja, un

color plido y en ocasiones una pigmentacin amarillenta (Windham et. al., 1986), como se
puede observar en la figura 2.
Figura 2. Diferentes tipos de colonia de Trichoderma sp, en medio PDA (Tomado de Chaverri et. al.,
2003).
2.2 Identificacin de Trichoderma spp.

La caracterizacin del gnero Trichoderma spp. se puede realizar utilizando
herramientas polifsicas, con base a su actividad antifngica, en su morfologa, mediante
pruebas bioqumicas y mtodos moleculares, utilizadas para una correcta clasificacin del
gnero (Bissett et. al., 2003; Larralde et. al., 2008).
Se conocen ms de 100 especies de Trichoderma sp., ninguna conocida como patgeno
en plantas, pero se sabe que T. longibrachiatum es un patgeno oportunista en mamferos
inmunocomprometidos (Kredics et. al., 2003; Druzhinina et. al., 2006). Este gnero posee
una gran variabilidad gentica, lo cual le confiere a cada especie caractersticas y
5
propiedades diferentes. Por lo que es necesario identificar la especie con la cual se esta
trabajando.
o 2.2.1 Identificacin taxonmica.
La identificacin taxonmica estaba principalmente basada en la descripcin
morfolgica, originando as 5 secciones del gnero: Trichoderma, Pachybasium,
Longibrachiatum, Saturnisporim y Hypocreanum (Rifai, 1969; Bissett, 1991 a, b; Bissett,
1992). Este tipo de identificacin requiere de mucha experiencia y dedicacin en tiempo,
para llevar una correcta clasificacin (Buhariwalla et. al., 2005). Las figura 3 muestra las
caractersticas morfolgicas de la seccin Trichoderma (1-3), de la seccin Pachybasium
(4-6) y seccin Longibrachiatum (7 y 8).
Esta identificacin se basa en la morfologa tpica de este gnero, tal como rpido
crecimiento, pigmentacin conidial verde brillante o blanco y ramificacin repetitiva, pero
mal definida la estructura del conidiforo.
Figura 3. Caractersticas morfolgicas de Trichoderma sp. 1. T. viride, 2. T. koningii, 3. T. harzianum, 4.

T. virens, 5. T. polysporum, 6. T. hamatum, 7. T. longibrachiatum, 8. T. pseudokoningii (Tomado de Kubicek
y Harman, 1998).
o 2.2.2 Identificacin por mtodos moleculares.

El incremento en el nmero de aislamientos, la variabilidad fenotpica y su
proximidad con Hypocrea y Gliocladium complic la identificacin por taxonoma clsica
y es a finales del siglo pasado, con las aplicaciones de tcnicas basadas en cidos
nuclicos, que se triplic la cantidad de especies descritas de Trichoderma sp. Varios
mtodos han sido empleados en estos estudios, entre otros, las secuencias obtenidas a
travs de los ITS; de los 5 intrones del gen de la protena que codifica para el factor de
traduccin de elongacin alfa 1 (tef1); del gen que codifica para la actina (gen act); ya que
es una regin codificante altamente conservada, la calmodulina (gen cal) y un exn parcial
del gen ech42 para quitinasa (Castle et. al., 1998; Hermosa et. al., 2000; Bissett et. al.,
2003; Chaverri et. al., 2003; Lu et. al., 2004; Vera et. al., 2005; Druzhinina et. al., 2006
Samuels, 2006; Samuels et. al., 2006).
Las herramientas moleculares predominantes que se utilizan, son los mtodos de RFLP
(Polimorfismo de longitud fragmentos de restriccin), RAPD (polimorfismo de ADN
amplificado al azar), AFLP (Amplificacin de fragmentos de longitud polimrficos)
mtodo genotpico basado en la amplificacin de grupos de fragmentos de ADN selectos,
obtenidos a partir de una digestin enzimtica (Vos et. al., 1995), es una tcnica altamente
discriminatoria y reproducible, utilizado en diversos microorganismos (Lieckfeldt et. al.,
1999). Estas herramientas son utilizadas para la identificacin de 4 clados del gnero
Trichoderma spp:
Clado A seccin Trichoderma la cual incluye T. hamatum, T. pubescens, T.

koningii and T. atroviride;
Clado B que contiene mezclas heterogneas representado por la seccin

Pachybrasium que incluye T. harzianum and T. inhamatum;
Clado C las especies de Longibrachiatum
Clado D por T. aureoviride (Kindermann et. al., 1998; Hermosa et. al.,
2000; Kubicek et. al., 2002; Kullnig-Gradinger et. al., 2002).
Tambin se utiliza la secuenciacin de ADN ribosomal, con las secuencias del trascrito
interno (ITS) 1 y 2 de ADN ribosomal, estas se comparan con las ya reportadas en las bases
de datos, utilizando principalmente la base de datos especfica para el gnero
Hypocrea/Trichoderma, el TrichOKEY del ISTH por sus siglas en ingles (International
Subcommission on Trichoderma and Hypocrea Taxonomy). TrichOKEY es una
herramienta para la identificacin molecular a nivel especie que esta en lnea
(www.isth.info), se basa en el cdigo de oligonucletidos, principalmente en tres
combinacin de estos, localizados especficamente en el ITS 1 y 2 (Figura 4). Por lo que
TrichOkey es una herramienta precisa para la identificacin de especies de
Hypocrea/Trichoderma, que es complementaria al mtodo tradicional (Druzhinina et. al.,
2005). Tambin se utiliza el tradicional banco de datos del NCBI por sus siglas en ingles
(National Center for Biotechnology Information), a travs del mtodo BLAST, en el cual se
identifican las especies comparando la secuencia con las ya reportadas y segn el mejor hit
o grado de identidad (ej. >98%) se determina la especie (Druzhinina et. al., 2005).
Figura 4. Regiones en el ITS 1 y 2, para la identificacin a nivel especie con el programa TrichOkey (Tomado de Druzhinina et. al., 2005).
10
En el ISTH adems del TrichOkey tambin encontramos los siguientes programas:

TrichoBLAST es una base de datos pblica, la cual soporta secuencias confirmadas y tiene
herramientas de bsqueda de similitud que cubre 88 especies del gnero Trichoderma spp.
Adems, contiene 5 o ms grupos casi completos de marcadores filogenticos usados
frecuentemente, los cuales comprenden: los ITS 1 y 2, los genes que codifican para el
factor de elongacin (dos intrones tef1_int4 (largo) y tef1_int5 (corto), un exn tef1_exn 6
(largo)) y por ltimo la subunidad 2 del gen de RNA polimerasa (rpb2_exn).
TrichoMARK es otra base de datos que detecta y recupera marcadores filogenticos
almacenados en bases de datos (de los exones de tef1 y rpb2). Esta base de datos, de la
subcomision Internacional sobre la taxonoma de Trichoderma e Hypocrea posee otras
herramientas que pueden ser empleadas en la identificacin de especies y genes especficos.
2.3 Caractersticas deseables de cepas de Trichoderma spp.

Debido a su versatilidad, adaptacin y supervivencia a diversas condiciones del suelo,
el gnero Trichoderma spp. ha sido estudiado ampliamente. Entre sus propiedades ms
importantes estn: su utilizacin como agente de control biolgico contra fitopatgenos ya
sea de forma indirecta con la absorcin de nutrientes, modificacin de condiciones del
medio ambiente, promocin del crecimiento de la planta, produccin de enzimas
hidrolticas y metabolitos secundarios, o de forma directa con formacin de estructuras
especializadas ejerciendo el micoparasitismo (Papavizas et. al., 1990; Rey et. al., 2000;
Bnitez et. al., 2004; Harman et. al., 2004b; Hoitink et. al., 2006).
o 2.3.1 Competencia por nutrientes y espacio:
Trichoderma spp. es un organismo hetertrofo saprobionte, que compite con otros
microorganismos, impidiendo que se desarrollen (Harman, 2006). Este hongo puede
secretar molculas llamadas siderforos, los cuales son quelantes del hierro del medio
ambiente, mineral que es necesario para la viabilidad de diversos hongos filamentosos, por
lo cual, cuando Trichoderma spp. absorbe este mineral impide que el hongo fitopatgeno lo
11
utilice, deteniendo as el crecimiento y desarrollo del mismo (Chet et. al., 1994; Eisendle et.
al., 2004).
o 2.3.2 Produccin de antibiticos:
Trichoderma spp. produce antibiticos y metabolitos secundarios txicos para otros
organismos, los cuales detienen la accin de las toxinas y otros compuestos generados por
los patgenos. La produccin de estos compuestos es estimulada en forma directa por la
presencia de un microorganismo patgeno (Kubicek y Harman, 1998; Stefanova et. al.,
1999; Harman et. al., 2004a; Druzhinina et. al., 2006).
Los metabolitos antifngicos ms conocidos que produce Trichoderma spp. son:
gliotoxina, gliovirina, viridina aislada del medio de cultivo de T. viride, entre otros
(Selitrennikoff, 2001), as como metabolitos voltiles o solubles, que afectan de forma
negativa el desarrollo de los patgenos, seguido esto de una fagociosis del contenido
celular (Guign y Gonzlez, 2004). Algunas de las especies de este gnero se caracterizan
por presentar una alta produccin de sustancias voltiles de naturaleza antibiocida con un
pronunciado aroma a coco (Howell et. al., 1993; Stefanova et. al., 1999).
Algunos compuestos como la gliotoxina y viridina, adems de poseer actividad
antibitica, en condiciones in vitro tambin inhiben la germinacin y crecimiento radicular
en mostaza y otras dicotiledneas (Bailey and Lumsden, 2004). Mientras que en
monocotiledneas sus efectos son menores (Jones et. al., 1988) o cuando el pH est cerca
de la neutralidad. Otros metabolitos producidos por Trichoderma spp. son el viridiol, 9-epiviridiol y la gliovirina. El primero tiene actividad herbicida y su variante, el 9-epi-viridiol
tiene efecto citotxico en clulas de carcinoma epidermoide (Bailey and Lumsden, 2004;
Phuwapraisisan et. al., 2006).
o 2.3.3 Hiperparasitismo:
El microorganismo patgeno produce estmulos que favorece el quimiotropismo de
Trichoderma spp., haciendo que las hifas crezcan en esa direccin, hasta ponerse en
contacto con el fitopatgeno, para despus enrollarse o adherirse sobre las hifas. Para ello
12
emplea estructuras especializadas llamadas apresorios y haustorios a fin de penetrar la

pared celular de los hongos y degradarlos (Kubicek y Harman, 1998; Harman, 2000).
El proceso antes mencionado esta dividido en 5 fases (Kubicek y Harman, 1998):
1. Quimiotropismo, exudados del patgeno que atraen a Trichoderma spp.
2. Determinacin del mecanismo de antagonismo, segn el fitopatgeno.
3. Adhesin por medio de apresorios y la degradacin de la pared celular del patgeno
por medio de enzimas hidrolticas, secretadas por Trichoderma spp.
4. Penetracin en las hifas del patgeno, engrosndolas y produciendo haustorios, para
absorber los nutrientes de la planta parasitada (Figura 5).
5. Ocasionalmente llega a producir lisis de la pared celular de la planta infectada, por
las sustancias secretadas, esto en forma localizada en la infeccin.
Figura 5. Parasitismo de Trichoderma spp. en Phytium . Las fechas indican el enrollamiento y formacin
de haustorios de las hifas de Trichoderma spp (T), sobre la hifa de P. capsici (P) (Tomado de Benhamou y
Chet, 1997).
Trichoderma spp. es capaz de secretar enzimas hidrolticas, entre las que se encuentran
las quitinasas, -glucanasas, proteasas, lipasas, xilanasas, pectinasas, amilasas, fosfolipasas,
RNasas y ADNsas. Esta produccin es mayor cuando estn presentes laminaria, la quitina o
la pared celular de algn hongo fitopatgeno, o el hongo mismo. En estos casos, las
enzimas secretadas por Trichoderma spp. degradan la pared celular del fitopatgeno,
13
facilitando la insercin de sus estructuras especializadas y la absorcin de los nutrientes del

interior del fitopatgeno (De la Cruz et. al., 1992; Stefanova et. al., 1999; Monte, 2001;
Vera et. al., 2005; Harman, 2006). De las sustancias mencionadas anteriormente, las glucanasas y las quitinasas se consideran los metabolitos ms importantes en el
hiperparasitismo de Trichoderma spp. sobre fitopatgenos (De la Cruz et. al., 1992).
Leuba y Stossel en 1986, mencionaron que la actividad antifngica es debido a la habilidad
que posee Trichoderma spp. de interferir en la funcin de la membrana plasmtica en las
clulas fngicas. La secrecin de enzimas lticas le permiten a Trichoderma spp. degradar
la pared celular del patgenos (Ait-Lahsen et. al., 2001) y ya a nivel celular causa
granulacin coagulacin, desintegracin y lisis (Chet y Baker, 1981; Bell et. al., 1982).
Nawar (2005) menciona que a mayor concentracin de citosina secretada por Trichoderma
sp, mayor es la inhibicin en la germinacin de esporas y el crecimiento lineal de Fusarium
oxysporum.
o 2.3.4 Hipovirulencia:
Trichoderma spp. activa el sistema de defensa de la planta al ponerse en contacto con
ella, esencialmente induciendo el sistema enzimtico oxidativo o activando el sistema de
resistencia inducida (Howell et. al., 2000; Monte, 2001; Harman et. al., 2004b; Harman et.
al., 2004a; Hoitink et. al., 2006). En estos casos se reporta la intermediacin del cido
jasmnico y del etileno, los cuales conducen a la expresin de genes que codifican para
unas protenas especializadas denominadas defensinas, tioninas o protenas antimicrobianas
(AMP). Induce adems la produccin de otras protenas como las PR (protenas
relacionadas con la patognesis) no inducidas por la va del acido saliclico; se han
reportado del grupo PR-3 en T. reesie y del grupo PR-4 en T. harzianum (Selitrnnikoff,
2001). Con todo esto se forma un medio exterior inapropiado para el mantenimiento y
proliferacin de microorganismos patgenos (Alfano et. al., 2007; Djonovi et. al., 2007).
Otros reportes mencionan que las planta de algodn tratado con Trichoderma spp.
son inducidas a la produccin de compuestos relacionados con la resistencia a
fitopatgenos, como la elevacin de los niveles de terpenoides (Hanson y Howel, 2004).
14
En tomate este hongo induce la activacin de genes relacionados con la produccin de

elicitores. As mismo se ha observado la inactivacin de otros genes despus de la
interaccin con el hongo (Alfano et. al., 2007).
o 2.3.5 Degradacin de agrotxicos:
Trichoderma spp. cuenta con resistencia natural a la mayora de los productos qumicos
utilizados para el control de plagas en la agricultura, incluyendo los fungicidas. Enzimas
secretadas por este hongo, como la celulasa, hemicelulosa y xylanasa contribuyen a la
ruptura de molculas complejas como: hidrocarburos, clorofenoles, polisacridos,
plaguicidas y xenobiticos (Kubicek y Harman, 1998; Woo et. al., 2006; Vinale et. al.,
2008).
La rapidez y eficacia de la accin de Trichoderma spp. vara dependiendo de las
condiciones ambientales en las que se encuentre y los sustratos sobre el cual se desarrolle.
Sin embargo, estudios realizados por Osorio et. al., en el 2005, determinaron que el
estircol y el bioslido no promueven el crecimiento del gnero Trichoderma spp.
Donoso et. al., en el 2008, menciona que debido al desarrollo radicular que promueve
en las plantas, le permite a sta, aprovechar mejor la disponibilidad de nutrientes o bien,
que Trichoderma spp. es capaz de degradar metabolitos provenientes de la composta,
facilitando la absorcin de estos por la planta.
As pues, se ha determinado que Trichoderma spp. puede ser complementario a la
utilizacin de agroqumicos ya que estos en ciertas concentraciones no resultan txicos para
el crecimiento o proliferacin de Trichoderma spp. Homenich en 1987, citado por Duran et.
al. (2007), seal que Trichoderma sp. es inhibido por concentraciones de 0.1 ppm de
Captan; pero 2 aos despus Santos y Melo observaron que tolera 1 ppm de captan.
Resende et. al., en el 2004, citado por Duran et. al., (2007), menciona que el fungicida
Maxim no caus efecto txico sobre Trichoderma sp. y que este se manifestaba en las
races de las plantas de maz tratadas todava un ao despus e identific que el crecimiento
micelial de Trichoderma sp. se vea disminuido.
15
o 2.3.6 Promocin del crecimiento vegetal:

El incremento en la tasa de germinacin de semilla, el aumento en el peso seco de la
raz y follaje, y el desarrollo radicular por Trichoderma spp. es debido a que acelera el
desarrollo de los tejidos meristemticos primarios, los cuales aumentan la germinacin, el
volumen, la altura, as como el peso de la planta (Moity, 1982; Cupull et. al., 2003),
tambin produce un factor de regulacin de crecimiento (Salt, 1978; Windham et. al., 1986)
y secreta fitohormonas; aunque Yedida et. al. en el 2003, mencionan que no existe relacin
entre la estimulacin de crecimiento promovida por Trichoderma sp. y la acumulacin de
fitoalexinas producidas en la interaccin del hongo con la planta. El desarrollo radicular
tambin mejora la asimilacin de humedad y nutrientes por parte de la planta (Windham et.
al., 1986; Andre et. al., 1992; Harman, 2006; Vinale et. al., 2008).
As pues, este fenmeno de estimulacin, puede deberse a un efecto directo de
Trichoderma spp. o tambin a efectos secundarios, en la interaccin con fitopatgenos para
su control (Salt, 1978; Windham et. al., 1986). La naturaleza gentica y molecular del
efecto de estimulacin de crecimientos que otorga Trichoderma sp. a las plantas aun no han
sido explicados (Harman et. al., 2004a).
Windham et. al., (1986) encontraron que la especies de T. harzianum y T. koningii
aumentaron el peso seco de raz y brote 213-215% en tomate y 259-318% en tabaco, 8
semanas despus de la plantacin. Se tiene reportado que T. harzianum influye en el
crecimiento vegetativo de papas y tomate y que interviene en la germinacin de los cafetos
(Gonzlez et. al., 1999; Cupull et. al., 2003). Guign y Gonzlez en el 2004, encontraron
que las cepas de Trichoderma sp. adems de ejercer un buen control sobre Phytophthora
capsici, promovieron el crecimiento de plantas de chile (Capsicum annum) en invernadero,
siendo la de mejores respuestas las cepas TC74 obtenida de suelo de chile jalapeo el cual
promovi un 30% la altura, 20% ms hojas, 30% rea foliar ms abundante, tallos en un
15% ms robustos y 60 y 38% ms biomasa en raz y brotes respectivamente. Y la cepa
TSO1 aislada de durazno estimul el crecimiento de un 15 a 35% ms follaje y un 40% ms
de materias seca; en comparacin a las otras cuatro cepas obtenidas de nogal y de menta.
Kleifeld y Chet en 1992, reportaron que Trichoderma sp. estimula el crecimiento en plantas
16
de chile, aumenta el peso seco de las mismas, as como la aceleracin en la emergencia de

la plntula; Cruz y Cisterna en 1998 obtienen resultados similares en pimientos. Donoso et.
al., en el 2008, reporta que T. harzianum estimula el crecimiento de plntulas de Pinus

radiata, y una mezcla de ste con perlita y composta, da incrementos significativos en
altura, biomasa y desarrollo del sistema radica (Figura 6).
Figura 6. Tratamiento de Trichoderma sp en Pinus radiata (C) y en combinacin con sustratos (D); B)
tratamiento con sustratos y A) testigo (Tomado de Donoso et. al., 2008).
Gravel et. al., (2006) estudiaron la capacidad de produccin o degradacin de AIA en
Pseudomona putida y T. atroviride, encontrando que este ltimo produce AIA en presencia
de indol-3-etanol (lEt). Determinando que el AIA esta involucrado en el mecanismo de
estimulacin de crecimiento en tomates en condiciones hidropnicas.
17
Lpez et. al. (2008) realizarn anlisis de los compuestos que secreta T. virens,
encontrando 3 compuestos de naturaleza auxinica el indol-3-actico (AIA), indol-3acetaldehido (IAid) y indol-3-etanol (lEt). Mencionan tambin que en la estimulacin de
crecimiento vegetal participan reguladores del crecimiento tipo auxnico y que en anlisis
celulares se observ que existe un efecto promotor de la divisin y elongacin celular.
2.4 Usos y aplicaciones.

Las propiedades del gnero Trichoderma spp, lo han convertido de mayor importancia
econmica para la industria, as como biofungicida comercial, tambin se usa en la
degradacin de xenobiticos y como estimulante del crecimiento vegetal (Papavizas et. al.,
1990; Rey et. al., 2000; Howell, 2003; Harman et. al., 2004b; Hoitink et. al., 2006).
o 2.4.1Agente de control biolgico:
La aplicacin de Trichoderma spp. como agente de control biolgico se debe a las
relaciones antagonistas que establece contra otros hongos fitopatgenos que viven en el
suelo, adems, ha mostrado influencia en la promocin del crecimiento de algunas plantas
de importancia econmica, ya que facilita la absorcin de nutrientes. Otro efecto favorable
es que induce resistencia a fitopatgenos en las plantas con las que se asocia (Windham et.
al., 1986; Andre et. al., 1992; Gonzlez et. al., 1999; Hermosa et. al., 2000; Rey et. al.,
2000; Monte, 2001; Harman, 2006; Vera et. al., 2005; Alfano et. al., 2007; Vinale et. al.,
2008).
El antagonismo que se presenta contra fitopatgenos, se debe a diversos mecanismos,
como el de competencia por nutrientes y espacio, antibiosis, hiperparasitismo e
hipovirulencia, los cuales no son excluyentes entre s, y pueden actuar de forma sinrgica.
Trichoderma spp. es utilizado como antagnico por su eficacia para el control de Botrytis
spp; Colletotrichum spp; Fusarium spp.; Macrophomina phaseolina; Phytophthora capsici;
Pythium spp; Rhizoctonia solani; entre otros patgenos de plantas (Monte, 2001).
18
Las especies de Trichoderma spp. ms utilizadas como agentes de control biolgico

son: T. harzianum, T. viridae, T. virens, T. hamatum, T. reesei y T. koningii (Hajieghrari et.
al., 2008). T. harzianum es efectivo contra M. phaseolina, P. capsici, C. gramincola y P.
ultimum en cultivos de ajonjol, pimiento y en maz, respectivamente (Ezziyyani et. al.,
2004; Harman et. al., 2004b; Cardona y Rodrguez, 2006). T. viride eficiente antagonista de
R. solani en cafetos (Cupull et. al., 2003). T. virens controla C. gramincola, P. ultimum, R.
solani en cultivos de algodn (Hanson y Howell, 2004; Djonovi et. al. ,2006; Djonovi et.
al., 2007) y en pruebas in vitro muestra actividad contra R. solani y Sclerotium rolfsii
(Mukherjee et. al., 2004) y T. asperellum altamente eficaz contra Gibberella fujikuroi
(Nagayama et. al., 2007).
Existen diversos productos comerciales basados en Trichoderma spp., el primer agente
de control biolgico en ser registrado y comercializado fue en Israel, con la cepa T39 T.
harzianum T39 aplicado en invernaderos y en viedos; existen otros ms en la India,
Europa, Estado Unidos, entre otros (Hajieghrari et. al., 2008)
En ocasiones Trichoderma spp, se ve afectado por los metabolitos producidos por la
planta o microorganismos con los que interacta, como es lo reportado por Mumpuni et.al.
(1998) que menciona que metabolitos como el n-butanol, producidos por A. bisporus
inhiben el estmulo del crecimiento de T. harzianum biotipo Th2.
o 2.4.2 Uso Industrial:
Las enzimas que produce Trichoderma spp. son utilizadas en la degradacin de
polisacridos complejos, as como en la produccin y la transformacin de los alimentos.
Tambin se ha incrementado su uso en industrias textiles, industrias del papel y fabricacin
de pastas (Nakari y Penttila, 1995). Las enzimas hidrolticas de Trichoderma spp. son
usadas para la hidrlisis de material celulsico, la obtencin de productos fermentables que
se usan como sustrato para la produccin de etanol (Galante et. al., 1998a); adems de la
clarificacin de los mostos para los procesos de filtrado de la cerveza y el vino, en la
maceracin de los tejidos vegetales para la extraccin de aroma, en la produccin de vinos
19
y zumos. En la industria textil son utilizadas para dar el efecto de deslavado, desfibrilacin
de tejidos, etctera (Galante et. al., 1998a; Galante et. al., 1998b).
La especie ms utilizada en la industria textil es T. reesei, debido a su gran produccin
de celulasas. Sin embargo como parte de bsqueda de nuevas alternativas se estudia la
obtencin de genes que codifiquen para estas enzimas de gran inters, para estimular su
sobreproduccin con el fin de potenciar su uso (Nakari y Penttila, 1995; Margolles et. al.,
1996; Miettinen et. al., 2005). As mismo, como desarrollo biotecnolgico, se desea la
generacin de plantas transgnicas, que lleven consigo los genes que expresan las enzimas
que ayudan al control de fitopatgenos, para que la planta tenga resistencia a enfermedades
causadas por hongos fitopatgenos de importancia (Saloheimo et. al., 2004).
2.5 Problemtica actual de fitopatgenos en cultivo y alternativas de control.

Las prdidas causadas por fitopatgenos en cultivos no son solo econmicas, tambin
cualitativas en cuestin biolgica en cuanto al tamao, color, textura, sabor, calidad
nutricional, etctera (Ashworth et. al., 1981; Agrios, 1988; Rodrguez, 2001). Estos
fitopatgenos pueden ser virus, bacterias, nematodos, fitoplasma, viroides y principalmente
hongos, causando severas prdidas en la agricultura (Agrios, 1988; Rey et al., 2000; Monte,
2001). Estas prdidas dan como resultado una reduccin en la produccin agrcola y un
aumento en el precio de los alimentos (Monte, 2001).
Algunos de los fitopatgenos de mayor inters en el pas: pertenecen a los gneros de
Rhizoctonia, Fusarium, Phytophthora, Pythium, Phymatotrichum y M. phaseolina
(Rodrguez, 2001). En el norte de Tamaulipas se tiene como principales problemticas la
pudricin carbonosa (M. phaseolina), Mildi velloso (Peronosclerospora sorghi), Carbn
de la panoja (Sporisorium reilianum), Cornezuelo (Claviceps sp.) y contaminacin de
granos por micotoxinas principalmente por Aspergillus (Daz-Franco y Montes-Garca,
2008)
20
El 21% de maz amarillo de Mxico es producido en Tamaulipas; en el 2004 se

destinaron ms de 220,000 ha destinadas a este cultivo, obteniendo una produccin de
710,000 ton y un rendimiento de 3.2 ton ha-1. El cultivo de maz est principalmente en la
parte norte del estado, en condiciones de temporal y altas temperaturas intermitentes
(Hernndez-Delgado et. al., 2007).
Para el control de M. phaseolina se han evaluado microorganismo considerados para su
aplicacin, como Trichoderma sp, Gliocadium sp., Pseudomonas sp, Bacillus sp, y
Sporidesmium sp, entre otros (Rodrguez, 2001).
Trichoderma spp. posee una capacidad micoparastica a fitopatgenos tanto de raz,
como areos (Sharon et. al., 2001, Windham et. al., 1989). Es el microorganismo ms
utilizado como agente de control biolgico, debido a que es tolerante a la aplicacin de
agroqumicos, ayudando a la reduccin de la aplicacin de plaguicidas y fertilizantes o
compuestos de origen qumico, que tienen efectos altamente negativos en el medioambiente
y en la salud humana (Woo et al., 2006; Vinale et al., 2008).
Por lo que en esta investigacin se estudia la capacidad in vitro de cepas de
Trichoderma spp nativas de Tamaulipas, para antagonizar a M. phaseolina, causante de la
pudricin carbonosa y a A. parasiticus, productor de micotoxinas en granos almacenados.
o 2.5.1 Macrophomina phaseolina.
La pudricin carbonosa del tallo (Figura 7) es ocasionada por el hongo imperfecto M.
phaseolina; el cual presenta una fase esclerocial (micelia sterilia) denominada Rhizoctonia
bataticola (Tab) Butler y una fase picnidial (Sphaeropsidal) denominada M. phaseolina
(Dhingra y Sanclair, 1978). M. phaseolina produce microesclerocios (Figura 8) como
estructuras de resistencia, estos son articulados, duros, coracoides y de color negro (Abawi
y Pastor-Corrales, 1990), los que son difciles de destruir. Este patgeno es capaz de
infectar a ms de 500 especies de plantas cultivadas, y es favorecido por temperaturas
mayores a 32C y a la sequa (Cardona y Rodrguez, 2006).
21
Figura 7. Imagen de un tallo infectado de esclerocios de M. phaseolina (Fotografa Lab de Biotecnologa

Experimental)
Figura 8. Fotomicrografa de esclerocios de M. phaseolina (Tomado de Cabrera et. al., 2001).
En Mxico M. phaseolina se reporta afectando los cultivos de maz en los estados de

Tamaulipas, Guerrero y Veracruz, con una incidencia en el caso de Tamaulipas del 60%
(Daz-Franco et. al., 2008). En el norte de este estado se considera que la pudricin
carbonosa es la enfermedad ms importante y a partir de 1987 afecta el rea de temporal,
causando perdidas del 20 al 30% de la produccin (Williams-Alans et. al., 1990). En sorgo
est estimado que ocasiona la mortalidad de las plantas desde un 30 al 90% (De la GarzaGonzlez y Daz-Franco, 1989).
22
Esta enfermedad en los cultivos es controlada con prcticas culturales como es el

barbecho fitosanitario y la aplicacin de sustancias qumicas, ninguna especfica para M.
phaseolina. Estos productos qumicos adems de inespecficos para este patgeno,
ocasionan daos en los agroecosistema y adems afecta la salud de las personas que los
aplican y gente que consume productos de los cultivos tratados. Por lo que se busca la
aplicacin del control biologico (Daz-Franco et. al., 2008).
Existen reportes del control de M. phaseolina por parte de Trichoderma spp. Dhingra y
Sinclair (1978) indica que M. phaseolina es parasitado por T. viride y T. lignorum
produciendo colapso y disolucin de la pared celular. Lifshitz et. al. (1986) indic que la
incidencia de la pudricin carbonosa en semilla de arveja (Pisum sativum) es reducida por
T. koningii. Pineda y Gonnella (1988) reportan que las semillas de ajonjol (Sesamum
indicum) tratadas con esporas de Trichoderma sp. reducen el porcentaje de muerte de
plantas por M. phaseolina hasta los 72 das de edad. Adekunle et. al. (2001) por su parte
indica que el 66% de las plntulas de frijol resistan la presencia de M. phaseolina cuando
las semillas se inocularon con una suspensin de Trichoderma sp. de 6.8 x 107ufc/mL-1.
Srivastava et. al. (1996) demostr que la germinacin de esclerocios de M. phaseolina es
reducido de 30 a 60% significativamente por la presencia de T. harzianum.
o 2.5.2 Aspergillus parasiticus.
Aspergillus es un hongo filamentoso imperfecto descrito por primera vez en 1729 por
Antonio Micheli quien le dio ese nombre por el parecido de la cabeza conidial con las pilas
bautismales de la poca llamada en latn Aspergillum. Las cabezas conidiales (Figura 9)
pueden ser de cuatro formas bsicas: globosa, radiada, columnar o claviforme
(Kozakiewicz, 1989). La colonia de este hongo presenta distintas tonalidades verdes,
pardas, amarillas, blancas, grises y negras (Figura 10). Es un hongo capaz de crecer a
diferentes temperaturas, sobre substratos con diverso contenido de humedad.
23
Figura 9. Imagen de conidiforos de Aspergillus sp (Tomado de Carrillo, 2003).
Figura 10. Colonia de Aspergillus sp, a) A. flavus y b) A. parasiticus (Tomado de presentacin impartido
por Dr. Juan Carlos Basilico)
Se conocen alrededor de 200 especies, de las cuales 20 estn considerados riesgosas

para el hombre, esto debido a las micotoxinas que producen. Las ms importantes se
denominan aflatoxinas y son principalmente 4 tipos (B1, B2, G1 y G2). Son producidas
principalmente por Aspergillus flavus y A. parasiticus (Bennett y Klich 2003; Vargas et.
24
al., 2004; Roze et. al., 2007; Yin et. al., 2008) y la mayora de las cepas de A. parasiticus
son capaces de sintetizarla. Las aflatoxinas se producen durante el cultivo antes de la
cosecha o bien, en ocasiones es durante el almacenamiento, procesamiento y manipulacin
cuando el grano (Figura 11) conserva humedad por arriba del 70% (Eguiaz, 1984). Sin
embargo an no se tiene claro de por que esta contaminacin se presenta durante unos aos
y en otros no (Perrone et. al., 2007).
La contaminacin por aflatoxinas en los cultivos como maz, algodn, soya, cacahuate
entre otros, y a su vez en alimentos, para ganado y consumo humano, preparados en base de
estos cultivos, resultan ser un riesgo para los animales y para la salud humana, ya que son
txicos y cancergenos. Aspergillus sp provoca cambios tanto de naturaleza sensorial,
nutricional y cualitativos tales como, pigmentacin, podredumbre y sabores desagradables,
entre otros (Kozakiewicz, 1989).
Figura 11. Mazorca infectada por Aspergillus (Tomado de Mazzani y Larisse, 1990).
Martnez y Garca en el 2003, mencionan que Aspergillus spp. tiene una alta incidencia
y presencia de aflatoxinas en maz importado, principalmente a Estado Unidos.
Aproximadamente el 25% de las cosechas de granos en el mundo se encuentra contaminado
por micotoxinas (Fink-Gremmels, 1999). En Mxico la presencia de aflatoxinas en maz se
ha estimado en un 90% de incidencia (Ellis et. al., 1991).
25
En los aos 60se inicio el cultivo de maz en el norte de Tamaulipas y para 1989, la
sequia aunado a las altas temperaturas, promovieron la presencia de aflatoxinas de
incidencia y concentracin inusuales (Rodrguez del Bosque et. al., 1992). El maz
almacenado en Tamaulipas en 1985-1988 presento un 2% de incidencia de A. flavus con
bajos niveles de aflatoxina B1 (Guzmn-de-Pea, 1989). Hernndez-Delgado et. al., en el
2007, reportaron que Aspergillus es el hongo toxignico ms frecuente en maz almacenado
en el norte de Tamaulipas con una incidencia mayor al 40%.
Diversas investigaciones se han realizado para la degradacin de aflatoxinas, sin
embargo la estabilidad y termoresistencia que presentan han dificultado obtener buenos
resultados (Valle, 1991). Al noreste de Mxico en Tamaulipas las medidas que se tomaron
para el control de contaminacin por aflatoxinas fueron, la siembra temprana y una
adecuada irrigacin (Rodrguez-del-Bosque, et. al., 1995).
La contaminacin por aflatoxinas en cultivos o granos almacenados, es controlado por
cepas de Trichoderma spp., el crecimiento de A. flavus es inhibido por 48 cepas de
Trichoderma sp., de los cuales 35 fueron caracterizados por la produccin de antibiticos
(Buhariwalla et. al., 2005). A. flavus es micoparasitado por cepas de Trichoderma sp,
aislados de tierra de cultivo de cacahuate (Srilakshmi et. al., 2001) y tambin se ha
reportado que previene la sntesis de la aflatoxina tipo B1 (Shanta, 1999; Desai et. al.,
2000).
26
3. JUSTIFICACIN
En el estado de Tamaulipas, la prctica agricola es importante en la economia, siendo
los cultivos de mayor importancia el maiz y el sorgo; sembrados principalmente en el norte
del estado.
Las prdidas en la agricultura se deben en su mayora por enfermedades producidas por
microorganismos fitopatgenos en las plantas, causadas principalmente por hongos y
bacterias, los cuales dan como resultado una reduccin en la produccin agrcola y un
aumento en el precio de los alimentos,
Algunas de las prcticas agrcolas como el uso desmedido de insecticidas, fertilizantes y
herbicidas favorecen al deterioro ambiental, son txicos inespecficos y eliminan adems de
los organismos fitopatgenos, a otros organismos benficos del suelo (Rey et. al., 2000;
Vinale et. al., 2008). Debido a este dao se han realizado investigaciones para el control
biolgico de las plagas y enfermedades utilizando microorganismos antagonistas de
fitopatgenos, a los cuales desplaza de forma natural, con mnima interferencia en el medio
ambiente, as como el bajo costo en su aplicacin (Cupull et. al., 2003). Se han estudiado
otras alternativas para el control de fitopatgenos, entre ellos los hongos que forman
asociaciones con la raz de la planta, conocidas como asociaciones micorrcicas, las cuales
ayudan a disminuir el dao por fitopatgenos; Glomus spp. es uno de los ms estudiados.
La bacteria Azospirillum brasilense es otro de los inoculantes evaluados que han mostrado
buenos resultados. Otros hongos menos empleados en la regin es Trichoderma spp., el
cual tiene capacidad de formar relaciones simbiticas semejantes y tener la posibilidad de
conocerlas, manejarlas y explotarlas, ayudar a contribuir y mejorar las condiciones en las
que se lleva a cabo la produccin de alimentos.
En el estado, se han aplicado microorganismos para la promocin del crecimiento
vegetal en los cultivos (Azospirillum spp y Glomus spp); mas no para el control de
fitopatogenos, por lo que se considera importante contar con un agente de control biolgico
para la pudricion carbonosa, causada por Macrophomina phaseolina; principal problema en
27
sorgo y frijol. Adems, para tratar de disminuir o controlar la produccin de aflatoxinas

causadas por el hongo Aspergillus spp en cosecha.
Por lo anterior se considera necesario buscar cepas de Trichodermas spp nativas, ya que
se encuentran adaptadas a las condiciones fisicoqumicas y ambientales de la regin y as
obtener mejores resultados en el control de fitopatgenos. Por otra parte, si la misma cepa
es capas de promover el crecimiento vegetal sera un gran acierto, ya que podra ayudar a la
economa de los agricultores, minimizando los gastos en el manejo del cultivo e
incrementando el rendimiento de los mismos.
28
4. HIPTESIS
El hongo Trichoderma spp. est presente de forma natural en suelos de cultivo en el

norte del estado de Tamaulipas y puede haber especies que tengan la capacidad de controlar
fitopatgenos de importancia para cultivos como maz y sorgo y que adems sean capaces
de producir sustancias que estimulen el crecimiento vegetal.
29
5. OBJETIVOS
5.1 General
Aislar y caracterizar molecular y agronmicamente Trichoderma spp. nativos del norte
de Tamaulipas.
5.2 Especficos
Obtener e identificar aislados de Trichoderma spp. nativos del norte de Tamaulipas.
Evaluar la actividad antagnica de los aislados de Trichoderma spp. nativos del norte
de Tamaulipas contra M. phaseolina y A. parasiticus.
Evaluar la promocin de crecimiento en plantas tratadas con los aislados de
Trichoderma spp. nativos del norte de Tamaulipas.
30
6. METODOLOGA
6.1 Muestreo.
Para realizar este estudio se recolectaron 42 muestras al azar de suelo de cultivo en
nueve municipios (Figura 12) de la regin norte del estado de Tamaulipas (Miguel Alemn,
Daz Ordaz, Camargo, Reynosa, Ro Bravo, Valle Hermoso, Matamoros, San Fernando, y
Mndez), las cuales se obtuvieron de suelos de cultivos (Sorgo, Maz, Frijol, y Pasto
principalmente) en condiciones de riego como en temporal, durante los meses de Octubre a
Diciembre del 2008.
Figura 12. Municipios muestreados en la regin norte de Tamaulipas.
En cada sitio de muestreo se colectaron 2 submuestras de aproximadamente 1 kg de

tierra a 10 cm de profundidad, descartado los primeros 5 cm de superficie de suelo. Las
muestras se transportaron en bolsas de plstico al Laboratorio de Biotecnologa
Experimental del CBG-IPN donde se mezclaron, homogenizaron y se conservaron a
temperatura ambiente hasta su procesamiento.
31
6.2 Aislamiento e identificacin de microorganismos.

o 6.2.1 Aislamiento de Trichoderma spp.
Se observ que las colonias fngicas de Trichoderma se encuentran en la semilla de
maz y que a partir de ah es ms fcil la obtencin de la colonia para sembrarla en los
medios de cultivo, que utilizar el mtodo de dilucin en placa (Com. Pers2). Por lo que, se
realiz la siguiente metodologa para el aislamiento de Trichoderma, la cual consisti en
colocar aproximadamente 150 gr de tierra de suelo de cultivo en vasos trmicos (unicel) de
177 ml (Figura 13), donde se sembraron 10 semillas de maz (Zea mays L.) de la variedad
3025 de Pioneer y regadas segn necesidades con agua desionizada. Los vasos se
mantuvieron en una charola cubierta. Este proceso se llevo acabo bajo condiciones
aspticas. A los 15 das despus de la siembra se procedi a la bsqueda de colonias de
hongo con la morfologa caracterstica de Trichoderma, tanto en la superficie de la tierra
como en la semilla de maz y tierra adjunta a ella.
Figura 13. Dispositivo para la obtencin de cepas de Trichoderma spp.
Dr. Jos Luis Hernndez Mendoza. Titular del Laboratorio de Biotecnologa Experimental. CBG-IPN.
Reynosa, Tamaulipas. Agosto 2008
32
Se tom una muestra de la colonia fngica seleccionada y fue sembrada en cajas petri
con agar papa dextrosa (PDA); estas se resembraron en PDA para obtener una colonia pura.
Las cajas fueron incubadas a 24C 1 con periodos de 12 h luz/oscuridad. De los
diferentes aislados se obtuvieron 16 cepas las cuales fueron codificadas con la serie HTE de
801 a 816.
o 6.2.2 Identificacin morfolgica de Trichoderma spp.
La identificacin de los aislados (Trichoderma), fue con base a sus caractersticas
morfolgicas macroscpicas, tomando en cuenta su aspecto, color y superficie de la colonia
desarrollada en medio PDA. La identificacin microscpica de los aislados fue con base a
las caractersticas del gnero como son conidiforos hialinos, ramificaciones, no
verticilados; fialides individuales o en grupo, conidios hialinos de una clula, ovoides,
nacidos de pequeos racimos terminales (Barnett y Hunter, 1972). Las cepas se
mantuvieron a 4C en cajas petri con PDA y esporas de las 16 cepas embebidas en papel
filtro (Whatman No.1) y colocadas en tubos de vidrio sellado y almacenado a -70C.
6.3 Caracterizacin molecular.

Para la realizacin de la caracterizacin molecular se obtuvieron cultivos monospricos
de las 16 cepas de Trichoderma spp. Para ello se realizarn diluciones de esporas hasta la
dilucin 10-6, de donde se tomaron 100 L, los cuales fueron depositados en el centro de
una caja de petri con medio PDA; que fueron distribuidos en toda la caja con la ayuda de
un asa de Diralsky. Las cajas fueron incubadas a 24C 1, las cuales fueron monitoreadas
con el microscopio estereoscpico cada 4 h para detectar la presencia de crecimiento, se
marco y corto el agar con la espora en crecimiento; para transferirlo a otra caja de petri con
PDA.
33
o 6.3.1 Obtencin de biomasa de aislados de Trichoderma spp.

Los aislados de Trichoderma spp. se multiplicaron en matraz Erlenmeyer de 500 ml,
con 50 ml de caldo LB Luria-Bertoni (Com. Pers)3, medio utilizado en anteriores
ocasiones para produccin de biomasa en el laboratorio de biotecnologa experimental; que
fueron inoculados con un asa de cultivo, se incubaron a una temperatura de 27C y 200
rpm. El cultivo de 72 h de crecimiento se centrifug para obtener la biomasa.
o 6.3.2 Extraccin ADN genmico.
Para la extraccin ADN genmico se sigui el mtodo de Hoffman y Wriston (1987)
modificado, una vez obtenida la biomasa y contenida en tubo eppendorf, fue lavada con
agua desionizada estril, se procedi a resuspender las clulas en 0.2 ml de solucin de lisis
(tritn X-100, 2 %; SDS, 1 %; NaCl, 0.1 M; Tris-HCl pH 8, 10mM y EDTA 1mM) y se
agreg 0.2 mL de fenol-cloroformo (1:1) y 0.3 g de perlas de vidrio (ballotini) de 0.45 mm
de dimetro. El tubo se agit en vortex durante 1 min, despus se coloc en hielo por 1 min,
repitiendo estos dos pasos tres veces; posteriormente se aadi 0.2 mL de TE 10:1 (Tris 10
mM y EDTA 1 mM) y se centrifug durante 10 min. a 12000 rpm a 4 C. Posteriormente se
transfiri la fase acuosa a un tubo nuevo al cual se le agreg 10 L de RNAsa y se incubo a
37 C por 15 min. En seguida se agreg 10 L de acetato de amonio (NH4C2H3O2 4 M) y 1
mL de etanol (C2H5OH) al 100%, se mezcl por inversin, dejando reposar por 15 min a 20 C. Nuevamente se centrifug a 12000 rpm por 5 min a 4 C, descartando el
sobrenadante y lavando el sedimento con 100 L de etanol al 70%, se centrifug a 12000
rpm por 5 min a 4 C, eliminando la fase acuosa y secando el precipitado a 55 C durante
aproximadamente 5 min o bien hasta que se deje de percibir el olor a etanol. El ADN
obtenido se resuspendi en 40 L de TE 10:1 y se mantuvo a -20C hasta su uso.
Alternativamente al protocolo anterior se utiliz el Kit de extraccin (Wizard
Genomic ADN Purification Kit). El cual consisti en triturar en un mortero la masa celular
Reynosa, Tamaulipas. Agosto 2008
34
con Nitrgeno lquido, el polvo se pas a un tubo eppendorf de 1.5 ml en donde se

aadieron 600l de solucin de lisis nuclear incubando a 65C durante 15 min.
Posteriormente se adicionaron 3 L de solucin de RNAsa y se incubo a 37C por 15 min,
pasado ese tiempo se dej enfriar a temperatura ambiente por 5 min, y se agreg 100 L de
solucin de precipitacin de protenas. Se coloc por 5 min en hielo y se centrifug a
13,500 rpm durante 3 min, en seguida se transfiri el sobrenadante a un nuevo tubo
eppendorf y se le agregarn 300 L de isopropanol. Se mezcl por inversin y centrifug a
13,500 rpm por 2 min. Se descart el sobrenadante y se agreg 300 L de etanol al 70%. Se
mezcl nuevamente por inversin y se centrifug por 2 min a 13,500 rpm; se descarto
nuevamente el sobrenadante y se coloc el tubo invertido sobre una tolla de papel por
espacio de 1 min, posteriormente se seco la pastilla a 65C, cuando el etanol se habia
evaporado se le aadi 50 L de solucin de rehidratacin del ADN y 1.5 L de solucin
RNAsa, dando un spin y se incubo a 37C por 15 min y luego a 65C por 1h. Al finalizar, se
guard el tubo a 4 C hasta su uso.
Una vez que se extrajo el ADN, se procedi a visualizarlo en un gel de agarosa al 1%,
adicionando 0.1 L syber gold y 0.4 L de orange. Se deposit 1 L de cada muestra en el
gel y se corri en una cmara de electroforesis horizontal (BIO-RAD) a 100 volts por 50
minutos usando una fuente de poder EC105. El gel se observ en el tras-iluminador de luz
ultravioleta y se capturo la imagen del gel en el programa Kodak digital ScienceTM 1D.
Las extracciones de ADN genmico se conserva a -20C.
o 6.3.3 Amplificacin ITS.
Las reacciones de PCR se realizarn en un volumen final de 50 L, utilizando 1 L del
ADN genmico, 5 L de Buffer 10X (concentracin final a 1X), 1.5 L de cloruro de
magnesio de 50 mM (final 1.5 mM), 1 L de dNTPs 10 mM (0.2 mM), 1 L de cada uno
de
los
iniciadores;
los
oligonucleotidos
(5TCCGTAGGTGAACCTGCGG3)
utilizados
e
ITS
fueron
ITS
4
Forward
Reverse
(5TCCTCCGCTTATTGATATGC3), 5 M (final 0.1 M) y 0.4 L de la enzima Taq

ADN polimerasa 5 U/L y completando el volumen a 50 L con agua milliQ estril. El
35
programa que se utiliz consisti de 1 ciclo de 3 min a 94C y 35 ciclos de 1 min a 94C,
1min a 53C y 1 min a 72C. Finalmente se dio un paso de extensin final de 1 min a 72C,
mantenindose a 4 C. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un termociclador
Peltier MJ Research. Se procedi a visualizarlo en un gel de agarosa al 1%, adicionando 0.1
L syber gold y 0.4 L de orange se depositaron 5 L de cada muestra en el gel y se corri
en una cmara de electroforesis horizontal (Bio- Rad) a 80 volts por 1 h. Se visualiz el gel
en el tras-iluminador de luz ultravioleta, captando la imagen del gel en el programa Kodak
digital ScienceTM 1D.
La metodologa anteriormente descrita no fue adecuada para la amplificaron de las
cepas HTE807 y HTE812, por lo que se realiz una dilucin 1:10 de la extraccin de ADN,
para realizar la amplificacin. La reaccin de PCR utilizada fue la siguiente Gotaq Green
12.5 M, oligonucleotidos ITS1 y ITS4 (5M) de 1.0l de cada uno, Cantidad de ADN
genmico 3.0 l y 7.5 l para tener un volumen final de 15 l. Con las siguientes
condiciones para la amplificacin 1 ciclo de 5 min a 94C, 35 ciclos de 30s a 94C, 30s a
58C y 1min de 72C, y un ciclo de extensin final de 7 min a 72C y se mantuvo a 4C
hasta su utilizacin. Posteriormente se purific utilizando 5 l de producto de PCR
agregando 12 l de EXOSAP, bajo las siguientes condiciones 37C durante 15 min y a
80C durante 15 min ms.
Ya obtenidos los productos, estos fueron purificados utilizando el Kit de Purification
ADN de Wizard el cual consinti en colocar la miniocolumna en el tubo colector. En el
centro de la membrana se coloc el contenido total de la amplificacin ms 50L de
solucin de unin de membrana, dejando incubar a temperatura ambiente por 1 minuto,
posteriormente se centrifug por 1 min a 16,000 rpm. Se descart el desecho del tubo
colector, se agreg en la columna 700L de solucin de lavado de membrana con etanol,
centrifugando por 1 min, nuevamente se descart el desecho y se agreg 500L de solucin
de lavado, se centrifug por 5min y se descart el desecho del tubo colector para volver a
centrifugar por 1 min, sin tapar el tubo para que el etanol se evapore. Despus de esto se
coloc la minicolumna en un tubo eppendorf de 1.5 ml, en donde se aadi 50 L de agua
libre de nucleadas, en la minicolumna; incubado a temperatura ambiente por 1 min, y
36
despus se centrifug por 1 min, para desacartar la minicolumna. Se tapo el tubo eppendorf
y se conservo a 4C.
o 6.3.4 Secuenciacin.
Los productos amplificados de cada una de las cepas fueron concentrados y transferidos
a un tubo eppendorf de 0.2 ml, con aproximadamente 20l de producto amplificado a una
concentracin de 50ng. Las muestras fueron enviadas a Cinvestav de Irapuato Guanajuato,
para su secuenciacin. Se dejo un stock de 5l de los productos amplificados de cada cepa.
La reaccin de secuenciacin fue de la siguiente manera buffer Big Dye 4l, agua
miliQ 8.5l, iniciador ITS1 (5mM) 1l, Big Dye 4l, templado 2.5l, para un volumen
final de 20l. Posteriormente se utiliz el Xterminador con la siguiente reaccin 45l SAM,
10l Xterminador y 10l de la reaccin de secuenciacin, esta reaccin se centrifug a
25C a 13,000rpm durante 30 min. Despus de esto nuevamente se centrifug a 13,000rpm
durante 2 min y el sobrenadante es utilizo para la secuenciacin.
o 6.3.5 Identificacin a nivel de especie.
Las secuencias que se obtuvieron fueron comparadas con las secuencias de referencia
depositadas en la base de datos en TrichOkey de ISTH principalmente y en GenBank del
NCBI, para determinar a que especie de Trichoderma pertenece cada una de las cepas.
6.4 Caracterizacin agronmica.

o 6.4.1 Pruebas de antagonismo.
Las pruebas de confrontacin in vitro consistieron en colocar en un extremo de una caja
petri, la cual contenan agar PDA, un disco de agar 7 mm de dimetro con micelio del
patgeno de siete das de crecimiento y en el otro extremo un aislado de Trichoderma spp de
cinco das de crecimiento, lo anterior se hizo para cada uno de los 16 aislados de
37
Trichoderma spp contra las cepas de M. phaseolina (HMP4) y A. parasiticus (G1),

respectivamente. Se realiz 3 repeticiones de cada enfrentamiento y las cajas fueron
incubadas a 24 1C con periodos de 12 h luz/oscuridad, por una semana. Los parmetros
que se evaluaron fueron el crecimiento en lnea recta entre los dos sitios de inoculacin en
las cajas petri con PDA. Los cuales se midieron cada 12 h por 5 das con un vernier y los
valores se expresaron en cm. Tambin se midi el crecimiento de la colonia de Trichoderma
spp., el de M. phaseolina y A. parasiticus, y la observacin de los fenmenos presentados en
la zona de interaccin de las dos especies fngicas.
Se procedi a la obtencin del porcentaje de inhibicin de crecimiento radial (PICR) de
M. phaseolina y A. parasiticus con relacin a su testigo respectivamente (Martnez et al.,
2008). Y para poder determinar si Trichoderma spp presenta un incremento en su
crecimiento cuando esta frente a los patgenos se realiz un cambio en la frmula de PICR
intercambiando los valores, al cual se nombro porcentaje de aceleracin de crecimiento
radial de Trichoderma (PACRT).
PICR= [(R1-R2)/R1] x 100
R1= Crecimiento radial del testigo del patgeno
R2= Crecimiento radial del patgeno frente a Trichoderma spp.
PACRT= [(R2-R1)/R2] x 100
R1= Crecimiento radial del testigo de Trichoderma spp.
R2= Crecimiento radial de Trichoderma spp frente al patgeno.
o 6.4.2 Evaluacin de promocin de crecimiento vegetal.
Esta evaluacin se realiz con maz amarillo comercial 30F53 (PIONEER ), ya que es
la variedad que se siembra en los ciclos siguientes, por los agricultores en el norte de
Tamaulipas. Las semillas desinfectadas fueron tratadas con una inoculacin de 1 x 106
esporas/ml de cada uno de los aislados en cajas de petri, colocando 75 semillas, la cual
38
contena 15 mL de agua (. Las semillas tratadas con Trichoderma spp contenan 10 ml de la

suspensin de esporas ms 5 ml de agua desionizada, el tratamiento testigo contena los 15
ml de agua desionizada estril; mantenindose en estas condiciones hasta su inicio de
germinacin. Estas condiciones fueron determinadas en ensayos realizados en laboratorio
de biotecnologa experimental en donde se evaluaron concentraciones que iban de 1x101
hasta 1x106 esporas/ml, donde esta ltima concentracin fue la que di los mejores
resultados en la produccin de biomasa de las plantas de maz. El nmero de semillas
depositadas en la caja, la cantidad y tipo de agua, tambin fueron determinadas bajo
estudios previos.
Posteriormente se procedi a trasplantarlas en charolas de polietileno de 72 cavidades,
las cuales contena un sustrato compuesto por 3 volmenes de tierra de cultivo y 1 volumen
de sustrato de perlita grado HPF (HORTPERL), mantenidas en condiciones de
invernadero. Realizando evaluaciones a los 15 y 30 das despus de tratado, en donde se
procedi a lavar la raz de la planta y se les quito la tierra para manipularlas.
La evaluacin se realiz en dos perodos, en el perodos 1 se realizarn 10 tratamientos,
que fueron los aislados con nomenclatura par, el HTE807 y el testigo absoluto; en el
segundo perodo fueron 8 tratamientos, los aislados con nomenclatura impar y el testigo
absoluto. Con veintids repeticiones.
Los parmetros que se evaluaron fueron la altura de la planta, a partir del cuello del
tallo hasta la punta de la hoja ms grande; posteriormente se secaron a 65C por 48 h, se
pesaron por separado el follaje y la raz y as determinar la biomasa producida. La toma de
muestra y evaluacin se realiz a 15 y 30 das despus de tratamiento (ddt). El muestreo fue
completamente al azar tomando la mitad de las plantas de cada tratamiento.
o 6.4.3 Deteccin de promotores de crecimiento por HPLC.
Para determinar si Trichoderma spp es capaz de producir fitohormonas y/o metabolitos
que interactan en la ruta metablica de stas, se procedi a inocular las cepas en medio
lquido LB, por 72 h de incubacin, para ser filtrado con membranas de nylon de 0.45 m
(Milipore), una vez filtrado se analiz por cromatografa lquida de alta presin (HPLC
39
High pressure liquid chromatography) para la deteccin de metabolitos, utilizando como

testigos solucin estndares de Triptfano (TRP), Acido Indol Actico (AIA), cido
Antranlico (AA), Acido Indol Butrico (AIB), Acido Giberlico (AG) y Kinetina (KIN).
Para su valoracin se utiliz la fase mvil 70/30 (700 ml de solucin de fosfatos y 300
ml de acetonitrilo) con pH 3, 1ml/min, columna C18 ultrasphere 150*4.6 MM, 300C, 24 H,
220 nm. y la informacin obtenida fue comparada con extractos comerciales puros de los
metabolitos mencionados.
Por otra parte se realiz otro estudio a fin de analizar la presencia de sustancias
promotoras de crecimiento vegetal, como los anteriormente mencionados, solo que en este
caso se realiz en semilla de maz inoculadas con cada una de las cepas de Trichoderma
spp aisladas en este trabajo. Para ello se colocaron 6 semillas de maz amarillo variedad
30F53 (PIONER) en caja petri chica con 6 ml de la suspensin de esporas. Los
tratamientos se realizarn por triplicado. La suspensin de tratamiento est compuesta por 3
ml de agua desionizada y 3 ml de una suspensin de 1x106 esporas/ml de cada una de las
cepas de Trichoderma spp.
Posteriormente se tomaron muestras de 1 ml de agua donde estn germinando las
semillas a las 24, 48 y 72 h de la inoculacin. El lquido obtenido recibi el mismo
tratamiento antes descrito para acondicionarla muestra y pasarlas al anlisis por HPLC.
6.5 Diseo experimental.

El efecto de los tratamientos se determino con un diseo completamente al azar. Cada
tratamiento tuvo tres repeticiones para las pruebas de antagonismo y la unidad experimental
estuvo constituida por una colonia del microorganismo; para la evaluacion de promocion de
crecimiento se utilizaron 22 repeticiones, donde la unidad experimental fue una planta de
maiz. Los datos obtenidos en las variables de Antagonismo y Promocion de crecimiento
vegetal, se analizaron estadisticamente utilizando el paquete SAS (Statistical Analysis
40
System, Version 2001), realizando analisis de varianza, comparacin multiple de medias

con la prueba de Tukey y correlacion de variables.
El modelo estadistico del experimento es el siguiente:

Yij= + Ti + ij
Donde:
Yij: variable respuesta
i: tratamiento
j: repeticin
ij: error experimental
: media general
Ti: efecto del tratamiento
41
7. RESULTADOS
7.1 Muestreo.
Se obtuvieron 42 muestras provenientes de 9 municipios del norte de Tamaulipas donde
se realiza la siembra de diferentes cultivos, tanto en condiciones de riego como de
temporal. La informacin de la ubicacin, localidad, tipo de cultivo y condiciones del
cultivo de cada muestra obtenida se presenta en el cuadro 1.
Cuadro 1. Origen de muestras de suelo y sitios con presencia de Trichoderma spp.
Muestra
Localidad
Ubicacin
Cultivo
Temporal
Riego
Reynosa
260614N
981917W
Maz
Reynosa
260652N
981956W
Maz
Daz Ordaz
261223N
982706W
Maz
Daz Ordaz
261217N
983358W
Daz Ordaz
261315N
983809W
Daz Ordaz
261433N
984203W
Maz
Zacate
Johnson
Maz
Miguel Alemn
262127N
985526W
Sorgo
Miguel Alemn
262136N
985837W
Sorgo
Daz Ordaz
261104N
983522W
Sorgo
10
Daz Ordaz
261047N
983548W
Pasto Buffel
11
Daz Ordaz
261104N
983522W
Quelite
12
Mndez
250125N
982144W
Girasol
13
Mndez
250412N
982811W
Sorgo
14
San Fernando
250125N
982144W
Sorgo
15
San Fernando
251454N
981220W
Sorgo
16
San Fernando
251454N
981220W
Pasto
17
San Fernando
250625N
980724W
Sorgo
18
Miguel Alemn
262241N
985808W
Maz
19
Camargo
261753N
984729W
Sorgo
20
Daz Ordaz
261402N
984101W
Sorgo
Cepa
HTE801
X
HTE802
HTE803
HTE806
HTE807
X
X
HTE804
HTE805
HTE808
42
21
Rio Bravo
260529N
981750W
Sorgo
22
Reynosa
260529N
981750W
Sorgo
23
Rio Bravo
255835N
980804W
Frijol
24
Rio Bravo
255835N
980737W
Maz
25
Rio Bravo
255832N
980721W
Maz
26
Rio Bravo
255836N
980718W
Sorgo
27
Rio Bravo
255753N
980707W
Sorgo
28
Rio Bravo
253905N
980618W
Maz
29
Rio Bravo
253904N
975902W
Sorgo
30
Rio Bravo
253905N
980618W
Maz
31
Valle Hermoso
253959N
975311W
Sorgo
32
Valle Hermoso
253959N
975125W
Sorgo
33
Valle Hermoso
253959N
974524W
Sorgo
34
Matamoros
254000N
974308W
Sorgo
35
Valle Hermoso
254307N
974444W
Sorgo
36
Matamoros
253959N
974307W
Sorgo
37
Matamoros
254104N
973345W
Sorgo
38
Matamoros
255648N
973818W
Sorgo
39
Matamoros
255657N
973844W
Sorgo
40
Matamoros
255457N
974839W
Sorgo
41
Rio Bravo
255700N
975819W
Sorgo
42
Reynosa
245914N
980509W
Sorgo
HTE816
HTE809
HTE810
HTE811
HTE812
HTE813
HTE814
X
HTE815
7.2 Aislamiento e identificacin de microorganismos.

o 7.2.1 Aislamiento de Trichoderma spp.
Con la metodologa aplicada se observ que Trichoderma spp. se encuentra en la
semilla o en la tierra adjunta a la semilla de maz, es decir, en la zona de germinacin de la
semilla; lo cual se puede apreciar en la imagen vista en microscopio estereoscpico (Figura
14).
43
Figura 14. Deteccin de Trichoderma spp en zona de germinacin del maz. Observado con un aumento de
32X, con un objetivo de 10X/20.
De las 42 muestras de tierra obtenidas, solo en diez muestras se detect la presencia de
Trichoderma. Estas muestras corresponden a seis municipios (Miguel Alemn, Daz Ordaz,
Ro Bravo, Valle Hermoso, Matamoros y San Fernando). De estos ocho proveniente de
cultivo de sorgo, los otros dos de zacate y pasto, en ambas condiciones de riego como en
temporal. Seis muestras de suelo presentaron dos tipos de colonia con distinta coloracin,
con caractersticas tpicas de Trichoderma spp. Los datos se muestran en el cuadro 1 en
partes sombreadas.
o 7.2.2 Identificacin morfolgica de Trichoderma spp.

Se obtuvieron 16 colonias distintas, con caractersticas de crecimiento de Trichoderma
spp, colonias con formacin de anillos blancos (micelio) y verde (esporas). En las figura 15
se muestran las colonias de las 16 cepas obtenidas, las cuales presentaron caractersticas
morfolgicas distintas (color, forma y nmero de anillos, crecimiento, formacin de
esporas, pigmentacin del medio de cultivo, etc.).
44
Figura 15. Caractersticas de la colonia de los 16 aislados de Trichoderma spp.
45
Al microscopio se observaron hifas hialinas, filides en forma de matraz, tanto

solitarias como en grupo, conidias de diversas formas (redondos, elipsoidales, elipsoidales
oblongo) tanto chicos como grandes y en tonalidades verdes (Figura 16).
Figura 16. Morfologa microscpica de los aislados de Trichoderma spp. a) conidias redondas, b)
conidias elipsoidales oblongas y c) conidias elipsoidales; observado en un amento de 40x.
7.3 Caracterizacin molecular

El ADN obtenido bajo el mtodo de Hoffman y Wriston (1987) modificado y el
obtenido bajo el kit comercial (Figura17), ambos visualizados en un gel de agarosa al 1% y
teido con orange y syberd gold. En los cuales se puede observar que con ambos mtodos
se obtiene ADN genmico, solo que con el kit de extraccin es ms rpido y de alguna
forma fueron mejores los resultados, ya que de todos los aislados tratados bajo este mtodo
se obtuvo ADN genmico.
46
Figura 17. Visualizacin de ADN genmico en gel de agarosa al 1%. M corresponde a Ladder 100pb
marcador de peso molecular y las Cepas 2,7,8,9 y 16 corresponden a las cepas HTE802, HTE807,HTE808,
HTE809 y HTE816.
o 7.3.1 Amplificacin de ITS

Como resultado de la amplificacin del fragmento ITS1 ITS2 y el gen 5.8S ADNr,
con una temperatura de alineamiento de 53C. Se obtuvieron bandas de 600 a 700 pb, las
cuales se observan en el gel de la figura 18 que muestra los productos ya purificados.
Figura 18. Visualizacin de productos de PCR purificados en gel de agarosa al 1%. M corresponde a
Ladder 100pb marcador de peso molecular y las Cepas 1,3,4,5,6,10,11,12,13,14 y 15 corresponden a las cepas
HTE801, HTE803,HTE804, HTE805, HTE806, HTE810,HTE811,HTE812, HTE813, HTE814 y HTE815.
o 7.3.2 Secuenciacin
Las cepas HTE801 a la HTE806, HTE808 a la HTE811 y HTE813 a la HTE816 se
enviaron a secuenciar al laboratorio de biodiversisdad del CINVESTAV, Irapuato y en la
figura 19 se muestra un electroferograma de una de las secuencias. Se observa la secuencia
47
de la cepa HTE808, la cual no presenta indeterminaciones, por que fueron editadas en el

laboratorio de biodiversidad. Las secuencias obtenidas variaron en su longitud, la ms
pequea correspondiente a la cepa HTE805 con 397 pb y la de mayor longitud con 569 pb
perteneciente a la cepa HTE816.
Figura 19. Imagen del electroferograma de la secuencia de la cepa HTE808.
o 7.3.3 Identificacin a nivel de especie

Una vez obtenidas las secuencias estas fueron alineadas con las secuencias almacenadas
en la base de datos de TrichOkey, la cual slo nos ayud a identificar a nivel especie 11 de
la 16 cepas. Las cepas HTE801, HTE804, HTE805, HTE810 y HTE814 slo fueron
identifica como Trichoderma sin especficar especie. En estos casos se recurri a los datos
del GenBank de la NBCI, donde se obtuvo la identificacin a nivel especie, en base al
mejor hit y al porcentaje de identidad. Estos datos se pueden ver en el Cuadro 2
48
Se empleando el programa MEGAlin del ADNstar para realizar el dendrograma de

distancia de las secuencias, el cual muestra la formacin de 2 grupos, de acuerdo al tipo de
especie (Figura 20). En el grupo A esta T. koningiopsis, el grupo B se subdivide a su vez en
2 subgrupos: el B1 en donde se encuentra T. virens y el B2 el cual contiene todas las cepas
pertenecientes a T. harzianum. Como se puede observar en el rbol filogentico las 14
cepas de T. harzianum son diferentes entre ellas, encontrando un grupo muy estrecho con
las cepas HE807, HTE810, HTE811 y HTE812 de T. harzianum los cuales fueron
obtenidos de cultivo de sorgo en condiciones de riego.
Se puede determinar con este rbol que las cepas obtenidas de una misma muestra, no
son iguales a excepcin de las cepas HTE811 y HTE812 de T. harzianum (Figura 15)
donde se observa que las secuencias son iguales, sin embargo morfolgicamente se
detectaron diferencias fenotpicas, por lo que fueron separadas. Para otras cepas aisladas de
la misma muestra de suelo, como son la T. virens (HTE809) - T. harzianum (HTE810),
HTE806-HTE807 ambas de T. harzianum y HTE802-HTE803 de T. harzianum, en base al
anlisis se muestran separadas y distantes entre si, las cepas HTE804 y HTE805
pertenecientes a T. harzianum son cercanas entre si.
B2
B
A
B1
Figura 20. Dendrograma de las 16 cepas de Trichoderma spp.
49
Cuadro 2. Identificacin a nivel especie de las 16 cepas de Trichoderma spp.

Cepa
Longitud
secuencia
% Identidad
% Cobertura
Longitud
identidad
Programa
HTE801
481
T. harzianum
96
100
450/466
GenBank
HTE802
569
T. harzianum
TrichOkey
HTE803
555
T. harzianum
TrichOkey
HTE804
429
T. harzianum
99
100
412/416
GenBank
HTE805
397
T. harzianum
98
99
390/394
GenBank
HTE806
553
T. harzianum
TrichOkey
HTE807
541
T. harzianum
TrichOkey
HTE808
550
T. koningiopsis
TrichOkey
HTE809
570
T. virens
TrichOkey
HTE810
534
T. harzianum
100
HTE811
556
T. harzianum
TrichOkey
HTE812
540
T. harzianum
TrichOkey
HTE813
556
T. harzianum
TrichOkey
HTE814
549
T. harzianum
98
HTE815
549
T. harzianum
TrichOkey
HTE816
569
T. harzianum
TrichOkey
Especie
99
97
534/534
540/551
GenBank
GenBank
7.4 Caracterizacin agronmica

o 7.4.1 Pruebas de antagonismo
Los resultados de la confrontacin de Trichoderma spp contra los hongos fitopatgenos
M. phaseolina y A. parasiticus en cajas petri con PDA, se analizaron mediante la
evaluacin de cintica de crecimiento y caractersticas macroscpicas.
50
o 7.4.1.1 Cintica de crecimiento

Las cepas de Trichoderma spp que presentaron mayor tasa de crecimiento lineal (8.3
mm/da) son HTE801, HTE803, HTE804, HTE807 y HTE808. Esta ltima pertenece a T.
koningiopsis, mientras que las dems cepas a T. harzianum. En cuanto a las cepas de los
fitopatgenos, tuvieron una tasa de crecimiento baja de 4.7 y 2.2 mm/da para M.
phaseolina y A. parasiticus respectivamente. En los apndice 1, 2 y 4 se muestran los
promedios de la tasa de crecimiento de las 16 cepas de Trichoderma spp, cuando est solo y
en presencia de los fitopatgenos; y en los apndice 3 y 5 se presentan los promedios de la
tasa de crecimiento de los fitopatgenos.
7.4.1.1.1 Caso Trichoderma spp.
En general las 16 cepas de Trichoderma spp cubrieron en su totalidad la caja petri
(90x15mm) con PDA entre las 108 y 120 h despus de la inoculacin. El crecimiento de
Trichoderma spp fue afectado cuando se encontraba frente a los fitopatgenos. En la figura
21 se muestran la cintica de crecimiento de Trichoderma spp cuando est solo y cuando se
encontraba frente a M. phaseolina. En la figura 22 se muestra la cintica de crecimiento de
Trichoderma spp cuando estaba solo y en presencia de A. parasiticus. Con los dos
fitopatgenos se observaron 2 fenmenos: aceleracion o inhibicion de crecimiento.
1.-Se observ una aceleracin en la velocidad de crecimiento en las cepas HTE806,
HTE807, HTE812 y HTE813 de T. harzianum, cuando se desarrollaban en la presencia
de M. phaseolina. Esta aceleracin est expresado como Porcentaje de Aceleracin del
Crecimiento Radial de Trichoderma (PACRT), obteniendo valores que van de 2.4 al
9.9% de aceleracin frente a M. phaseolina (ver apndice 2).
Cuando las cepas de Trichoderma sp se desarrollaron ante la presencia de A.
parasiticus, tambin se observ una aceleracin en el crecimiento con valores de
PACRT que van de un 2.9% hasta un 21%. En las cepas HTE802, HTE812, HTE816 de
T. harzianum y la HTE809 de T. virens (ver apndice 4).
51
2.-Otros fenmeno observado es la disminucin en la velocidad de crecimiento,

presente en 10 de las 16 cepas de Trichoderma sp (Las cepas HTE801 a la HTE805, la
HTE810, la HTE815 y HTE816 de T. harzianum, la HTE808 de T. koningiopsis y la
HTE809 de la T. virens) cuando se desarrollan en la presencia de M. phaseolina. Esta
disminucin esta expresada como Porcentaje de Inhibicin de Crecimiento Radial
(PICR), valores que van en un rango del 2.4 hasta el 43%, siendo la HTE801 el de
menor porcentaje mientras la mayor fue la HTE810 (ver apndice 2).
En la presencia de A. parasiticus, se observ una disminucin en el crecimiento en
las cepas HTE801, de la HTE803 a la HTE807, HTE810, HTE811 y de la HTE813 a la
HTE815 de T. harzianum y la cepa HTE808 de T. koningiopsis, en las cuales se
obtuvieron valores de PICR del 2.4 al 26.8%, siendo el de menor porcentaje la cepa
HTE813 y la de mayor inhibicin fue la cepa HTE804 (ver apndice 4).
A pesar de este decremento observado en el crecimiento de las cepas de
Trichoderma spp cuando se encuentra frente a los fitopatgenos, se observ que no
impide que las cepas de Trichoderma sp esporule sobre ambos fitopatgenos 10 das
despus de haber iniciado la confrontacin.
Cuando las cepas HTE811 y HTE814 de T. harzianum se desarrollan ante M.
phaseolina, este no se ve afecado, segn los valores PICR y PACRT (ver apndice 2).
Al realizar un analisis estadistico a las 72 h de crecimiento de las 16 cepas de
Trichoderma spp y cuando estas se desarrollan ante la presencia de los patogenos. Se
observo que, significativamente solo en la cepa HTE810 existe una reduccion en el
crecimiento cuando esta frente a M. phaseolina (ver apndice 9). Cuando Trichoderma spp
se desarrolla ante A. parasiticus, su crecimiento disminuye significativamente, en las cepas
HTE804, HTE807 y HTE810 de T. harzianum (ver apndice 11).
Una aceleracion significativa del crecimiento de Trichoderma spp se observo en las
cepas HTE802 de T. hharzianum y en la HTE809 de T. virens cuando se desarrollan ante A.
parasiticus (ver apndice 11)
52
Figura 21. Cintica de crecimiento de Trichoderma.
53
Figura 22. Cintica de crecimiento de Trichoderma.
54
7.4.1.1.2 Caso M. phaseolina.

En cuanto al crecimiento de M. phaseolina, se observ que por la presencia de
Trichoderma spp el PICR vari desde 1.8 al 21.6 % (ver apndice 3), siendo el de mayor
porcentaje con la cepa HTE811 y el menor con la cepa HET812, ambos de la especie de T.
harzianum. El anlisis estadstico realizado a las cinticas de M. phaseolina en
confrontacin con todas las cepas de Trichoderma spp indica que a las 72 h, la cepa
HTE811 es la de menor crecimiento radial, mientras que frente a la HTE801 es la de mayor
velocidad de crecimiento (ver ver apndice 6).
Sin embargo al igual que con Trichoderma spp, M. phaseolina es afectado por la
presencia de este, no solo inhibiendo su crecimiento, si no que tambin tienen un marcado
incremento en la velocidad de crecimiento (Figura 23), observado en las cepas HTE801,
HTE803, HTE810, HTE813 y HTE815, de T. harzianum, por lo que se obtuvo un valor
negativo en el PICR (ver apndice 3).
El anlisis estadstico practicado a las cinticas de crecimiento de M. phaseolina a las
72 h de crecimiento, mostr que frente a la cepa HTE801 de T. harzianum es afectado
acelerando su crecimiento, siendo significativo (Tukey P< 0.05) con respecto al testigo que
es el crecimiento de M. phaseolina sin la presencia de Trichoderma sp (ver apndice 7).
7.4.1.1.3 Caso A. parasiticus.
Con respecto al PICR de A. parasiticus se observ que este vari desde 3.9 al 11.8% en
presencia de las diferentes cepas de Trichoderma spp. Siendo mayor el porcentaje con las
cepas HTE802, HTE810 y HTE812, de T. harzianum, mientras que el de menor PICR es la
cepa HET815 de T. harzianum (ver apndice 5).
Al igual que con M. phaseolina, en A. parasiticus se obtuvieron valores de PICR
negativos (ver apndice 5), como en las cepas HTE809 de T. virens, y HTE806 y HTE814
de T. harzianum, que estimulan la velocidad de crecimiento de A. parasiticus. Sin embargo,
el anlisis estadstico individual (entre la cepa de A. parasiticus en confrontacin con las
cepas de Trichoderma spp y la de crecimiento solo, testigo), muestra que a las 24 h, 9 cepas
55
(HTE806, HTE808-HTE813, HTE815 y HTE816) tienen un crecimiento mayor al testigo,

sin embargo posterior a las 24 horas en adelante la velocidad de crecimiento es similar
entre las cepas a excepcin de la HTE812 que tiene significativamente una mayor
velocidad de crecimiento. Esto es demostrado estadsticamente (Tukey P>0.05) ver
apndice 10.
56
Figura 23. Cintica de crecimiento de M. phaseolina.
57
Figura 24. Cintica de crecimiento de A. parasiticus.
58
o 7.4.1.2 Interacciones fngicas.

Se logr observar cuatro fenmenos que ejerce Trichoderma spp contra los dos
fitopatgenos que fueron evaluados en este trabajo. Estos fenmenos corresponden a los
mecanismos de accin del antagonismo y al efecto que tiene en el desarrollo de estos.
Como se ha descrito en las secciones anteriores, Trichoderma spp puede influir en la
aceleracin o disminucin del crecimiento de las colonias de los hongos M. phaseolina y A.
parasiticus cuando estan en confrontacin. Los fenmenos del antagonismo han sido
descritos en varios hongos, sin embargo, no se tiene reportes de la aceleracin del
crecimiento de las colonias de los hongos con los que esta en confrontacin. Este es un
fenmeno que se describe por primera vez aqu.
Los fenmenos de antagonismo son:
A) Competencia: por espacio, en donde todas las cepas de Trichoderma spp son
capaces de detener el crecimiento tanto de M. phaseolina y de A. parasiticus al no
permitir que se sigan desarrollando.
B) Antibiosis: Donde Trichoderma spp puede secreta metabolitos al medio de cultivo,
los que al entrar en contacto detienen el crecimiento de los fitopatgenos. Otras
sustancias, como los voltiles inhiben el crecimiento como es el caso de A.
parasiticus frente a la cepa HTE803.
C) Hiperparasitismo: Donde Trichoderma spp es capaz de crecer sobre la colonia del
patgeno, siendo esta una manifestacin visible de tal evento. A nivel microscpico
hay un parasitismo de Trichoderma spp sobre las hifas del hongo patgeno
provocando estrangulacin y degradacin del contenido celular.
D) El cuarto fenmeno que se observ es que Trichoderma spp puede estimular el
crecimiento del patgeno, como se presento en M. phaseolina cuando se encontraba
frente a la cepa HTE801 de T. harzianum.
En cuanto al fenmeno de competencia fue observado en todas las cepas confrontados
contra ambos patgeno. Aun aunque algunas cepas de Tricoderma sp, estimularan el
crecimiento del patgeno; al entrar en contacto las dos colonias fungicas, la colonia del
patgeno ya no creci ms. En la figura 25 se puede observar un tipo de barrera que limita
59
el crecimiento del patgeno, a la derecha con A. parasiticus y a la izquierda con M.
phaseolina donde adems se observa una zona de cero crecimiento.
Figura 25. Confrontacin de Trichoderma spp en a) M. phaseolina y b) A. parasiticus. Las fechas

indican la barrera que limita el crecimiento del patgeno.
Con respecto al fenmeno de antibiosis fue observado en las cepas HTE807, HTE810,
HTE815 y HTE809 (las primeras tres pertenecen a la especie de T. harzianum y la ltima a
T. virens) cuando est frente a M. phaseolina. En el caso de A. parasiticus lo muestran las

cepas HTE806, HTE811 y HTE813 a la HTE815, todas pertenecientes a T. harzianum.
Como se puede observar en la figura 26 con M. phaseolina (a) y con A. parasiticus (b) se
forma una zona libre de esporulacin de ambos hongos, inhibiendo as el crecimiento del
patgeno. En este punto, el medio de cultivo en algunos casos cambia de pigmentacin
tpico del PDA por un color amarillento.
60
Figura 26. Antibiosis de Trichoderma spp en contra a) M. phaseolina y b) A. parasiticus, caracterizado

por una banda sin crecimiento micelial y en ocasiones con cambios de color en el medio de cultivo. Se
enmarca la zona libre de esporulacin.
El fenmeno a nivel macroscpico del hiperparasitismo contra M. phaseolina fue

observado en las cepas HTE807, HTE808 y HTE809, de la especie T. harzianum, T.
koningiopsis y T. virens respectivamente. En el caso de A. parasiticus, solamente se

observ con la cepa HTE808 de T. koningiopsis.
Como se observa en la figura 27, la cepa HTE807 de T. harzianum es capaz de crecer
sobre M. phaseolina cubrindola totalmente. En la figura 28 se observa la presencia de la
cepa HTE808 de T. koningiopsis en el punto de inoculacin de A. parasiticus.
61
Figura 27. Hiperparasitismo que presenta T. harzianum en M. phaseolina.
Figura 28. Hiperparasitismo que presenta T. koningiopsis en A. parasiticus. Foto de la izqierda muestra
acercamiento en el punto de inoculoacion.
Las cepas de Trichoderma spp tuvieron contacto con M. phaseolina, en diferentes

tiempos que quedan comprendidos entre 72 y 96 h post inoculacin del medio. El anlisis
de varianza realizado entre tiempo de contacto y cepas, indic diferencia altamente
significativa entre tratamientos, al comparar las medias de las 16 cepas de Trichoderma spp
62
frente a M. phaseolina, esta presento 7 grupos. La cepa que logr el contacto en menor
tiempo fue la cepa HTE804 de T. harzianum a las 72 h, mientras que con la cepa HTE809
de T. virens el tiempo de contacto fue hasta las 96 h (ver apndice 8).
Las cepas de Trichoderma spp fueron clasificadas siguiendo el mtodo descrito por Bell
et. al., (1982) de acuerdo a su nivel de antagonismo, la clase 1 es cuando Trichoderma spp.
sobrecrece completamente al patgeno y cubre totalmente la superficie del medio; en esta
clase se encuentra la cepa HTE808 de T. koningiopsis que present cubrimiento total en el
medio; en la clase 2, estn las cepas HTE801, HTE806, HTE807, HTE811 a HTE815,
todas de la especie T. harzianum, en esta clase Trichoderma spp. sobrecrece la 2/3 partes de
la superficie del medio. Las cepas HTE802 a HTE805, HTE810, HTE816 y HTE809,
corresponden a la clase 3, de ellas, solo esta ltima pertenece a T. virens y el resto de T.
harzianum, aqu tanto Trichoderma spp y el patgeno colonizan cada uno
aproximadamente la mitad de la superficie y ningn organismo parece dominar al otro; no
hubo cepas incluidas en las clases 4 y 5, en el primero el patgeno coloniza 2/3 partes del
medio y el segundo el patgeno sobrecrece completamente a Trichoderma spp y ocupa la
superficie total del medio. Esto indica que las 16 cepas de Trichoderma spp son candidatos
a ser utilizados como aente de control biologico contra M. phaseolina y A. parasiticus; ya
ninguno de estos es limitado en su crecimiento por estos fitpatogenos.
El cuarto fenmeno observado, cuando M. phaseolina est frente a las cepas HTE801,
HTE803 y HTE815 de T. harzianum, es la aceleracin del crecimiento, como se puede
observar en la figura 26, especifcamente la cepa HTE801, tiene un incremento
estadsticamente significativo (ver apndice 7).
o 7.4.2 Evaluacin de promocin de crecimiento vegetal.
Al tratar las 75 semillas de maz hibrido 30P49 con la suspensin de esporas de las 16
cepas de Trichoderma spp, se observ a las 72 h el 100% de germinacin de las semillas y
un 97.3% en las semillas no tratadas. Por lo tanto, la presencia de Trichoderma spp mejora
este proceso.
63
Recordando este experimento se realiz en dos secciones, en la primera donde se

incluan las cepas con nomenclatura non, excluyendo la cepa HTE807, la cual se trabajo en
la segunda seccin, junto con los pares. Cada seccin adems de los tratamientos llev un
testigo, donde las semillas no fueron tratadas con suspensin de esporas. En cada caso las
semillas se mantuvieron en imbibicin en el agua por 3 das, tiempo que tarda en germinar.
Posteriormente, las semillas fueron sembradas en las charolas y se regaron de acuerdo a sus
necesidades hasta la toma de muestras.
o 7.4.2.1 Altura de la planta.
Se realizarn dos tomas de muestras de las plantas que fueron tratadas con las 16 cepas
de Trichoderma spp, la primera 15 das despus de tratamiento (ddt) y la segunda a los 30
ddt.
A) Altura de la planta 15 ddt.
En la figura 29A se muestran las graficas de las mediciones de altura obtenidas a los 15
das, se observa que las plantas tratadas con las cepas HTE805 y HTE813 de T. harzianum,
son mayor que el testigo, sin embargo el anlisis estadstico con la prueba de Tukey
(P>0.05) muestra que solo el tratado con la cepa HTE813 es significativamente mejor que
el testigo (ver apndice 13).
En la figura 29B se puede observar que los tratamientos con las cepas HTE806,
HTE810 y HTE812 de T. harzianum, se ven ligeramente mayor que el testigo, pero el
anlisis estadstico de los datos con prueba de Tukey (P>0.05) muestra que solo la cepa
HTE810 tiene significativamente una mayor altura. (ver apndice 12).
64
A
bc*
B
d
cd
ab
bc
cd
bc
bc
abc abc ab
abc
ab
abc abc
Figura 29. Estimulacin de crecimiento de la planta de maz (Pioneer 30P49) con las diferentes cepas
de Trichoderma spp a los 15 das despus de su tratamiento. A) Los tratamientos con cepas codificadas en
nmero non y B) Los tratamientos con cepas codificadas en nmero par.
*= Medias con la misma letra indican que no hay diferencias estadsticas significativas (P>0.05).
B) Altura de planta 30 ddt.

La mitad de plantas de la charola experimental, fue evaluada a los 30 ddt y como se
puede observar en la figura 30, algunas cepas de Trichoderma spp son capaces de promover
el crecimiento y alcanzar alturas mayores que el testigo, de las cuales, solo la planta tratada
con la HE807 de T, harzianum son significativamente ms altas que todos los dems
tratamientos. Las plantas tratadas con la cepa HTE804 de T. harzianum, tienen la menor
altura de la planta, lo cual es respaldado por la prueba de Tukey (P>0.05) los cuales se
presentan en los apndices 9 y 10.
65
A
a*
B
b
cd
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
Figura 30. Estimulacin de crecimiento de la planta de maz (Pioneer 30P49) con las diferentes cepas
de Trichoderma spp a los 30 das despus de su plantacin. A) Los tratamientos con cepas codificadas en
o 7.4.2.2 Biomasa de la planta.

Con la finalidad de evaluar la promocin de crecimiento, en la ganancia de peso de las
plantas que puede ser inducido por la presencia de las diferentes cepas de Trichoderma spp,
se evalo la ganancia de biomasa, por lo que se obtuvo el peso seco de follaje, peso seco de
raz y peso seco total de la planta. A continuacin se analiza cada uno por separado.
7.4.2.2.1 Peso seco del Follaje de la planta.
A) Peso seco del follaje a 15 ddt.
En la figura 31 estn las graficas correspondientes al peso seco del follaje a los 15 ddt.
En la seccin de los nones se distingue que los tratamientos HTE805 y HTE813 que
corresponden a T. harzianum, tienen mayor ganancia de peso seco que el testigo. Al
realizar los anlisis estadsticos con la prueba de Tukey (P>0.05) se muestra la existencia
de diferencias significativas (ver apndice 13).
66
ab
Con respecto a la seccin de las cepas pares se distingue que los tratamientos HTE806,
HTE810 y HTE812, de la especie de T. harzianum, son ligeramente mayor que el testigo
sin embargo, estadsticamente no es suficiente para considerarlas diferentes (ver apndice
12).
A
bc*
B
c
bc
ab
a
Figura 31. Peso seco de follaje de la planta de maz (Pioneer 30P49) con las diferentes cepas de
Trichoderma spp a los 15 das despus de su tratamiento. A) Los tratamientos con cepas codificadas en
nmero non y bB) Los tratamientos con cepas codificadas en nmero par.
B) Peso seco del follaje a 30 ddt

En la figura 32 se muestra el peso seco del follaje a los 30 ddt, en donde se puede
observar que todos los valores de las medias, son inferiores al peso seco del follaje en el
testigo. Estadsticamente, con prueba de Tukey (P>0.05) muestra que el testigo es contiene
ms biomasa que las plantas tratadas con HTE803 de T. harzianum. Con respecto a las
dems plantas tratadas aunque se observa valores promedios variables, esto no es suficiente
para separarlos estadsticamente (ver apndice 13).
En la segunda seccin (Figura 32B), la de las cepas pares, la HTE807, es la que ms
biomasa produce, mientras la HTE804 es la de menor peso seco, es decir la de menor
67
ganancia y desarrollo, ambas cepas corresponden a T. harzianum. La pueba de Tukey

(P>0.05) muestra que la diferencia estadstica es significativa. Mientras que el resto de las
cepas son estadsticamente iguales (ver apndice 12).
A
a*
B
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
ab
Figura 32. Peso seco de follaje de la planta de maz (Pioneer30P49) con las diferentes cepas de
Trichoderma spp a los 30 das despus de su plantacin. A) Los tratamientos con cepas codificadas en
7.4.2.2.2 Peso seco de la raz de la planta.

A) Peso seco de la raiz a 15 ddt.
En cuanto al peso seco de la raz a los 15 ddt se obtuvieron resultados significativos en
la seccin de los nones, donde la diferencia entre pesos seco de raz es de casi 100 mg con
la cepa HTE805 de T. harzianum, y los dems tratamientos, esto se puede observar en la
figura 33A.
En la seccin de los pares (Figura 33B) se tiene que el tratamiento de la planta de maz
con la cepa HTE810, de la especie de T. harzianum es significativamente (Tukey P>0.05)
68
diferente al testigo y a la cepa HTE804, que tienen el menor peso seco de raz. Todas las
dems son iguales entre s (ver apndice 12.
A
b*
B
b
ab
ab
ab
ab
ab
ab
Figura 33. Peso seco de raz de la planta de maz (Pioneer 30P49) con las diferentes cepas de
B) Peso seco de la raz a 30 ddt.

Con respecto a la medicin del peso seco de la raz de la planta realizada a los 30 ddt, se
detectaron diferencias significativas (Tukey P>0.05) entre la HTE813 que presenta mayor
ganancia de peso seco, con respecto a la cepa HTE803 (Figura 34A), ambas de T.
harzianum. Todas las dems cepas son estadsticamente iguales (ver apndice 13).
En el caso del segundo lote experimental, aunque se detecten diferencias en los
promedios de peso seco, la prueba estadstica por Tukey (P>0.05) no muestra diferencia
significativas, como se puede observar en la figura 34B (ver apndice 12).
69
A
ab*
B
ab
ab
ab
ab
ab
a
Figura 34. Peso seco de raz de la planta de maz (Pioneer 30P49) con las diferentes cepas de
7.4.2.2.3 Peso seco total de la planta.

A) Peso seco de la planta a 15 ddt.
Al analizar la produccin de biomasa en forma global, es decir sumando los pesos secos
de raz y del follaje, en la figura 35A se observa, que los promedios entre lotes tratados
tienen diferencias significativas. La prueba de Tukey (P>0.05) muestra que la cepa
HTE805 de T. harzianum es significativamente mayor que el testigo (ver apndice 13).
En cuanto a la seccin de los pares, la cepa HTE810 de T. harzianum, muestra
diferencias significativa (Tukey P>0.05) con respecto al testigo, como se ve en la figura
35B. Mientras que la cepa HTE804 de T. harzianum es la significativamente la que produce
menor biomasa en la planta de maz (ver apndice 12).
70
A
b*
B
b
ab
ab ab
ab
ab
bc
ab
Figura 35. Peso seco total de la planta de maz (Pioneer 30P49) con las diferentes cepas de
B) Peso seco de la planta a 30 ddt.

Si bien a los 15 ddt se obtuvo dos tratamientos en la seccin de los nones, en los cuales
el peso seco de la planta es significativamente mejor que el testigo. Cuando se analizan los
datos a los 30 ddt, los tratamientos son estadsticamente iguales al testigo (Tukey P>0.05)
como se observa en la figura 36A. Mas sin embargo, en la seccin de los pares (Figura
36B) se observa diferencia significativa entre la cepa HTE807 y la HTE812 ambos
pertenecientes a la especie de T. harzianum lo cual significa que aun que correspondan a la
misma especie se pueden obtener resultados diferentes. Siendo la HET812 estadsticamente
la de menor produccin de biomasa en la planta, mientras que entre los dems tratamientos
no existen diferencias significativas, que quiere decir que el efecto observado a los 15 ddt
donde la de mejor ganancia en biomasa, es la HTE810 de T. harzianum siendo
significativamente mayor al testigo (ver apndice 12 y 13), deja de manifestarse a los 30
ddt.
71
A
a*
B
a
ab
ab
ab
ab
ab
ab
Figura 36. Peso seco total de la planta de maz (Pioneer 30P49) con las diferentes cepas de
o 7.4.3 Deteccin de promotores de crecimiento por HPLC.

En este captulo de la tesis se trat de detectar algunos metabolitos relacionados con la
promocin de crecimiento vegetal, especficamente a triptfano (TRP), cido Giberlico
(AG), cido Antranlico (AA), cido Indol butrico (AIB), Kinetina (KIN) y cido Indol
Actico (AIA). Se buscaron estos metabolitos por ser los principales utilizados en el
campo, para la estimulacin de crecimiento en los cultivos, el de mayor aplicacin es el
AIA; los otros compuestos (KIN, AG, AIB y AA) se encuentran presentes en la mayora de
los fertilizantes. La deteccin del triptfano se realiza de acuerdo con los antecedentes
mencionados en el captulo correspondiente, ya que se reporta como una substancia que
est involucrada en la sntesis del AIA y AA.
72
o 7.4.3.1 Sustancias promotoras de crecimiento vegetal producidos por Trichoderma

sp en medio de cultivo.
Los cromatogramas del HPLC que fueron obtenidos, muestran curvas o picos segn los
metabolitos detectados en las muestras. As, en la figura 37 se muestra el cromatograma
obtenido en el HPLC, donde se observan 6 picos, mismos que corresponden a los
estndares de triptfano, cido Giberlico, cido Antranlico, acido Indol butrico, kinetina
y cido Indol Actico. En la figura, el primer pico identificado corresponde al TRP con un
tiempo de retencin de 1.84 minutos (min). Se sigue la KIN con un tiempo de retencin de
1.94 min, seguido por el AG3 con 2.19 min, AA con 3.12 min, despus el AIA con 3.72
min y el AIB con 7.33 min.
Figura 37. Cromatograma mostrando los estndares de los promotores de crecimiento vegetal que fueron
evaluadas en este trabajo.
En la figura 38 se muestra el cromatograma que le fue practicado al medio de cultivo

LB despus de ser esterilizado y antes de inocularse. Se considera de relevancia el
mostrarlo, ya que en este medio fueron cultivadas todas las cepas de Trichoderma spp de
73
este trabajo y como veremos mas adelante, se observan modificaciones a la composicin

del mismo debidas al crecimiento del hongo.
Figura 38. Cromatograma del medio de cultivo LB sin inocular, donde se observa la presencia de TRP
en su composicin.
Una vez conocidos y estandarizados los picos en los cuales se detectan las substancias
promotoras de crecimiento vegetal, se someti a evaluacin una muestra de caldo LB que
fue inoculada con la cepa HTE813 de T. harzianum. En ella se observa que para las 72 h el
TRP, el AG, el AA y al AIA (Figura 39) son detectados en diferentes cantidades. Es
importante mencionar que se detecta por primera vez el AIA, ya que anteriormente ningn
artculo menciona que el Trichoderma spp sea capaz metabolizar TRP y transformarlo en
AIA.
74
Figura 39. Cromatograma de los promotores de crecimiento vegetal de la cepa HTE813 de Trichoderma
harzianum en medio LB.
En la cuadro 3 se relacionan todos los metabolitos evaluados y las concentraciones en

que fueron detectados a las 72 h despus de haber inoculado el medio de cultivo con cada
una de las cepas de Trichoderma spp. De lo ms remarcable en esta relacin, es que en la
cepa HTE802 el TRP fue metabolizado completamente. Que ninguna de las cepas es capaz
de producir AIB usando el TRP como fuente carbono. De los otros metabolitos evaluados,
solo la Kinetina fue detectada en una alta concentracin en la cepa HTE802 y es la nica
cepa que aparentemente la metaboliza.
Por otra parte, en las cepas HTE808 de T. koningiopsis y HTE813 de T. harzianum se
detect un ligero incremento en la concentracin de TRP, ya que en el medio de cultivo la
concentracin es de 130.9, mientras que los valores para las cepas son 139.4 y 138.3 ppm
respectivamente. La cepa HTE807 de T. harzianum aparentemente no tiene capacidad para
metabolizar TRP, ya que la concentracin de este metabolito en el medio de cultivo no se
modific despus de 72 horas de crecimiento del hongo en el medio de cultivo y si hubo
produccin de biomasa.
Por su parte, el cido Giberlico (AG3) fue detectado en concentraciones de 350.8 y
440.6 ppm respectivamente a las cepas HTE801 y HTE805 de T. harzianum. En otras 8
75
cepas (HTE802, HTE804, HTE807, HTE810, HTE813, HTE814, HTE808 y HTE809) de

este metabolito solo se detectaron concentraciones bajas que no alcanzan a cuantificarse y
se mencionan como trazas. Con estos resultados, aparentemente el AG no se limita a una
especie, puesto que las cepas mencionadas anteriormente corresponden a T. harzianum, T.
koningiopsis y T. virens respectivamente.
Como se puede observar en el cuadro 3 se detect ABA en 11 cepas, mientras que AIA
se observ en 8 cepas. Finalmente, en ninguna cepa se detecto el AIB.
En general se observ que Trichoderma spp puede metabolizar el TRP en AA y AIA; y
la KIN, AG y AIB.
Cuadro. 3. Deteccin de metabolitos en medio de cultivo lquido.

TRP
KINETINA
AG3
AA
AIA
ppm
HTE801
104.78
ND
350.85
TRAZAS
TRAZAS
HTE802
ND
1938.58
TRAZAS
TRAZAS
ND
HTE803
103.88
ND
ND
TRAZAS
TRAZAS
HTE804
104.37
ND
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
HTE805
133.82
ND
440.68
TRAZAS
TRAZAS
HTE806
97.86
ND
ND
TRAZAS
TRAZAS
HTE807
130.92
ND
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
HTE808
139.46
ND
TRAZAS
TRAZAS
ND
HTE809
77.40
ND
TRAZAS
TRAZAS
ND
HTE810
121.76
ND
TRAZAS
ND
ND
HTE811
88.10
ND
ND
ND
ND
HTE812
90.73
ND
ND
TRAZAS
ND
HTE813
138.35
ND
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
HTE814
107.41
ND
TRAZAS
ND
TRAZAS
HTE815
67.37
ND
ND
ND
ND
HTE816
99.45
ND
ND
ND
ND
LB
130.95
ND
ND
ND
ND
ND: No Detectado
Trazas: Se detecta su presencia pero en niveles muy bajos que no alcanza a cuantificarse
AIB
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
76
o 7.4.3.2 Sustancias promotoras de crecimiento vegetal detectados durante la

Interaccin de Trichoderma spp con semillas de maz (Zea mays).
En esta seccin, se muestran los resultados de la presencia y comportamiento de estos
metabolitos cuando Trichoderma spp esta interactuando durante el proceso de germinacin
con la semilla de maz. Los anlisis se realizarn a las 24, 48 y 72 h. despus tratamiento.
Estos estudios se realizarn a partir de que Trichoderma spp es capaz de metabolizar el
TRP y sintetizar a partir de l otros metabolitos, tal como se consigna en la seccin anterior
de este captulo.
Se muestra un cromatograma de los estndares utilizados para la deteccin de TRP,
KIN, AG, AA, AIA, y AIB (figura 40). Para el AG, en esta ocasin se detectaron 3 picos,
los cuales se nombraron segn el nmero de pico AG1, AG2 y AG3. Coincidiendo el
tiempo de retencin del AG3 con el AG3 detectado en medio de cultivo lquido.
Figura 40. Cromatograma mostrando los estndares de los promotores de crecimiento vegetal que fueron
evaluadas en la interaccin de Trichoderma spp con la semilla de maz en el proceso de germinacin.
77
A continuacin se redactan los resultados obtenidos del anlisis de cada uno de los
metabolitos y su cintica durante las 72 horas, tiempo de seguimiento del trabajo para este
caso.
En el cuadro 4 se observa que la semilla de maz 30P49 de Pionner produce pequeas
cantidades de TRP durante las primeras 72 horas del proceso de imbibicin. En el caso del
TRP se observan tres comportamientos, uno que es el caso del testigo y de la cepa HTE815,
de la especie de T. harzianum, en donde la cantidad de TRP van decreciendo; otro
comportamiento es que la cantidad de TRP decrece a las 48 h, y a las 72 h la cantidad de
TRP supera la detectada a las 24h presente en 6 cepas (HTE801, HTE802, HTE808,
HTE809, HTE812, HTE814) y las 9 cepas restantes mostraron un aumento gradual de la
cantidad detectada de TRP. A excepcin de la cepa HTE815, se observa que las cepas de
Trichoderma spp son capaces de liberar TRP de la semilla de maz, ya que la cantidad de
este metabolito detectado a las 72 h es mayor a la encontrada en el testigo.
En el mismo cuadro 4, en este caso con respecto a KIN, se detectan trazas al igual que
el testigo, en 6 de las cepas y en las otras no se produce el metabolito en el tiempo en que
se realizarn los anlisis. En HTE801 a las 48 horas, se detecta KIN en una cantidad mayor
(219 ppm), mientras que en las dems est ausente. Con respecto al muestreo realizado para
las 72 h, las cepas HTE807, HTE810, HTE811, HTE808 y HTE809, las tres primeras
pertenecientes a la especie de T. harzianum, las dos siguiente a T. koningiopsis y T, virens
respectivamente, detectaron cantidades que van de 3.16 a 10.14 ppm; las 11 cepas restantes
y el testigo detectaron mnimas cantidades de KIN a las 72 horas post inoculacin. Por lo
que se puede deducir que Trichoderma spp metaboliza KIN, encontrndose 5 cepas con
mayor producion.
78
Cuadro 4. Deteccin de TRP y KIN en interaccin entre las cepas de Trichoderma spp
con la semilla de maz.
24
TRP
48
72
2.18
2.63
2.42
1.51
2.05
2.12
1.64
2.39
2.26
2.15
1.80
2.10
1.69
3.10
2.01
1.03
2.85
ND
1.36
2.74
1.71
2.16
2.98
1.78
2.19
2.07
2.26
2.22
1.89
1.90
2.58
1.90
1.85
2.87
2.66
3.41
3.30
3.01
3.27
4.84
2.19
2.75
2.32
2.83
2.85
2.45
3.16
3.36
1.83
2.54
1.91
24
KIN
48
72
ND
ND
ND
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
ND
TRAZAS
219.17
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
10.14
3.16
7.69
5.32
9.69
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
ppm
HTE801
HTE802
HTE803
HTE804
HTE805
HTE806
HTE807
HTE808
HTE809
HTE810
HTE811
HTE812
HTE813
HTE814
HTE815
HTE816
Testigo
ND: No Detectado
Trazas: Se detecta su presencia pero en niveles muy bajos que no alcanza a cuantificarse
En la cuadro 5 se describen los resultados de Acido giberlico cuando Trichoderma spp

esta interactuando con la semillas de maz, mismos que fueron obtenidos durante las
corridas de HPLC. En este cuadro se puede apreciar que el AG1 es detectado en cantidad
en los tres tiempos, a excepcin en las 48 h en la cepa HTE801, de la especie de T.
harzianum. En el testigo se tiene un decremento gradual de la concentracin del AG1. Las
cepas HTE802, HTE803, HTE807, HTE10, HTE812, pertenecientes a T. harzianum, as
como la cepa HTE808 y HTE809, de T. koningiopsis y T. virens respectivamente, presentan
una degradacin marcada de las 24 a las 48 h y esta degradacin es menor para las 72 h.
Las 9 cepas restantes de la especie de T. harzianum, tienen una degradacin importante
para las 48 h, pero a las 72 h logra sintetizar ms AG1, en cantidades por debajo de la que
haba a las 24h.
79
Las cepas HTE804, HTE807, HTE811, HTE812 y HTE816 tuvieron una produccin
menor que el testigo de AG1 a las 24h, mientras que las 11 cepas restantes tuvieron una
produccin mayor. A las 48h solamente en la cepa HTE806 se detect una cantidad mayor
que al testigo y a las 72h se detect una cantidad menor al testigo el la cepa HTE807.
Trichoderma spp es capaz de producir AG1, encontrndose valor superiores al testigo a
las 24 y 72 h. Solo la cepa HTE806 es la que produce cantidades mayores al testigo en los
tres tiempos, mientras que la HTE807 es la de menor produccin.
Cuadro 5. Deteccin de Acido Giberlico en interaccin entre las cepas de

Trichoderma spp con la semilla de maz.
24
AG1
48
72
24
AG2
48
72
24
AG3
48
72
ppm
ND
5598.93
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
ND
TRAZAS
HTE801 9928.19
6564.72
ND
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
HTE802 10852.55 7252.09
11893.05
6334.23
6202.78
ND
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
HTE803
4452.85
5378.22
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
HTE804 6831.94
9277.38
5452.87
5905.20
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
3026.68
TRAZAS
HTE805
10741.63
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
HTE806 11302.71 8249.76
7004.72
4923.52
4729.78
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
HTE807
5794.03
ND
TRAZAS
ND
1877.98
TRAZAS
HTE808 13185.02 6735.67
10837.32
5809.15
5506.18
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
4263.00
44.28
HTE809
6287.70
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
HTE810 11494.02 6324.78
9158.59
6091.20
6245.19
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
HTE811
9025.80
5274.39
5180.94
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
ND
HTE812
4658.48
5769.27
ND
ND
TRAZAS
TRAZAS
ND
HTE813 9622.72
6478.00
8086.21
ND
ND
ND
TRAZAS
TRAZAS
HTE814 9925.74
9647.89
5505.10
6227.93
ND
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
HTE815
4934.63
5760.39
TRAZAS
ND
ND
TRAZAS
ND
HTE816 5125.55
9254.25
7254.62
4779.05
TRAZAS
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
Testigo
ND: No Detectado
Trazas: Se detecta su presencia pero en niveles muy bajos que no alcanza a cuantificarse.
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
36.59
81.78
52.93
60.67
TRAZAS
TRAZAS
ND
ND
TRAZAS
ND
En cuanto al AG2, no se detect a las 24 horas en las cepas HTE802, HTE803,

HTE808, HTE813, HTE814 y HTE815, mientras que en las 10 cepas restantes y el testigo
80
se detectaron trazas de este compuesto. Para las 48h siguen sin producir AG2 las cepas
HTE813 y HTE814, adems de la HTE816, en el testigo al igual que en las cepas restantes
se detectaron trazas. Ya para las 72 h no se detecta este compuesto en el testigo al igual que
en las cepas HTE803, HTE808, HTE814, HTE815 y HTE16, al resto de las cepas se les
detecta trazas de AG2.
La mayora de las cepas de Trichoderma spp probadas en este trabajo son capaces de
producir AG2, principalmente a las 48 h, siguiendo a diferencia del testigo esta produccin
a las 72 h.
A las 24 h no se detecta AG3 en la cepa HTE801, pero si en las cepas HTE805,
HTE808 y HTE809 en cantidades 3026.6, 1877.9 y 4263.0 respectivamente; en el resto de
las cepas y en el testigo solo se detectaron cantidades mnimas. En HTE808 y HTE809 a las
48 h se detectan cantidades de 1.0 y 44.2 ppm. En 9 cepas se detectan cantidades mnimas y
en las 5 cepas restantes junto con el testigo no se detect el AG3. Para las 72 h sigue sin
detectarse AG3 en el testigo junto con las cepas HTE815 y HTE816, todas las dems cepas
se detectaron trazas del compuesto excepto en 4 (HTE808, HTE809, HTE810 y HTE811)
con cantidades que van de 36.5 a los 81.7 ppm.
Se observ que Trichoderma spp produce AG3 en los tres tiempos, a diferencia del
testigo que solo produjo a las 24 h. Cuatro cepas tienen una mayor produccin de este
metabolito a las 72 h, de las cuales dos de ellas tambin presentan mayor produccin a las
24 y 48 h en comparacin a las dems cepas.
Como se puede observar en el cuadro 6, el cido antranlico (AA) es detectado en
cantidades mnimas a las 24 h de interaccin entre Trichoderma spp y la semilla de maz. A
las 48 de tratamiento, en el testigo se detectan cantidades mnimas, mientras que en
ninguna de las cepas es posible encontrarlo. Esto mismo sucede en las corridas de HPLC
que fueron practicadas en todas las cepas, en las muestras de las 72 h.
El AIB se detecto en cantidades mnimas a las 24 y 72 h en el testigo y en las cepas
HTE801 y HTE808, las cuales corresponden a la especie de T. harzianum y T.
koningiopsis, respectivamente; no fue detectado en ninguno de los tres tiempos de medicin
81
en las cepas HTE807, HTE810, HTE811, HTE814, HTE816 y HTE809, esta ltima de la
especie de T. virens y el resto a T. harzianum. Lo que puede suponer que Trichoderma spp
no es capaz de metabolizar AIB.
El AIA no fue detectado en el testigo, pero si fue detectado en cantidades mnimas en la
mayora de las interacciones entre las semillas de maz tratadas con las diferentes cepas de
Trichoderma spp. La excepcin es la cepa HTE806 de la especie de T. harzianum, a las 48
h en cantidades mnimas, siendo el nico que presenta AIA en los tres tiempos en que
fueron tomadas las muestras.
Cuadro 6. Deteccin de AIA, AIB y AA en interaccin entre las cepas de Trichoderma

spp con la semilla de maz.
24
AIA
48
72
AIB
24
48
ppm
TRAZAS ND
ND
ND
TRAZAS ND
TRAZAS ND
TRAZAS ND
TRAZAS ND
ND
ND
TRAZAS ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
TRAZAS ND
TRAZAS ND
ND
ND
TRAZAS ND
ND
ND
TRAZAS ND
AA
72
24
48
TRAZAS
ND
TRAZAS
TRAZAS TRAZAS
ND
HTE801
TRAZAS
ND
TRAZAS
TRAZAS TRAZAS
ND
HTE802
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
HTE803
ND
ND
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
HTE804
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
HTE805
TRAZAS TRAZAS TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
HTE806
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
HTE807
TRAZAS
ND
TRAZAS
TRAZAS TRAZAS
ND
HTE808
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
HTE809
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
HTE810
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
TRAZAS
ND
HTE811
TRAZAS
ND
ND
ND
TRAZAS
ND
HTE812
ND
ND
ND
ND
TRAZAS
ND
HTE813
TRAZAS
ND
ND
ND
TRAZAS
ND
HTE814
ND
ND
ND
ND
TRAZAS
ND
HTE815
ND
ND
ND
ND
TRAZAS
ND
HTE816
ND
ND
ND
TRAZAS
TRAZAS
TRAZAS
Testigo
ND: No Detectado
Trazas: Se detecta su presencia pero en niveles muy bajos que no alcanza a cuantificarse.
72
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND
82
o 7.4.3.3 Efecto de los metabolitos en la promocin de crecimiento vegetal.

Se realiz un anlisis de correlacin mltiple, entre los metabolitos que estn
relacionados con la promocin de crecimiento vegetal, que fueron tomados en cuenta en
este trabajo y parmetros fenotpicos, como la altura de la planta y la biomasa producida en
la plantas sometidas a tratamiento con las cepas de Trichoderma spp (ver apndice 14).
Un total de 38 variables fueron consideradas en la evaluacin entre los que estn altura
de la planta, peso seco de raz, peso seco del follaje y peso seco total de la planta medidas a
los 15 y 30 ddt. Por otra parte se consideran las concentraciones de TRP, KIN, AG, AA,
AIA y AIB cuando los hongos estn en crecimiento en medio lquido y cuando estn en
interaccin con la semilla de maz germinando, en este ltimo caso, los anlisis
comprenden tambin mediciones a las 24, 48 y 72 h de estar en interaccin.
El AG3 producido por Trichoderma spp en medio lquido LB puede tener un efecto
benfico en la produccin de biomasa en la planta de maz, ya que al analizar este
metabolito en relacin al crecimiento de la raz a los 15 y 30 ddt, al igual que el peso seco
del follaje a los 30 ddt, se observan efectos positivos en las plantas y el anlisis de
regresin mltiple as lo confirma.
83
8. DISCUSION
8.1. Aislamiento e identificacin de Trichoderma spp.

En la tierra de cultivos en la regin norte de Tamaulipas esta presente de forma natural
el hongo del gnero Trichoderma, observndose que no existe una relacin entre la especie
y el origen en donde estn presentes, condiciones de los cultivos, etc. Lo cual coincide con
lo reportado por Woo et. al., en el 2006, quien menciona que se pueden obtener cepas de
Trichoderma spp tanto en praderas, bosques, desiertos, en suelos de diferentes zonas
climticas, en materia vegetal muerta, en races, semillas entre otros.
Los aislados obtenidos mostraron la formacin tpica de anillos concntricos de las
colonias de Trichoderma spp., donde se intercala el color verde de las conidias y blanco del
micelio, lo cual concuerda con descripciones realizadas por otros autores sobre este hongo
(Windham et. al., 1986; Chaverri et. al., 2003).
8.2. Caracterizacin molecular: Identificacin a nivel de especie.
De las cepas que fueron aisladas se identificaron tres especies, de las cuales son T.
harzianum, que fue la ms frecuentemente encontrada en el muestreo y es una especie de
amplia distribucin. Con respecto a T. koningiopsis, Hernndez y Cols (Com. Pers)4,
obtienen aislarla de la rizsfera de girasol silvestre (Helianthus annum L). As mismo,
Larralde et. al., (2008) reportan su presencia en suelos de cultivo con sorgo de la regin
norte de Tamaulipas. Con respecto a la cepa HTE809, que corresponde a T. virens, obtenida
de suelos de esta regin, es una espacie que no haba sido reportada en la zona.
Por otra parte, la morfologa de colonia sirve para detectar hongos de este gnero, sin
embargo no es suficiente para separarlos como especie, ya que T harzianum tiene varios
fenotipos, tal como se observa en las fotografas de las cepas aqu obtenidas y que se
Reynosa, Tamaulipas. Agosto 2008.
84
muestran en la figura 16. La variabilidad fenotpica en esta especie ya haba sido reportada
con anterioridad (Mumpuni et. al., 1998).
En cuanto al uso de las secuencias almacenadas en la base de datos de TichOKEY, solo
pudo ser empleada para la identificacin a nivel especie de 11 de las cepas, puesto que son
muy especficos los fragmentos de las secuencias del ADN genmico que utiliza este
programa. Esto, en comparacin con la secuencia de las otras 5 cepas, donde solamente
podan ser identificadas a nivel de gnero; ya que las secuencias del fragmento deseado
fueron muy pequeas. En estos casos fue necesario recurrir a los datos del Genbank de la
NBCI, donde se compararon nuevamente las secuencias y se asign el nombre de la
especie segn el porcentaje de similitud con secuencias del banco.
Empleando el programa MEGAlin del ADNstar, se analizaron los datos de las
secuencias de las 16 cepas de Trichoderma spp obtenidas y se obtuvo un dendrograma
donde se observa que la cepa HTE808 de T. koningiopsis est muy separada de las dems,
lo cual indica que forma parte de otro grupo, el de la seccin A Trichoderma, en los que se
separan las especies de este hongo (Rey et al, 2004; Samuels et al., 2006).
Las especies de T virens y T harzianum se encuentran ubicadas en el grupo de B
Seccin Pachybasium. A este respecto, la cepa HTE809 de T. virens, presenta un mayor
grado de similitud con T. harzianum. Sin embargo las caractersticas genticas son
suficientemente grandes para separarla como especies diferentes (Rey et al, 2004,
Hypocrea/Trichoderma Biodiversity).
En este grupo de T. harzianum se puede observar aunque pertenezcan a la misma
especie son fenotpicamente y genticamente diferentes, a excepcin de las cepas HTE811
y HTE812, que muestran tener alto % identidad; pero su comportamiento en la efectividad
biolgica no es la misma. Es necesario utilizar genes, como el tef1, act, cal y ech42; y la
utilizacin de otras tcnicas (Samuels, 2006) para demostrar que efectivamente son la
misma especie o no.
85
8.3. Caracterizacin agronomica: Pruebas de antagonismo.

8.3.1. Cineticas de crecimiento.
Estas cepas de Trichoderma nativas, tambin presentan un crecimiento rpido, de 5 das
cubriendo en su totalidad la superficie de la caja petri con PDA. El tipo de especie de la
cual se trate tambin tiene que ver con la velocidad de crecimiento ya que segn anlisis
estadsticos realizados a las 72, 84 y 96 h de incubacin, se observ que la cepa HTE809 de
T. virens es las ms lenta en crecimiento. La cepa HTE808 de T. koningiopsis muestra la
mayor velocidad de crecimiento. De todas las cepas evaluadas, le sigue en velocidad de
desarrollo, la cepa HTE804 de T. harzianum. El resto de las cepas pertenecientes a esta
especie tienen un crecimiento intermedio. Lo cual coincide con las caractersticas en las que
se basaban para la clasificacin taxonmica de este gnero, donde consideraban adems de
la morfologa, el tipo y taza de crecimiento radial (Windham et. al., 1986; Samuels, 2004).
La presencia de otro hongo frente a Trichoderma spp en algunas ocasiones puede
afectar su crecimiento, como es el caso de la cepa HTE812 de T. harzianum, en la que se
acelera su desarrollo en la presencia de los fitopatgenos utilizados en este estudio. Esto
debido probablemente a la estimulacin que recibe al reconocer las lectinas unidas al
patgeno (Rocha et. al., 2002; Nawar, 2005).
Contrario al caso anterior, se detectaron otras cepas que disminuyen la velocidad de
crecimiento de Trichoderma spp, frente a ambos fitopatgenos, como es el caso en las
cepas HTE801, HTE803, HTE804, HTE805, HTE808, HTE809, HTE810, HTE815. Esto
puede ser atribuido a la produccin de metabolitos que inhiben el crecimiento de
Trichoderma sp, lo cual se observ en A. bisporus produce metabolitos, aun no
determinados, con este efecto sobre T. harzianum (Mumpuni et. al., 1998).
Por otra parte, el crecimiento de los fitopatgenos tambin se ve afectado por la
presencia de Trichoderma spp, que puede ocasionar inhibicin del crecimiento, como en el
caso de M. phaseolina afectado por las cepas HTE811 y HTE812. En este ltimo caso el
porcentaje de inhibicin (PICR) fue del 21.6% (ver apndice 3); Esto debido quiz a
algunos metabolitos secretados por Trichoderma spp. Guigon y Gonzlez, 2004 observan
86
que Trichoderma sp parasita las hifas de P. capsici, reduciendo su crecimiento hasta un

50%.
En cuanto a A. parasiticus, las cepas en las cuales se present el fenmeno de
inhibicin son HTE815, HTE802, HTE810 y HTE812, siendo nuevamente la HTE812, la
de mayor PICR con 11.8% (ver apndice 5). Con ambos fitopatgenos la cepa HTE812
perteneciente a T. harzianum, logra tener el mayor efecto inhibitorio con respecto a las
dems cepas de Trichoderma spp. Esto es algo que se debe esperar puesto que Trichoderma
spp es utilizado como agente de control biolgico y uno de los mecanismos que ejerce es la
inhibicin del crecimiento del patgeno. Este comportamiento ha sido atribuido a la
excrecin al medio de cultivo de metabolitos con efectos fungistticos y por ende la
delimitacin del crecimiento del patgeno. (Guigon y Gonzlez, 2004; Martnez et. al.,
2008).
Un efecto no reportado, es que Trichoderma spp es capaz de incrementar el crecimiento
de los patgenos, Esto fue observado en la cepa HTE801 de T. harzianum frente a M.
phaseolina, Siendo este incremento altamente significativo (Tukey P>0.05) en comparacin
al testigo de M. phaseolina. Posiblemente este incremento sea debido a sustancias
secretadas por Trichoderma spp. en el medio de cultivo.
De manera global segn los resultados obtenidos se puede suponer que la cepa HTE812
tiene la propiedad de inhibir el crecimiento de los dos fitopatgenos, mientras que la cepa
HTE815 tiene la propiedad de incrementar o acelerar el crecimiento de ambos
fitopatgenos.
8.3.2. Interacciones fungicas.
Referente, a los fenmenos de antagonismo, se observ en varias cepas de
Trichoderma spp que no permitieron el desarrollo in vitro de las colonias de M phaseolina
y A. parasiticus, fenmeno ya reportado en otros aislados de Trichoderma spp de varios
orgenes. Wardle et. al., (1993) menciona que T. harzianum es un hongo altamente
competitivo en suelos y que ejerce una competencia interespecfica en campo, mientras
87
que Widden y Scattolin en 1988, mencionan que Trichoderma spp ejerce una competencia
intraespecfica en condiciones de campo.
En cuanto al antagonismo por antibiosis, se observaron espacios de cero crecimiento
frente a las cepas HTE807, HTE810, HTE815 de T. harzianum y HTE809 de T. virens con
M. phaseolina y en A. parasiticus cuando esta frentes a las cepas HTE806, HTE811,
HTE813, HT814 y HTE815 de T harzianum. En estos casos, esta condicin de cero
crecimiento tal vez se deba a la produccin por parte de Trichoderma spp de metabolitos
como viridina y sus derivados que funcionan como antimicrobianos. Sivasithamparaam y
Ghisalberti (1998) reportan sustancias producidas por Trichoderma spp con propiedades
antifngicas, antibiticas, bactericidas, fungicidas, antibacterial, antiviral, antimicrobianas,
citotxicas, etctera.
El efecto macroscpico del hiperparasitismo, en M. phaseolina se observ con la cepa
HTE807 de T. harzianum y la HTE808 de T. koningiopsis. En donde Trichoderma sp.
crece sobre el patgeno llegando a cubrirlo en su totalidad. Con respecto a A. parasiticus
no se observ el cubrimiento total de la colonia, pero si la presencia de T. koningiopsis en
el punto de inoculacin de A. parasiticus. El hiperparasitismo de Trichoderma spp, ha sido
ampliamente reportado en diversos fitopatgenos tanto en condiciones in vitro como in
vivo (Monte, 2001; Cupull et. al., 2003; Harman et. al., 2004b; Mukherjee et. al., 2004;
Cardona y Rodrguez, 2006; Djonovi et. al. ,2006; Djonovi et. al., 2007,). Ezziyyani et.
al (2004), observaron in vitro que T. harzianum es capaz de sobrecrececer sobre P. capsici
e incluso llega a reducir la colonia del patgenos a los 4 das. Srilakshmi et. al., (2001)
reportan que especies de Trichoderma spp muestran micoparasitismo sobre Aspergillus
flavus, y tambin es reportado que Trichoderma sp previene la sntesis de aflatoxina B1
(Shanta, 1999; Desai et. al., 2000; Buhariwalla et. al., 2005).
Tambin se observ que la cepa HTE808 de T. koningiopsis es la que presenta mayor
capacidad de antagonismo frente a M. phaseolina y A. parasiticus y pudiera ser utilizada
en condiciones de campo para combatir la problemtica ocasionada por estos dos
fitopatgenos. Esto coincide con lo ya reportado por Larralde et. al. (2008) en donde
reportan que T. koningiopsis es el mejor antagonista de M. phaseolina.
88
8.4. Caracterizacin agronomica: Promocin del crecimiento vegetal.

En cuanto a lo que se refiere a la promocin de crecimiento vegetal, se pudo observar
que las semillas de maz hibrido 30P49 tratadas presentaron un porcentaje de germinacin
del 100%. Bentez et. al., (2004) mencionan que Trichoderma sp es capaz de producir
factores de crecimiento que incrementen la taza de germinacin de la semilla. Lo cual no
coincide con los reportado por Besnard y Davet (1993), citados por Ezziyyani et. al.,
(2004), en donde no observaron diferencias en el porcentaje de germinacin, de las semillas
de tomate y pepino tratadas y no tratadas con Trichoderma spp.
La realizacin de estos ensayos en dos secciones, bajo condiciones climticas distintas
dio variaciones en los valores obtenidos entre las dos secciones de nones y pares; esto tal
vez debido a cuando se realiz el segundo ensayo, estas se desarrollaron en un clima muy
variado, pasando de frentes fros a das sumamente soleados y con temperaturas altas, esto
pudo haber influido en su desarrollo. Adems de esto, se observaron ganancias en la altura
de la planta y en la produccin de biomasa a los 15 ddt, dejando de manifestarse a los 30
ddt. Existen reportes en donde se ha detectado que en los primeros momentos de la
interaccin, entre Trichoderma y las plantas, el metabolismo se altera y tiempo despus
regresa a sus niveles originales (Harman, et. al., 2004a; Harman, 2006).
En cuanto a la ganancia de altura en las plantas de maz tratadas con las cepas de
Trichoderma spp, se observ que los tratamientos con las cepas HTE813 y la HTE810 de T.
harzianum a los 15 ddt presentan un mayor tamao. Mientras que en la produccin de
biomasa solo se obtuvieron resultados significativos con la cepa HTE810 de T. harzianum,
con ganancia en peso seco de raz y en peso seco total de la planta. Estos resultados
probablemente se puedan relacionar con los metabolitos que producen las cepas de
Trichoderma spp cuando interactan con la semilla de maz en la fase germinativa (Harman
et. al., 2004b; Bailey and Lumsden, 2004; Harman, 2006). Ya que esta reportado que
diferentes cepas de Trichoderma spp. son capaces de producir fitoalexinas (Hanson and
Howell, 2004).
Harman et. al., (2004b) mencionan que cuando T. harzianum es aplicado como
tratamiento en semillas y/o suelo, se obtiene una colonizacin en el sistema radicular,
89
dando un aument en la profundidad de enraizamiento del maz. Este aumento del

desarrollo radicular, permite a la planta obtener mayor absorcin y disponibilidad de
nutrientes o bien que Trichoderma sp. metabolice nutrientes del sustrato facilitando a la
planta la absorcin de estos (Donoso et. al., 2008).
La cepa en la que se detecto menor incremento en follaje y biomasa fue en la HTE804
de T. harzianum. Debido quiz a que esta cepa sea capaz de producir alguna sustancia con
capacidad fitotxica; ya que se ha reportado que metabolitos producidos por Trichoderma
spp tienen efecto en la reduccin de la germinacin o la produccin de masa radicular, esto
reportado en dicotiledneas y en T. harzianum sobre algunas lneas de maces (Jones et al,
1988; Bailey and Lumsden, 2004; Harman, et al, 2004b; Harman, 2006).
8.5. Caracterizacin agronomica: Deteccin de promotores de crecimiento.
Referente a la produccin de metabolitos involucrados en la promocin de crecimiento
vegetal, se observ que Trichoderma spp es capaz de metabolizar los metabolitos que se
buscaron en este estudio (TRP, AA, AIA, AIB, AG, KIN). Si bien el medio lquido LB en
el que se inocularon las cepas de Trichoderma spp contiene TRP, se observ que este
hongo es capaz de metabolizar este compuesto para producir AA y AIA, adems de que se
detectaron cantidades de KIN, AG3. Esta reportado que T. virens secreta 3 compuestos de
naturaleza auxinita AIA, lAld y lEt, detectados por cromatografa de gases acoplada a
masas. Plantas tratadas con AIA y lAld promovieron desarrollo de raz, observando el
mismo efecto en plantas inoculadas con T. virens (Lpez et. al., 2008).
Un punto de vista interesante en las interacciones que se realizarn entre los hongos y la
germinacin del maz, es que el embrin de la semilla de maz, tienen cantidades
importantes de TRP (Mendoza-Elos et. al., 2006), razn por la cual se cultivo Trichoderma
spp en medio LB, el cual contiene TRP y se buscaron los otros metabolitos.
Las semillas de maz contienen TRP, el cual utilizan para obtener metabolitos
involucrados en su desarrollo. As, se detecto que durante el proceso de germinacin, las
concentraciones de este metabolito disminuyen de las 24h a las 72h. Cuando las semillas
estn inoculadas con las cepas de Trichoderma spp se observa de manera global que a
90
diferencia de la semilla sin inocular, las concentraciones de TRP aumentan de las 24 a las
72h. Lo cual indica, que probablemente la presencia de Trichoderma spp durante la
germinacin acelera la liberacin de TRP para transformarlo en metabolitos de desarrollo
vegetal.
En cuanto a la presencia de KIN en la germinacin de la semilla de maz se detecto en
cantidades mnimas a las 24 y a las 72 h, sin embrago en 5 cepas presentan cantidades
cuantificables de este metabolito a las 72 h. La KIN se encuentran en mayor concentracin
en la raz de la planta, donde dirige su proceso para la divisin y diferenciacin celular
(Sobern et. al., 2005).
Se detectaron 3 picos correspondientes al AG, identificados como AG1, AG2 y AG3.
Las giberelinas promueven la germinacin de la semilla y la produccin de enzimas
hidrolticas durante este proceso (Sobern et. al., 2005). El AG1 en el testigo se va
degradando, mientras que en las semillas tratadas con las cepas de Trichoderma sp. a las 72
aumenta.
En cuanto a AG2 es detectado en los tres tiempos en las semillas tratadas, a excepcin
de las tratadas con la cepa HTE814, en donde no fue detectado en ningn tiempo; en las
semillas no tratadas solo se detecto en los primeros dos tiempos
El AG3 por su parte, se detect en el testigo a las 24 h trazas de este compuesto. Las
semillas tratadas a las 24 h, las cantidades encontradas son cuantificables en 2 cepas
HTE808 y HTE809, a las 48 h cuantificable solo en la cepa HTE809 y a las72 h
cuantificables en las cepas HTE808 a la HTE811. El resto de las dems cepas, en su
mayora presentan trazas de este compuesto en los 3 tiempos. Esto indica que cada cepa
tiene sus propias capacidades con respecto a este metabolito. Es decir una lo metabolizan,
otras no.
Con respecto a AIA este no se encuentra presente en el testigo, sin embargo se detecta
la presencia en cantidades mnimas en las semillas tratadas a las 24 y 72 h. Gravel et. al.,
(2006) reportan que T. atroviride es capaz de producir AIA en presencia de triptamina, y
91
derivados de AIA en presencia de triptofol; mencionan que AIA esta involucrado en la

promocin de crecimiento vegetal en tomates bajo condiciones hidropnicas.
En cuanto a AIB, es detectado en cantidades mnimas a las 24 h en las semillas no
tratadas y en las tratadas (9cepas) y a las 72 h en el testigo y en 3 cepas (HTE801, HTE802
y HTE808); por lo que posiblemente, provenga de la semilla de maz y por tanto
Trichoderma spp sea capaz de degradarlo, ya que no es detectado, ni siquiera en cantidades
mnimas, en 6 de las cepas en las que fue detectado a las 24 h. No existen reportes de que
este hongo sea capaz de metabolizar AIB.
El AA es detectado cantidades mnimas solo a las 24 h en las semillas tratadas y puede
provenir del propio AA que libera las semillas en las primeras horas de la germinacin, ya
que existen reportes que en la composicin de la semilla de maz se encuentra AA (Sigh y
Wildholm, 2004).
8.5.1. Efecto de los metabolitos en la promocion del crecimiento vegetal.
La promocin de crecimiento vegetal solo se detect a los 15 ddt, este incremento fue
significativo solo en dos cepas la HTE810 y la HTE813, mas sin embargo en cuanto a los
resultados obtenidos en la correlacin con la produccin de metabolitos, se observ que
posiblemente la presencia de TRP y AG en la interaccin de las cepas de Trichoderma sp
con las semillas de maz, puede afectar de forma negativa a la produccin de raz.
Windham et. al., (1986) reportan que a las 8 semanas despus de la plantacin de tomate y
tabaco tratadas con Trichoderma sp, observaron incrementos en el peso seco de la raz y
follaje. Probablemente no se obtuvieron resultados notables debido al poco tiempo se le
dio a la planta de maz.
92
9. CONCLUSION
Los muestreos realizados muestran que Trichoderma spp puede ser aislado de suelos
cultivados del norte de Tamaulipas; y no existe una relacin de la especie con las
condiciones en la que se realiza la agricultura en esta regin. De los hongos detectados,
Trichoderma harzianum es la especie ms frecuente, siguindole en importancia T.
koningiopsis y T. virens.
De los resultados de las pruebas de antagonismo que fueron efectuadas, T. harzianum y
T. virens muestran actividad antagnica de competencia por espacio, mientras que T.
koningiopsis mostr un alto nivel de hiperparasitismo en M. phaseolina y en A.
parasiticus, con lo cual se visualiza un alto potencial de uso en el control de estos
patgenos para mejorar la calidad de los cultivos.
En cuanto a la promocin de crecimiento vegetal se observ incremento en la
produccin de raz y este fenmeno no se refleja en la produccin de follaje. Se cree es
necesario realizar evaluaciones ms tardas, para determinar el efecto de estimulacin.
Finalmente, al estudiar las sustancias relacionadas con el crecimiento vegetal durante
el desarrollo de Trichoderma spp en medio de cultivo LB se detecto que el hongo es capaz
de metabolizar el TRP para formar AIA, AA y AG. La cepa HTE802 metaboliza en su
totalidad el TRP y es el nico en producir KIN. El AIB no es producido por ninguna de las
16 cepas de Trichoderma spp en medio LB.
Durante el proceso de imbibicin y germinacin de la semilla de maz solo e inoculado
con las cepas de Trichoderma spp obtenidas en este trabajo, se detecto que el hongo es
capaz de metabolizar el TRP y formar a partir de l, las sustancias que promueven el
crecimiento vegetal.
93
10. RECOMENDACIONES
Realizar ensayos en cultivos con problemas de pudricin carbonosa y presencia de

aflatoxinas, para ver la efectividad de las cepas de Trichoderma spp en el control de M.
phaseolina y A. parasiticus.
Hacer una bsqueda de genes relacionados con la promocin del crecimiento vegetal,
con la utilizacin de microarreglos.
Evaluando los parmetros de la promocin de crecimiento vegetal, a mayor tiempo,
incluso llegar a la produccin.
94
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107
12. GLOSARIO
Antagonismo. Interaccion entre dos organismos (ej. Mohos y bacterias) por la que el
crecimiento de uno de ellos es inhibido por el otro.
Antagonista. Organismo ejerciendo un efecto daino a otro: por ejemplo, mediante la
produccin de enzimas lticas, antibiticos o por competicin.
Antibiosis. Inhibicin del crecimiento o desarrollo de un organismo por medio de una
sustancia, las cuales actan en bajas concentraciones (menores a 10 ppm.). La antibiosis es
el mecanismo de antagonismo entre microorganismos ms estudiado.
Antibitico. Compuesto natural o sintetico que inhibe el crecimiento o mata algunos
microorganismos. Los antibiticos se utilizan en medicina de manera generalizada para el
control de bacterias patgenas, estas, por mutacion, puede adquirir con rapidez resistencia a
determinados antibiticos.
Auxinas. Cualquiera de las vitaminas y hormonas de los vegetales que favorecen y regulan
el crecimiento de las plantas, que mantienen el crecimiento apical y la iniciacin de la
formacin de races es esquejes. Auxinas naturales, como el acido indolactico (AIA), son
sintetizadas en las yemas.
Biomasa. Masa total de todos los organismos de un tipo o en un area especficos.
Cepa. Es un grupo de aislamientos caracterizados de un microorganismo. Esencialmente
esto se aplica a aislamientos del laboratorio, cultivos o seleccin, raza, variedad, forma
specialis.
Competencia. el desigual comportamiento de dos o ms organismos ante un mismo
requerimiento, siempre y cuando la utilizacin del mismo por uno de los organismos
reduzca la cantidad disponible para los dems. Un factor esencial para que exista
competencia es que haya "escasez" de un elemento, si hay exceso no hay competencia. La
competencia ms comn es por nutrientes, oxgeno o espacio.
Control biolgico. r.Baker y Cook (1974) definen el control biolgico como la reduccin
de la densidad o de las actividades productoras de enfermedades de un patgeno o parsito,
en su estado activo o durmiente, lograda de manera natural o a travs de la manipulacin
del ambiente, del hospedero o de antagonistas del patgeno o plaga que se quiere controla
Especies o poblaciones nativas. Las pertenecientes a especies silvestres que se encuentran
dentro de su mbito de distribucin natural.
Hiperparasitismo (micoparasitismo). se refiere al hecho de que un microorganismo
parasite a otro. Puede ser definido como una simbiosis antagnica entre organismos. El
parasitismo consiste en la utilizacin del patgeno como alimento por su antagonista.
108
Generalmente se ven implicadas enzimas extracelulares tales como quitinasas, celulasas, b1-3-glucanasas y proteasas que lisan o digieren las paredes de los hongos. (Melgarejo 1989,
Ulhoa 1996).
In vitro. Es una prueba o procedimiento que se lleva acabo en condiciones de laboratorio:
p. ej., al probar un antagonista en una caja petri contra un cultivo del patgeno.
Inculo (inoculante). Un organismo introducido al medio ambiente, despus de haber sido
producido artificialmente en el laboratorio, para llevar a cabo alguna funcin especial: p.ej.,
control de la enfermedad, promocin del crecimiento de plantas, descomposicin de paja,
etc.
ITS (Espacio transcrito interno) Regiones no codificantes que separan los componentes
individuales de las unidades de ADN ribosmico. Estas regiones muestran mayor
polimorfismo de secuencia que las propias regiones gnicas.
109
13. APNDICE
spp.
Horas
12
24
36
48
60
72
84
(cm)
HTE801
0.50
1.25
2.00
3.20
4.30
5.60
6.65
HTE802
0.50
0.85
1.55
2.18
3.10
4.05
5.10
HTE803
0.50
1.30
2.10
3.10
4.15
5.30
6.60
HTE804
0.65
1.55
2.55
3.60
4.95
6.35
7.45
HTE805
0.45
1.00
1.95
2.80
3.80
5.05
6.05
HTE806
0.50
1.00
2.03
3.47
4.47
5.47
6.50
HTE807
0.40
0.87
1.97
3.27
4.57
5.70
6.83
HTE808
0.53
1.30
2.57
3.57
4.80
5.80
6.90
HTE809
0.43
0.90
1.57
2.30
3.00
3.70
4.40
HTE810
0.43
1.20
2.23
3.40
4.43
5.40
6.50
HTE811
0.50
0.97
1.83
2.97
4.00
5.03
6.23
HTE812
0.50
0.87
1.43
2.77
3.70
4.57
5.53
HTE813
0.50
0.87
1.37
2.57
3.73
4.67
5.63
HTE814
0.33
0.80
1.50
2.60
3.70
4.83
5.97
HTE815
0.40
0.90
1.90
3.00
4.23
5.13
6.03
HTE816
0.40
0.90
1.90
3.00
4.23
5.13
6.03
- = este signo indica que la cepa llego a su mximo crecimiento.
Cepa
96
108
120
8.00 6.20
7.30
7.70
8.00
8.00
8.00
8.00
8.00
8.00
6.75
7.55
8.00
7.40
8.00 8.00 7.97 5.20
6.17
7.07
7.40
8.00 7.43
8.00 6.37
7.30
8.00
6.57
7.70
8.00
7.30
8.00 6.93
8.00 6.93
8.00 -
110

spp en confrontacin con M. phaseolina.
Adems se muestra el Porcentaje de Aceleracin del Crecimiento Radial de Trichoderma
(PACRT).
Horas
PICR PACRT
12
24
36
48
60
72
84
96 108 120
(cm)
%
HTE801 0.43 1.17 2.50 4.10 4.67 5.47 2.4
-2.4
HTE802 0.47 0.87 1.53 2.20 3.07 3.73 4.47 7.8
-8.5
HTE803 0.53 1.33 2.13 3.07 4.13 4.75 10.4
-11.6
HTE804 0.60 1.50 2.50 3.63 4.70 5.1
-5.3
HTE805 0.50 1.13 1.97 2.83 3.93 4.77 5.6
-5.9
HTE806 0.47 1.13 2.17 3.47 4.53 5.60 6.50 -2.4
2.4
HTE807 0.47 1.03 2.23 3.50 4.90 5.90 -3.5
3.4
HTE808 0.50 1.37 2.50 3.53 4.67 5.57 6.63 4.0
-4.2
HTE809 0.43 0.70 1.37 2.13 2.80 3.50 4.03 4.93 5.4
-5.7
HTE810 0.43 0.63 0.93 1.37 2.20 3.07 3.77 4.63 43.2
-76.1
HTE811 0.50 1.03 2.03 3.03 4.10 5.03 6.17 0.0
0.0
HTE812 0.50 1.00 2.13 3.30 4.23 5.07 5.93 -10.9
9.9
HTE813 0.40 0.80 1.70 2.90 3.97 4.97 5.87 -6.4
6.0
HTE814 0.33 0.73 1.47 2.57 3.67 4.83 5.93 0.0
0.0
HTE815 0.50 0.97 1.60 2.27 3.63 4.47 5.40 13.0
-14.9
HTE816 0.50 1.13 1.97 2.83 3.93 4.77 7.1
-7.7
Cepa
111
A 3. Promedio de la cintica de crecimiento medida cada 12 h de las cepas de M.

phaseolina.
Adems se muestra el Porcentaje de Inhibicin del Crecimiento Radial (PICR).
Horas
60
72
84
96
(cm)
M. phaseolina 0.35 0.70 1.35 2.20 2.90 3.70 4.65 5.65
HTE801
0.43 1.17 2.50 4.10 4.67 5.63 6.10 HTE802
0.47 0.87 1.53 2.20 3.07 3.73 4.47 HTE803
0.53 1.33 2.13 3.07 4.13 4.75 HTE804
0.50 0.70 1.27 2.00 2.60 3.07 HTE805
0.50 0.80 1.33 2.03 2.60 3.37 3.70 HTE806
0.43 1.07 1.93 2.57 3.07 3.60 4.00 HTE807
0.57 1.20 2.10 2.70 3.03 3.50 HTE808
0.47 0.83 1.43 2.03 2.60 3.03 HTE809
0.43 0.67 1.30 1.87 2.50 3.10 3.40 3.70
HTE810
0.53 1.07 1.97 2.73 3.37 3.87 4.60 5.00
HTE811
0.47 0.90 1.50 2.00 2.60 2.90 3.35 HTE812
0.47 0.97 1.93 2.63 3.30 3.63 4.03 HTE813
0.53 1.20 2.10 2.87 3.67 4.10 4.10 HTE814
0.47 0.93 1.70 2.33 2.93 3.40 3.90 HTE815
0.47 1.10 1.90 2.63 3.57 4.13 4.60 HTE816
0.47 0.93 1.70 2.03 2.60 3.37 3.70 - = este signo indica que la cepa llego a su mximo crecimiento.
Cepa
12
24
36
48
108
120
6.10
-
6.70
-
PICR
%
-52.3
-0.9
-28.4
17.1
9.0
2.7
5.4
18.0
16.2
-4.5
21.6
1.8
-10.8
8.1
-11.7
9.0
112

spp en confrontacin con A. parasiticus.
Adems se muestra el Porcentaje de Aceleracin del Crecimiento Radial de Trichoderma
(PACRT).
Horas
PICR PACRT
12
24
36
48
60
72
84
96 108 120
(cm)
%
HTE801 0.50 1.00 1.93 3.07 4.10 5.30 6.00 6.30 6.80 9.8
-10.8
HTE802 0.50 0.87 2.00 3.10 4.50 5.37 5.67 5.90 -11.1
10.0
HTE803 0.27 0.63 1.73 3.13 4.40 5.20 5.50 5.63 5.75 5.80 16.7
-20.0
HTE804 0.35 0.70 1.60 2.65 3.80 4.75 5.45 5.70 5.85 26.8
-36.7
HTE805 0.37 0.47 1.43 2.73 4.07 4.83 5.23 5.47 5.65 13.5
-15.6
HTE806 0.37 1.00 2.00 3.50 4.63 5.33 5.48 5.50 5.60 15.6
-18.5
HTE807 0.40 0.50 1.40 2.27 3.47 4.23 5.10 5.50 25.4
-34.0
HTE808 0.40 1.13 2.37 3.63 4.83 5.63 5.93 14.0
-16.3
HTE809 0.40 1.00 1.90 3.03 4.03 4.93 5.57 5.73 -26.5
21.0
HTE810 0.50 0.87 1.73 2.73 3.57 4.40 5.00 23.1
-30.0
HTE811 0.43 1.03 1.97 3.17 4.20 4.97 5.53 5.67 11.2
-12.7
HTE812 0.47 1.10 2.30 3.53 4.50 5.40 5.70 -3.0
2.9
HTE813 0.47 1.00 1.77 2.80 4.03 4.67 5.50 5.90 2.4
-2.4
HTE814 0.47 0.87 1.77 2.90 4.07 5.07 5.50 5.60 7.8
-8.5
HTE815 0.43 0.90 1.69 2.87 4.07 4.90 5.47 5.63 5.73 9.4
-10.4
HTE816 0.50 1.07 2.20 3.33 4.35 5.40 -5.2
4.9
Cepa
113
A 5. Promedio de la cintica de crecimiento medida cada 12 h de las cepas de A.

parasiticus.
Adems se muestra el Porcentaje de Inhibicin del Crecimiento Radial (PICR).
Horas
60
72
84
96
(cm)
A. parasiticus 0.40 0.50 0.73 0.95 1.20 1.45 1.73 1.98
HTE801
0.40 0.50 0.70 0.90 1.10 1.33 1.60 HTE802
0.40 0.50 0.73 0.93 1.07 1.27 1.50 1.60
HTE803
0.40 0.50 0.73 0.93 1.13 1.33 1.55 1.75
HTE804
0.40 0.50 0.83 1.07 1.27 1.43 1.60 HTE805
0.40 0.50 0.73 0.97 1.17 1.43 1.60 1.65
HTE806
0.40 0.60 0.83 1.20 1.50 1.67 1.85 HTE807
0.40 0.50 0.73 0.97 1.20 1.40 1.60 1.80
HTE808
0.47 0.57 0.83 1.00 1.20 1.37 1.55 1.60
HTE809
0.47 0.63 1.00 1.27 1.53 1.67 1.75 HTE810
0.50 0.67 0.83 1.03 1.17 1.30 1.50 1.70
HTE811
0.40 0.63 0.97 1.13 1.33 1.50 1.60 1.65
HTE812
0.40 0.57 0.83 1.13 1.30 1.40 1.50 1.60
HTE813
0.40 0.53 0.77 0.93 1.27 1.45 1.55 1.70
HTE814
0.37 0.60 0.90 1.20 1.37 1.60 1.80 1.90
HTE815
0.47 0.70 0.87 1.03 1.27 1.47 1.63 1.73
HTE816
0.50 0.60 0.80 1.03 1.27 1.40 1.57 1.73
Cepa
12
24
36
48
108
120
2.33
1.75
1.80
1.95
1.80
-
2.63
-
PICR
%
5.9
11.8
8.8
5.9
5.9
-8.8
5.9
8.8
-2.9
11.8
5.9
11.8
8.8
-5.9
3.9
7.8
114
A 6. Pruebas de Tukey (P>0.05) realizadas a la cintica de crecimiento de M. phaseolina

cuando esta sola y en presencia de las 16 cepas de Trichoderma sp a las 72 horas de
incubacin.
Cepa
HTE801
HTE815
HTE813
HTE810
HTE802
HMP4
HTE803
HTE812
HTE806
HTE807
HTE814
HTE816
HTE805
HTE809
HTE804
HTE808
HTE811
CV1
DMS2
CME3
Media
5.6333 az
4.1333 b
4.1000 b
3.8667 bc
3.7333 bcd
3.7000 bcd
3.7000 bcd
3.6333 bcde
3.6000 bcde
3.5000 bcde
3.4000 bcde
3.3667 bcde
3.3667 bcde
3.1000 cde
3.0667 de
3.0333 de
2.9000 e
6.91579
0.7826
0.063231
Coeficiente de variacin
Diferencia mnima significativa
3
Cuadrado medio del error
z
Medias con las misma letra indican que no hay diferencias estadsticas significativas
(Tukey, =0.05)
2
115
A 7. Pruebas de Tukey (P>0.05) realizadas a la cintica de crecimiento a distintas horas de

incubacin de M. phaseolina frente a la cepa HTE801 de T. harzianum.
Cepa
HTE801
HMP4
CV1
DMS2
CME3
Hora de incubacin
60
72
84
a
a
5.0000
5.8000
1.0000 b
b
b
2.9000
3.7000
4.6500 a
2.919
2.366
1.337
0.496
0.496
0.248
0.01
0.01
0.002
3
2
116
A 8. Pruebas de Tukey (P>0.05) realizadas entre tiempo de contacto de las 16 cepas de

Trichoderma sp frente a M. phaseolina.
Cepa
HTE809
HTE810
HTE813
HTE812
HTE811
HTE814
HTE815
HTE802
HTE808
HTE806
HTE801
HTE807
HTE805
HTE803
HTE804
CV1
DMS2
CME3
Media
96 az
88 ab
84 abc
84 abc
84 abc
84 abc
84 abc
84 abc
84 abc
80 bcd
76 bcd
72 cde
72 cde
68 de
60 e
5.8554
14.177
21.942
3
z
(Tukey, =0.05)
2
117
A 9. Pruebas de Tukey (P>0.05) realizadas a las cinticas de crecimiento de las 16 cepas de

Trichoderma sp y cuando stas se desarrollan frente a M. phaseolina.
Cepa
Media
HTE810
14.500 az
HTE804
6.325 b
HTE808
5.900 b
5.850 b
HTE807m
5.700 b
HTE807
5.700 b
HTE801m
5.600 b
HTE801
5.567 b
HTE808m
5.550 b
HTE806m
HTE806
5.500 b
HTE804m
5.400 b
HTE803
5.300 b
HTE815
5.133 b
HTE816
5.133 b
HTE805
5.075 b
HTE812m
5.067 b
HTE811
5.033 b
HTE811m
5.033 b
HTE813m
4.967 b
HTE814m
4.833 b
HTE814
4.833 b
HTE805m
4.800 b
HTE803m
4.750 b
HTE816m
4.700 b
HTE813
4.667 b
HTE812
4.567 b
HTE815m
4.467 b
HTE802
3.975 b
HTE802m
3.733 b
HTE809
3.700 b
HTE809m
3.500 b
HTE810m
3.067 b
CV1
37.24
2
DMS
6.962
3.654
CME3
HTE8XXm=Cepas que se desarrollaron frente a M. phaseolina.
1
2
3
z
(Tukey, =0.05)
118
A 10. Pruebas de Tukey (P>0.05) realizadas a la cintica de crecimiento de A. parasiticus

cuando esta sola y en presencia de las 16 cepas de Trichoderma sp a 72 h de incubacin.
Cepa
HTE812
HTE806
HTE809
HTE814
HTE811
HTE813
G1
HTE815
HTE805
HTE804
HTE816
HTE807
HTE808
HTE801
HTE803
HTE810
HTE802
CV1
DMS2
CME3
Media
6.700 az
1.667 b
1.667 b
1.600 b
1.500 b
1.467 b
1.467 b
1.467 b
1.433b
1.433 b
1.400 b
1.400 b
1.367 b
1.333 b
1.333 b
1.300 b
1.267 b
7.8910
0.4061
1.7038
3
z
(Tukey, =0.05)
2
119
A 11. Pruebas de Tukey (P>0.05) realizadas a las cinticas de crecimiento de las 16 cepas
de Trichoderma sp y cuando stas, se desarrollan frente a A. parasiticus.
Cepa
Media
HTE804
6.325 az
HTE808a
5.850 ab
HTE808
5.800 ab
5.750 ab
HTE801
5.700 abc
HTE807
5.500 abcd
HTE801a
5.500 abcd
HTE806
5.350 bcde
HTE802a
5.300 bcde
HTE803
HTE803a
5.300 bcde
HTE806a
5.250 bcde
HTE815a
5.200 bcde
HTE816a
5.200 bcde
HTE815
5.100 bcde
HTE810
5.100 bcde
HTE816
5.100 bcde
HTE805
5.075 bcde
HTE811a
5.050 bcde
HTE811
5.000 bcde
HTE814
4.850 cdef
HTE809a
4.850 cdef
HTE804a
4.825 def
HTE805a
4.800 def
HTE814a
4.800 def
HTE813
4.650 def
HTE813a
4.650 def
HTE812
4.600 ef
HTE812a
4.566 ef
HTE810a
4.550 ef
HTE807a
4.500 ef
HTE802
4.050 fg
HTE809
3.650 g
CV1
3.5824
2
DMS
0.8594
0.0319
CME3
HTE8XXa=Cepas que se desarrollaron frente a A. parasiticus.
1
2
3
z
(Tukey, =0.05)
120
crecimiento vegetal en cepas pares.
Cepa
HTE810
HTE806
HTE812
HTE816
HTE808
HTE802
HTE804
HTE814
TEST.
HTE807
CV1
DMS2
CME3
Altura de planta
15 das
z
18.771 a
18.580 ab
18.550 ab
17.664 abc
17.600 abc
17.600 abc
17.378 abc
17.377 abc
16.555 bc
16.413 c
13.461
2.033
5.627
30 das
21.652 a
21.445 ab
21.100 ab
20.845 ab
20.650 ab
20.380 ab
20.153 ab
19.764 ab
19.617 ab
19.256 b
12.999
2.215
7.128
follaje
raz
15 das
0.1200 a 0.1762 a
0.1166 a 0.1696 ab
ab
0.1135 a 0.1546
ab
0.1036 a 0.1642
a
0.1568 ab
0.1245
0.0994 a 0.1532 ab
0.1015 a 0.1466 b
0.0841 a 0.1472 b
0.0937 a 0.1429 b
0.0987 a 0.1683 ab
46.879
19.829
0.042
0.026
0.0024
0.0009
Peso seco
total
follaje
0.2961 a
0.2887 ab
0.2681 ab
0.2678 ab
0.2813 ab
0.2526 ab
0.1784 c
0.2313 bc
0.2366 b
0.2680 ab
26.227
0.057
0.004
0.1767 ab
0.1771 ab
0.1693 ab
0.1589 ab
0.1590 ab
0.1615 ab
0.1380 b
0.1780 ab
0.1557 ab
0.1909 a
30.673
0.042
0.0024
raz
30 das
0.3603 ab
0.3422 ab
0.1970 c
0.3503 ab
0.3316 ab
0.3369 ab
0.3052 b
0.3622 ab
0.3257 ab
0.3888 a
30.281
0.045
0.002
total
0.1835 a
0.1651 a
0.1883 a
0.1914 a
0.1725 a
0.1754 a
0.1672 a
0.1841 a
0.1700 a
0.1979 a
29.224
0.083
0.009
3
z
Medias con las misma letra dentro de las columnas indican que no hay diferencias
estadsticas significativas (Tukey, =0.05)
2
121
crecimiento vegetal en cepas nones.
Cepa
HTE813
HTE805
HTE815
HTE809
TEST
HTE811
HTE803
HTE801
CV1
DMS2
CME3
Altura de planta
15 das
z
26.224 a
24.382 ab
22.897 bc
22.711 bc
22.672 bc
21.200 cd
20.564 cd
19.680 d
12.791
2.348
8.361
follaje
30 das
31.039 a
30.518 ab
30.065 ab
29.592 ab
28.733 ab
27.654 b
27.487 b
24.377 c
12.088
3.090
12.085
0.1455 a
0.1396 a
0.1260 ab
0.1132 bc
0.1058 bc
0.0924 c
0.0996 c
0.1016 c
24.042
0.022
0.0007
raz
15 das
0.2017 b
0.3007 a
0.1811 b
0.2104 b
0.2058 b
0.1893 b
0.1900 b
0.2048 b
27.785
0.047
0.033
Peso seco
total
follaje
0.3472 b
0.4403 a
0.3071 bc
0.3236 bc
0.3117 bc
0.2817 c
0.2896 bc
0.3064 bc
22.659
0.060
0.005
0.2723 ab
0.2833 ab
0.2542 ab
0.2326 ab
0.2896 a
0.2322 ab
0.2143 b
0.2500 ab
30.461
0.070
0.005
raz
total
30 das
0.2909 a 0.5631 a
0.2691 ab 0.5525 a
0.2818 ab 0.5355 a
0.2452 ab 0.4778 a
0.2518 ab 0.5413 a
0.2543 ab 0.4865 a
0.2195 b 0.4338 a
a
0.2751 ab 0.5251
20.306
28.545
0.067
0.133
0.005
0.021
3
z
Medias con las misma letra dentro de las columnas indican que no hay diferencias
estadsticas significativas (Tukey, =0.05)
2
122
A 14. Resultados del anlisis de correlacin mltiple de los efectos de los metabolitos en la promocin del crecimiento vegetal.
Medio de cultivo LB
Variables
TRP
KIN
(ppm)
AG
(ppm)
NS
0.14
AA
(ppm)
NS
0.28
24 h de Interaccin
(ppm)
NS
0.13
NS
AIA
AIB
TRP
KIN
AG1
AG2
AG3
AA
(ppm)
(ppm)
(ppm)
(ppm)
(ppm)
(ppm)
(ppm)
(ppm)
0.01
NS
Altura 15ddt (cm)
-0.13
Altura 30ddt (cm)
0.06 NS
-0.17 NS
0.37 NS
-0.03 NS
0.04 NS
0.24
NS
-0.13
NS
0.26
NS
0.30
NS
0.09
NS
0.22
NS
-0.24
NS
0.47
NS
-0.04
NS
0.15
NS
P.s. Follaje 15ddt (gr)

P.s. Raiz 15ddt (gr)
-0.04 NS
-0.10 NS
0.48 NS
-0.02 NS
0.10 NS
NS
NS
NS
NS
NS
0.07
-0.20
0.47
0.03
0.13
P.s. Total 15ddt (gr)
-0.03 NS
-0.11 NS
0.50 NS
-0.02 NS
0.09 NS
NS
NS
NS
NS
NS
0.14
-0.15
0.43
-0.12
0.11
NS
-0.52*
0.20
0.03 NS
-0.50*
0.11 NS
-0.07 NS
0.31 NS
-0.27
NS
-0.16
NS
0.22
NS
-0.16
NS
0.30
NS
0.06
NS
-0.44
NS
0.09
NS
0.00
NS
0.25
NS
-0.01
-0.11 NS
-0.25
TRP
(ppm)
KIN
(ppm)
AG1
(ppm)
AG2
(ppm)
Altura 15ddt (cm)
-0.06 NS
-0.03 NS
-0.05 NS
-0.06 NS
Altura 30ddt (cm)
-0.09 NS
0.19 NS
-0.22 NS
0.00 NS
-0.13 NS
-0.06
NS
NS
-0.57 NS
0.77*
0.63*
0.02 NS
-0.32 NS
0.36 NS
-0.47 NS
0.24
-0.64*
-0.11 NS
-0.37 NS
0.02 NS
0.25 NS
-0.08 NS
0.26 NS
0.02 NS
-0.60*
NS
NS
NS
NS
NS
0.04
NS
-0.01
0.13
-0.06
-0.13
0.23
0.25
-0.03 NS
-0.05 NS
-0.06 NS
0.06 NS
0.25 NS
-0.15 NS
0.10 NS
-0.09 NS
0.19 NS
-0.22 NS
-0.02 NS
-0.01 NS
0.00 NS
0.15 NS
-0.19 NS
0.00 NS
-0.13 NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
-0.05 NS
-0.09 NS
-0.13 NS
-0.57 NS
0.77*
-0.63*
0.17 NS
-0.04 NS
0.18 NS
-0.26 NS
-0.05 NS
-0.32 NS
0.36 NS
-0.47 NS
NS
NS
NS
NS
NS
0.77*
-0.62*
-0.15 NS
-0.11 NS
0.27 NS
-0.24 NS
0.27 NS
-0.24 NS
-0.07 NS
0.15 NS
-0.14
-0.09
0.05
-0.05
72 h de Interaccin
-0.06 NS
-0.11 NS
-0.05 NS
0.15
NS
-0.05
-0.10
NS
-0.13 NS
0.16
NS
NS
0.22 NS
-0.62*
0.29
NS
NS
AG2
(ppm)
0.77*
-0.16
NS
NS
AG1
(ppm)
-0.57
NS
NS
KIN
(ppm)
0.06 NS
0.07
0.02 NS
TRP
(ppm)
NS
-0.15 NS
-0.13
0.26 NS
AIB
(ppm)
0.12
(ppm)
NS
-0.10 NS
AIA
(ppm)
0.02
(ppm)
NS
0.26 NS
AA
(ppm)
-0.24
AG3
(ppm)
0.33
NS
0.00 NS
48 h de Interaccin
Variables
NS
AIB
-0.35 NS
-0.14
NS
AIA
-0.13
-0.08
0.15
-0.13
0.09 NS
-0.06
-0.57
0.24
AA
(ppm)
AIA
(ppm)
AIB
(ppm)
0.22 NS
-0.13 NS
-0.05 NS
0.64*
0.25 NS
0.15 NS
0.10 NS
-0.02 NS
-0.01 NS
0.00 NS
0.15 NS
-0.19 NS
NS
NS
NS
NS
0.15 NS
-0.05 NS
-0.09 NS
-0.13 NS
-0.04 NS
0.18 NS
-0.26 NS
-0.05 NS
NS
NS
NS
-0.13 NS
-0.15 NS
0.09 NS
-0.24
0.02
0.16
-0.07 NS
AG3
(ppm)
0.12
-0.05
0.15 NS
-0.13
-0.08
NS
=Efecto no significativo con =0.05.

* = Efecto significativo con =0.05.
123
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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

CENTRO DE BIOTECNOLOGA GENMICA

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRA EN

Cd. Reynosa, Tamp. Mxico

5.1 General ............................................................................................................................ 30

7.4.1.1.3 Caso A. parasiticus ..................................................................................... 55

Figura 1. Microfotografa de Trichoderma sp.. ..................................................................... 4

Figura 28. Hiperparasitismo que presenta T. koningiopsis en A. parasiticus ...................... 62

A 1. Promedio de la cintica de crecimiento, medida cada 12 h , de las cepas de

Das Despus de Tratamiento

Espacio interno transcrito

International Subcommission on Trichoderma and Hypocrea Taxonomy

Porcentaje de Aceleracin de Crecimiento Radial de Trichoderma sp.

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Porcentaje de Inhibicin de Crecimiento Radial

Partes Por Milln

En el Norte de Tamaulipas, anualmente se cultiva maz (Zea mays L.) entre 80 y

2.1 Generalidades de Trichoderma spp.

Figura 1. Microfotografa de Trichoderma sp. d) se observa codioforos de T. viridescens, las flechas

Las mejores condiciones de crecimiento para este hongo son:

Temperatura: se desarrolla en un rango de 15-35C, siendo la ptima de 25C.

Humedad relativa: capaz de crecer entre el 20 y 80% siendo de 70% la mejor.

pH: de 6 a 6.5 es el adecuado para su desarrollo pero puede sobrevivir en rangos

Carbono: La principal fuente de carbono que asimila es celulosa.

En medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA) Trichoderma spp, presenta un

forma concntrica. Al crecer en medio de cultivo, se observa en el reverso de la caja, un

2.2 Identificacin de Trichoderma spp.

Figura 3. Caractersticas morfolgicas de Trichoderma sp. 1. T. viride, 2. T. koningii, 3. T. harzianum, 4.

o 2.2.2 Identificacin por mtodos moleculares.

Clado A seccin Trichoderma la cual incluye T. hamatum, T. pubescens, T.

Clado B que contiene mezclas heterogneas representado por la seccin

Clado C las especies de Longibrachiatum

En el ISTH adems del TrichOkey tambin encontramos los siguientes programas:

2.3 Caractersticas deseables de cepas de Trichoderma spp.

emplea estructuras especializadas llamadas apresorios y haustorios a fin de penetrar la

facilitando la insercin de sus estructuras especializadas y la absorcin de los nutrientes del

En tomate este hongo induce la activacin de genes relacionados con la produccin de

o 2.3.6 Promocin del crecimiento vegetal:

de chile, aumenta el peso seco de las mismas, as como la aceleracin en la emergencia de

al., en el 2008, reporta que T. harzianum estimula el crecimiento de plntulas de Pinus

Gravel et. al., (2006) estudiaron la capacidad de produccin o degradacin de AIA en

2.4 Usos y aplicaciones.

Las especies de Trichoderma spp. ms utilizadas como agentes de control biolgico

2.5 Problemtica actual de fitopatgenos en cultivo y alternativas de control.

El 21% de maz amarillo de Mxico es producido en Tamaulipas; en el 2004 se

Figura 7. Imagen de un tallo infectado de esclerocios de M. phaseolina (Fotografa Lab de Biotecnologa

Figura 8. Fotomicrografa de esclerocios de M. phaseolina (Tomado de Cabrera et. al., 2001).

En Mxico M. phaseolina se reporta afectando los cultivos de maz en los estados de

Esta enfermedad en los cultivos es controlada con prcticas culturales como es el

Figura 9. Imagen de conidiforos de Aspergillus sp (Tomado de Carrillo, 2003).

Se conocen alrededor de 200 especies, de las cuales 20 estn considerados riesgosas

sorgo y frijol. Adems, para tratar de disminuir o controlar la produccin de aflatoxinas

El hongo Trichoderma spp. est presente de forma natural en suelos de cultivo en el

Figura 12. Municipios muestreados en la regin norte de Tamaulipas.

En cada sitio de muestreo se colectaron 2 submuestras de aproximadamente 1 kg de

6.2 Aislamiento e identificacin de microorganismos.

Figura 13. Dispositivo para la obtencin de cepas de Trichoderma spp.

6.3 Caracterizacin molecular.

o 6.3.1 Obtencin de biomasa de aislados de Trichoderma spp.

con Nitrgeno lquido, el polvo se pas a un tubo eppendorf de 1.5 ml en donde se

(5TCCTCCGCTTATTGATATGC3), 5 M (final 0.1 M) y 0.4 L de la enzima Taq

6.4 Caracterizacin agronmica.

Trichoderma spp contra las cepas de M. phaseolina (HMP4) y A. parasiticus (G1),