UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

INFORME DE LABORATORIO
RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS Y MATERIALES DEUSO EN LA
MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

CURSO
Microbiologa I

PROFESOR
Villanueva, Juan

ALUMNO
Cceres Apcho, Jhonatan Jess
Aguirre Santiago, Brayan
Huitrn Ramrez, Tabita Angie
Rosales Garca, Jarol Joel

CICLO
2016-I

Tingo Mara

I.

INTRODUCCIN
La esterilizacin es un mecanismo por el que se consigue la muerte o

eliminacin de todos los microorganismos vivos de una muestra, medio, superficie o

material de trabajo (LEAHY et al., 1999). Entre los microorganismos vivos se incluyen
bacterias, hongos, protistas, virus y sus formas de resistencia. Un objeto esterilizado
est, por lo tanto, totalmente libre de microorganismos incluyendo sus formas de
resistencia. No hay que confundir la esterilizacin con la desinfeccin en la que no se
eliminan todos los microorganismos, sino nicamente aquellos que pueden causar
enfermedad o efectos deletreos sobre los productos en los que se encuentran (en
alimentos, cosmticos, etc.).
Un objeto desinfectado, por lo tanto, no est estril.
La esterilizacin se consigue generalmente por

mtodos

fsicos

excepcionalmente por la aplicacin de compuestos qumicos. Entre los mtodos fsicos

ms comunes est la aplicacin de calor (calor hmedo o calor seco), la filtracin o las
radiaciones. La esterilizacin sin embargo tambin se puede conseguir mediante la
aplicacin de algunos productos qumicos, como el xido de etileno, formaldehdo o
glutaraldehdo. La desinfeccin se realiza generalmente mediante agentes qumicos,
que pueden ser desinfectantes o antispticos dependiendo del uso prctico que
tengan. Los ltimos deben ser compatibles con los tejidos biolgicos, pues se
aplicarn en la superficie corporal.
En el laboratorio de Microbiologa la esterilizacin se puede utilizar como
esterilizacin preparativa o como esterilizacin final. La esterilizacin preparativa es la
que se realiza para mantener libre de microorganismos el material que vamos a utilizar
antes de empezar el trabajo en s mismo o durante el proceso de trabajo (placas Petri,
pipetas, medios de cultivo, asas de siembra, hisopos, etc.). La esterilizacin final sin
embargo tiene como nico fin destruir los microorganismos con los que se ha estado
trabajando. En el primer caso, la eleccin del proceso de esterilizacin se debe
adecuar para preservar las caractersticas de los diversos materiales o medios a
esterilizar, pues algunos pueden ser susceptibles de ser destruidos o alterados,
durante los mecanismos de esterilizacin. Sin embargo, en la esterilizacin final no es
necesario considerar ni el tipo de medio de cultivo, ni la posible alteracin de

materiales, excepto para tener la constancia de que el proceso ha conseguido su

finalidad, es decir, la muerte de todos los microorganismos. Este trabajo tiene como
objetivo principal, eliminar todo tipo de microorganismo y esporas para garantizar un
cultivo inocuo.
METODOLOGAS DE ESTERILIZACIN PREPARATIVA
La esterilizacin preparativa o final se puede realizar, como se ha indicado por
mecanismos fsicos o qumicos (Tabla 1). El mecanismo fsico ms utilizado es el calor,
ya sea hmedo o seco (Tabla 1). Sin embargo, cuando estas metodologas fsicas no
son aplicables, por las caractersticas del material o medio a esterilizar, la filtracin o la
radiacin son los mecanismos a elegir. Excepcionalmente y sobre todo en aplicaciones
a material de uso sanitario, donde no se pueden utilizar las metodologas ya
reseadas, se utiliza generalmente algn tipo de esterilizacin fra. La esterilizacin
fra se lleva a cabo en dispositivos cerrados donde se emplea un agente qumico
gaseoso, como el xido de etileno, el formaldehdo o lquidos como el glutaraldehdo.

Agente esterilizante
Calor hmedo
Calor seco
Filtracin

Equipo
Autoclave
Horno
Mechero
Filtros
Equipos

Radiacin

Pasteur
membrana
filtracin

Filtros HEPA
Fuentes Rayos gamma

Fuente Rayos X
xido etileno
Cmara
Glutaraldehdo
Cmara
Tabla 1. Mecanismos de esterilizacin
Autoclave (calor hmedo)
El vapor saturado (vapor a altas temperaturas bajo presin) es el sistema ms
efectivo para esterilizar material termorresistente. Su accin germicida se produce por
desnaturalizacin de las protenas y enzimas, y desestabilizacin de membranas.
La esterilizacin con calor hmedo, se utiliza principalmente con el autoclave.
El autoclave, desarrollado por CHAMBERLAND en 1884, es un aparato (Fig. 1)
constituido por una caldera, que se puede cerrar hermticamente con una tapa

metlica y que presenta una resistencia elctrica en su interior (antiguamente por gas)
que calienta el agua. Este aparato permite que en el interior de la caldera se desplace
el aire por una vlvula de purga, dejando que se acumule posteriormente vapor
saturado a presin, que alcanza temperaturas superiores a los 100C sin que se
produzca ebullicin.

Figura 1. Autoclaves: actual (izquierda) y antiguo (derecha).

El material a esterilizar se introduce en el interior de la cmara, se somete al
vapor de agua con sobrepresin (lo ms comn: 1,1 atmsferas), hasta alcanzar
temperaturas adecuadas para la eliminacin de los microorganismos y todas las
formas de resistencia, sin que se produzca ebullicin de los medios lquidos. Las
temperaturas y los tiempos de exposicin pueden variar dependiendo del material a
esterilizar (LEWIS, 2002). Actualmente, los autoclaves controlan automticamente la
temperatura, la presin y el tiempo de exposicin, para esto estn provistos de un
manmetro que permite regular la presin y por lo tanto la temperatura, y un
temporizador que permite ajustar el tiempo de exposicin automticamente (Fig. 2). El
equipo suele incluir adems una vlvula de seguridad.

Figura 2. Controlador automtico

El autoclave se puede utilizar para la esterilizacin de medios de cultivo ya

sean slidos (agares) o lquidos, soluciones, material de vidrio, gomas o ciertos tipos
de plsticos (policarbonato o polipropileno), acero inoxidable y tambin material de
trabajo como ropas, algodn, gasas, etc. Tambin es un mecanismo que se utiliza para
esterilizacin final de medios de cultivo.
La esterilizacin con calor hmedo puede causar corrosin de algunos
materiales, por lo tanto, no ser el mtodo a elegir cuando esto sea un problema.
Tambin se debe tener en cuenta que en el proceso de esterilizacin de medios,
puede bajar el pH entre 0,3 y 0,5 unidades, puede caramelizar azcares y algunos
compuestos voltiles se pueden destruir durante el proceso. Los procesos de
esterilizacin largos pueden producir una precipitacin de sales.
Tindalizacin (calor hmedo)
La tindalizacin es un mtodo de esterilizacin fraccionada con calor que se
aplica para esterilizar materiales y medios de cultivo termosensibles, que no pueden
someterse a temperaturas superiores a los 100C. La denominacin de este proceso
es un homenaje al fsico John Tyndall que describi formas bacterianas con una
elevada resistencia al calor, diseando esta metodologa para su eliminacin.
Actualmente el proceso de tindalizacin se lleva a cabo en autoclave con la vlvula
abierta de modo que no se produzca sobrepresin y por lo tanto, no se alcanzan
temperaturas superiores a las de ebullicin (100C). El procedimiento consiste en
aplicar tratamientos trmicos de 30 minutos a 100C durante tres das consecutivos,
dejando el material a temperatura ambiente o a 37C en intervalos de 24 horas. Las
temperaturas cercanas a los 100C destruyen las formas vegetativas pero no las
endosporas bacterianas, por eso se requiere la realizacin de tres periodos de
tratamientos consecutivos con el fin de permitir el desarrollo de las formas esporuladas
en los intervalos a temperatura ambiente. Este procedimiento se puede utilizar en
medios de cultivo con azcares, gelatina, sueros o huevo que se descomponen a
temperaturas elevadas. Tambin se suele utilizar de forma aplicada en el control de
microorganismos en alimentos.

Horno Pasteur (calor seco)

La esterilizacin puede llevarse a cabo mediante calor seco y en este caso se
realiza en una estufa denominada horno Pasteur (Fig. 3), en cuyo interior se disponen
los materiales que van a ser esterilizados debidamente protegidos con papel satinado,
o en contenedores especiales para evitar la contaminacin ambiental una vez
finalizado el proceso y hasta su utilizacin. La destruccin microbiana se produce por
oxidacin de los componentes celulares y desnaturalizacin de protenas. Este es un
proceso menos eficaz por la ausencia de agua y por lo tanto deben incrementarse
tanto las temperaturas como los tiempos de exposicin.

Figura 3. Horno Pasteur

La esterilizacin mediante este tratamiento, debe alcanzar temperaturas entre
160-180C y el tiempo de tratamiento oscila entre 3 horas y 30 minutos en funcin de
la temperatura seleccionada (Tabla 2).

Material

Envuelto

Sin envoltorio (rapid

Temperatura (C)

Tiempo exposicin

170

(min)
60

160

120

150

150

140

180

121
190

12hrs.
6

flow)
Envuelto (rapid flow)
190
12
Tabla 2. Temperaturas y tiempos caractersticos de esterilizacin en horno
Pasteur.

El horno Pasteur se utiliza para esterilizar productos u objetos de porcelana o

vidrio como pipetas, probetas, embudos, y generalmente aquellos materiales metlicos
que no se pueden esterilizar en autoclave por problemas de corrosin y tambin
fluidos oleaginosos. En general material o medios que resisten las temperaturas ms
elevadas que se utilizan en este aparato.
Flameado (calor seco)
La esterilizacin rpida

durante

los

procedimientos

de

trabajo

en

microbiologa se realiza por flameado (Fig. 4), mediante la exposicin directa y breve
de los materiales a la llama de un mechero. Este procedimiento est especialmente
indicado para la esterilizacin de agujas y asas de siembra, o para la boca de los
tubos y matraces, ya estriles o con cultivos, durante los procedimientos habituales de
manipulacin de microorganismos y/o medios estriles.

Figura 4. Flameado de asa de siembra o material de vidrio.

Filtracin
Las aplicaciones de la esterilizacin por filtracin son diversas en el campo de
la microbiologa, se puede aplicar para eliminar microorganismos de soluciones,
fluidos o gases o para la esterilizacin del ambiente de trabajo, en todos los casos los
microorganismos no son destruidos sino que son retenidos fsicamente o adsorbidos
por los filtros con un tamao de poro adecuado. El tamao de poro que se considera
en la actualidad esterilizante es el de 0,22 m aunque ms recientemente se tiende a la

utilizacin de poros de 0.1 m (MELTZER y JORNITZ, 2006). Se describen a

continuacin los tipos de filtros ms utilizados y sus aplicaciones ms relevantes.
Filtros de membrana. Se utilizan para esterilizar soluciones termolbiles
como son antibiticos, vitaminas, medios de cultivo lquidos que
contienen

azcares

concentraciones

elevadas

que

pueden

caramelizar, o protenas que pueden desnaturalizarse por el calor, de tal

forma que los microorganismos quedan retenidos en el filtro, y el lquido
filtrado se encuentra estril.
Los filtros son de muy variada composicin dependiendo de su aplicacin,
normalmente son de steres de celulosa (acetato de celulosa, nitrato de celulosa)
politetrafluoretileno (PTFE o tefln), fluoruro de polivinilo hidrofbico (PVDF), etc.
Dependiendo del volumen a esterilizar son de distinto tamao (dimetro) y se utilizan
en distintos mecanismos. Para volmenes grandes, la solucin se pasa a travs del
filtro montado sobre un soporte y conectado a una bomba de vaco que facilita la
succin (Fig. 5). Previamente a la filtracin se debe esterilizar todo el equipo que va a
estar en contacto con la solucin a esterilizar, como el soporte y embudo para filtros y
el kitasato que recibir el medio estril. Todo este material puede ser de vidrio o de
policarbonato o polietileno esterilizables.

Figura 5. Mecanismos de filtracin.

Algunos filtros se venden previamente esterilizados por radiacin gamma (ver
apartado radiaciones) en carcasas plsticas (Fig. 6 Izquierda) o en bolsas hermticas
(Fig. 6 Derecha)

Figura 6. Mecanismos de filtracin de volmenes pequeos. Filtros estriles

por radiacin gamma para utilizar con jeringuilla (izquierda) o con embudo de filtracin
(derecha).
Los microorganismos son retenidos en el filtro y por lo tanto el fluido filtrado
est estril. La retencin se hace en funcin del tamao de poro existiendo filtros de
diferente tamao, los ms habituales en microbiologa han sido los de 0,45 y los de
0,22 m. Estos filtros retienen la mayora de los microorganismos pero no virus, ni
algunas bacterias pequeas (micoplasmas), por lo que ltimamente se estn utilizando
de hasta 0,1 m para aumentar el espectro de los microorganismos retenidos
(MELTZER y JORNITZ, 2006; GOMEZ y MOLDENHAUER, 2009).
Filtros de profundidad. Son columnas de materiales fibrosos o porosos
(tierra de diatomeas, lana de vidrio, materiales cermicos porosos) que
permiten retener las partculas, en este caso microorganismos y que
normalmente se utilizan para la esterilizacin de gases o como prefiltros
para otros filtros esterilizantes. Los filtros de seguridad son importantes
para las aplicaciones de bioseguridad. Estas pueden desarrollarse en
una cabina de seguridad biolgica con flujo de aire que pasa
previamente a travs de un filtro de profundidad llamado filtro de aire

particulado de alta eficacia (HEPA).

Filtros HEPA. Buena parte de las manipulaciones propias de la
microbiologa deben realizarse en condiciones de esterilidad total para
evitar la contaminacin de los medios o cultivos y la seguridad de los
trabajadores, para ello se usan las cabinas de seguridad biolgica con
flujo de aire campanas o cmaras de flujo laminar (Fig. 7), se trata de

equipos que crean un rea de trabajo libre de partculas contaminantes,

pasando el aire ambiente a travs de filtros y produciendo un flujo
laminar sobre la zona de trabajo que provoca una presin positiva
constante que previene la infiltracin de aire contaminado y se mantiene
as la zona en esterilidad.

Figura 7. Campana de seguridad biolgica con flujo de aire

La esterilidad en estas cmaras se consigue mediante el sistema de filtracin
del aire, generalmente filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air), formados por una
matriz de fibras de fibra de vidrio. Estos filtros retienen partculas de hasta 0,3-0,12
micrmetros (m) de dimetro y pueden estar montados en cmaras de flujo laminar
de distinto tipos, en funcin del riesgo para el manipulador (normativa UNE-EN 12469).
En stas el aire ambiente se pasa a travs de un prefiltro y un filtro HEPA antes de
entrar en la zona de trabajo manteniendo una velocidad media del aire en esa zona
entre 0,4 y 0,5 m/s que produce una barrera o cortina de aire estril. Hay cmaras de
flujo vertical donde la corriente de aire se establece desde la parte superior a la
inferior, crendose as una cortina vertical de aire estril que protege a la persona que
est trabajando con microorganismos de riesgo, y a los cultivos o medios de
contaminacin externa. Tambin hay campanas de flujo horizontal, el aire del exterior
es absorbido horizontalmente y que se emplean para trabajos con microorganismos
que no reporten riesgos para el operador.

Las cmaras suelen estar provistas adems de lmparas UV que mantienen

el interior estril (ver radiaciones), mientras no se utilizan, o inmediatamente antes de
su uso. Externamente suelen presentar unos indicadores con las horas de utilizacin
(para el control de la vida til del filtro HEPA), luz ultravioleta, luz visible, etc.
Radiaciones
Las radiaciones de distinto tipo se utilizan tambin en microbiologa con la
finalidad de la esterilizacin (LAMBERT y HANSEN, 1998). La ms utilizada en el
laboratorio de microbiologa es la radiacin ultravioleta (UV) de una longitud de onda
de unos 260 nm. Aunque suele ser poco eficaz debido a su escaso poder de
penetracin en los materiales, tales como vidrio, agua, pelculas de suciedad, sin
embargo, es muy til para esterilizar el aire y las superficies, as, se suelen colocar en
cabinas de flujo laminar, en habitaciones estriles, quirfanos, etc. Otras radiaciones,
como los rayos gamma, radiaciones electromagnticas ms penetrantes, por su menor
longitud de onda (<0,1 nm), suelen ser ms efectivas como agentes esterilizantes,
pero suelen tener menor uso en el laboratorio microbiolgico y sin embargo, un uso
industrial muy extendido. Son la opcin adecuada para esterilizar equipos o medios
sensibles al calor, as se emplean por ejemplo para la esterilizacin de material
plstico de un solo uso o para material quirrgico desechable, para ciertos alimentos,
etc.
Esterilizantes gaseosos
Dentro de este apartado incluimos todos aquellos compuestos qumicos que
se suelen utilizar como esterilizantes, y que se suelen utilizar en fase gaseosa
generalmente. Entre estos compuestos ya hemos mencionado el xido de etileno o el
formaldehdo. Estos suelen utilizarse para esterilizar materiales sensibles al calor o
que no pueden someterse a radiaciones. Sus aplicaciones suelen darse en la industria
farmacutica o en medicina. El compuesto ms utilizado es el xido de etileno, que
acta por medio de su actividad alquilante sobre los hidrgenos lbiles en cidos
nuclicos y otras macromolculas, inactivndolas. El proceso de esterilizacin en
estos casos suele darse en cmaras hermticas y suele requerir en general tiempos
de exposicin largos (30 minutos - 18 horas). Aunque procesos a temperaturas entre

60- 80C pueden disminuir el tiempo de exposicin (30 min-6 h) (BLOCK, 2001). Suele
ser poco usado en el trabajo rutinario del laboratorio microbiolgico.
Metodologas de esterilizacin final
Su finalidad es destruir los microorganismos con los que se ha trabajado y
descontaminar el material utilizado antes de que sea desechado. Generalmente se
hace por calor hmedo en autoclave, o por incineracin.
Cuando se utiliza el calor hmedo en autoclave, por ejemplo a 121C, durante
20 minutos; la temperatura y tiempo de eleccin son irrelevantes, siempre que sean
esterilizantes, ya que las precauciones para evitar la alteracin de medios de cultivo y
materiales en este caso, ya no tienen importancia. El material contaminado (placas,
tubos, medios, etc) se suele introducir en bolsas especiales para su utilizacin en
autoclave (Fig. 8), que se colocan en contenedores apropiados para las condiciones
usadas en el autoclave.

Figura 8. Bolsas autoclavables para esterilizacin y bolsa conteniendo

material para eliminar ya esterilizado, en un contenedor apropiado.
Incineracin (calor seco)
La esterilizacin de cierto tipo de material por incineracin, se realiza en aquel
material contaminado de desecho antes de ser eliminado. Este procedimiento es
caracterstico en la eliminacin de material sanitario desechable contaminado. En este
caso, se suelen utilizar contenedores apropiados de un solo uso (Fig. 9) que tienen
cierre hermtico una vez llenos. En estos se recolecta el material contaminado
(puntas, agujas, gasas, etc) y sern posteriormente incinerados con su contenido.

Figura 9. Contenedores de diversos tamaos para la eliminacin de material

contaminado para incineracin.
Control de esterilizacin
Los procesos de esterilizacin deben disponer de sistemas o mecanismos
que nos permitan garantizar y controlar que el proceso se ha realizado con xito.
Existen diferentes mecanismos para ello:
Sistemas de control fsico. Lo ms bsico es el control mecnico de las
temperaturas (sensor de temperatura) que permita realizar un registro
de las temperaturas alcanzadas en el interior durante todo el proceso.

Son sistemas requeridos en los laboratorios acreditados.

Sistemas de control qumico. Son habitualmente sistemas constituidos
por

cintas

adhesivas

impregnadas

en

compuestos

qumicos

termosensibles, sensibles a radiaciones o al xido de etileno que

cambian de color si el proceso se ha desarrollado de forma correcta, es
decir, si se ha alcanzado la temperatura adecuada, si ha sido irradiado,
o si ha estado expuesto a xido de etileno. Ests tiras se adhieren al
material a esterilizar de forma que el cambio de color supone una
garanta de la temperatura alcanzada. Se utiliza de forma rutinaria en
los laboratorios de microbiologa (Fig. 10).

Figura 10. Cinta adhesiva termosensible para el control de esterilizacin por

calor.

Sistemas de control biolgico. Se refieren a la utilizacin de

microorganismos o esporas resistentes a distintos procesos de
esterilizacin, como temperaturas elevadas, xido de etileno, etc. Estas
bacterias vienen preparados en tiras impregnadas o en suspensiones
en ampollas cerradas que se exponen al proceso de esterilizacin, por
ejemplo en autoclave, junto con el material que se va a esterilizar. Una
vez finalizado el proceso, se cultiva el microorganismo en las
condiciones habituales en microbiologa. La ausencia de crecimiento
despus de un tiempo prudencial de incubacin en las condiciones
adecuadas significa que el proceso de esterilizacin es correcto. Para
este fin se suele trabajar con bacterias que forman endosporas por su
especial caracterstica de resistencia (especialmente termorresistencia)
a distintos procesos de esterilizacin, por ejemplo, algunas especies del
gnero Bacillus (Bacillus stearothermophilus, B. subtilis var. Nger, B.
pumilus) son utilizadas comnmente como organismos de validacin de
esterilizacin en los autoclaves de vapor.

Estndares de esterilizacin
La validacin de calidad en los procesos de esterilizacin, sigue una
normativa publicada y consensuada en las normas ISO (International Organization for
Standardization) que est especficamente creada para productos utilizados en salud,
y material mdico, aunque realmente muchos de ellos sirven para cualquier proceso
de esterilizacin. En los ltimos aos, los estndares de esterilizacin europeos (EN
550, EN 552 y EN 554), fueron revisados para convertirse en estndares ISO.
Previamente las normas ISO relacionadas con estas (ISO 11135, ISO 11137 e ISO
11134 respectivamente) tambin fueron reemplazados (ver recursos electrnicos:
Global Sterilization: Making the Standards Standard y Changes in sterilization
standards). Estas normas se han ido publicando sucesivamente en varios aos en

nuevos documentos que se detallan a continuacin (Tabla 3). Los nuevos estndares
siguen un formato comn, proporcionando definiciones consistentes y utilizando un
sistema de calidad comn.
En estas normativas se detallan los procesos y mecanismos adecuados y
consensuados de calidad en la utilizacin de esterilizacin, y que son requeridos a
todos aquellos laboratorios de microbiologa que pretendan obtener una certificacin
de calidad.

Norma
ISO

17665-

Protocolo

Publicacione

Esterilizacin
Calor (Hmedo)

1:2006
ISO/TS

Calor (Hmedo)

17665-2:2009
Esterilizacin

con

ISO
vapor a baja de
25424:2009
temperatura

formaldehdo.
ISO

Radiacin

11137:2006

Parte1
Parte2
Parte 3

ISO

xido de etileno
Parte1

11135:2007

Parte 2
ISO/TS

xido de etileno

11135-2:2008
ISO

Indicadores

14161:2009

bilgicos
Parte1

ISO
11138:2006

Indicadores

Parte2

bilgicos

Parte3
Parte4

Parte 5
Tabla 3. Normas ISO sobre esterilizacin (Sterilization of health care products
or medical devices) y control de esterilizacin.
II.

MATERIALES Y MTODOS

II.1.
II.1.1.
II.1.2.
II.1.3.
II.1.4.
II.1.5.
II.1.6.

Materiales
Pipeta
Caja Petri
Tubo de ensayo
Papel
Pabilo
Algodn

II.2.

Mtodos

II.2.1. Lavar el material de laboratorio, principalmente la cristalera con detergente

enjuaga con abundante agua de la llave y en seguida con agua destilada.
II.2.2. Secar el material utilizando papel absorbente para acelerar el secado.
II.2.3. Empaca el material correctamente.

II.2.3.1.

Caja Petri:

II.2.3.2.

Corta el papel estraza, en forma de rectngulos adecuados para cada caja

Petri.

II.2.3.3.

Colcalas en la parte central y Envulvelas, se toman los extremos de

Papel y se unen.

II.2.3.4.

Se hace un nuevo doblez recargando ligeramente en la caja para marcarlo.

II.2.3.5.

Los extremos se doblan en forma triangular.

II.2.3.6.

Ya en forma triangular se doblan hacia atrs quedando listas para

esterilizar.

II.2.3.7.

Pipeta

II.2.3.8.

Con tiras de papel de 2 - 3 cm de ancho envulvelas.

2.2.3.8.

Comenzando por la punta.

2.2.3.9.

En forma de espiral gira hacia arriba hasta el final de la pipeta.

2.2.3.10.

Tubo de ensayo

2.2.3.11.

Doblar el algodn en tres partes.

2.2.3.12.

Envolverlo en s mismo dando forma de un tubo.

2.2.3.13.

El algodn debe entrar en entrada del tubo de ensayo con

facilidad.

PREPARACION DE LA
TORUNDA

Se corta una tira de algodn, de

acuerdo a las necesidades.

Se dobla en dos partes iguales.

Se enrolla el algodn de manera

que quede firme el enrollado.

III.

Se coloca en el tubo de
Ensayo.

RESULTADOS Y DISCUSIONES
III.1. Resultados

IMAGEN

III.2. Discusiones
La duracin de la esterilidad de un material no est relacionada
directamente con el tiempo, sino con factores que comprometen su
exposicin al medio ambiente.
Dejar que los materiales que salen del horno o el autoclave alcancen la
temperatura ambiente antes de ser almacenados; de esta forma se evita la
condensacin dentro del empaque.
IV.

CONCLUSIONES

IV.1.

En el laboratorio de microbiologa se aprendi la metodologa

para envolver los instrumentos antes de la esterlizacion, tanto
de cajas Petri, pipetas o de tubos de ensayo.

V.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

V.1.

BLOCK, S.S. 2001. Disinfection, sterilization and preservation.

V.2.

5 th Ed. Lippincott Williams y Wilkins Eds. Philadephia.

CHAMBERLAND, C. 1884. Sur un filtre donnant de leau

V.3.

physiologiquement pure. Compt. Rend. Acad. d. sc. Paris.

GOMEZ, M. Y MOLDENHAUER, J. 2009. Biological indicators
for sterilization processes. PDA Books. Davis Healthcare

V.4.

International Publishing, LLC. Bethesda.

LAMBERT B.J. Y HANSEN J.M. 1998. ISO radiation

V.5.

sterilization standards. Radiation Physics and Chemistry.

LEAHY, T.J.; KERRY, L.R. Y CHRISTOPHER, M.R. 1999.
Microbiology of sterilization processes. En: Validation of
pharmaceutical processes: sterile product. Carleton, F.J. y

V.6.

Agalloco, J.P.
LEWIS, R.E. 2002. Practical guide to autoclave validation.

V.7.

Pharmaceutical Engineering. ISPE 2002.

MELTZER T.H. Y JORNITZ, M.W. 2006. Chapter 1. The
sterilizing

filter.

En:

Pharmaceutical

Filtration:

Management of Organism Removal. PDA Books.

The

V.8.

PREZ B. Y TORRALBA, M. R. 2010. Metodologa de

esterilizacin en el laboratorio de microbiologa. Reduca
(Biologa): Serie Microbiolgica.

VI.
CUESTIONARIO
VI.1. Cuntos tipos de esterilizacin existen?
VI.1.1. ESTERILIZACIN POR MTODOS FSICOS
VI.1.1.1. Calor seco (estufa u horno)
El calor seco produce desecacin de la clula, efectos txicos por
niveles elevados de electrolitos, procesos oxidativos y fusin de membranas.
Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los
microorganismos que estn en contacto con stos. El aire es mal conductor del
calor, y el aire caliente penetra ms lentamente que el vapor de agua en
materiales porosos. La accin destructiva del calor sobre protenas y lpidos
requiere mayor temperatura cuando el material est seco o la actividad de
agua del medio es baja. Esto se debe a que las protenas se estabilizan
mediante uniones puente de hidrgeno intramoleculares que son ms difciles
de romper por el calor seco.
La estufa de esterilizacin es el artefacto utilizado en los laboratorios
para esterilizar por calor seco. Se requiere mayor temperatura y tiempo de
exposicin que el autoclave. La temperatura vara entre 120 y 180C,
requirindose distintos tiempos de exposicin. A 140C se necesitan por lo
menos 5 horas de exposicin, mientras que a 160C se requieren al menos 2
horas de exposicin.
Sirve para esterilizar material de vidrio. El papel y el algodn no
pueden ser esterilizados a ms de 160C.

Ventajas
No es corrosivo para metales e instrumentos.
Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y de

sustancias viscosas no voltiles.

Desventajas

Requiere mayor tiempo de esterilizacin, respecto al calor hmedo,

debido a la baja penetracin del calor.

Existen otras formas de eliminar microorganismos por calor seco. La

incineracin se utiliza para destruir material descartable contaminado. La accin
directa de la llama (6.1.1.8) elimina a los microorganismos cuando se lleva al rojo el
material de metal como hansas, lancetas, agujas de diseccin.
VI.1.1.2.

Calor Hmedo (autoclave)

El calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas.

Estos efectos se deben principalmente a dos razones:

El agua es una especie qumica muy reactiva y muchas estructuras biolgicas (DNA,
RNA, protenas, etc.) son producidas por reacciones que eliminan agua. Por lo tanto,
reacciones inversas podran daar a la clula a causa de la produccin de productos
txicos. Adems, las estructuras secundarias y terciarias de las protenas se
estabilizan mediante uniones puente de hidrgeno intramoleculares que pueden ser
reemplazadas y rotos por el agua a altas temperaturas.

El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho ms elevado

que el aire. Por lo que, los materiales hmedos conducen el calor mucho ms
rpidamente que los materiales secos debido a la energa liberada durante la
condensacin.
El autoclave es el aparato ms comnmente utilizado en los laboratorios para
esterilizar cultivos y soluciones que no formen emulsiones con el agua y que no se
desnaturalicen a temperaturas mayores a 100C. Una temperatura de 121 C (una
atmsfera de sobrepresin) con un tiempo de exposicin mayor a 15 minutos sirve
para destruir organismos formadores de esporas.

Presin
[atm]

Temperatura
[C]

Descarga
completa del
aire

Descarga de
2/3 del aire

Descarga de
1/2 del aire

Sin
descarga
del aire

1/3

109

100

90

72

2/3

115

109

100

90

121

115

109

100

4/3

126

121

115

109

5/3

130

126

121

115

133

130

126

121

Influencia de la descarga incompleta de aire en la temperatura del autoclave

Ventajas

Rpido calentamiento y penetracin

Destruccin de bacterias y esporas en corto tiempo

No deja residuos txicos

Hay un bajo deterioro del material expuesto

Econmico

Desventajas

No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua

Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos

VI.1.1.3.

Radiaciones ionizantes ( gamma, beta y ultravioleta)

Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los cidos
nucleicos, estructuras proteicas y lipdicas, y componentes esenciales para la
viabilidad de los microorganismos.
Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales
termolbiles (termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se utilizan a
escala industrial por sus costos.
No se utilizan para medios de cultivo o soluciones proteicas porque producen
alteraciones de los componentes.

Ultravioletas
Afectan a las molculas de DNA de los microorganismos debido a que forman dmeros
de pirimidinas adyacentes que inducen errores en la duplicacin y por lo tanto la
prdida de la viabilidad de las clulas.
Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies.

VI.1.1.4. Ondas supersnicas

Este aparato est formado por un foco emisor de alta frecuencia que causa
vibraciones en las molculas de los microorganismos. Dichas vibraciones se
transforman, por friccin interna, en calor y de esta forma se altera y se desactiva todo
tipo de estructura viva. El instrumental se coloca en un contenedor cubierto por bolitas
de vidrio humedecidas con un lquido (ortobencil paraclorofenato de sodio). El tiempo
de esterilizacin es de 90 segundos.
VI.1.1.5. Filtracin
Es un proceso que impide el paso de microorganismos de un ambiente a otro.
Se utiliza en la industria farmacutica, en soluciones termolbiles que no pueden sufrir
la accin del calor. Actualmente este mtodo se usa en los compresores de aire que
utilizan filtros coalescentes que filtran partculas hasta 0,001 pm (99,9 % de pureza).
VI.1.1.6.

Ebullicin

Se pueden usar 2 tipos de lquidos: agua y aceite

Agua en ebullicin. El agua hierve a 100C, este sistema ofrece todas las
garantas de esterilizacin siempre y cuando se cumpla el tiempo en que el material
debe permanecer en ebullicin, para lograr la muerte de las bacterias, no as las de las
esporas que an siguen resistentes. Aqu por supuesto no se puede esterilizar gasas,
artculos de papel (conos) etc. Tiempo de ebullicin establecido: 20 minutos.
Aceite en ebullicin. Para esto se utiliza un aceite especial voltil,
aprovechando la ventaja de que el aceite hierve a una temperatura mayor que la del
agua, la que puede llegar a 300C. Desde luego, no hace falta que hierva, basta con
mantener el instrumental a 130C Tiempo de ebullicin establecido: 20 minutos.
VI.1.1.7. Flameo
Se trata del calor que produce una llama de gas o alcohol; es un
procedimiento de emergencia y consiste en colocar directamente en la llama el objeto
que se desea esterilizar. Con la llama se consigue una temperatura muy alta que
puede exceder, en la de gas, los 1000C. Esta temperatura tan elevada deteriora el
instrumento, y para evitarlo, se debe colocar por encima de la llama a fin de que no
reciba directamente el calor de esta.
VI.1.1.8. Microesferas de Vidrio
Este tipo de esterilizacin se realiza con un equipo que contiene un recipiente
con microesferas de vidrio que son calentadas elctricamente y que pueden ser
sustituidas por sal comn o arena. Se usa para esterilizar instrumental pequeo de
Endodoncia, conos de papel o bolillas de algodn, que se introducen en el
compartimiento durante 15 a 20 segundos a temperatura de 250 C. Su uso es
cuestionado.
VI.1.2. ESTERILIZACIN POR MTODOS QUMICOS
Dentro de los compuestos qumicos podemos encontrar agentes
esterilizantes, desinfectantes y antispticos.
La efectividad de estos agentes depende de las condiciones bajo las que actan.

Concentracin: vara con el tipo de agente y de microorganismo, pues una

misma concentracin del agente puede producir un efecto diferente en distintos
microorganismos.

Tiempo: los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma

forma, por lo que no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo.

pH: afecta tanto a los microorganismos como a los agentes qumicos. El

aumento de pH por encima de 7 incrementa la carga negativa de los
microorganismos afectando la concentracin del agente sobre la clula. El pH
determina el grado de disociacin y la efectividad del agente qumico, pues a
menor disociacin mayor permeabilidad y mayor efectividad.

Alcoholes
Iodo
Agentes

catinicos,

aninicos

Antispticos
anfteros
rgano Mercuriales
Colorantes
Cloro y Compuestos clorados
Desinfectantes

y/o

Aldehdos
xido de Etileno

Esterilizantes

Compuestos Fenlicos
cidos y lcalis

VI.1.2.1. xido de etileno

Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgenos lbiles
como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.

Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria

farmacutica. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable y
plstico, equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias, etc. Es muy peligroso por
ser altamente inflamable y explosivo, y adems cancergeno.
VI.1.2.2. Formaldehdo
Aldehdos
Son agentes alquilantes que actan sobre protenas, lo que provoca
modificacin irreversible de enzimas e inhibicin de la actividad enzimtica (Adicin
nucleoflica de grupos -NH2 y -SH). Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes.
Destruyen esporas.
El glutaraldehdo es el nico esterilizante efectivo en fro. El formaldehdo
como gas se utiliza para descontaminar edificios, ambientes, etc. El formaldehdo
gaseoso se obtiene por calentamiento del paraformaldehdo (OH (CH2O)n-H), lo que
produce las despolimerizacin de este compuesto y la liberacin de formaldehdo.
El formaldehdo tiene la desventaja de ser muy irritante y perder actividad en
ambientes refrigerados.
VI.1.2.3. Agentes oxidantes
IODO
Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de protenas y cidos
nucleicos. Inactiva protenas y enzimas por oxidacin de los grupos -SH a S-S,
pudiendo atacar tambin grupos amino, indoles, etc.
Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo: yodo molecular 2% y
yoduro de sodio 2% en alcohol), aunque es irritante.
Es efectivo contra esporas en una concentracin de 1600 ppm de iodo libre.
VI.1.2.4.

Soluciones antispticas

ALCOHOLES
Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan
protenas celulares. Desorganizan la estructura fosfolipdica.
No destruyen esporas y tienen una accin germicida lenta. Los alcoholes de
cadena corta tienen un efecto nocivo mayor que los de cadena larga.
Se utilizan en concentraciones del 50 al 70%. Los ms utilizados son el etanol
e isoproplico.

VI.1.2.5.

Agentes inicos y anfteros

Son sustancias que lesionan la membrana celular debido a que desordenan la
disposicin de las protenas y de los fosfolpidos, por lo que se liberan metabolitos
desde la clula, se interfiere con el metabolismo energtico y el transporte activo.
No son esporicidas ni tubercolicidas an en altas concentraciones. Sus principales
ventajas se hallan en que son inodoros, no tien, no son corrosivos de metales,
estables, no txicos y baratos.

Catinicos: Sales de amonio cuaternarias. Tienen mayor actividad a pH alcalino

y los Gram + son ms susceptibles.

Aninicos: Jabones y cidos grasos. Tienen mayor actividad a pH cido y son

eficaces contra Gram +.

VI.1.2.6.

Anfteros: Actan como catinicos o aninicos segn el pH.

rgano mercuriales
Estos tipos de compuestos se combinan con los grupos -SH de las protenas,
inactivando enzimas. Dentro de los mercuriales orgnicos se encuentran el metafen y
el mertiolate.

VI.1.2.7.

Perxido de Hidrgeno

Es un antisptico dbil, con capacidad oxidante y formadora de radicales

libres.
Actualmente, el perxido de hidrgeno gaseoso se est utilizando como
desinfectante de superficies o descontaminante de gabinetes biolgicos debido a que
no posee las propiedades txicas y cancergenas del xido de etileno y formaldehdo.

VI.1.2.8.

Colorantes
Interfieren en la sntesis de cidos nucleicos y protenas (acridina) o
interfieren en la sntesis de la pared celular (derivados del trifenilmetano). La acridina
se inserta entre dos bases sucesivas del DNA separndolas fsicamente. Esto provoca
errores en la duplicacin del DNA. Los derivados del trifenilmetano (violeta de
genciana, verde de malaquita y verde brillante) bloquean la conversin del cido UDPacetilmurmico en UDP-acetilmuramil-pptido.

R = HSO4- Verde Brillante

R = Cl- Verde de Malaquita

Violeta de Genciana

VI.1.2.9.

Desinfectantes y/o Esterilizantes

Cloro
El cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actan sobre
protenas y cidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan grupos -SH, y atacan
grupos aminos, indoles y al hidroxifenol de la tirosina.

El producto clorado ms utilizado en desinfeccin es el hipoclorito de sodio

(agua lavandina), que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y
adems es efectivo en un amplio rango de temperaturas.
La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al cido hipocloroso
(HClO) y al Cl2 que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua. La actividad
germicida del ion hipocloroso es muy reducida debido a que por su carga no puede
penetrar fcilmente en la clula a travs de la membrana citoplamtica. En cambio, el
cido hipocloroso es neutro y penetra fcilmente en la clula, mientras que el
Cl2 ingresa como gas.
El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas (50-100 g/l
de Cloro activo), a pH alcalino y en envases oscuros que favorecen su estabilidad,
pero es inactivo como desinfectante. A causa de sto, es que deben utilizarse
soluciones diluidas en agua corriente (que tiene un pH ligeramente cido), con el
objeto de obtener cido hipocloroso. Generalmente, se utilizan soluciones con una
concentracin del 0.1-0.5% de Cloro activo.

Su actividad est influida por la presencia de materia orgnica, pues puede

haber en el medio sustancias capaces de reaccionar con los compuestos clorados que
disminuyan la concentracin efectiva de stos.

VI.1.2.10. Compuestos Fenlicos

Son desinfectantes que provocan lesiones en la membrana citoplasmtica

porque desordenan la disposicin de las protenas y fosfolpidos. Esto causa filtracin
de compuestos celulares, inactivacin de enzimas y lisis.
El fenol no es usado a menudo como desinfectante por su olor desagradable,
por ser muy irritante y por el resido que queda luego de tratar las superficies.
Los derivados del fenol ms utilizados son el hexaclorofeno (compuesto
difenlico) y los cresoles (alquil fenoles). Estos son muy efectivos a bajas
concentraciones contra formas vegetativas de bacterias. No son efectivos contra
esporas.

VI.2.

Cules son los mtodos de propagacin del calor?

El calor se puede transferir en tres modos diferentes: conduccin, conveccin

y radiacin. Todos los modos de transferencia de calor requieren de la existencia de
una diferencia de temperatura y todos ellos ocurren del medio que posee la
temperatura ms elevada hacia uno de temperatura ms baja. En seguida una breve
descripcin de cada modo.
Conduccin:
La conduccin es la transferencia de energa de las partculas ms
energticas de una sustancia hacia las adyacentes menos energticas, como

resultado de interacciones entre esas partculas. La conduccin puede tener lugar en

los slidos, lquidos o gases. En los gases y lquidos la conduccin se debe a las
colisiones y a la difusin de las molculas durante su movimiento aleatorio. En los
slidos se debe a la combinacin de las vibraciones de las molculas en una retcula y
al transporte de energa por parte de los electrones libres. Por ejemplo, llegara el
momento en que una bebida en latada fra en un cuarto clido se caliente hasta la
temperatura ambiente como resultado de la transferencia de calor por conduccin,
entre el cuarto hacia la bebida, a travs del aluminio.
Conveccin:
La conveccin es el modo de transferencia de energa entre una superficie
slida y el lquido o gas adyacentes que estn en movimiento y comprende los efectos
combinados de la conduccin y el movimiento de fluidos. Entre ms rpido es el
movimiento de un fluido, mayor es la transferencia de calor por conveccin. En
ausencia de cualquier movimiento masivo del fluido acrecienta la transferencia de
calor entre una superficie slida y el fluido adyacente es por conduccin pura. La
presencia de movimiento masivo del fluido acrecienta la transferencia de calor entre la
superficie slida y el fluido, pero tambin complica la determinacin de las velocidades
de esa transferencia.
Considere el enfriamiento de un bloque caliente al soplar aire frio sobre su
superficie superior. La energa se transfiere primero a la capa de aire adyacente al
bloque, por conduccin. En seguida, esta energa es acarreada alejndola de la
superficie, por conveccin, es decir por los efectos combinados de la conduccin
dentro del aire, que se debe al movimiento aleatorio de molculas de ste, y del
movimiento masivo o macroscpico de ese aire que remueve el aire calentado cercano
a la superficie y lo reemplaza por aire ms frio.
La conveccin recibe el nombre de conveccin forzada si el fluido si el fluido
es forzado a fluir sobre la superficie mediante medios externos como un ventilador,
una bomba o el viento. Como contraste, se dice que es conveccin natural (o libre) si
el movimiento del fluido es causado por las fuerzas de empuje que son inducidas por
las diferencias de densidad debidas a la variacin de la temperatura en el fluido.

Radiacin:
La radiacin es la energa emitida por la materia en la forma de ondas
electromagnticas (o fotones), como resultado de los cambios en las configuraciones
electrnicas de los tomos o molculas. A diferencia de la conduccin y la conveccin
la transferencia de energa por radiacin no requiere la presencia de un medio
interpuesto. De hecho, la transferencia de calor por radiacin es la ms rpida (a la
velocidad de la luz) y no sufre atenuacin en el vaco. De esta manera llega a la tierra
la energa del sol.
VI.3. Qu tipo de materiales se esterilizan por material hmedo?
Materiales de laboratorio a excepcin de materiales metlicos o cortantes, ya
el proceso de esterilizacin en autoclave, pierden filo por la corrosin. As mismo est
prohibido esterilizar grasas, aceites, vaselina, talco en paquetes y vendajes
con nitrofurazona (Furacn) o con vaselina. No se
VI.4. Cmo funciona la esterilizacin por radiacin Gamma?
La radiacin gamma funciona como esterilizante, gracias a la alta energa que
llevan los electrones acelerados por el cobalto radioactivo por maquinas especiales,
que penetran la materia y ionizan el agua lo cual hace que formen radicales hidroxilos
altamente reactivos (radical libre hidroxilo). Este radical libre de hidroxilo se forma en
el citoplasma y destruye el ADN, lo cual impide su reproduccin.
VI.5. Qu tipo de materiales para uso en el laboratorio se esteriliza con
radiacin Gamma?
Se usan en la industria de artculos mdicos, odontolgicos y farmacuticos.
No es muy utilizada para esterilizaciones rutinarias.
VI.6. En qu se fundamenta la muerte de clulas vegetativas, esporas
por efecto del calor?
La muerte de las