Universidade Federal Do Rio Grande Do Sul Faculdade de Farmácia Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE FARMCIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS FARMACUTICAS
Avaliao da fotoestabilidade do cetoconazol e determinao da atividade

antifngica e da segurana biolgica in vivo e in vitro do xampu de
cetoconazol
Tese de Doutorado
Inara Staub
Porto Alegre, 2005.


cetoconazol
INARA STAUB
Porto Alegre, 2005.


cetoconazol
Tese apresentada por Inara Staub para

obteno do TTULO DE DOUTOR em
Cincias Farmacuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Maria Bergold

Co-orientadora: Profa. Dra. Elfrides Eva Scherman Schapoval
Porto Alegre, 2005.
Tese apresentada no Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas

da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e aprovada em 06 de julho de 2005,
pela Comisso Examinadora constituda por:
Profa. Dra. Hrida Regina Nunes Salgado

Universidade Estadual Paulista
Prof. Dr. Alex Flores

Universidade Federal de Santa Maria
Profa. Dra. Teresa Dalla Costa

Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Prof. Dr. Martin Steppe

Universidade Federal do Rio Grande do Sul
CATALOGAO NA PUBLICAO
S798a
Staub, Inara
Avaliao da fotoestabilidade do cetoconazol e determinao da
atividade antifngica e da segurana biolgica in vivo e in vitro do
xampu de cetoconazol / Inara Staub Porto Alegre: UFRGS, 2005. p.224: il., tab., grf.
Tese (doutorado). UFRGS. Faculdade de Farmcia. Programa de
Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas.
1. Cetoconazol. 2. Xampus. 3. Antifngicos. 4. Fotoestabilidade.
5. Validao: mtodo de anlise de frmacos. I. Bergold, Ana
Maria.; II. Schapoval, Elfrides Eva Scherman. III. Ttulo.
CDU: 615.2.011
Bibliotecria Responsvel:
Margarida Maria Cordeiro Fonseca Ferreira CRB10/480
Agradecimentos a CAPES, rgo que financiou

a bolsa de estudos para o desenvolvimento deste trabalho,
e aos Laboratrios de Qumica Farmacutica e Controle
de Qualidade que disponibilizaram todos equipamentos
e materiais necessrios para a realizao dos experimentos.
A vida pode florescer

numa existncia inteira.
Mas tem de ser buscada, tem de ser
conquistada.
Lya Luft
Ao Auro, meu noivo,

por todo amor e carinho.
A minha famlia,
por sempre
acreditar em mim.
Agradecimentos
Profa. Dra. Ana Maria Bergold meu agradecimento pela convivncia,
amizade, incentivo, conhecimento cientfico e ajuda de quem foi fundamental para a
realizao deste trabalho.
Profa. Dra. Elfrides Eva Scherman Schapoval pela receptividade,
esclarecimentos e incentivo durante o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Auro pelo amor, carinho, compreenso e constante incentivo.
A minha famlia pelo carinho e apoio em mais esta etapa da minha vida.
Aos Laboratrios de Qumica Farmacutica e Controle de Qualidade pela
disponibilizao dos equipamentos e materiais necessrios para o desenvolvimento
do trabalho.
Aos professores do Laboratrio de Qumica Farmacutica: Dr. Pedro
Eduardo Frehlich, Dr. Jarbas Alves Montanha e Dra. Grace Gosmann pelos
esclarecimentos.
Profa. Dra. Adriana Pohlman pela receptividade e pelo auxlio na
interpretao dos dados dos mtodos espectroscpicos.
Profa. Dra. Terezinha de Jesus Andreoli Pinto e Dra. urea Silveira Cruz,
do Instituto Adolfo Lutz, pelo auxlio na execuo e interpretao dos dados da
avaliao da segurana biolgica.
Aos Laboratrios de Ressonncia Magntica Nuclear do Instituto de Qumica
(UFRGS) e Ressonncia Magntica Nuclear do Departamento de Qumica (UFSM)
pela execuo das anlises de RMN.
Ao Dr. Pascal Sonnet da Facult de Pharmacie, Universit Picardie Jules
Verne (Amiens-Frana) pela execuo das anlises de RMN.
Ao Centro Bioanaltico de Medicamentos (CBIM-UFRGS) pela execuo
das anlises de espectrometria de massas.
Aos amigos e colegas do Laboratrio de Qumica Farmacutica: Eliane,
Carolina, Vanessa, Alexandre, Sirlei, Andra, Marins, Lidiane, Liliana, Rochele,
Letcia, Tiago, Tiago Mota, Marquinho, Luis, Slvio, Jeferson, Raquel e Larissa
pelo convvio e amizade.
Aos amigos e colegas do Laboratrio de Controle de Qualidade: Cristiane,
Cssia, Ana Rita, Vanessa e Jlia pela ajuda durante a realizao dos ensaios
microbiolgicos.
Aos amigos do Laboratrio de Fitoqumica: Claiton, Simone Gnoato, Simone
Quintana e Juliane pela ajuda durante o isolamento dos produtos de degradao.
viii
SUMRIO
AGRADECIMENTOS..........................................................................................................vi
SUMRIO..........................................................................................................................viii
LISTA DE TABELAS........................................................................................................xvi
LISTA DE FIGURAS..........................................................................................................xx
LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................................xxvii
RESUMO..........................................................................................................................xxix
ABSTRACT......................................................................................................................xxxi
1.
INTRODUO...........................................................................................................01
2.
OBJETIVOS................................................................................................................05
2.1. Objetivos gerais.............................................................................................................07

2.2. Objetivos especficos.....................................................................................................07
3.
REVISO BIBLIOGRFICA...................................................................................09
3.1. Infeces fngicas.........................................................................................................11

3.2. Pele e anexos cutneos..................................................................................................12
3.3. Pitriase versicolor e dermatite seborrica.....................................................................14
3.4. Xampus..........................................................................................................................15
3.5. Antifngicos..................................................................................................................19
3.5.1. Histrico.....................................................................................................................19
3.5.2. Cetoconazol................................................................................................................22
3.5.2.1. Uso oral...................................................................................................................23
3.5.2.2. Uso tpico................................................................................................................25
3.5.2.3. Mtodos para determinao do cetoconazol...........................................................27
ix
3.5.2.4. Estabilidade.............................................................................................................30
4.
MATERIAL E MTODOS........................................................................................33
4.1. DESCRIO GERAL..................................................................................................35

4.2. SUBSTNCIA QUMICA DE REFERNCIA (SQR)................................................35
4.3. MATRIA-PRIMA.......................................................................................................36
4.3.1. Anlise qualitativa da matria-prima.........................................................................36
4.3.1.1. Caractersticas organolpticas.................................................................................36
4.3.1.2. Determinao do ponto de fuso.............................................................................36
4.3.1.3. Rotao especfica...................................................................................................36
4.3.1.4. Cromatografia em camada delgada (CCD).............................................................37
4.3.1.5. Espectrofotometria de absoro na regio do infravermelho..................................38
4.3.1.6. Espectrofotometria na regio do ultravioleta..........................................................38
4.3.1.7. Perda por dessecao...............................................................................................38
4.3.2. Anlise quantitativa da matria-prima.......................................................................38
4.3.2.1. Volumetria em meio no-aquoso............................................................................38
4.4 FORMAS FARMACUTICAS.....................................................................................39
4.4.1. Xampu de cetoconazol 2 % preparado no laboratrio (Xb-Ceto)..............................39
4.4.1.1. Preparo do xampu base (Xb)...................................................................................39
4.4.1.2. Preparo do xampu de cetoconazol 2 % (Xb-Ceto)..................................................40
4.4.2. Xampu comercial de cetoconazol 2% (Form1 e Form2)...........................................40
4.4.3. Soluo Metanlica 2 % (Sol-ceto)............................................................................42
4.5. ANLISE DAS FORMAS FARMACUTICAS.........................................................42
4.5.1. Anlise Qualitativa.....................................................................................................42
4.5.1.2. Determinao da densidade.....................................................................................42
4.5.1.3. Determinao do pH................................................................................................43
4.5.2. Anlise Quantitativa...................................................................................................44

4.5.2.1. Cromatografia lquida de alta eficincia.................................................................44
4.5.2.1.1. Reagentes..............................................................................................................44
4.5.2.1.2. Equipamento.........................................................................................................45
4.5.2.1.3. Fase mvel............................................................................................................45
4.5.2.1.4. Condies cromatogrficas..................................................................................45
4.5.2.1.5. Validao..............................................................................................................46
4.5.2.1.5.1. Linearidade........................................................................................................46
4.5.2.1.5.2. Preciso.............................................................................................................46
A) Preparo da soluo de cetoconazol SQR........................................................................47
B) Preparo das solues amostra........................................................................................47
C) Clculos...........................................................................................................................47
4.5.2.1.5.3. Especificidade...................................................................................................48
4.5.2.1.5.4. Exatido.............................................................................................................48
4.5.2.1.5.5. Robustez............................................................................................................49
A) Estabilidade da soluo...................................................................................................49
B) Modificaes na fase mvel.............................................................................................50
4.5.2.1.5.6. Limites de quantificao e deteco..................................................................50
4.5.2.2. Ensaio microbiolgico.............................................................................................51
4.5.2.2.1. Material................................................................................................................52
4.5.2.2.2. Preparo do meio de cultura...................................................................................52
4.5.2.2.3. Preparo da soluo tampo fosfato de potssio 1 % pH 6,0.................................53
4.5.2.2.4. Preparo da soluo salina.....................................................................................53
4.5.2.2.5. Preparo do inculo................................................................................................53
4.5.2.2.6. Validao..............................................................................................................54
4.5.2.2.6.1. Preparo das solues de cetoconazol SQR........................................................54
4.5.2.2.6.2. Preparo das solues amostra............................................................................55
xi
4.5.2.2.6.3. Ensaio................................................................................................................55
4.5.2.2.6.4. Clculos.............................................................................................................56
4.5.2.2.6.5. Exatido.............................................................................................................56
A) Preparo das solues de cetoconazol SQR ....................................................................57
B) Preparo das solues amostra........................................................................................57
C) Preparo das solues R1, R2 e R3..................................................................................57
4.6. ESTUDOS DE FOTOESTABILIDADE......................................................................58
4.6.1. Avaliao do cetoconazol frente luz UV-C e luz UV-A.........................................58
4.6.1.1. Amostras expostas luz UV...................................................................................58
A) Matria-prima.................................................................................................................58
B) Soluo metanlica de cetoconazol 2 % (Sol-ceto).........................................................59
C) Xampu de cetoconazol 2 % (Xb-ceto).............................................................................59
4.6.1.2. Determinao do teor de cetoconazol.....................................................................60
4.6.2. Avaliao do cetoconazol frente luz natural............................................................60
4.6.2.1. Amostras expostas luz natural..............................................................................61
A) Matria-prima.................................................................................................................61
B) Soluo metanlica de cetoconazol 2 %.........................................................................61
C) Xampu de cetoconazol 2 %.............................................................................................61
D) Formulaes comerciais.................................................................................................61
4.6.2.2. Deteco dos produtos de degradao.....................................................................62
4.6.2.3. Determinao do teor de cetoconazol.....................................................................62
4.6.2.5. Determinao do pH................................................................................................62
4.7. ESTABILIDADE QUMICA........................................................................................63
4.7.1. Degradao cida.......................................................................................................63
A) Matria-prima.................................................................................................................63
B) Formas farmacuticas.....................................................................................................63
xii
4.7.2. Degradao alcalina...................................................................................................63

A) Matria-prima.................................................................................................................63
4.7.3. Degradao com perxido de hidrognio...................................................................64
A) Matria-prima.................................................................................................................64
4.8. ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DOS PRODUTOS DE DEGRADAO.......65
4.8.1. Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear (RMN)........................................65
4.8.1.1. Degradao das amostras........................................................................................65
4.8.1.2. Cromatografia lquida de alta eficincia semipreparativa.......................................65
4.8.1.2.1. Equipamento.........................................................................................................66
4.8.1.2.2. Fase mvel............................................................................................................66
4.8.1.2.3. Condies cromatogrficas..................................................................................66
4.8.1.3. Determinao da pureza..........................................................................................66
4.8.1.4. Concentrao das fraes........................................................................................67
4.8.1.5. Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear de 1H e 13C...............................67
4.8.2. Espectrometria de massas (MS).................................................................................68
4.8.2.1. Degradao das amostras........................................................................................68
4.8.2.2. Equipamento e condies cromatogrficas.............................................................68
4.8.2.3. Condies da espectrometria de massas - ionizao eletrospray............................69
4.9. AVALIAO DA SEGURANA BIOLGICA........................................................69
4.9.1. Avaliao da toxicidade aguda com efeito local........................................................69
4.9.1.1. Teste de irritao ocular..........................................................................................70
4.9.2. Avaliao in vitro.......................................................................................................72
4.9.2.1. Avaliao do potencial de citotoxicidade in vitro...................................................72
4.9.2.1.1. Culturas celulares.................................................................................................73
4.9.2.1.2. Mtodo de difuso em gar..................................................................................73
xiii
5.
RESULTADOS E DISCUSSO................................................................................75
5.1. MATRIA-PRIMA.......................................................................................................77
5.1.1. Anlise qualitativa da matria-prima.........................................................................77
5.1.1.2. Determinao do ponto de fuso.............................................................................77
5.1.1.3. Rotao especfica...................................................................................................78
5.1.1.5. Espectrofotometria de absoro na regio do infravermelho..................................79
5.1.1.6. Espectrofotometria na regio do ultravioleta..........................................................82
5.1.1.7. Perda por dessecao............................................................................................83
5.1.2. Anlise quantitativa....................................................................................................83
5.1.2.1. Volumetria em meio no-aquoso............................................................................83
5.2. FORMAS FARMACUTICAS....................................................................................84
5.2.1. Xampu de cetoconazol 2 % preparado no laboratrio (Xb-Ceto)..............................84
5.2.2. Xampu comercial de cetoconazol 2% (Form1 e Form2)...........................................87
5.2.3. Soluo metanlica 2 % (Sol-ceto)............................................................................88
5.3. ANLISE DAS FORMAS FARMACUTICAS.........................................................88
5.3.1. Anlise Qualitativa.....................................................................................................88
5.3.1.3. Determinao do pH................................................................................................89
5.3.2. Anlise Quantitativa...................................................................................................91
5.3.2.1. Cromatografia lquida de alta eficincia.................................................................92
5.3.2.1.1. Linearidade...........................................................................................................97
5.3.2.1.2. Preciso................................................................................................................98
xiv
5.3.2.1.3. Especificidade....................................................................................................100
5.3.2.1.4. Exatido..............................................................................................................102
5.3.2.1.5. Robustez.............................................................................................................103
5.3.2.1.6. Limites de deteco e quantificao...................................................................105
5.3.2.1.7. Validade do ensaio.............................................................................................106
5.3.2.2. Ensaio microbiolgico...........................................................................................107
5.3.2.2.1. Linearidade.........................................................................................................109
5.3.2.2.2. Preciso..............................................................................................................111
5.3.2.2.3. Exatido..............................................................................................................112
5.3.2.2.4. Validade do ensaio.............................................................................................113
5.3.2.3. Anlise comparativa dos mtodos.........................................................................114
5.4. ESTUDOS DE FOTOESTABILIDADE....................................................................115
5.4.1. Avaliao do cetoconazol frente luz UV-C e luz UV-A.......................................117
5.4.1.1. Amostras expostas luz UV.................................................................................117
A) Matria-prima...............................................................................................................117
B) Soluo metanlica de cetoconazol 2 % (Sol-ceto).......................................................119
C) Xampu de cetoconazol 2 % (Xb-ceto)...........................................................................123
5.4.2. Avaliao do cetoconazol frente luz natural..........................................................128
5.4.2.1. Amostras expostas luz natural............................................................................128
A) Matria-prima...............................................................................................................128
B) Soluo metanlica de cetoconazol 2 % (Sol-ceto).......................................................129
C) Xampu de cetoconazol 2 % (Xb-ceto) e formulaes comerciais (Form1 e
Form2)................................................................................................................................133
5.5. ESTABILIDADE QUMICA......................................................................................138
5.5.1. Degradao cida e alcalina.....................................................................................138
5.5.2. Degradao com perxido de hidrognio.................................................................139
5.6. ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DOS PRODUTOS DE DEGRADAO.....142
xv
5.6.1. Cromatografia lquida de alta eficincia semipreparativa........................................145

5.6.2. Determinao da pureza...........................................................................................145
5.6.3. Anlise do cetoconazol.............................................................................................149
5.6.4. Anlise do produto de degradao denominado Fr1................................................156
5.6.5. Anlise do produto isolado denominado Fr2...........................................................163
5.7. AVALIAO DA SEGURANA BIOLGICA......................................................170
5.7.1. Avaliao da toxicidade aguda com efeito local......................................................171
5.7.2. Avaliao in vitro.....................................................................................................173
6.
CONCLUSES.....................................................................................................177
7.
CONSIDERAES FINAIS...............................................................................183
8.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...............................................................187
ANEXO 1...........................................................................................................................199
ANEXO 2...........................................................................................................................203
ANEXO 3...........................................................................................................................213
CURRICULUM VITAE..................................................................................................219
xvi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Micoses sistmicas e fungos causadores...........................................................11

Tabela 2 Relao das principais categorias de matrias-primas e respectiva ao
predominante em formulaes de xampu.............................................................................18
Tabela 3 Alguns agentes tpicos disponveis para tratamento de infeces fngicas
superficiais............................................................................................................................21
Tabela 4 Resumos dos mtodos utilizados para a determinao do cetoconazol por
CLAE em formas farmacuticas..........................................................................................29
Tabela 5 Parmetros utilizados para a avaliao de xampu de cetoconazol por ensaio
microbiolgico......................................................................................................................51
Tabela 6 Graduao das reaes observadas no teste de irritao ocular de acordo com a
escala de Draize....................................................................................................................71
Tabela 7 Tabela de graduao da classificao do produto aps teste de irritao
ocular....................................................................................................................................72
Tabela 8 ndice de zona e descrio da reatividade para a avaliao do potencial de
citotoxicidade in vitro mtodo de difuso em gar...........................................................74
Tabela 9 -Valores obtidos na determinao do ponto de fuso de Ceto1 e Ceto2, atravs do
equipamento, METTLER TOLEDO modelo FP90 ............................................................78
Tabela 10 Freqncias de absoro das principais bandas do cetoconazol e suas
respectivas
atribuies,
realizado
por
espectrofotometria
na
regio
do
infravermelho.......................................................................................................................81
Tabela 11 Valores obtidos na determinao do teor de Ceto1 e Ceto2 atravs de mtodo
de VMNA.............................................................................................................................84
Tabela 12 - Valores da determinao da densidade de Xb-ceto, Form1 e Form2...............89
Tabela 13 - Valores das reas obtidas na elaborao da curva padro do cetoconazol por
CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e
monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3,
V/V) pH 5,5 como fase mvel..............................................................................................97
Tabela 14 Valores experimentais obtidos na determinao de cetoconazol em xampu
(Xb-Ceto) por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase
reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua
(1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel................................................................99
xvii

(Form1) por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase
(1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel................................................................99
(Form2) por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase
(1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel..............................................................100
Tabela 17 - Valores experimentais obtidos no teste de recuperao para amostra Xb-ceto
atravs de CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa
C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V)
(7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel...................................................................................103
Tabela 18 Valores de reas absolutas da soluo de cetoconazol SQR (300 g/ml), nos
trs dias de anlise, obtido por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando
coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de
amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel........................................104
Tabela 19 - Valores dos dimetros dos halos de inibio, no doseamento de xampu de
cetoconazol (Xb-ceto), obtidos atravs de ensaio microbiolgico - mtodo de difuso em
garcilindros em placas utilizando meio de cultura gar Sabouraud-dextrose 2%,
Candida albicans como microrganismo teste, tempo de incubao de 18 horas e
temperatura de 35 2 C....................................................................................................110
Tabela 20 Valores experimentais obtidos na determinao de xampu de cetoconazol
(Xb-ceto) atravs de ensaio microbiolgico mtodo de difuso em gar cilindros em
placas utilizando meio de cultura gar Sabouraud-dextrose 2%, Candida albicans como
microrganismo teste, tempo de incubao de 18 horas e temperatura de 35 2 C..........112
Tabela 21 - Valores experimentais obtidos no teste de recuperao atravs de ensaio
microbiolgico mtodo de difuso em gar cilindros em placas utilizando meio de
cultura gar Sabouraud-dextrose 2%, Candida albicans como microrganismo teste, tempo
de incubao de 18 horas e temperatura de 35 2 C.......................................................113
Tabela 22 Teores obtidos na determinao do xampu de cetoconazol (Xb-ceto), atravs
de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) e ensaio microbiolgico mtodo de
difuso em gar cilindros em placa.................................................................................114
Tabela 23 Valores dos teores de cetoconazol em soluo metanlica (Sol-ceto), aps
exposio s lmpadas UV-A e UV-C, obtidos atravs de CLAE.....................................120
Tabela 24 Valores dos teores de cetoconazol em xampu (Xb-ceto), aps exposio s
lmpadas UV-A e UV-C, obtidos atravs de CLAE..........................................................124
Tabela 25 Teores obtidos atravs de ensaio microbiolgico e CLAE para amostras de
Xb-ceto expostas lmpada UV-C por um perodo de 0, 6 e 22 horas.............................126
xviii
Tabela 26 Valores dos teores de cetoconazol em soluo metanlica (Sol-ceto), aps

exposio luz natural, obtidos atravs de CLAE.............................................................130
Tabela 27 Valores dos teores de cetoconazol em xampu (Xb-ceto), aps exposio luz
natural, obtidos atravs de CLAE.......................................................................................134
Tabela 28 Valores dos teores das formulaes comerciais (Form1 e Form2), aps
exposio luz natural, obtidos atravs de CLAE.............................................................137
Tabela 29 Teores obtidos atravs de ensaio microbiolgico e CLAE para amostras de
Xb-ceto, expostas luz natural, por um perodo de 17 meses...........................................137
Tabela 30 Valores de deslocamentos qumicos (ppm), multiplicidade, constante de
acoplamento (J), nmero de hidrognios e a atribuio dos hidrognios para espectro de
RMN-1H do cetoconazol SQR, obtido em espectrmetro BRUKER (200 MHz), utilizando
clorofrmio deuterado como solvente................................................................................151
Tabela 31 Valores de deslocamentos qumicos (ppm) e atribuies dos carbonos para
cetoconazol SQR a partir dos espectros de RMN-13C, obtido em espectrmetro VARIAN
(300 MHz), utilizando clorofrmio deuterado como solvente e TMS como referncia
interna.................................................................................................................................153
RMN-1H do Fr1, obtido em espectrmetro BRUKER AMX 500 (500 MHz), utilizando
clorofrmio deuterado como solvente e TMS como referncia interna.............................156
Fr1 a partir dos espectros de RMN-13C, obtido em espectrmetro BRUKER AMX 500
interna.................................................................................................................................160
RMN-1H do Fr2, obtido em espectrmetro BRUKER AMX 500 (500 MHz), utilizando
clorofrmio deuterado como solvente e TMS como referncia interna.............................164
Fr2 a partir dos espectros de RMN-13C, obtido em espectrmetro BRUKER AMX 500
interna.................................................................................................................................167
Tabela 36 Valores obtidos aps o teste de irritao ocular, segundo escala de Draize
(item 4.9.1.1.), para amostra de Xb-ceto no degradada....................................................172
Tabela 37 Valores obtidos aps o teste de irritao ocular, segundo escala de Draize
(item 4.9.1.1.), para amostra de Xb-ceto degradada...........................................................172
Tabela 38 Valores dos ndices de zona obtidos aps a leitura das placas de culturas
celulares, utilizando mtodo de difuso em gar e linhagem celular NCTC Clone 929
(ATCC CCL-1), para as amostras de Xb-ceto e Xb-ceto degradado.................................174
xix
Tabela 39 - Anlise de varincia (ANOVA) das reas determinadas para a obteno da

curva padro do cetoconazol por CLAE............................................................................201
Tabela 40 ANOVA dos dados obtidos no ensaio microbiolgico mtodo de difuso em
garcilindros em placas utilizando meio de cultura gar Sabouraud-dextrose 2%,
Candida albicans como microrganismo teste, tempo de incubao de 18 horas e
temperatura de 35 2 C....................................................................................................201
Tabela 41 DPR dos teores encontrados no estudo de fotoestabilidade da soluo
metanlica (Sol-ceto) e do xampu (Xb-ceto) aps exposio luz natural.......................202
Tabela 42 DPR dos teores encontrados no estudo de fotoestabilidade das formulaes
comerciais (Form1 e Form2)..............................................................................................202
xx
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Estrutura qumica do cetoconazol.......................................................................22

Figura 2 - Espectro de absoro na regio do IV para cetoconazol SQR...........................80
Figura 3 - Espectro de absoro na regio do IV para Ceto1..............................................80
Figura 4 - Espectro de absoro na regio do IV para Ceto2..............................................81
Figura 5 Espectro de absoro na regio do UV para cetoconazol SQR.........................82
Figura 6 Espectro de absoro na regio do UV para Ceto1...........................................82
Figura 7 Espectro de absoro na regio do UV para Ceto2...........................................83
Figura 8 - Estrutura qumica do lauril ter sulfato de sdio................................................85
Figura 9 - Estrututa qumica do metilparabeno...................................................................86
Figura 10 Representao do cromatograma em camada delgada, utilizando n-hexano,
acetato de etila, metanol, gua e cido actico (42:40:15:2:1 V/V/V/V/V) como eluente.
Valor de Rf do cetoconazol de 0,33. Soluo padro (1), Soluo padro diluda (2),
Form1 (3), Form2 (4), Xb-ceto (5) e Sol-ceto (6)................................................................91
Figura 11 Estrutura do cetoconazol..................................................................................94
Figura 12 Cromatograma do cetoconazol SQR (300 g/ml), obtido por CLAE com
comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e
Figura 13 Cromatograma da amostra Xb-ceto (320 g/ml), obtido por CLAE com
Figura 14 Cromatograma da amostra Form1 (320 g/ml), obtido por CLAE com
Figura 15 Cromatograma da amostra Form2 (320 g/ml), obtido por CLAE com
Figura 16 - Representao grfica da mdia das trs curvas padro de cetoconazol e sua
respectiva equao da reta, obtidas por CLAE com comprimento de onda de 225 nm,
xxi
utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato

de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel......................................98
Figura 17 - Cromatograma do placebo (Xb), obtido por CLAE com comprimento de onda
de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol
(2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase
mvel..................................................................................................................................101
Figura 18 - Curva de pureza apresentada para Form1, indicando a pureza total do pico do
cetoconazol de 0,999993, obtido por CLAE com comprimento de onda de 225 nm,
de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel....................................101
cetoconazol de 0,999997, obtido por CLAE com comprimento de onda de 225 nm,
Figura 20 - Cromatograma da soluo de cetoconazol SQR (300 g/ml), obtido por CLAE
com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e fase mvel
com diferente proporo de metanol e gua (6,5:3,5 v/v) pH 5,5......................................104
Figura 21 - Cromatograma da soluo de cetoconazol SQR (300 g/ml), obtido por CLAE
com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e
V/V) pH 4,5 como fase mvel............................................................................................105
Figura 22 Doseamento microbiolgico (mtodo de difuso em garcilindros em
placas), utilizando Candida albicans ATCC 10231 como microrganismo teste, meio de
cultura gar Sabouraud-dextrose 2%, tempo de incubao de 18 horas e temperatura de 35
2 C. Cetoconazol SQR com concentraes de 20 (P1); 100 (P2) e 500 (P3) g/ml e
xampu de cetoconazol (Xb-ceto) com concentraes de 20 (A1); 100 (A2) e 500 (A3)
g/ml..................................................................................................................................110
Figura 23 - Representao grfica da curva padro de cetoconazol e sua respectiva
equao da reta, obtida atravs de ensaio microbiolgico - mtodo de difuso em garcilindros em placas utilizando meio de cultura gar Sabouraud-dextrose 2%, Candida
albicans como microrganismo teste, tempo de incubao de 18 horas e temperatura de 35
2 C.....................................................................................................................................111
Figura 24 Representao grfica dos teores de cetoconazol matria-prima obtidos por
CLAE, aps exposio lmpada UV-C (Light express LE UV (254 nm)) por um perodo
de 8 horas............................................................................................................................118
Figura 25 - Cromatograma do cetoconazol matria-prima (concentrao terica de
400 g/ml), aps exposio lmpada UV-C por 8 horas, obtido atravs de CLAE com
monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V) /acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3,
xxii
Figura 26 - Representao grfica dos teores da soluo metanlica de cetoconazol

obtidos por CLAE, aps exposio lmpada UV-C (Light express LE UV (254 nm)) e
UV-A (Blacklight blue lamp Orion (352 nm)) por um perodo de 24 horas...................120
Figura 27 - Cromatograma da soluo metanlica de cetoconazol (concentrao terica de
400 g/ml), aps exposio lmpada UV-A por 8 horas, obtidos atravs de CLAE com
400 g/ml), aps exposio lmpada UV-C por 4 horas, obtidos atravs de CLAE com
Figura 30 - Representao grfica dos teores de xampu de cetoconazol obtidos por CLAE,
aps exposio lmpada UV-C (Light express LE UV (254 nm)) e lmpada UV-A
(Blacklight blue lamp Orion (352 nm)) por um perodo de 24 horas..............................123
Figura 31 -Cromatograma do Xb-ceto (concentrao terica 320 g/ml), aps exposio
lmpada UV-A por 24 horas, obtidos atravs de CLAE com comprimento de onda de
225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol
mvel..................................................................................................................................125
Figura 32 -Cromatograma do Xb-ceto (concentrao terica 320 g/ml), aps exposio
lmpada UV-C por 24 horas, obtidos atravs de CLAE com comprimento de onda de
225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol
mvel..................................................................................................................................125
Figura 33 Doseamento microbiolgico (mtodo de difuso em garcilindros em placas),
utilizando Candida albicans ATCC 10231 como microrganismo teste, meio de cultura
gar Sabouraud-dextrose 2%, tempo de incubao de 18 horas e temperatura de 35 2 C.
Cetoconazol SQR com concentraes de 20 (P1); 100 (P2) e 500 (P3) g/ml e xampu de
cetoconazol (Xb-ceto), aps exposio lmpada UV-C por 22 horas, com concentraes
de 20 (D1); 100 (D2) e 500 (D3) g/ml.............................................................................127
Figura 34 - Representao grfica dos teores da soluo metanlica de cetoconazol
obtidos por CLAE. Amostras armazenadas em frasco transparente e em frasco opaco
expostas luz natural por um perodo de 26 meses...........................................................130
xxiii
Figura 35 - Cromatograma da Sol-ceto (concentrao terica 400 g/ml) armazenada em

frasco transparente, aps exposio luz natural por 26 meses, obtidos atravs de CLAE
Figura 36 - Cromatograma da Sol-ceto (concentrao terica 400 g/ml) armazenada em
frasco opaco, aps exposio luz natural por 26 meses, obtidos atravs de CLAE com
Figura 37 - Cromatograma com escala ampliada da Sol-ceto (concentrao terica 400
g/ml) armazenada em frasco opaco, aps exposio luz natural por 26 meses, obtidos
atravs de CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa
C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V)
(7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel...................................................................................132
Figura 38 - Representao grfica dos teores do xampu de cetoconazol (Xb-ceto) obtidos
por CLAE. Amostras armazenados em frasco transparente e em frasco opaco expostas
luz natural por um perodo de 26 meses.............................................................................134
Figura 39 - Cromatograma do Xb-ceto (concentrao terica 320 g/ml) armazenado em
frasco transparente, aps exposio luz natural por 26 meses, obtidos atravs de CLAE
Figura 40 - Cromatograma do Xb-ceto (concentrao terica 320 g/ml) armazenado em
frasco opaco, aps exposio luz natural por 26 meses, obtidos atravs de CLAE com
Figura 41 - Representao grfica dos teores do xampu de cetoconazol (Form1 e Form2)
obtidos por CLAE. Amostras armazenadas nos frascos de comercializao, expostas luz
natural por um perodo de 17 meses...................................................................................136
Figura 42- Cromatograma do Xb-ceto (concentrao terica 320 g/ml) em presena de
HCl M, por 4 horas, obtido atravs de CLAE com comprimento de onda de 225 nm,
Figura 43 - Cromatograma do cetoconazol matria-prima (concentrao terica 320
g/ml) em presena de perxido de hidrognio 30 %, por 30 minutos, obtido atravs de
xxiv
Figura 44 - Cromatograma do cetoconazol matria-prima (concentrao terica 320

g/ml) em presena de perxido de hidrognio 30 %, por 4 horas, obtido atravs de CLAE
Figura 45 - Cromatograma do perxido de hidrognio 30 %, obtido atravs de CLAE com
Figura 46 Espectro de absoro na regio do UV e Visvel da Fr1 para amostra de Solceto frente luz UV-C por 30 horas, obtido com auxlio de detector de arranjo de diodos
atravs de CLAE semipreparativa, utilizando coluna Waters Spherisorb C-8 e metanolgua-acetato de amnio (7:3:0,0025 V/V/p) como fase mvel..........................................143
Figura 47 Espectro de absoro na regio do UV e Visvel da Fr1 para amostra de Xbceto frente luz natural por 26 meses, obtido com auxlio de detector de arranjo de diodos
Figura 48 Espectro de absoro na regio do UV e Visvel da Fr2 para amostra de Solceto frente luz UV-C por 30 horas, obtidos com auxlio de detector de arranjo de diodos
Figura 49 Espectro de absoro na regio do UV e Visvel da Fr2 para amostra de Xbceto frente luz natural por 26 meses, obtido com auxlio de detector de arranjo de diodos
Figura 50 Cromatograma da soluo metanlica de cetoconazol, exposta luz UV-C por
30 horas, obtido atravs de CLAE semipreparativa com comprimento de onda de 225 nm,
utilizando coluna Waters Spherisorb C-8 e metanol-gua-acetato de amnio (7:3:0,0025
V/V/p) como fase mvel....................................................................................................145
Figura 51- Cromatograma de Fr1 isolada (tempo 16,4 min.), obtido atravs de CLAE com
Figura 53 - Curva de pureza apresentada para Fr1, indicando a pureza total do pico de
0,999968, obtido por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de
fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua
xxv
Figura 54 - Curva de pureza apresentada para Fr2, indicando a pureza total do pico de
0,999999, obtido por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de
fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua
Figura 55 Espectro de absoro na regio do UV e Visvel do pico relativo ao
cetoconazol para amostra de Sol-ceto frente luz UV-C, obtido com auxlio de detector de
arranjo de diodos atravs de CLAE semipreparativa, utilizando coluna Waters Spherisorb
C-8 e metanol-gua-acetato de amnio (7:3:0,0025 V/V/p) como fase mvel..................148
Figura 56 Estrutura qumica do cetoconazol..................................................................149
Figura 57 Espectro de RMN 1H do cetoconazol SQR obtido em espectrmetro
BRUKER (200MHz), utilizando clorofrmio deuterado como solvente...........................150
Figura 58 - Espectro de RMN 13C do cetoconazol SQR obtido em espectrmetro VARIAN
(300MHz), utilizando clorofrmio deuterado como solvente e TMS como referncia
interna.................................................................................................................................152
Figura 59 Cromatograma do cetoconazol, degradado sob ao da luz UV-C, obtido
atravs de CLAE acoplada a espectroscopia de massas ionizao eletrospray...............154
Figura 60 - Espectro de massas do pico relativo ao cetoconazol, obtido atravs de sistema
de espectrometria de massas ionizao eletrospray acoplado ao sistema de CLAE,
utilizando coluna Waters Spherisorb S5 C8 (10 x 250 mm) e fase mvel conforme
descrita no item 4.8.1.2.2...................................................................................................155
Figura 61 Espectro de RMN 1H da Fr1 obtido em espectrmetro BRUKER AMX 500
interna.................................................................................................................................158
Figura 62 Espectro de RMN 13C da Fr1 obtido em espectrmetro BRUKER AMX 500
interna.................................................................................................................................159
Figura 63 Espectro de massas do pico relativo a Fr1, obtido atravs de sistema de
espectrometria de massas ionizao eletrospray acoplado ao sistema de CLAE, utilizando
coluna Waters Spherisorb S5 C8 (10 x 250 mm) e fase mvel conforme descrita no item
4.8.1.2.2..............................................................................................................................162
Figura 64 Estrutura proposta para produto de degradao isolado denominado Fr1: cis-1acetil-4-{4-[2-(2-clorofenil)-2-(1H-imidazolil-1-metil)-1,3-dioxolanil-4-metoxi]fenil}
piperazina..........................................................................................................................163
Figura 65 Espectro de RMN 1H da Fr2 obtido em espectrmetro BRUKER AMX 500
interna.................................................................................................................................165
Figura 66 Espectro de RMN 13C da Fr2 obtido em espectrmetro BRUKER AMX 500
interna.................................................................................................................................166
xxvi
Figura 67 Espectro de massas do pico relativo a Fr2, obtido atravs de sistema de

espectrometria de massas ionizao eletrospray acoplado ao sistema de CLAE, utilizando
coluna Waters Spherisorb S5 C8 (10 x 250 mm) e fase mvel conforme descrita no item
4.8.1.2.2..............................................................................................................................168
Figura 68 Estrutura proposta para produto de degradao isolado denominado Fr2: cis-1acetil-4-{4-[2-(4-clorofenil)-2-(1H-imidazolil-1-metil)-1,3-dioxolanil-4-metoxi]fenil}
piperazina..........................................................................................................................169
xxvii
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA anlise de varincia

ATCC American Type Culture Collection
ATV associao de tripsina e versene
BHT butilidroxitolueno
CAS chemical abstracts service
CCD cromatografia em camada delgada
Ceto1 cetoconazol matria-prima
Ceto2 - cetoconazol matria-prima
CIM concentrao inibitria mnima
CLAE cromatografia lquida de alta eficincia
COLIPA European Cosmetic, Toiletry and Perfumary Association
DMSO dimetilsulfxido
DPR desvio padro relativo
FDA Food and Drug Administration
Form1 xampu de cetoconazol 2 % comercial
Form2 xampu de cetoconazol 2 % comercial
Fr1 produto de degradao isolado com tempo de reteno de 16,4 minutos
Fr2 produto de degradao isolado com tempo de reteno de 19,2 minutos
GL graus de liberdade
LD limite de deteco
LQ limite de quantificao
MEM - meio mnimo de Eagle, suplementado com 0,1 mM de aminocidos no
essenciais, 1 mM de piruvato de sdio
MS espectrometria de massas
xxviii
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

NCTC National Collection for Type Culture
Rf fator de reteno
RMN ressonncia magntica nuclear
SFB - soro fetal bovino
Sol-ceto soluo metanlica de cetoconazol 2 %
SQR substncia qumica de referncia
UV ultravioleta
VIH vrus da imunodeficincia humana
Vis - visvel
VMNA volumetria em meio no-aquoso
Xb xampu base
Xb-ceto xampu de cetoconazol 2 % preparado no laboratrio
xxix
RESUMO
Cetoconazol um agente antifngico que possui ao tpica e sistmica,

podendo ser incorporado em diferentes formas farmacuticas. Como exemplo,
pode-se citar o xampu de cetoconazol, que efetivo no tratamento da dermatite
seborrica e pitirase versicolor. reconhecido que o cetoconazol, nas formas
farmacuticas xampu e soluo, rapidamente altera a colorao se tornando
avermelhado. A exposio de frmacos radiao pode influenciar a estabilidade da
formulao, levando a modificaes nas propriedades fsico-qumicas do produto. O
objetivo deste trabalho foi avaliar a fotoestabilidade do cetoconazol em xampu e
soluo. As formulaes foram expostas radiao UV-A (352 nm), UV-C
(254 nm) e luz diurna. Mtodos foram desenvolvidos e validados para a
determinao quantitativa do cetoconazol: cromatografia lquida de alta eficincia e
ensaio microbiolgico utilizando o mtodo de cilindros em placa. Estudos
comparativos entre xampu de cetoconazol e xampu de cetoconazol contendo
produtos de degradao foram feitos para avaliar a atividade antifngica e a
segurana biolgica in vivo (teste de Draize) e in vitro (teste de citotoxicidade). Os
resultados
demonstraram
diminuio
na
atividade
antifngica,
mas
no
demonstraram alterao na segurana biolgica. Os mtodos utilizados para anlise

do cetoconazol (ensaio microbiolgico e CLAE) demonstraram ser lineares,
precisos e exatos, sendo teis no controle de qualidade do frmaco. Os resultados
indicam alterao do cetoconazol em presena da luz. Dois produtos de degradao
foram isolados e identificados: 1-acetil-4-{4-[2-(2-clorofenil)-2-(1H-imidazolil-1metil)-1,3-dioxolanil-4-metoxi]fenil}piperazina e 1-acetil-4-{4-[2-(4-clorofenil)-2(1H-imidazolil-1-metil)-1,3-dioxolanil-4-metoxi]fenil}piperazina. Conseqentemente,
adequada proteo da luz deve ser adotada durante armazenamento das duas formas
farmacuticas contendo o frmaco.
xxx
Palavras-chave: cetoconazol, xampu, cromatografia lquida de alta

eficincia, ensaio microbiolgico, estudos de fotoestabilidade, segurana
biolgica.
xxxi
ABSTRACT
Photostability evaluation of ketoconazole and determination of the

antifungal activity and biological reactivity in vivo and in vitro of
ketoconazole shampoo
Ketoconazole is an antifungal agent with topic and systemic action and
can be incorporated into several dosage forms. As an example, it could be
mentioned ketoconazole shampoo, which is effective against seborrhoeic
dermatitis and pityriasis versicolor. It is remarkable that ketoconazole is rapidly
altered in shampoo and solution dosage forms, since its colour turns into red.
Exposure of a drug to radiation can influence the stability of the formulation,
leading to changes in the physicochemical properties of the product. The aim of
this work was to assess the photostability of ketoconazole in shampoo and
solution. The formulations were exposed to UV-A (352 nm) and UV-C (254 nm)
radiations and daylight. Methods were developed and validated for the
quantitative
determination
of
ketoconazole:
high
performance
liquid
chromatography and microbiological assay using the cylinder-plate method.

Comparative studies between ketoconazole shampoo and ketoconazole shampoo
containing degradation products were conducted to evaluated the antifungal
activity and biological reactivity in vivo (Draize test) and in vitro (cytotoxity
test). The results showed a decrease in antifungal activity but not an alteration on
the biological reactivity. The methods used for ketoconazole analysis
(microbiological assay and HPLC) were linear, precise and accurate, providing
valuable methods for the quality control of this drug. The results indicate
alteration in ketoconazole in presence of light. Two photodegradation products
were isolated and identified: 1-acetyl-4-{4-[2-(2-chlorophenyl)-2-(1H-imidazol1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-ylmethoxy]phenyl}piperazine and 1-acetyl-4-{4-[2(4-chlorophenyl)-2-(1H-imidazol-1-ylmethyl)-1,3-dioxolan-4-ylmethoxy]phenyl}
xxxii
piperazine. Consequently, adequate light protection should be adopted for storage

of these two dosage forms containing the drug.
Key
words:
ketoconazole,
shampoo,
high
performance
liquid
chromatography, microbiological assay, photostability studies, biological

reactivity.
INTRODUO
Introduo 3
A introduo dos derivados imidazlicos na teraputica, na dcada de 70,

representou grande avano no tratamento das micoses. Foram os primeiros
compostos a exercerem atividade contra grande nmero de leveduras, dermatfitos
e fungos dimrficos. Desde seu advento, vrios compostos foram desenvolvidos por
diversos laboratrios, sendo utilizados no tratamento de micoses superficiais e
sistmicas.
Em 1981, o FDA (Food and Drug Administration) aprovou o uso do
cetoconazol, um derivado imidazlico, desenvolvido e sintetizado pela Janssen
Pharmaceutica (ESPINEL-INGROF,1996). O frmaco, que possui ao sistmica e
tpica, pode ser incorporado em diversas formas farmacuticas, como xampus e
cremes.
Durante a preparao de algumas formulaes tpicas, contendo cetoconazol,
pde-se observar que o produto apresenta instabilidade, pois adquire colorao
avermelhada muito rapidamente (STAUB et al., 2002), sugerindo a formao de
produtos de degradao.
Diversos fatores podem alterar um produto farmacutico com o tempo. Aps
extensa reviso de literatura, constatou-se que o nmero de frmacos fotolbeis tem
aumentado. Segundo THOMA e KBLER (1996c), a investigao comparativa da
fotoestabilidade de antimicticos azlicos mostrou que, apesar de muitas estruturas
serem homlogas, existem muitas varincias entre a estabilidade fotoqumica. Em
particular, cetoconazol e terconazol mostraram-se fotolbeis. Por outro lado,
clotrimazol, fluconazol e miconazol resistiram degradao fotoltica.
Segundo TONESSEN (2001), frmacos sensveis luz podem ser afetados
pela luz solar (especialmente radiao ultravioleta) e por fonte de luz artificial
(lmpada fluorescente). A exposio inadequada luz pode levar fotodegradao
da substncia ativa, podendo formar um produto inativo, mas tambm pode alterar
propriedades fsico-qumicas como alterao na colorao do produto.
Introduo 4
Frmacos sensveis luz freqentemente aumentam os problemas de uma

formulao farmacutica. Reaes fotoqumicas so complexas e um bom
entendimento do processo de fotodecomposio necessrio a fim de otimizar a
estabilidade do produto.
Sendo assim, justifica-se o desenvolvimento, validao e utilizao de
mtodos fsico-qumicos e microbiolgicos para caracterizao, identificao e
doseamento do frmaco, visando obteno de dados para o estudo da estabilidade
fotoqumica do cetoconazol em formulaes farmacuticas, em especial o xampu,
com avaliao dos possveis produtos de degradao formados. Apesar do frmaco
ter sido sintetizado na dcada de 70, no foram encontrados estudos publicados
sobre seus produtos de degradao.
OBJETIVOS
Objetivos 7
2.1. Objetivos gerais

O trabalho tem como objetivo geral o desenvolvimento e validao de
mtodos de anlise e avaliao da fotoestabilidade do cetoconazol matria-prima e
em formulao farmacutica, verificando a presena de produtos de degradao.
2.2. Objetivos especficos

9 Desenvolvimento e validao de mtodo de doseamento do cetoconazol em
xampu, atravs de cromatografia lquida de alta eficincia.
9 Desenvolvimento e validao de mtodo de doseamento do cetoconazol em
xampu, atravs de ensaio microbiolgico - mtodo de difuso em gar
cilindros em placa.
9 Estudo da estabilidade fotoqumica do cetoconazol matria-prima, em soluo e
na forma de xampu.
9 Determinao da atividade antifngica do xampu de cetoconazol contendo os
produtos de degradao.
9 Isolamento e identificao dos produtos de degradao majoritrios, atravs de
espectroscopia de ressonncia magntica de hidrognio e de carbono e
espectrometria de massas.
9 Avaliao do potencial de citotoxicidade in vitro do xampu de cetoconazol
contendo os produtos de degradao.
9 Avaliao da toxicidade aguda com efeito local do xampu de cetoconazol
contendo os produtos de degradao, atravs do teste de irritao ocular.
REVISO BIBLIOGRFICA
Reviso bibliogrfica 11
3.1. Infeces fngicas

As micoses humanas podem ser causadas por fungos patognicos primrios
ou por fungos oportunistas. Patognicos primrios so aqueles que tm capacidade
de invadir os tecidos de um hospedeiro normal; os oportunistas, no entanto, somente
so invasores de tecidos de indivduos com alteraes do sistema imunolgico do
organismo (VERONESI e FOCACCIA, 1998). Nos ltimos anos, a incidncia de
infeces fngicas tem aumentado em funo do vrus da imunodeficincia humana
(VIH), cncer e transplantes. importante salientar, que tanto os fungos
patognicos como os oportunistas so conhecidos como causadores de micoses
severas e algumas vezes fatais em pacientes imunocomprometidos (ESPINELINGROF,1996).
As doenas por fungos podem ser classificadas em trs grupos
(FREEDBERG et al., 2003):
9 Micoses sistmicas
As micoses sistmicas so caracterizadas por serem adquiridas, geralmente
por inalao de fungos patgenos dimrficos, dando origem, na maioria das vezes, a
uma leso pulmonar primria que tem tendncia regresso espontnea. As leses
extrapulmonares resultam da disseminao hematognica do fungo. As micoses
sistmicas esto apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1 Micoses sistmicas e fungos causadores.
Micoses
Histoplasmose
Blastomicose
Coccidioidomicose
Paracoccidioidomicose
Peniciliose
Criptococose
Fungos
Histoplasma capsulatum (capsulatum, duboisii)
Blastomyces dermatitidis
Coccidioides immitis
Paracoccidioides brasiliensis
Penicillium marneffei
Cryptococcus neoformans
9 Micoses subcutneas
As micoses subcutneas so infeces causadas por fungos que penetraram
na pele ou tecido subcutneo. As micoses subcutneas mais comuns so
esporotricose, micetomas e cromoblastomicose.
9 Micoses superficiais
As micoses superficiais so causadas por fungos ou leveduras capazes de
invadir a pele, unha, cabelo e membrana mucosa. Pode-se citar as dermatofitoses
(ou tinhas) que so infeces causadas por trs gneros de fungos (Microsporum,
Trichophyton e Epidermophyton), candidase que uma infeco causada por
Candida albicans ou por outra levedura da mesma espcie (C. parapsilosis, C.
tropicalis, C. kefyr, C. krusei, C. stellatoidea, C. guilliermondii). Pode-se citar,
ainda, tinha nigra, piedra, malassezioses e eventualmente outros fungos no
dermatfitos.
Por malassezioses designam-se as trs formas clnicas da infeco causada
pela levedura Malassezia: pitirase (tinha) versicolor, foliculite por Malassezia e
alguns autores correlacionam o fungo Malassezia furfur no desenvolvimento da
dermatite seborrica. Uma forma farmacutica muito utilizada para o tratamento
destas infeces o xampu pois geralmente o couro cabeludo acometido.
3.2. Pele e anexos cutneos

As infeces causadas por fungos esto entre as causas mais comuns de
doenas cutneas. A pele, possui muitas funes essenciais, incluindo proteo,
termorregulao, resposta imune, sntese bioqumica, deteco sensorial, entre
outras (HARDMAN e LIMBIRD, 1996).
A pele compe-se, essencialmente, de trs grandes camadas de tecidos: uma
camada superior a epiderme, uma camada intermediria a derme, e uma camada
profunda - a hipoderme ou tecido celular subcutneo. A epiderme constituda por

epitlio estratificado cuja espessura apresenta variaes topogrficas desde 0,04 mm
nas plpebras at 1,6 mm nas regies palmo-plantares. A segunda camada tissular
componente da pele, disposta imediatamente abaixo da epiderme, a derme, que
compreende denso estroma fibro-elstico. A terceira camada da pele, mais
profunda, a hipoderme, compe-se de tecido adiposo (SAMPAIO e RIVITTI,
1998).
Os capilares sangneos e as fibras nervosas emergem do tecido adiposo
subcutneo ou hipoderme, atravessam a derme e chegam epiderme. As glndulas
sebceas presentes no tecido subcutneo liberam seus produtos atravs de ductos
sudorparos que atravessam a superfcie da pele. As glndulas sebceas e os
folculos pilosos originam-se na derme e nas camadas subcutneas e atingem a
superfcie da epiderme na forma de ductos e plos, respectivamente (ANSEL et al.,
2000).
O cabelo formado por duas partes distintas: a haste e a raiz. A haste
constitui a parte visvel do cabelo e formada por clulas queratinizadas. Em corte
longitudinal distinguem-se trs pores diferenciadas designadas por medula, crtex
e cutcula. A raiz atravessa toda a zona da epiderme e insere-se profundamente na
derme ou hipoderme atravs do folculo piloso. Junto ao folculo piloso se situa o
orifcio de excreo da glndula sebcea. O produto de excreo dessa glndula o
sebo que desempenha papel importante na lubrificao do cabelo e impede a sua
desidratao. Entretanto, quando a produo de sebo excessiva o cabelo torna-se
oleoso, podendo ser prejudicial (PRISTA et al., 1995). Entre as doenas
relacionadas ao aumento da oleosidade pode-se citar a dermatite seborrica, pitirase
versicolor e a caspa, sendo que o cetoconazol bastante empregado no tratamento
destas infeces.
3.3. Pitirase versicolor e dermatite seborrica

Pitirase versicolor e dermatite seborrica so doenas da pele muito comuns.
Pitirase versicolor uma doena fngica superfcial crnica, usualmente localizada
na parte superior do tronco e braos, e no pescoo (FAERGEMANN, 2000).
A leso caracterizada por uma descamao, entretanto uma leso extensa
pode ser evidenciada como uma mancha hipopigmentada ou hiperpigmentada.
reconhecido que o microrganismo causador da pitirase versicolor a Malassezia
spp, que um comensal da pele humana normal (GUPTA et al., 2002).
A Malassezia apresenta sete espcies da levedura lipoflica: Malassezia
furfur (Pityrosporum orbiculare, Pityrosporum ovale e Malassezia ovalis), M.
pachydermatis, M. sympodialis, M. globosa, M. restricta, M. slooffiae e M. obtusa.
M. furfur h muito tempo tem sido identificada como causador da pitirase
versicolor, entretanto estudos recentes indicam que M. globosa pode estar envolvida
na patogenia da doena (ERCHIGA et al., 2000).
Fatores endgenos e exgenos esto relacionados ao aparecimento da
doena. Entre os fatores exgenos pode-se citar alta temperatura e umidade, por isso
mais comum nos pases tropicais. Entre os fatores endgenos pode-se citar
hiperidrose, imunodeficincia, fatores hereditrios e pele muito oleosa; por isso a
doena mais comum em adolescentes e adultos jovens (FAERGEMANN, 2000).
A dermatite seborrica uma desordem dermatolgica comum. A etiologia
da doena pouco conhecida. Alguns autores focalizam o papel da Malassezia
furfur no desenvolvimento da dermatite seborrica (GUPTA et al., 2004).
Entretanto, muitos fatores tm sido citados como possveis contribuintes para o
desenvolvimento da doena: fatores hormonais (nvel de sebo), nutricionais e
imunolgicos (GUPTA e BLUHM, 2004).
O nome dermatite seborrica significa uma inflamao oleosa da pele. No
entanto, a doena muito mais complexa do que o nome sugere, pois estudos
demonstraram que a pele de pacientes com dermatite no necessariamente mais

oleosa do que indivduos no afetados pela doena. Dermatite seborrica
caracterizada por uma aparncia avermelhada, com descamao de reas da pele
mais oleosas, mais comumente no couro cabeludo, orelhas, sobrancelhas e trax. A
relao entre dermatite seborrica do couro cabeludo e caspa no clara, sendo que
alguns autores sugerem que a caspa um termo mais genrico que se refere a uma
descamao do couro cabeludo sem considerar a etiologia da doena (GUPTA e
BLUHM, 2004). Uma vez que o couro cabeludo geralmente acometido, o xampu
a forma farmacutica de escolha para o tratamento destas infeces.
3.4. Xampus
O xampu, como produto de limpeza e higiene do cabelo, surgiu nos anos 20
nas mais diversas formas de apresentao. Decorridos vrios anos do seu
surgimento, as formas primitivas praticamente desapareceram e deram lugar a
produtos mais sofisticados surgindo no mercado xampus com atividades especficas
como para o tratamento da caspa e xampus adequados a cabelos secos, oleosos e os
aconselhados para bebs, devido s caractersticas suavizantes que apresentam
(PRISTA et al., 1995).
Os xampus lquidos so preparaes fluidas ou levemente viscosas, de fcil
aplicao, podendo ser transparentes ou opacos. A diversidade de matrias-primas
utilizadas para a produo de xampus contribui para a obteno de diferentes tipos
de produtos. Em geral, nos xampus lquidos, alm dos tensoativos que so os
agentes de limpeza, so empregadas diferentes matrias-primas para complementar
a formulao.
A detergncia uma propriedade dos tensoativos que lhes permite remover a
gordura e as sujidades depositadas no cabelo. Os tensoativos apresentam grupos
lipoflicos, que apresentam afinidade pelas partculas a serem removidas, e
hidroflicos que tornam a molcula solvel em gua ajudando a dispersar e remover

as sujidades. O balano entre poro lipoflica e hidroflica da molcula determina a
aplicao do tensoativo (WOLF et al., 2001). Os tensoativos so divididos em
quatro categorias principais de acordo com a poro polar que apresentam:
9 Tensoativos aninicos
A poro polar dos tensoativos aninicos carregada negativamente. Em
geral, possuem timas propriedades detergentes e espumantes e so altamente
solveis em gua. Os tensoativos mais utilizados so os sulfatos de alquila e ter
sulfatos de alquila e so utilizados como sais de sdio, amnio, monoetanolamina e
trietanolamina (BOUILLON, 1996). Alm destes, uma grande variedade de
tensoativos aninicos so utilizados como os sulfossuccinatos de alquila, ter
carboxilatos de alquila, sarcossinatos de alquila, entre outros, sendo que estes
apresentam maior suavidade, sendo recomendados para cabelos sensveis;
entretanto, apresentam propriedades detergentes e espumantes menos eficazes
(BOUILLON, 1996, WILKINSON e MOORE, 1982).
9 Tensoativos catinicos
A poro polar dos tensoativos catinicos carregada positivamente. Esses
tensoativos apresentam alta afinidade pelas fibras do cabelo transmitindo suavidade
ao mesmo; alm disso possuem bom poder bactericida (BOUILLON, 1996). Estas
substncias, em geral, apresentam baixas propriedades de limpeza e so
incompatveis com tensoativos aninicos. Pode-se citar como exemplos de
tensoativos catinicos: os sais de alquiltrimetilamnio, sais de alquildimetilamnio,
sais
de
alquildimetilbenzilamnio,
sais
de
alquilpiridnio,
entre
outros
(WILKINSON e MOORE, 1982).

9 Tensoativos anfteros
Possuem em sua estrutura grupamento catinico e aninico. Em pH cido
comportam-se como tensoativos catinicos e em pH alcalino como tensoativos
aninicos. Esses tensoativos, por possurem baixas propriedades de limpeza e de

formao de espuma, em geral, so associados a outros tensoativos para a
preparao de xampus suaves, devido ao seu baixo grau de irritao. Os mais
utilizados em xampus so as betanas, sulfobetanas, derivados imidazolnicos,
alquilaminopropionatos, entre outros (BOUILLON, 1996).
9 Tensoativos no-inicos
Esses tensoativos no possuem poro polar nem carga eltrica na sua
estrutura. Geralmente so considerados os tensoativos mais suaves apresentando
boa disperso, emulsificao e propriedade detergente; entretanto seu uso
limitado, pois possuem baixa capacidade de formao de espuma. Devido ao baixo
poder de irritao pele so utilizados em associao com os ter sulfatos de alquila
no desenvolvimento de xampus muito suaves. Como tensoativo no-inico pode-se
citar as alcanolamidas e dialcanolamidas de cidos graxos (monoetanolamida e
dietanolamida do cido lurico, monoetanolamida do cido esterico, dietanolamida
do cido olico, monoetanolamida e dietanolamida dos cidos graxos de coco),
derivados do polietilenoglicol, entre outros (PRISTA et al., 1995, WOLF et al.,
2001).
Alm dos tensoativos, outras substncias so incorporadas aos xampus. Estes
compostos auxiliam a assegurar a estabilidade do produto acabado e garantem a sua
maior aceitabilidade por parte do consumidor, pois melhoram o aspecto esttico das
formulaes. Na Tabela 2 encontra-se a relao dos principais componentes de uma
formulao de xampu.
importante salientar que em formulaes de xampu a gua utilizada em
alta quantidade, pois responsvel pela diluio do tensoativo, portanto a mesma
deve possuir qualidades microbiolgica e qumica adequadas.
Tabela 2 Relao das principais categorias de matrias-primas e respectiva ao predominante

em formulaes de xampu.
Categoria
Exemplos
Ao predominante
Estabilizadores
de espuma
alcanolamidas de cido graxo

(monoetanolamida e dietanolamida do
cido lurico), polmeros (metilcelulose)
aumentar o volume e a
qualidade da espuma e
estabilizar a mesma
Espessantes
derivados da celulose (metilcelulose),

eletrlitos (cloreto de sdio), polmeros
carboxivinlicos (carbopol), gomas naturais,
alcanolamidas de cido graxo
alterar a viscosidade
Conservantes
imidazolidiniluria, metil e propilparabeno,

formaldedo, dimetilidantona
proteger da
contaminao
microbiolgica
Condicionadores
silicone, protenas hidrolisadas (queratina,

colgeno), derivados da lanolina, lcoois
graxos (lurico, mirstico e olico)
doador de maciez e
suavidade ao cabelo e
redutor da eletricidade
esttica
Opacificantes e
clarificantes
melhorar a apresentao
lcoois graxos (cetlico e estearlico),
do produto final
alcanolamidas de cidos graxos (esterico),
steres (monoestearato de glicerila), xido
de zinco ou dixido de titnio
Quelantes
EDTA e seus sais,

cido tartrico
capturar
ons presentes na gua
Acidulantes
cido ctrico, cido clordrico, cido ltico
diminuir pH
Fonte: BOUILLON, 1996, WILKINSON e MOORE, 1982.
Produtos aromatizantes e corantes tambm podem ser adicionados em

formulaes de xampu. Os aromatizantes auxiliam a mascarar odores dos
tensoativos, transmitindo ao produto acabado um aroma agradvel. Os corantes so
utilizados para melhorar o aspecto de apresentao do produto. Algumas vezes,
estes produtos so adicionados para mascarar alguma alterao que o produto sofre
com o passar do tempo como precipitao e alterao de cor (FERREIRA, 2002).
Alm das matrias-primas j citadas, muitos agentes podem ser adicionados
a formulaes de xampu por possurem ao especfica, destinados a casos
particulares do cabelo e couro cabeludo. Existem xampus para combater a caspa,

dermatite seborrica, pitirase versicolor, infeces bacterianas causadas por
Staphylococcus aureus, psorase, entre outros. Segundo SHAPIRO e MADDIN
(1996), os frmacos antifngicos, dentre eles o cetoconazol, so amplamente
empregados em formulaes de xampu, pois esses frmacos possuem mecanismo de
ao especfico, sendo capazes de controlar alteraes no couro cabeludo.
3.5. Antifngicos
3.5.1. Histrico
At 1945, terapias no especficas como queratolticos (cido saliclico) e
anti-spticos (violeta de genciana) eram a base do tratamento tpico de infeces
causadas por fungos. Em 1945, surgiu o cido undecilnico, um composto
insaturado com 11 carbonos, com ao fungisttica. Entretanto, esse agente
apresentava odor ranoso desagradvel e necessidade do uso prolongado
(FREEDBERG et al., 2003).
Em 1950, a descoberta dos antibiticos polinicos (anfotericina B e nistatina)
representou um avano na micologia mdica. Apesar da anfotericina B ter
rapidamente se tornado o principal suporte na terapia de infeces sistmicas srias,
o seu uso foi associado a diversos efeitos colaterais como nefrotoxicidade, por
exemplo. Um terceiro agente antifngico, a griseofulvina, foi descoberto em 1958 e
desenvolvido a partir do Penicillium griseofulvum (ESPINEL-INGROF,1996).
A flucitosina, anlogo pirimidnico, foi sintetizada em 1957 e apresentou
limitada atividade contra determinados fungos. O tolnaftato (1964), pertencente
classe dos tiocarbamatos, utilizado topicamente, teve seu uso essencialmente restrito
a infeces causadas por dermatfitos (VANDEN-BOSSCHE et al., 2003).
A descoberta da atividade antifngica da naftidina, prottipo das alilaminas,
foi o ponto inicial para os estudos de relao estrutura-atividade resultando no
desenvolvimento da terbinafina, uma alilamina com considervel melhora das

propriedades antimicticas (VANDEN-BOSSCHE et al., 2003).
A procura por novos antifngicos menos txicos conduziu descoberta dos
derivados imidazlicos. Em 1960, trs novos compostos de uso tpico foram
introduzidos: clotrimazol, desenvolvido pela Bayer (Alemanha), miconazol e
econazol,
ambos
desenvolvidos
pela
Janssen
Pharmaceutica
(Blgica)
(MAERTENS, 2004).
Em 1981, o FDA aprovou o cetoconazol, desenvolvido pela Janssen
Pharmaceutica, o primeiro composto imidazlico disponvel para tratamento oral de
infeces fngicas sistmicas. Por quase uma dcada, o cetoconazol foi considerado
o frmaco de escolha e nico disponvel para tratamento oral de infeces
sistmicas (ESPINEL-INGROF,1996).
A introduo da primeira gerao de triazis (fluconazol e itraconazol)
representou o segundo maior avano no tratamento de infeces fngicas. Apesar
do uso difundido, esses agentes tm importantes limitaes clnicas relatadas como
o surgimento de resistncia e toxicidade. A fim de superar essas limitaes,
diferentes anlogos tm sido desenvolvidos. Pode-se citar a segunda gerao de
triazis (voriconazol, pozaconazol e ravuconazol) que possuem grande potncia,
maior
atividade
contra
resistncia
atividade
contra
Aspergillus
spp.
(LAVERDIERE et al., 2002; MAERTENS, 2004).

Atualmente existem muitos agentes tpicos empregados no tratamento de
micoses superficiais. A terapia tpica apresenta grandes vantagens sobre a
sistmica, dentre elas pode-se destacar a falta de efeitos adversos severos e de
interaes medicamentosas, facilidade do uso e o no monitoramento do paciente
com exames laboratoriais. Na Tabela 3 esto apresentados alguns agentes tpicos
disponveis para o tratamento de infeces fngicas superficiais e o seu mecanismo
de ao.
Tabela 3 Alguns agentes tpicos disponveis para tratamento de infeces fngicas superficiais.
Classe / antifngico
Derivados
imidazlicos
cetoconazol
clotrimazol
econazol
miconazol
climbazol
bifonazol
Alilaminas
terbinafina
Hidroxipiridona
ciclopirox
olamina
rilopirox
Mecanismo de ao
Referncias
HARDMAN e
inibio da esterol 14-LIMBIRD,
1996
desmetilase, prejudicando a sntese
do ergosterol na membrana.
inibio da esqualeno-2,3epoxidase, prejudicando a sntese

VANDENBOSSCHE et al.,
2003
inibio do transporte de substratos FREEDBERG et

essenciais para a clula,
al., 2003
interferindo na sntese de
protenas.
Antibiticos
polinicos
nistatina
interao com os esteris da

membrana, resultando em um
aumento na permeabilidade da
membrana.
VANDENBOSSCHE et al.,
2003
Tiocarbamatos
tolnaftato
inibio da esqualeno-2,3epoxidase, prejudicando a sntese

FREEDBERG et
al., 2003
Corticosterides
desonida
reduo da inflamao
PIERARDFRANCHIMON
e PIERARD,
2002
Diversos
cido
saliclico
ao queratoltica
HARDMAN e
LIMBIRD, 1996
sulfeto de
selnio
antiproliferativo
JACKSON, 1996
piritiona
zncica
antiproliferativo
JACKSON, 1996
alcatro
mineral
ao queratoltica, antiproliferativo JACKSON, 1996

e anti-sptico
3.5.2. Cetoconazol
O cetoconazol (Figura 1) um antifngico, pertencente classe dos
imidazis, que possui ao sistmica e tpica, podendo ser incorporado em diversas
formas farmacuticas.
N
CH2
Cl
O
CH3C
O
OCH2
Cl
O
Figura 1- Estrutura qumica do cetoconazol
O cetoconazol tem atividade contra infeces clnicas causadas por

Blastomyces dermatitidis, Candida sp., Coccidioides immitis, Histoplasma
capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Phialophora sp., Trichophyton sp.,
Epidermophyton sp., Microsporum sp., Pityrosporum orbiculare (Malassezia
furfur) e Cryptococcus neoformans (KOROLKOVAS et al.,2003/2004).
O principal efeito dos imidazis sobre os fungos a inibio da esterol 14-desmetilase, um sistema enzimtico microssomal dependente do citocromo P450.
Portanto, o cetoconazol prejudica a biossntese do ergosterol na membrana
citoplasmtica e conduz ao acmulo de 14--metilesteris. Esses metilesteris
podem desagregar o arranjo compacto das cadeias acclicas dos fosfolipdios e
prejudicar as funes de determinados sistemas enzimticos ligados membrana,
como a ATPase e enzimas do sistema do transporte de eltrons, inibindo,
conseqentemente, o crescimento dos fungos (HARDMAN e LIMBIRD, 1996).
Alguns dos efeitos colaterais do cetoconazol so nusea, vmito, dor

abdominal, diarria, hepatotoxicidade, cefalia, tontura, exantema, prurido, ictercia,
ginecomastia, diminuio da libido, irregularidades menstruais, oligospermia,
irritao e ardor no local da aplicao, com a forma tpica (KOROLKOVAS et al.,
2003/2004).
3.5.2.1. Uso oral

HEERES e colaboradores (1979) descreveram a sntese e as propriedades
antifngicas do cetoconazol, que em baixas doses orais apresentou alta atividade
contra candidase vaginal em ratas e contra candidase cutnea em porcos-da-ndia.
Aps a descoberta do novo antifngico, a eficcia do mesmo foi avaliada em
mulheres, no tratamento da candidase vaginal. A cura foi obtida em 87,3 % das
pacientes e poucos efeitos colaterais foram relatados (BISSCHOP et al., 1979).
BORELLI e colaboradores (1979) demonstraram a eficcia do frmaco contra 10
fungos em pacientes com infeces fngicas sistmicas e superficiais.
O cetoconazol tambm foi avaliado no tratamento da dermatofitose,
demonstrando atividade superior griseofulvina (LEGENDRE e STELTZ, 1980), e
no tratamento de histoplasmose e criptococose que em combinao com a
anfotericina B apresentou vantagem teraputica quando comparado monoterapia
(GRAYBILL et al., 1980).
Em 1981 o FDA aprovou o cetoconazol, para tratamento oral de infeces
fngicas sistmicas (ESPINEL-INGROF,1996). Depois disso, vrios trabalhos
foram publicados avaliando a atividade e segurana do frmaco.
VAN CUTSEN (1983) investigou a atividade in vitro e in vivo do
cetoconazol contra 715 fungos pertencentes a 85 espcies. O frmaco demonstrou
ser altamente ativo in vitro e possuir amplo espectro de atividade. Segundo COX e
colaboradores (1982) o frmaco apresentou grande potencial teraputico na

dermatomicose.
Alguns artigos relataram que o cetoconazol tem atividade sobre outras
doenas que no so causadas por fungos. Baixa dose de cetoconazol mostrou ser
efetiva no tratamento do hirsutismo, apresentando pequeno nmero de efeitos
colaterais, mas ainda ficando reservado como alternativa de escolha devido
hepatotoxicidade (GOKMEN et al., 1996). O frmaco tambm mostrou ser efetivo
no tratamento de cncer de prstata, pois em altas doses pode diminuir rapidamente
o nvel de testosterona (TRACHTENBERG et al., 1983).
Estudos que compararam a carga viral do VIH em pacientes tratados com
saquinavir isolado ou associado com cetoconazol mostraram que pacientes que
receberam o regime combinado apresentaram maior queda na carga viral. Os
resultados indicaram que a combinao cetoconazol mais saquinavir requer maiores
estudos (JORDAN, 1998).
A adio de baixas doses de cetoconazol ciclosporina no tratamento de
pacientes renais e cardacos transplantados produziu efeitos favorveis na funo do
rgo transplantado, diminuindo o nmero de infeces cutneas fngicas, as taxas
de rejeio e as necessidades de ciclosporina. O frmaco interage com ciclosporina
atravs do citocromo P450, conduzindo inibio do metabolismo de ciclosporina
aumentando o seu nvel no sangue (KEOGH et al., 1995; SOBH et al., 1995;
GERNTHOLTZ et al., 2004).
importante salientar que, em 1983, HENNING e colaboradores
descreveram um caso importante de efeito colateral do cetoconazol, quando o
frmaco induziu hepatite em um paciente. Atualmente, recomenda-se que o mdico
solicite exames clnicos da funo heptica durante o tratamento (2 semanas aps o
incio do tratamento e aps com intervalos mensais).
3.5.2.2. Uso tpico

Um aumento na produo de sebo pode estar relacionado ao aparecimento de
infeces no couro cabeludo. O xampu de cetoconazol bastante utilizado no
tratamento da dermatite seborrica, caspa e pitirase versicolor sendo que diversos
autores avaliaram a eficcia do frmaco.
Para CARR e colaboradores (1987), o cetoconazol tpico mostrou ser uma
terapia efetiva e adequada para dermatite seborrica no couro cabeludo, para longo
tempo de tratamento, observando uma melhora significativa na descamao e
prurido. Segundo FAERGEMANN (1990), trinta e seis pacientes com dermatite
seborrica no couro cabeludo e com cultura positiva para Pityrosporum ovale foram
tratados com xampu de cetoconazol duas vezes por semana durante um ms; 89 %
dos pacientes tornaram-se livres das leses ou melhoraram. Os pacientes acharam o
xampu efetivo, fcil de usar e cosmeticamente atrativo.
Pacientes com dermatite seborrica no couro cabeludo foram tratados duas
vezes por semana com xampu de cetoconazol a 2 % durante um ms. Avaliaes
clnicas foram feitas antes e aps o tratamento sendo observado uma melhora na
severidade da doena (DOBREV e ZISSOVA, 1997).
O xampu de cetoconazol a 2 %, alm de ser efetivo no tratamento da
dermatite seborrica, demonstrou ser efetivo no tratamento da caspa. GO e
colaboradores (1992) realizaram um estudo duplo-cego com 176 pacientes com
caspa. O xampu foi aplicado duas vezes por semana obtendo bons resultados em
80 % dos pacientes aps quatro semanas. Segundo PETER e RICHARZ (1995), o
xampu foi efetivo no tratamento da caspa, bem como na preveno de recidivas
quando, aps a remisso, foi usado profilaticamente uma vez por semana.
PIERARD-FRANCHIMONT e colaboradores (2001) compararam xampu de
cetoconazol a 1 % e 2 % no tratamento da caspa. O xampu de cetoconazol a 2 %
mostrou superior eficcia, alm do que mostrou apresentar menores chances de

recadas.
Alguns trabalhos tambm relataram a eficcia do cetoconazol no tratamento
da pitirase versicolor. Com o objetivo de avaliar a eficcia do xampu de
cetoconazol a 2 %, usado como aplicao nica ou diariamente por 3 dias, no
tratamento da pitirase versicolor, foi realizado um estudo em pacientes com a
infeco micologicamente confirmada. Observou-se que o xampu foi mais eficaz
que o placebo. As respostas clnicas foram 73 %, 69 % e 5 % para aplicao durante
3 dias, 1 dia e placebo, respectivamente. Sendo assim, cetoconazol a 2 % usado
como aplicao nica ou diariamente por trs dias, mostrou-se seguro e efetivo no
tratamento da pitirase versicolor (LANGE et al., 1998).
O xampu de cetoconazol a 2 % foi avaliado como monoterapia no tratamento
da tinha capitis. Dezesseis crianas com a infeco causada pelo Trichophyton
tonsurans foram tratadas diariamente por 8 semanas. O xampu reduziu o nmero de
artrocondeas reduzindo desta forma a transmisso e o contgio da doena. A cura
foi obtida em 33 % das crianas (GREER, 2000).
Aps reviso de literatura, foram encontrados diversos trabalhos relatando as
comparaes das atividades in vitro e in vivo do cetoconazol com outros
antifngicos amplamente empregados na teraputica.
Segundo NENOFF e HAUSTEIN (1994) o cetoconazol e o itraconazol
apresentaram melhor atividade contra o Pityrosporum utilizando tcnica de diluio
em gar. A atividade de clotrimazol, cetoconazol, miconazol e sertaconazol foi
testada contra Malassezia furfur por tcnica de diluio em gar. A eficcia das
formulaes tpicas foi avaliada na pele de porcos-da-ndia infectados com M.
furfur. O mais potente inibidor in vitro foi o cetoconazol, apresentando uma
concentrao inibitria mnima (CIM) de 0,51 g/ml. Os experimentos envolvendo
animais foram realizados por trs dias consecutivos de tratamento tpico e
demonstraram que o cetoconazol a 2 %, em creme ou xampu, reduziu a leso severa
causada por M. furfur (VANGERVEN e ODDS, 1995). Para SQUIQUERA e

colaboradores (1996) o cetoconazol tambm provou ser o frmaco mais efetivo na
inibio do crescimento de Pityrosporum ovale.
A atividade in vitro do cetoconazol, miconazol, econazol, fenticonazol,
itraconazol e fluconazol foi avaliada contra a Malassezia furfur isolada de leses de
pitirase versicolor. Os resultados mostraram que todos os frmacos apresentam boa
atividade, e cetoconazol e itraconazol parecem ser os mais ativos (STRIPPOLI et
al., 1997). Avaliou-se a atividade in vitro de fluconazol, itraconazol e cetoconazol
contra 30 isolados clnicos de S. cerevisiae por mtodo de microdiluio em caldo,
seguindo recomendaes do National Committee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS). Foram detectados elevadas CIM para os trs azis testados (BARCHIESI
et al., 1998).
Foi detectada a concentrao inibitria mnima de alguns antifngicos para
vrias espcies de Candida. Para o cetoconazol foram encontradas concentraes
variando de 0,03 a 0,5 g/ml (DUROVICOVA et al., 2001).
SQUIRE e GOODE (2002) compararam a eficcia teraputica de xampu
contendo ciclopirox olamina 1,5 % e cido saliclico 3 % e xampu Nizoral
(cetoconazol 2 %). Os xampus foram usados nos pacientes trs vezes por semana
durante quatro semanas. O estudo demonstrou que ambas as formulaes foram
eficazes e seguras no tratamento da caspa e dermatite seborrica.
3.5.2.3. Mtodos para determinao do cetoconazol

O cetoconazol apresenta monografias na USP 28 (2005) e Ph. Eur. (2002) no
que se refere matria-prima. A USP 28 (2005) tambm apresenta monografias do
frmaco nas formas comprimidos e suspenso oral. Para a forma farmacutica
xampu no existem metodologias em cdigos oficiais.
Segundo a USP 28 (2005), a determinao do teor de cetoconazol matriaprima feita atravs de volumetria em meio no-aquoso com determinao
potenciomtrica do ponto final. Para comprimidos contendo cetoconazol a
determinao feita atravs de CLAE com fase mvel diisopropilamina-metanol
(1:500) / acetato de amnio (1:200) (7:3) e detector em 225 nm. A suspenso oral
de cetoconazol avaliada por CLAE com a seguinte fase mvel: 2,55g de sulfato de
tetrabutilamnio em 750 ml de gua e 250 ml de acetonitrila.
Diferentes
mtodos
analticos
para
quantificao
do
cetoconazol,
principalmente em fluidos biolgicos e comprimidos foram citados na literatura.

Mtodos espectrofotomtricos na regio do visvel foram descritos para o
doseamento do cetoconazol. SADEGHI e SHAMSIPUR (1998) desenvolveram um
mtodo para determinao do cetoconazol em comprimidos, creme e amostras de
soro. O mtodo consiste na extrao do frmaco com cido pcrico pH 2,5 e
clorofrmio, seguido de deteco a 410 nm. Segundo KELANI e colaboradores
(1997), a quantificao de derivados piperaznicos, entre eles o cetoconazol na
forma de comprimidos, foi aplicada com sucesso. Fez-se reao do frmaco com
2,3-dicloro-5,6-diciano-p-benzoquinona e determinao da absorvncia do produto
colorido formado em 588 nm. Os resultados foram comparados com a metodologia
oficial.
O doseamento do cetoconazol, atravs de espectrofotometria na regio do
ultravioleta, tambm foi descrito. Os autores desenvolveram, para a determinao
do frmaco em comprimidos e cremes, um mtodo onde a amostra foi dissolvida em
cido clordrico 0,01 M e detectada em comprimentos de onda de 222 nm e 269 nm
(KEDOR-HACKMANN et al., 1994). Mtodo baseado na formao de um
complexo do frmaco com iodo foi desenvolvido. O produto formado apresentou
duas absores mximas a 290 e a 377 nm. As leituras foram feitas a 290 nm. O
mtodo mostrou-se rpido, simples e sensvel (EL-SHABOURI et al., 1998).
ABOUNASSIFE e EL-SHZLY (1989) determinaram o cetoconazol

(substncia
ativa)
na
forma
farmacutica
comprimidos
por
titulao
potenciomtrica em meio no-aquoso, e por RMN-1H. Foram obtidos resultados

com boa exatido, preciso e sensibilidade.
Alguns trabalhos utilizando a cromatografia lquida de alta eficincia, foram
encontrados. Na Tabela 4 esto apresentados os resumos de algumas tcnicas.
Tabela 4 Resumos dos mtodos utilizados para a determinao do cetoconazol por cromatografia
lquida de alta eficincia em formas farmacuticas.
Coluna
Fase Mvel
Deteco
Forma
Farmacutica
Bondapak C18
10 m
(10 cm x 8 mm)
metanol : gua: c.
actico
(67,5:32:0,5)
UV (242 nm)
comprimidos
LiChrospher 100
C18 5 m
(125 x 4 mm)
diisopropilamina :
metanol 1:500 /
acetato amnio :
gua 1:200 (8:2)
UV (225 nm) comprimidos e

KEDORcreme
HACKMANN
et al., 1994
Bondapak
acetonitrila : tampo UV (260 nm) comprimidos e
fosfato (55:45)
creme
C18 10 m
pH 7,0
(25 cm x 4,6 mm)
LiChrosorb
C18
5m (250 x 4 mm)
metanol-acetato de
amnio 0,5 %
(80:20)
Autor
ALMESHAL,
1989
ABDELMOETY
et al., 2002
UV (225 nm) comprimidos e VELIKINAC

creme
et al., 2004
Aps extensa reviso da literatura, encontraram-se poucos trabalhos para a

determinao do frmaco na forma farmacutica xampu. HEYDEN e colaboradores
(2002) desenvolveram e validaram um mtodo de CLAE para a determinao
simultnea de cetoconazol e formaldedo em xampu. Foi utilizado coluna
Interchrom Nucleosil C8, 5 m (250 x 4,6 mm) e fase mvel constituda por
acetonitrila : tampo fosfato de sdio 0,025 M, (45:55) e pH 4,0. A determinao do
cetoconazol foi feita a 250 nm e o formaldedo foi determinado a 345 nm. Segundo
os autores, as duas substncias em anlise puderam ser determinadas com bons
resultados.
Um mtodo de CLAE para a determinao simultnea de cetoconazol e
formaldedo em xampu, utilizando colunas pequenas, foi desenvolvido. As colunas
utilizadas foram Zorbax SB C8 (75 x 4,6 mm) 3,5 m e Discovery C8 (50 x
4,6 mm) 5 m. A fase mvel foi constituda por acetonitrila : tampo fosfato de
sdio 0,01 M (45:55). O pH final foi ajustado com cido fosfrico para 4,0. O fluxo
empregado foi de 1 ml/min e a deteco foi feita a 250 nm para o cetoconazol e 345
nm para o formaldedo. O mtodo foi validado para as duas colunas pequenas
utilizando a coluna original como referncia. A reduo no tempo de anlise uma
vantagem na utilizao destas colunas (NGUYET et al. 2003).
3.5.2.4. Estabilidade
No produto acabado, a estabilidade pode ser definida como a capacidade
que o produto tem, num determinado perodo de tempo, do incio ao final da sua
vida til, e numa embalagem determinada, de manter as mesmas propriedades e
caractersticas que tinha no momento em que finalizou a sua preparao (DLEN,
2001). Os tipos de estabilidade so:
9 qumica: propriedade de conservar a concentrao da substncia ativa;
9 fsica: propriedade de reter as caractersticas fsicas como odor, cor,
consistncia;
9 microbiolgica: propriedade de conservar, de forma inalterada, suas
caractersticas microbiolgicas;
9 toxicolgica: propriedade de no aumentar seu potencial txico, alm do
nvel apresentado no momento da sua preparao.
Aps a preparao do xampu de cetoconazol, observa-se que o produto sofre

algum tipo de alterao, pois o mesmo adquire colorao avermelhada muito
rapidamente (STAUB et al., 2002). Essa alterao sugere que o produto no
estvel e que o mesmo forma produtos de degradao. Um grande problema da
instabilidade de uma formulao a diminuio no teor da substncia ativa e a
possvel formao de produtos txicos de degradao.
Aps reviso de literatura sobre a estabilidade do frmaco, foi possvel
encontrar alguns artigos sugerindo a instabilidade do produto frente luz.
Segundo KUMMER e colaboradores (1991), solues etanlicas de
cetoconazol (2,5 e 5,0 g/ml) mostraram-se estveis por um perodo de 28 dias.
Foram analisadas solues armazenadas em presena da luz ou ao abrigo da luz
assim como a ao da temperatura sobre as solues (temperatura ambiente e
refrigerao a 8 C). Os resultados apresentados no demonstraram diferena
significativa, indicando estabilidade do cetoconazol em soluo etanlica.
Entretanto, THOMA e KBLER (1996c) compararam a fotoestabilidade de
antimicticos azlicos. Apesar de suas estruturas serem semelhantes, os
pesquisadores relataram que existem diferenas na estabilidade fotoqumica. Em
particular, cetoconazol e terconazol mostraram-se fotolbeis. A instabilidade
fotoqumica foi considerada em soluo metanlica e tambm com o frmaco no
estado slido. Por outro lado, clotrimazol, nitrato de econazol e miconazol
resistiram degradao fotoltica.
ALLEN e ERICKSON (1996) avaliaram a estabilidade do cetoconazol em
lquidos orais (20 mg/ml). Seis frascos foram preparados, sendo que trs foram
armazenados a 5 C e trs a 25 C, todos no escuro. As amostras foram analisadas
por um perodo de 60 dias, utilizando cromatografia lquida de alta eficincia. O
frmaco mostrou ser estvel por 60 dias, armazenado ao abrigo da luz, a 5 C e a
25 C nos lquidos orais analisados.
O xampu de cetoconazol 2 % foi avaliado aps exposio luz visvel. A

determinao foi feita atravs de espectrofotometria na regio do ultravioleta,
detectando-se alterao do espectro a partir do dcimo quinto dia, o que fez
pressupor alterao na formulao (HEPP, 1999).
Foi avaliado o emprego de antioxidantes (vitamina E e BHT), e seu
desempenho como agente promotor de estabilidade de preparaes (creme e
xampu), que continham cetoconazol, avaliando-se as caractersticas organolpticas
(aspecto, cor, odor) e o teor de cetoconazol atravs de espectrofotometria na regio
do ultravioleta. As amostras foram armazenadas a 10, 25 ou 50 C, sendo avaliadas
nos tempos 0, 30 e 85 dias. Para as amostras na forma de creme, armazenadas
baixa temperatura, todos os sistemas permaneceram inalterados. Nas amostras
temperatura ambiente ficou evidenciada a importncia da presena de antioxidantes
para diminuir a queda no teor de cetoconazol. Porm, na anlise visual todos os
sistemas apresentaram-se normais quanto ao aspecto, cor e odor. Possivelmente, o
fato das amostras permanecerem fechadas e ao abrigo da luz tenha propiciado a
estabilidade na sua cor durante os 85 dias de teste. Na estufa ocorreram variaes na
cor, sugerindo que o antioxidante BHT foi mais eficiente (TONON et al., 1999).
A estabilidade do cetoconazol em meio aquoso foi avaliada por SKIBA e
colaboradores (2000) em funo do pH, antioxidantes e concentrao do frmaco.
Achou-se que o cetoconazol foi menos estvel em pH 1,0 numa faixa de valor
avaliada de 1,0 a 9,0. A quantidade de cetoconazol teve pequena influncia no
mecanismo de degradao, e o aumento de butilidroxitolueno (BHT) de 0,05 a
0,4 % pareceu melhorar a estabilidade do cetoconazol, em formulaes aquosas,
particularmente em pH 1,0.
MATERIAL E MTODOS
Material e mtodos 35
4.1. DESCRIO GERAL

Nome genrico: cetoconazol (Figura 1)
Nome qumico: 1-acetil-4-{4-[2-(2,4-diclorofenil)-2-(1H-imidazolil-1-metil)1,3-dioxolanil-4-metoxi]fenil}piperazina
CAS: 65277-42-1
Frmula qumica: C26H28Cl2N4O4
Massa molecular: 531,43
Faixa de fuso: 148 152 C (USP 28, 2005)
Propriedades fsico-qumicas: p branco ou quase branco. Praticamente
insolvel em gua, parcialmente solvel em lcool, solvel em lcool metlico,
bastante solvel em diclorometano ( REYNOLDS, 1996).
Categoria: antifngico
Classe: imidazol
pKa: 2,9 e 6,5 (FOYE et al., 2002)
4.2. SUBSTNCIA QUMICA DE REFERNCIA (SQR)

Foi utilizado cetoconazol, substncia qumica de referncia, com teor
estimado em 98,8 % e identificado pelo nmero de lote 0100005564, cedido pelo
laboratrio Stiefel (So Paulo, Brasil).
4.3. MATRIA-PRIMA
Foram utilizadas duas matrias-primas no desenvolvimento do trabalho.
Cetoconazol (Galena) n de lote 01000029, validade 01/06 denominado Ceto1 e
Cetoconazol (DEG) n de lote 3CGS010, validade 10/05 denominado Ceto2.
4.3.1. Anlise qualitativa da matria-prima

4.3.1.1. Caractersticas organolpticas
As duas amostras de cetoconazol e a substncia qumica de referncia foram
avaliadas visualmente quanto ao aspecto, cor e odor apresentados pelo frmaco.
4.3.1.2. Determinao do ponto de fuso

A faixa de fuso foi determinada nas matrias-primas Ceto1 e Ceto2,
utilizando equipamento METTLER TOLEDO modelo FP90.
Uma pequena quantidade de amostra foi transferida para 3 tubos capilares.
Os capilares foram introduzidos verticalmente no equipamento, e determinada sua
faixa de fuso.
4.3.1.3. Rotao especfica

As matrias-primas foram submetidas avaliao polarimtrica para
determinao da rotao especfica, de acordo com o preconizado pela USP 28
(2005). Para tanto, foram dissolvidos 400 mg de Ceto1 e de Ceto2 em 10 ml de
metanol, respectivamente Soluo teste 1 e 2. A rotao especfica das amostras foi
determinada com auxlio de polarmetro PERKIN ELMER 341. Foram feitas cinco
medidas e calculou-se a mdia dos valores obtidos.
Para o clculo do poder rotatrio especfico utilizou-se a equao 1:
[] 20D= / c.l
Equao 1
onde: = ngulo de rotao

c = concentrao da amostra em g/ml
l = comprimento do tubo (dm)
4.3.1.4. Cromatografia em camada delgada (CCD)

Foram dissolvidos 30 mg de Ceto1, Ceto2 e SQR em 3 ml de clorofrmio
respectivamente (Soluo teste 1, 2 e Soluo padro). Diluiu-se uma poro da
Soluo padro at obter concentrao de 1 mg/ml, sendo esta denominada Soluo
padro diluda.
Foram aplicados, separadamente, 10 l das Solues padro, teste 1 e teste 2
e 2 l da Soluo padro diluda, com auxlio de capilar, em linha horizontal. A
aplicao foi feita 1,5 a 2 cm acima do bordo inferior e com distncia entre elas de
1 cm. O cromatograma foi desenvolvido at 7 cm acima do ponto de aplicao.
Foram utilizadas placas de gel de slica 60 F254 Merck como fase estacionria
e o sistema eluente foi constitudo de uma mistura de n-hexano, acetato de etila,
metanol, gua e cido actico glacial (42:40:15:2:1 V/V/V/V/V). O cromatograma
foi desenvolvido em cuba no saturada com o sistema eluente e revelado atravs da
exposio a vapores de iodo e luz ultravioleta 254 nm, respectivamente (USP 28,
2005).
4.3.1.5. Espectrofotometria de absoro na regio do infravermelho

Os espectros foram obtidos, com auxlio de espectrofotmetro de
infravermelho SHIMADZU FTIR, modelo 8001, pesando 1,5 mg de cetoconazol
SQR e cetoconazol matriaprima (Ceto1 e Ceto2), em pastilhas de 150 mg de
brometo de potssio dessecado.
4.3.1.6. Espectrofotometria na regio do ultravioleta

Foram traados espectros de absoro na regio de 200-400 nm, utilizando-se
equipamento SHIMADZU UV-1601 PC, empregando cubetas de quartzo de 1 cm
de percurso ptico. As amostras e o padro foram solubilizados em metanol com
concentrao final de 10 g/ml.
4.3.1.7. Perda por dessecao

Foi dessecado 1 g de cada matria-prima (Ceto1 e Ceto2), em pesa-filtro, em
estufa vcuo, por um perodo de 4 h e com temperatura de 80 C (USP 28, 2005).
4.3.2. Anlise quantitativa da matria-prima

4.3.2.1. Volumetria em meio no-aquoso
Ceto1 e Ceto2 foram quantificadas por volumetria em meio no-aquoso,
segundo USP 28 (2005). Dissolveram-se exatamente cerca de 200 mg de
cetoconazol previamente dessecado, em 40 ml de cido actico glacial. Titulou-se
com cido perclrico 0,1 M SV e o ponto de equivalncia foi determinado
potenciometricamente. Cada ml de cido perclrico 0,1 M SV equivale a 26,57 mg
de C26H28Cl2N4O4. Procedeu-se ensaio em branco.
Os ensaios para cada matria-prima foram realizados em triplicata e os

desvios padres relativos (DPR) foram calculados. Para a correo do volume gasto
da soluo titulante, em funo da diferena entre as temperaturas de padronizao
do cido perclrico e do doseamento, fez-se uso da equao 2 (KOROLKOVAS,
1984):
Vc = V [ 1 + (t1 t2) . 0,0011]
Equao 2
onde Vc = volume corrigido

V = volume gasto
t1= temperatura ambiente por ocasio da padronizao do titulante
t2 = temperatura ambiente por ocasio do doseamento
0,0011= coeficiente de expanso cbica do cido actico glacial
4.4 FORMAS FARMACUTICAS

Para o desenvolvimento e validao de mtodos analticos e posterior estudos
de fotoestabilidade do frmaco foram utilizadas duas formulaes comerciais de
xampu, uma formulao de xampu desenvolvida e preparada no laboratrio e uma
soluo metanlica de cetoconazol. Todas as formulaes utilizadas apresentavam a
mesma concentrao de cetoconazol (2 %).
4.4.1. Xampu de cetoconazol 2 % preparado no laboratrio (Xb-Ceto)

4.4.1.1. Preparo do xampu base (Xb)
Os constituintes da formulao esto citados abaixo:
DLauril ter sulfato de sdio 40%
DDietanolamida de cido graxo de coco 2%

DMetilparabeno 0,2 %
DCloreto de sdio 2%
Dgua qsp
Adicionou-se, mediante agitao, lauril ter sulfato de sdio, dietanolamida
de cido graxo de coco e metilparabeno (solubilizado em lcool etlico) at
obteno de um produto homogneo. Dissolveu-se o cloreto de sdio na gua e
adicionou-se mistura anteriormente obtida. A formulao foi feita com agitao
at obter um produto final homogneo.
4.4.1.2. Preparo do xampu de cetoconazol 2 % (Xb-Ceto)

Pesaram-se 2 g de cetoconazol, seguindo-se a solubilizao do frmaco em
HCl M e adio de 100 ml de xampu base (item 4.4.1.1.). Aps, fez-se a
homogeneizao da formulao, com auxlio de um basto. O pH final do xampu
foi ajustado com NaOH M at 5,5, medido em potencimetro DIGIMED DMPH-2.
A formulao foi preparada ao abrigo da luz.
A formulao utilizada para desenvolvimento e validao dos mtodos, foi
armazenada em frasco plstico opaco, e mantida ao abrigo da luz.
4.4.2. Xampu comercial de cetoconazol 2% (Form1 e Form2)

Foram adquiridas duas formulaes de diferentes indstrias farmacuticas
que foram denominadas Form1 e Form2. As amostras foram escolhidas, pois a
Form1 o medicamento de referncia e a Form2 medicamento genrico. Os
constituintes das formulaes esto descritos abaixo:
Form1
DConcentrao: cetoconazol 20 mg/g
DQuantidade de xampu no frasco: 100 ml
DFrasco de comercializao: branco opaco
DFabricao: abril/03
DValidade: abril/05
DObs: conservar protegido da luz
DComposio: sulfato sdico de lauril-poliglicol-ter, lauril-poliglicol-ter
sulfosuccinato sdico, dietanolamida de cido lurico, mirstico, palmtico,
esterico e olico, laurdimnio de colgeno hidrolisado, dioleato de macrogol-120
metil glicose, perfume buqu, imiduria, cido clordrico, eritrosina sdica e gua
purificada.
Form2
DConcentrao: cetoconazol 20 mg/g
DQuantidade de xampu no frasco: 110 ml
DFrasco de comercializao: branco opaco
DFabricao: agosto/03
DValidade: agosto/05
DObs: conservar protegido da luz
DComposio: lauril ter sulfato de sdio, lauril ter sulfosuccinato de
sdio, dietanolamida do cido graxo de coco, trioleato de metil glicose, hidroxipropillaurildiamnio de colgeno hidrolisado, cloreto de sdio, imidazolinidil uria,
cido clordrico, hidrxido de sdio, fragrncia, corante vermelho Ponceaux 4R e

gua deionizada.
4.4.3. Soluo metanlica de cetoconazol 2 % (Sol-ceto)

Para a preparao da soluo metanlica pesaram-se 2 g de cetoconazol e
aps adicionaram-se 100 ml de lcool metlico p.a.
4.5. ANLISE DAS FORMAS FARMACUTICAS

4.5.1. Anlise qualitativa
As amostras de xampu (Xb-ceto, Form1 e Form2) e soluo (Sol-ceto) foram
analisadas quanto ao aspecto de cor e odor para posterior comparao durante o
estudo de estabilidade.
4.5.1.2. Determinao da densidade

A densidade relativa do Xb-ceto, Form1 e Form2 foi determinada atravs de
picnmetro. Primeiramente, fez-se a calibrao do mesmo, para tanto determinou-se
a massa do picnmetro vazio e a massa do seu contedo com gua, recentemente
destilada, a 20 C. Aps, colocou-se o xampu no picnmetro, removeu-se o excesso
da substncia e pesou-se. O peso da amostra, assim como o peso da gua, foi obtido
atravs da diferena de massa do picnmetro cheio e vazio. O quociente entre a
massa da amostra lquida e a massa da gua, a densidade relativa. (F. Bras. IV,
1988).
4.5.1.3. Determinao do pH
Fez-se a determinao do pH das formulaes comerciais (Form1 e Form2)
com auxlio de potencimetro DIGIMED DMPH-2.

Para as amostras na forma farmacutica xampu (Xb-ceto, Form1 e Form2)
foi necessria a extrao do frmaco com auxlio de solvente, para aps ser efetuada
a CCD. Para tanto, adicionaram-se em um funil de separao 1,25 ml de xampu e
10 ml de uma soluo aquosa contendo NaCl. Aps adicionaram-se 10 ml de
diclorometano, agitou-se vigorosamente e aguardou-se at a separao total das
duas fases. Recolheu-se a camada orgnica (inferior) em um frasco opaco. Aps
adicionaram-se, novamente, 10 ml e, por fim, 5 ml de diclorometano no funil de
separao e procedeu-se como anteriormente. A concentrao final obtida para o
cetoconazol foi de aproximadamente 1 mg/ml.
A Soluo padro foi obtida dissolvendo-se 3 mg de cetoconazol SQR em
diclorometano. Aps, diluiu-se uma poro da Soluo padro at obter
concentrao de 0,1 mg/ml sendo esta a Soluo padro diluda.
Aplicaram-se, separadamente, 10 l das Solues padro e padro diluda e
10 l das amostras (Xb-ceto, Form1 e Form2) extradas do xampu, com auxlio de
capilar, em linha horizontal.
Para a soluo metanlica de cetoconazol a 2 % (Sol-ceto) no foi feita
diluio para a aplicao na placa, sendo aplicados 2 l da amostra diretamente na
placa.
A aplicao foi feita 1,5 a 2 cm acima do bordo inferior e com distncia entre
elas de 1 cm. O cromatograma foi desenvolvido at 7 cm acima do ponto de
aplicao em placas de gel de slica 60 F254 Merck como fase estacionria. O
sistema eluente constitudo de uma mistura de n-hexano, acetato de etila, metanol,

gua e cido actico glacial (42:40:15:2:1 V/V/V/V/V). O cromatograma foi
desenvolvido em cuba no saturada com o sistema eluente e revelado atravs da
exposio a vapores de iodo e luz ultravioleta 254 nm, respectivamente (USP 28,
2005).
4.5.2. Anlise quantitativa

Para posterior estudo da fotoestabilidade do cetoconazol, desenvolveram-se e
validaram-se dois mtodos para determinao do teor do frmaco nas formulaes:
cromatografia lquida de alta eficincia e ensaio microbiolgico.
4.5.2.1. Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)

Atravs de testes preliminares foram determinados os parmetros ideais para
o desenvolvimento e validao do mtodo por cromatografia lquida de alta
eficincia para a determinao do cetoconazol nas seguintes formulaes: Xb-ceto,
Form1 e Form2.
4.5.2.1.1. Reagentes
Foram utilizados reagentes grau CLAE e a gua foi obtida por sistema
Millipore.
4.5.2.1.2. Equipamento
As anlises foram realizadas em cromatgrafo a lquido de alta eficincia
SHIMADZU LC-10AD, detector de UV-Vis SPD-10AV, central de controle SCL10A, desgaseificador DGU-14A.
4.5.2.1.3. Fase mvel

A fase mvel foi constituda de uma mistura das solues A e B (7:3, V/V).
A soluo A contendo monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V) e a soluo B
acetato de amnio-gua (1:200, p/V). O pH final da soluo foi ajustado com cido
actico at 5,5, com auxlio de potencimetro. Aps a mistura foi desgaseificada
durante 12 minutos, em banho de ultra-som sob vcuo.
4.5.2.1.4. Condies cromatogrficas

Os parmetros utilizados foram:
DFluxo: 1ml/min
DColuna: LiChrospher 100 RP-8, 5 m (150 mm x 4,6 mm)
DComprimento de onda: 225 nm
DVolume de injeo: 20,0 l
DTemperatura: 20 C
4.5.2.1.5. Validao
Para a validao do mtodo foram avaliados os parmetros de linearidade,
preciso, especificidade, exatido, robustez e limites de deteco e quantificao
(USP 28, 2005; ICH, 1996b).
4.5.2.1.5.1. Linearidade
Fez-se a solubilizao do cetoconazol substncia qumica de referncia
(SQR) em HCl M e aps completou-se o volume com a fase mvel, de forma a
obter soluo estoque contendo 600 g/ml.
A partir desta soluo, alquotas de 1,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0 ml foram
transferidas para bales volumtricos mbar de 10 ml, com auxlio de uma bureta.
Completaram-se os volumes com a fase mvel, obtendo-se concentraes finais de
60,0; 120,0; 240,0; 360,0; 480,0 g/ml. Os procedimentos de diluio foram
executados ao abrigo da luz.
A curva padro foi realizada em trs dias, sendo que cada ponto da curva foi
injetado em triplicata, e com a mdia das reas obtidas nos diferentes dias,
construiu-se um grfico plotando-se o resultado da mdia das reas versus
concentrao (g/ml).
4.5.2.1.5.2. Preciso
A preciso do mtodo foi verificada na amostra da formulao elaborada no
laboratrio (Xb-ceto), assim como nas formulaes comerciais (Form1 e Form2).
Foram avaliadas seis amostras de cada formulao, em trs dias diferentes, sendo
cada amostra injetada em triplicata. A preparao das mesmas e da soluo de SQR
est descrita abaixo.
A. Preparo da soluo de cetoconazol SQR

Foram pesados, analiticamente, 15,0 mg de SQR em balo volumtrico
mbar de 50 ml; adicionaram-se 2 ml de HCl M e completou-se o volume com a
fase mvel.
B. Preparo das solues amostra

Para as trs formulaes avaliadas (Xb-ceto, Form1 e Form2) foram pesados
exatamente cerca de 400 mg de xampu (equivalentes a 8,0 mg de cetoconazol) em
balo volumtrico mbar de 25 ml. Aps, completou-se o volume com a fase mvel,
obtendo-se concentrao de 320 g/ml.
Para a formulao desenvolvida no laboratrio (Xb-ceto), foi necessrio
fazer a correo da densidade, para os clculos de teor, pois a concentrao da
mesma era expressa em mg/ml. Para as formulaes comerciais, a correo no foi
necessria (concentrao mg/g).
C. Clculos
Foram calculadas as reas mdias correspondentes a trs injees, para as
amostras Xb-ceto, Form1, Form2 e para a soluo de SQR. Aps, procedeu-se a
quantificao de cetoconazol em cada formulao, utilizando-se a equao 3:
% cetoconazol = Aa . Cp .100
Ap . Ca
Equao 3
onde: Aa = rea mdia da amostra

Ap = rea mdia do padro
Ca = concentrao da amostra (g/ml)
Cp = concentrao do padro (g/ml)
4.5.2.1.5.3. Especificidade
Para a formulao desenvolvida no laboratrio, a especificidade foi avaliada
atravs da comparao dos cromatogramas obtidos da soluo amostra do Xb-ceto e
de uma soluo amostra placebo, isto , contendo somente os excipientes do xampu
(Xb) descrito no item 4.4.1.1.
A soluo de amostra de Xb-ceto foi preparada conforme descrito no item
4.5.2.1.5.2.B.; a soluo do placebo foi preparada pesando-se 400 mg de Xb (item
4.4.1.1.) em balo volumtrico de 25 ml.
A determinao da especificidade nas amostras comerciais (Form1 e Form2)
foi realizada atravs da determinao da pureza dos picos cromatogrficos, com
auxlio de detector de arranjo de diodos SPD-M10A VP.
4.5.2.1.5.4. Exatido
A exatido do mtodo foi verificada pela adio de quantidades conhecidas
da SQR na soluo amostra de Xb-ceto.
Para tanto, foram transferidas para balo volumtrico mbar de 25 ml,
alquotas de 2,5 ml, a partir de soluo estoque de amostra, contendo o equivalente
a 2,2 mg/ml. A essas alquotas foram acrescentados 1,0; 2,0 e 3,0 ml de soluo
estoque de cetoconazol SQR (1,1 mg/ml); aps completou-se o volume com a fase
mvel. As concentraes obtidas foram de 264,0; 308,0; 352,0 g/ml, sendo estas
denominadas R1, R2 e R3, respectivamente.
Para quantificar o teor recuperado de cetoconazol SQR, adicionado nas
solues, procedeu-se o clculo de percentagem recuperada atravs da equao 4
descrita
pelo
AOAC
(ASSOCIATION
OF
OFFICIAL
ANALYTICAL
CHEMISTS, 1990).
R % = (Cf Ca) .100

CSQR
Equao 4
onde: Cf = concentrao encontrada na amostra adicionada da SQR (g/ml)

Ca = concentrao encontrada na amostra no adicionada da SQR (g/ml)
CSQR = concentrao da SQR adicionada amostra (g/ml)
4.5.2.1.5.5. Robustez
Para a determinao da robustez do mtodo foi avaliada a estabilidade da
soluo e realizados testes com alteraes na fase mvel conforme descrito a seguir.
A. Estabilidade da soluo
Avaliou-se durante trs dias a estabilidade de uma soluo SQR. Para tanto,
preparou-se a soluo, em balo volumtrico mbar, no diluente contendo
300 g/ml de cetoconazol. A soluo foi armazenada temperatura ambiente e foi
analisada no momento do preparo, no segundo e terceiro dias. Calculou-se o desvio
padro relativo das mdias das reas obtidas e verificou-se o possvel surgimento de
outros picos no cromatograma.
B. Modificaes na fase mvel

Fez-se modificaes na fase mvel original (monoisopropilamina-metanol
(2:500, V/V) / acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5) e aps
injetou-se a soluo de 300 g/ml de cetoconazol SQR verificando possveis
alteraes no cromatograma. Alterou-se a proporo de solvente orgnico (6,5:3,5)
e alterou-se o pH (4,5). Calculou-se o desvio padro relativo das mdias das reas
obtidas.
4.5.2.1.5.6. Limites de deteco e quantificao

Os limites de deteco (LD) e de quantificao (LQ) foram calculados
matematicamente, a partir dos dados obtidos da equao da reta da curva padro,
pelas equaes 5 e 6 (ICH, 1996b):
LD = DP . 3,3
b
Equao 5
onde: DP = desvio padro do intercepto

b = inclinao da reta
LQ = DP . 10
b
Equao 6
4.5.2.2. Ensaio microbiolgico

Foram realizados ensaios preliminares para o desenvolvimento do mtodo de
anlise do cetoconazol na formulao de Xb-ceto. Para o desenvolvimento deste
ensaio foram realizados testes alternando-se alguns parmetros conforme Tabela 5.
Tabela 5 Parmetros utilizados para a avaliao de xampu de cetoconazol por ensaio

microbiolgico mtodo de difuso em gar.
Parmetros
Descrio
Microrganismo
Candida albicans ATCC 10231

Saccharomyces cerevisiae ATCC2601
Concentrao do inculo
0,25; 0,5; 1,0 %
Soluo diluente inicial
HCl M,
DMSO,
lcool metlico
Soluo diluente final
gua
Soluo tampo fosfato potssio 1 % pH 4,5
Soluo tampo fosfato potssio 1 % pH 6,0
Concentrao das solues
25,0; 100,0; 400,0 g/ml

30,0; 120,0; 480,0 g/ml
50,0; 150,0; 450,0 g/ml
20,0; 100,0; 500 g/ml
Mtodo
Cilindros em placa
Discos de papel
Meios de cultura
gar Sabouraud-dextrose 2 %
gar Sabouraud-dextrose 4 %
Tempo de incubao
16; 18; 24 horas
A partir dos resultados obtidos nos ensaios preliminares, foi possvel

estabelecer os parmetros ideais para a realizao do doseamento microbiolgico,
mtodo de difuso em gar, que encontram-se descritos abaixo:
DMicrorganismo: Candida albicans ATCC 10231

DConcentrao do inculo: 0,5 %
D Soluo diluente inicial: lcool metlico
D Soluo diluente final: Soluo tampo fosfato potssio 1 % pH 6,0
D Concentrao das solues: 20,0; 100,0; 500 g/ml
DMtodo: Cilindros em placa
DMeio de cultura: gar Sabouraud-dextrose 2 %
DTempo de incubao: 18 horas
DTemperatura de incubao: 35 2 C
4.5.2.2.1. Material
Foram empregadas placas de Petri (20 mm x 100 mm) e cilindros de ao
inoxidvel (8 mm x 6 mm x 10 mm). Esses materiais, assim como vidraria no
volumtrica, utilizados no ensaio microbiolgico, foram esterilizados em estufa
temperatura de 180 C, durante duas horas.
Aps a execuo do ensaio, a medida dos halos de inibio formados foi feita
em leitor de placas BIOMATIC com auxlio de paqumetro digital STARRET, com
graduao de 0,01 mm.
4.5.2.2.2. Preparo do meio de cultura

No doseamento microbiolgico foi utilizado gar Sabouraud-dextrose 2 %
(Merck), para manuteno e repique do microrganismo, assim como para o preparo
da camada base e inculo. O meio de cultura, Sabouraud-dextrose 2 %, foi

preparado atravs de reconstituio do meio dessecado em gua. Fez-se o
aquecimento do meio at total dissoluo e aps esterilizou-se em autoclave a
121 C, durante 15 minutos.
4.5.2.2.3. Preparo da soluo tampo fosfato de potssio 1 % pH 6,0

Dissolveram-se 2 g de fosfato de potssio dibsico e 8 g de fosfato de
potssio monobsico em 1000 ml de gua. Aps procedeu-se a determinao do pH,
com auxlio de potencimetro, e esterilizao em autoclave a 121 C, durante 15
minutos (USP 28, 2005).
4.5.2.2.4. Preparo da soluo salina

Pesou-se 0,9 g de cloreto de sdio e diluiu-se em 100 ml de gua. Aps, fezse a esterilizao em autoclave a 121 C, durante 15 minutos.
4.5.2.2.5. Preparo do inculo

O microrganismo foi mantido em refrigerador, em tubo contendo gar
Sabouraud-dextrose 2 % inclinado, e repicado para outro tubo, 48 horas antes do
ensaio, permanecendo temperatura de 25 C. No momento do ensaio, o
microrganismo foi transferido para soluo salina, at obter-se uma suspenso a
25 % 2 % de transmitncia, a 580 nm. A partir desta suspenso, preparou-se o
inculo a 0,5 % em gar Sabouraud-dextrose 2 %, mantido em banho-maria a 47 C
1 C at ser distribudo nas placas.
4.5.2.2.6. Validao
Para a validao do mtodo alguns parmetros foram avaliados:
DLinearidade: foram desenvolvidas duas curvas padro, em dias diferentes,
com trs concentraes cada uma. A equao da reta e o coeficiente de correlao
(r) foram calculados.
DPreciso: foi avaliada atravs do desvio padro relativo (DPR) obtido na
repetibilidade (mesmo dia) e na preciso intermediria (diferentes dias) das
amostras com a mesma concentrao.
DExatido: avaliada atravs do percentual de recuperao de uma
quantidade conhecida de SQR adicionada amostra.
4.5.2.2.6.1. Preparo das solues de cetoconazol SQR

Foram transferidos 25,0 mg de cetoconazol substncia qumica de referncia,
exatamente pesados, para balo volumtrico mbar de 25 ml. Solubilizou-se em
2 ml de HCl M, e aps adicionaram-se 1,25 g de xampu base (descrito no item
4.4.1.1.), 0,25 ml de polissorbato 80 e 10 ml de lcool metlico. O balo
volumtrico foi agitado durante 20 minutos em agitador mecnico e aps
completou-se o volume com lcool metlico. Aps filtrao com papel de filtro
comum, foram transferidos, analiticamente, 1,0; 1,0 e 5,0 ml da soluo com
concentrao de 1000 g/ml, para bales volumtricos mbar de 50, 10 e 10 ml e
adicionados de soluo tampo fosfato de potssio 1 % pH 6,0, obtendo
concentraes finais de 20,0; 100,0 e 500,0 g/ml (P1, P2 e P3).
4.5.2.2.6.2. Preparo das solues amostra

Foram transferidos 1,25 g de xampu de cetoconazol (descrito no item
4.4.1.2.), exatamente pesados, para balo volumtrico mbar de 25 ml.
Adicionaram-se 0,25 ml de polissorbato 80 e 10 ml de lcool metlico. O balo
completou-se o volume com lcool metlico. Aps filtrao com papel de filtro
comum, foram transferidos, analiticamente, 1,0; 1,0 e 5,0 ml da soluo com
concentrao de 1000 g/ml, para bales volumtricos mbar de 50, 10 e 10 ml e
adicionados de soluo tampo fosfato de potssio 1 % pH 6,0, obtendo
concentraes finais de 20,0; 100,0 e 500,0 g/ml (A1, A2 e A3).
4.5.2.2.6.3. Ensaio
O teor de cetoconazol presente no xampu (Xb-ceto) foi determinado atravs
do mtodo de difuso em gar - cilindros em placas, com delineamento 3 x 3. Em
capela de fluxo laminar, foram adicionados 20 ml do meio de cultura (gar
Sabouraud-dextrose 2 %) em cada placa, permanecendo as placas abertas at a
solidificao do meio. Foram adicionados 5 ml de inculo 0,5 %. Aps a
solidificao do inculo, procedeu-se distribuio de seis cilindros estreis por
placa, nos quais foram adicionados, em cada cilindro, 200 l das solues de
cetoconazol SQR (descritas no item 4.5.2.2.6.1.) e das solues amostra (descritas
no item 4.5.2.2.6.2.), resultando na anlise de trs concentraes de cetoconazol
SQR e trs concentraes de cetoconazol amostra.
As placas foram incubadas, em estufa a 35 C 2 C, por um perodo de 18
horas. Aps, procedeu-se a leitura dos dimetros dos halos de inibio formados ao
redor de cada cilindro, com auxlio de paqumetro digital.
4.5.2.2.6.4. Clculos
Os ensaios foram realizados em dois dias, sendo que, em cada dia utilizaramse 24 placas, finalizando 48 placas avaliadas. Para efeito de clculo, foram
realizadas mdias de cada 8 placas, totalizando seis resultados mdios que foram
submetidos anlise estatstica.
A reta foi construda plotando no grfico os valores mdios dos halos de
inibio versus o logaritmo da concentrao. A equao da reta foi determinada
atravs do estudo de regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados. O ensaio
foi avaliado atravs de anlise de varincia (ANOVA), conforme preconizado pela
F. Bras. IV (1988). A determinao da potncia do cetoconazol na amostra foi
calculada pela equao de HEWITT (1977).
4.5.2.2.6.5. Exatido
A exatido do mtodo foi verificada pela adio de quantidades conhecidas
da SQR na soluo amostra.
Para realizao do ensaio preparou-se uma soluo estoque da SQR,
denominada Soluo estoque 1. Para tanto, foram transferidos 100 mg de
cetoconazol SQR, exatamente pesados, para balo volumtrico mbar de 50 ml.
Solubilizou-se em HCl M, e aps adicionaram-se 5 g de xampu base (descrito no
item 4.4.1.1.), 0,5 ml de polissorbato 80 e 10 ml de lcool metlico. O balo
completou-se o volume com metanol. Procedeu-se filtrao com papel de filtro
comum. A concentrao final obtida foi de 2000 g/ml.
A partir da Soluo estoque 1 fez-se uma nova diluio em metanol,
denominada Soluo estoque 2, obtendo concentrao final de 500 g/ml.
Preparou-se, da mesma forma, uma soluo estoque da amostra. Foram

transferidos 5,0 g de xampu de cetoconazol (descrito no item 4.4.1.2.), exatamente
pesados, para balo volumtrico mbar de 50 ml. Adicionaram-se 0,5 ml de
polissorbato 80 e 10 ml de lcool metlico. O balo volumtrico foi agitado durante
20 minutos em agitador mecnico e aps completou-se o volume com metanol.
Procedeu-se filtrao com papel de filtro comum. A concentrao final obtida foi de
2000 g/ml.
A. Preparo das solues de cetoconazol SQR

Transferiram-se, analiticamente, 1,0; 1,5 e 1,8 ml da Soluo estoque 1
(2000 g/ml), para bales volumtricos mbar de 50, 25 e 10 ml e adicionou-se
soluo tampo fosfato de potssio 1 % pH 6,0, obtendo concentraes finais de
40,0; 120,0 e 360,0 g/ml (P1, P2 e P3).
B. Preparo das solues amostra

Transferiram-se, analiticamente, 1,0; 1,5 e 1,8 ml da soluo estoque amostra
(2000 g/ml), para bales volumtricos mbar de 50, 25 e 10 ml e adicionou-se
40,0; 120,0 e 360,0 g/ml (A1, A2 e A3).
C. Preparo das solues R1, R2 e R3

Transferiram-se, analiticamente, 1,0; 1,5 e 1,8 ml da soluo estoque da
amostra (2000 g/ml) e adicionaram-se 1,0; 1,5 e 1,8 ml da Soluo estoque 2
(500 g/ml), para bales volumtricos mbar de 50, 25 e 10 ml. Aps adicionou-se

50,0; 150,0 e 450,0 g/ml (R1, R2 e R3).
Para quantificar o teor recuperado de cetoconazol SQR adicionado na
soluo amostra, procedeu-se execuo do mtodo sendo utilizadas 15 placas de
Petri, adicionadas, aleatoriamente com 200 l das solues de cetoconazol SQR,
solues amostra e solues R1, R2 e R3.
Com a mdia dos valores de halos de inibio obtidos e com a equao da
reta foi possvel calcular a percentagem recuperada atravs da equao 4 descrita no
item 4.5.2.1.5.4 pela AOAC (ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL
CHEMISTS, 1990).
4.6. ESTUDOS DE FOTOESTABILIDADE

4.6.1. Avaliao do cetoconazol frente luz UV-C e luz UV-A
Para avaliao da fotoestabilidade do cetoconazol, amostras contendo o
frmaco foram expostas lmpada Light express LE UV (254 nm), 30 W (UV-C) e
lmpada Blacklight blue lamp Orion (352 nm) 30 W, 130 V (UV-A). As
lmpadas foram colocadas em cmara, espelhada internamente, com 100 x 16 x 16
cm.
4.6.1.1. Amostras expostas luz UV

A. Matria-prima
Alquotas de 1,0 ml de uma soluo metanlica de cetoconazol 2 % foram
transferidas para vidro de relgio. Aguardou-se at a evaporao total do solvente
orgnico, obtendo a formao de um filme no vidro. As amostras foram colocadas
na cmara e analisadas nos tempos 0, 2, 6 e 8 horas para amostras expostas

lmpada UV-C e nos tempos 0 e 48 horas para amostras expostas lmpada UV-A.
B. Soluo metanlica de cetoconazol 2 % (Sol-ceto)

Retiraram-se alquotas de 1,0 ml da soluo metanlica de cetoconazol 2 %
que foram acondicionadas em cubetas de plstico descartveis Plastibrand.
Fecharam-se as cubetas, com auxlio de Parafilm, e colocaram-se as amostras na
cmara.
Adicionaram-se em cubetas de plstico descartveis, metanol sem o
cetoconazol (Branco 1), e amostras da soluo metanlica de cetoconazol 2 %,
revestidas com papel alumnio para proteo da luz UV (Branco 2). A temperatura
da cmara foi monitorada durante todo o experimento. As amostras expostas luz
UV-C e UV-A foram avaliadas por 24 horas.
C. Xampu de cetoconazol 2 % (Xb-ceto)

Utilizaram-se
cubetas
de
plstico
descartveis
Plastibrand
para
acondicionamento das amostras. Para tanto, pesaram-se 1,5 g de Xb-ceto em cada

cubeta. Fecharam-se as cubetas, com auxlio de Parafilm; fez-se determinao do
peso total (amostra, cubeta e Parafilm) e colocaram-se as cubetas na cmara
contendo as lmpadas. Aps a retirada das cubetas da cmara, cada uma foi pesada,
a fim de verificar alterao na densidade do produto. Juntamente com os testes de
degradao do frmaco, avaliou-se a formulao do xampu base (Xb) sem o
cetoconazol (Branco 1).
Alm do Branco 1, cubetas de plstico descartveis contendo amostras do

xampu de cetoconazol (Xb-ceto), revestidas com papel alumnio para proteo da
luz UV (Branco 2) foram avaliadas. A temperatura da cmara foi monitorada
durante todo o experimento. As amostras expostas luz UV-C e UV-A foram
avaliadas por 24 horas.
4.6.1.2. Determinao do teor de cetoconazol

As amostras expostas luz UV (UV-A e UV-C) foram avaliadas atravs de
mtodo desenvolvido e validado por CLAE (item 4.5.2.1.). Para tanto, a matriaprima contida no vidro de relgio foi transferida quantitativamente para balo
volumtrico mbar de 50 ml. O Xb-ceto retirado da cubeta foi pesado (400 mg) em
balo volumtrico mbar de 25 ml e as alquotas da Sol-ceto retirada da cmara,
foram transferidas, quantitativamente, para balo volumtrico mbar de 50 ml. Fezse a diluio com a fase mvel. O teor do cetoconazol foi determinado, assim como
foi verificada a presena de produtos de degradao.
As amostras de Xb-ceto expostas lmpada UV-C, por um perodo de 0, 6 e
22 horas, foram avaliadas atravs de ensaio microbiolgico (item 4.5.2.2.) para
determinao da atividade antifngica do frmaco.
4.6.2. Avaliao do cetoconazol frente luz natural

Todas as amostras avaliadas ficaram a 50 cm da janela de modo a assegurar
luz diurna constante.
4.6.2.1. Amostras expostas luz natural

A. Matria-prima
Para verificar a fotoestabilidade da matria-prima, utilizaram-se pastilhas de
brometo de potssio e cetoconazol que foram acondicionadas em cubetas de
quartzo. Quando necessrio, antes das leituras, as pastilhas eram dessecadas em
estufa. Os estudos foram realizados durante 9 meses.
B. Soluo metanlica de cetoconazol 2 %

As solues metanlicas (Sol-ceto) foram acondicionadas em frascos
plsticos transparentes ou opacos, contendo aproximadamente 100 ml cada um. O
perodo de anlise foi de 26 meses. As amostras foram avaliadas nos tempos 0, 1, 2,
4, 6, 8, 10, 12, 14, 17, 19, 22 e 26 meses.
C. Xampu de cetoconazol 2 %
As formulaes de xampu (Xb-ceto) foram acondicionadas em frascos
plsticos transparentes ou opacos, contendo aproximadamente 100 ml cada um. O
perodo de anlise foi de 26 meses. As amostras foram avaliadas nos tempos 0, 1, 2,
4, 6, 8, 10, 12, 14, 17, 19, 22 e 26 meses.
D. Formulaes comerciais
As formulaes comerciais (Form1 e Form2) foram colocadas junto s
formulaes de Xb-ceto, permanecendo na embalagem de comercializao (frasco
opaco). O perodo de anlise foi de 17 meses, a partir da obteno das mesmas. As
amostras foram avaliadas nos tempos 0, 3, 6, 11 e 17 meses.
4.6.2.2. Deteco dos produtos de degradao

As pastilhas de brometo de potssio foram submetidas diretamente anlise
por espectroscopia na regio do infravermelho. A soluo metanlica e as
formulaes de xampu foram avaliadas por cromatografia em camada delgada (item
4.5.1.4.) e cromatografia lquida de alta eficincia (item 4.5.2.1.).
4.6.2.3. Determinao do teor de cetoconazol

Para a determinao do teor do frmaco as amostras (Sol-ceto, Xb-ceto,
Form1 e Form2) foram avaliadas atravs de CLAE (item 4.5.2.1.). As formulaes
de Xb-ceto, expostas luz visvel, por um perodo de 17 meses, foram avaliadas
atravs de ensaio microbiolgico (item 4.5.2.2.) para avaliao da atividade
antifngica do frmaco.

Durante os estudos de estabilidade das formulaes fez-se a determinao da
densidade do Xb-ceto, Form1 e Form2, atravs de picnmetro, para observar
possvel modificao na massa do produto. Para tanto, utilizou-se metodologia
descrita no item 4.5.1.2.
Durante os estudos de estabilidade das formulaes, fez-se a determinao do
pH das formulaes comerciais (Form1 e Form2) e da Xb-ceto, com auxlio de
potencimetro DIGIMED DMPH-2, para verificar possvel alterao no pH das
mesmas.
4.7. ESTABILIDADE QUMICA

4.7.1. Degradao cida
A. Matria-prima
Adicionaram-se a 15,0 mg de cetoconazol (matria-prima) 4 ml de HCl M
em balo volumtrico mbar de 50 ml, aguardouse por 4 horas e aps a soluo foi
neutralizada com 4 ml de NaOH M. Completou-se o volume com a fase mvel. As
amostras foram avaliadas atravs de CLAE (item 4.5.2.1.).
B. Formas farmacuticas
Para as trs formulaes avaliadas (Xb-ceto, Form1 e Form2) foram pesados,
analiticamente, 400 mg de xampu (equivalentes a 8,0 mg de cetoconazol) em balo
volumtrico mbar de 25 ml. Adicionaram-se 4 ml de HCl M, aguardouse por
4 horas, e aps a soluo foi neutralizada com 4 ml de NaOH M. Completou-se o
volume com a fase mvel. As amostras foram avaliadas atravs de CLAE (item
4.5.2.1.).
4.7.2. Degradao alcalina

A. Matria-prima
Pesaram-se 15,0 mg de cetoconazol (matria-prima) em balo volumtrico
mbar de 50 ml, solubilizou-se em lcool metlico e a esta soluo foram
adicionados 4 ml de NaOH M. Aguardouse por 4 horas e aps a soluo foi
neutralizada com 4 ml de HCl M. Completou-se o volume com a fase mvel. As
amostras foram avaliadas atravs de CLAE (item 4.5.2.1.).
analiticamente, 400 mg de xampu (equivalentes a 8,0 mg de cetoconazol) em balo
volumtrico mbar de 25 ml. Adicionaram-se 4 ml de NaOH M, aguardouse por
4 horas, e aps a soluo foi neutralizada com 4 ml de HCl M. Completou-se o
volume com a fase mvel. As amostras foram avaliadas atravs de CLAE (item
4.5.2.1.).
4.7.3. Degradao com perxido de hidrognio

A. Matria-prima
Pesaram-se 200,0 mg de cetoconazol (matria-prima) em balo volumtrico
mbar de 50 ml, solubilizou-se em lcool metlico e a estes foram adicionados
30 ml de perxido de hidrognio 30 %. Agitou-se durante 30 minutos, e aps
completou-se o volume com perxido de hidrognio. Alquota de 2,0 ml foi
transferida para balo volumtrico mbar de 25 ml e completou-se o volume com a
fase mvel. Fez-se um branco. As amostras foram avaliadas atravs de CLAE (item
4.5.2.1.), logo aps a preparao e aps 4 horas sob repouso.
analiticamente, 5 g de xampu (equivalentes a 200 mg de cetoconazol) em balo
volumtrico mbar de 50 ml e a estes foram adicionados 30 ml de perxido de
hidrognio 30 %. Agitou-se durante 30 minutos, e aps completou-se o volume com
perxido de hidrognio. Alquotas de 2,0 ml foram transferidas para balo
volumtrico mbar de 25 ml e completou-se o volume com a fase mvel. Fez-se um
branco. As amostras foram avaliadas atravs de CLAE (item 4.5.2.1.), logo aps a
preparao.
4.8. ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DOS PRODUTOS DE

DEGRADAO
Para a identificao dos produtos de degradao foram empregadas duas
tcnicas: espectroscopia de ressonncia magntica nuclear (RMN) e espectrometria
de massas (MS).
4.8.1. Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear (RMN)

4.8.1.1. Degradao das amostras
Alquotas de 1,0 ml da soluo metanlica de cetoconazol 2 % foram
acondicionadas em cubetas de plstico descartveis Plastibrand. Fecharam-se as
cubetas, com auxlio de Parafilm e colocaram-se as amostras na cmara. O tempo
de exposio lmpada UV-C foi de 30 horas.
4.8.1.2. Cromatografia lquida de alta eficincia semipreparativa

Os produtos de degradao formados, aps exposio luz, foram isolados
atravs de cromatografia lquida de alta eficincia semipreparativa, para posterior
realizao de espectroscopia de RMN. Atravs de testes preliminares foram
determinados os parmetros ideais para o desenvolvimento do mtodo por CLAE
semipreparativa.
4.8.1.2.1. Equipamento
O isolamento dos produtos foi realizado em cromatgrafo a lquido de alta
eficincia SHIMADZU LC-10AD, detector de UV-Vis SPD-10AV, central de
controle SCL-10A, desgaseificador DGU-14A.
4.8.1.2.2. Fase mvel

A fase mvel foi constituda de metanol-gua-acetato de amnio (7:3:0,0025,
V/V/p). Aps, a mistura foi desgaseificada durante 12 minutos, em banho de ultrasom sob vcuo.
4.8.1.2.3. Condies cromatogrficas

Os parmetros utilizados foram os seguintes:
DFluxo: 2 ml/min
DColuna: Waters Spherisorb S5 C8 (10 x 250 mm)
DComprimento de onda: 225 nm
DVolume de injeo: 200,0 l
DTemperatura: 20 C
4.8.1.3. Determinao da pureza

Com o objetivo de verificar a pureza dos dois produtos de degradao
isolados, fez-se avaliao da pureza do pico das fraes coletadas. Para tanto, foi
utilizado cromatgrafo a lquido de alta eficincia SHIMADZU LC-10AD, detector
de arranjo de diodos SPD-M10A VP, central de controle SCL-10A, desgaseificador

DGU-14A. A fase mvel e as condies cromatogrficas utilizadas na determinao
da pureza das amostras foram as mesmas descritas nos itens 4.5.2.1.3. e 4.5.2.1.4.,
respectivamente.
4.8.1.4. Concentrao das fraes

As fraes foram levadas secura em evaporador rotatrio com temperatura
inferior a 50 C sob presso reduzida. Primeiramente, aguardou-se a evaporao do
metanol e aps fez-se extrao do produto de degradao, em funil de separao,
com auxlio de clorofrmio. O produto de degradao, em maior concentrao na
fase orgnica, foi novamente colocado em evaporador rotatrio para evaporao do
solvente.
Aps, as amostras foram colocadas em dessecador sob vcuo, protegidas da
luz.
4.8.1.5. Espectroscopia de ressonncia magntica nuclear de 1H e 13C

O espectro de RMN de 1H do cetoconazol SQR foi obtido em espectrmetro
BRUKER (200 MHz), utilizando clorofrmio deuterado como solvente. A anlise
foi feita no laboratrio de Ressonncia Magntica Nuclear, Departamento de
Qumica, Universidade Federal de Santa Maria. O espectro de
13
C do cetoconazol
SQR foi obtido em espectrmetro VARIAN (300 MHz), utilizando clorofrmio

deuterado como solvente e tetrametilsilano (TMS) como referncia interna. A
anlise foi feita no laboratrio de Ressonncia Magntica Nuclear, Instituto de
Qumica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Os dois produtos de degradao isolados foram enviados para Facult de
Pharmacie, Universit Picardie Jules Verne (Amiens - Frana) onde foi realizada a
espectroscopia de RMN de 1H e 13C. Os espectros dos produtos isolados (Fr1 e Fr2)

foram obtidos em espectrmetro BRUKER AMX 500 (500 MHz), utilizando
clorofrmio deuterado como solvente e TMS como referncia interna.
4.8.2. Espectrometria de massas (MS)

Para obteno dos espectros de massas de Fr1, Fr2 e cetoconazol foi utilizada
a cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a espectrometria de massas (LCMS).
4.8.2.1. Degradao das amostras

Alquotas de 1,0 ml da soluo metanlica de cetoconazol 2 % foram
acondicionadas em cubetas de plstico descartveis Plastibrand. Fecharam-se as
cubetas, com auxlio de Parafilm e colocaram-se as amostras na cmara. O tempo
de exposio lmpada UV-C foi de 30 horas.
4.8.2.2. Equipamento e condies cromatogrficas

As anlises foram realizadas em cromatgrafo a lquido de alta eficincia
SHIMADZU LC-10AD VP, detector de UV SPD-10AV VP e desgaseificador
DGU-14A. A fase mvel foi constituda de metanol-gua-acetato de amnio
(7:3:0,0025, V/V/p). Aps a mistura foi desgaseificada durante 12 minutos, em
banho de ultra-som sob vcuo.
Os parmetros utilizados foram os seguintes: fluxo: 2 ml/min, coluna: Waters
Spherisorb S5 C8 (10 x 250 mm) e comprimento de onda: 225 nm.
4.8.2.3. Condies da espectrometria de massas - ionizao eletrospray

O sistema de espectrometria de massas ionizao eletrospray utilizado no
estudo foi Micromass Quattro LC, acoplado ao sistema de cromatografia lquida de
alta eficincia.
As condies otimizadas do detector MS foram as seguintes: fluxo de
nitrognio de 430 l/h, capilaridade e voltagem do cone foram de 3,2 kV e 30 V,
respectivamente e as temperaturas da fonte e de dessolvatao foram de 80 e
200 C, respectivamente. Foram traados todos os espectros de massas para ons
positivos, variando m/z de 50 a 700.
4.9. AVALIAO DA SEGURANA BIOLGICA

Visando a investigar o grau de irritao das formulaes contendo os
produtos de degradao, as amostras foram avaliadas atravs de teste de irritao
ocular e avaliao do potencial de citotoxicidade in vitro.
4.9.1. Avaliao da toxicidade aguda com efeito local

Os experimentos foram realizados em coelhos albinos, de ambos os sexos, da
raa Nova Zelndia com peso corpreo de 2 a 2,5 kg. Antes de iniciar o teste, os
animais foram examinados pelo veterinrio responsvel e selecionados. Os animais
sadios foram escolhidos aleatoriamente, mantidos em gaiolas individuais
identificadas, com fornecimento de rao e gua, em sala a temperatura de 20 C
2 C e umidade relativa entre 30 e 70 %. Durante todo o perodo de execuo do
ensaio, desde a aplicao da amostra at a leitura, o animal foi tratado e manuseado
adequadamente.
Os ensaios foram realizados em So Paulo, em laboratrio conveniado com a

Fundao Instituto de Pesquisas Farmacuticas da Universidade de So Paulo
(USP), sendo o laboratrio habilitado para trabalhar com animais.
O procedimento, a seguir descrito, foi baseado no trabalho desenvolvido por
DRAIZE e colaboradores (1944).
4.9.1.1. Teste de irritao ocular

Este mtodo foi utilizado para avaliar as amostras de xampu (Xb-ceto)
contendo os produtos de degradao. Para tanto avaliaram-se uma formulao com
teor de 103,3 % (amostra no degradada) e uma formulao com teor de 41,4 %
(amostra degradada aps exposio lmpada UV-C).
Utilizaram-se cinco coelhos albinos para cada amostra e as amostras de
xampu foram utilizadas sem diluio.
Para aplicao da amostra a plpebra inferior do olho direito foi
cuidadosamente tracionada, formando o saco conjuntival, onde, com auxlio de uma
seringa, foi aplicado 0,1 ml do xampu. Em seguida as plpebras foram mantidas
unidas por 30 segundos, massageando-se o olho do animal para permitir o contato
uniforme com o produto. O olho esquerdo serviu de controle.
Os efeitos causados conjuntiva, crnea e ris foram observados depois de
decorridas 24, 48, 72 horas e no final do stimo dia, aps aplicao do produto. As
avaliaes das reaes oculares foram baseadas na escala de Draize, onde esto
descriminadas as graduaes atribudas s reaes oculares, como: hiperemia
(superabundncia de sangue), quemose (edema), secreo, irite e opacidade (Tabela
6) (DRAIZE et al., 1944).
Aps as leituras, o valor total de cada animal foi obtido e a mdia dos cinco
coelhos, por perodo de leitura, foi calculada, resultando no ndice de irritao
ocular. Para verificar o grau da irritao utilizou-se uma tabela de graduao

(Tabela 7) (INCQS, 2002).
Tabela 6 Graduao das reaes observadas no teste de irritao ocular de acordo com a escala
de Draize.
Crnea
A. Opacidade - grau de densidade
Sem opacidade
rea difusa ou disseminada da ris visveis (perda do brilho)
reas translcidas facilmente discernveis, detalhes da ris ligeiramente obscuros
rea opalescente, nenhum detalhe da ris visvel e tamanho da pupila pouco discernvel
Opaca, ris invisvel
0
1
2
3
4
B. rea da crnea envolvida

Um quarto ou menos, mas no zero
Maior de um quarto e menor do que a metade
Maior que a metade e menor do que trs quartos
Maior do que trs quartos at a rea total
Graduao TOTAL = (A x B) x 5
1
2
3
4
C. ris
Normal
Dobras marcadamente profundas, congesto, inchao, ris ainda reativa luz
No reao luz, hemorragia, destruio grosseira
Graduao TOTAL = C x 5
0
1
2
Conjuntiva
D. Hiperemia
Vasos normais
Vasos definidamente injetados acima do normal
Vermelho intenso mais difuso e vasos no facilmente discernveis
Vermelho escuro difuso
0
1
2
3
E. Quemose
Ausncia de edema
Algum edema acima do normal
Edema bvio com everso parcial das plpebras
Edema com plpebras pouco fechadas
Edema com plpebras mais que metade fechadas
0
1
2
3
4
F. Secreo
Ausncia de secreo
Alguma secreo
Secreo com umedecimento das plpebras e plos adjacentes a estas
Secreo com umedecimento das plpebras, plos e rea considervel ao redor do olho
Graduao TOTAL = (D + E +F) x 2
Fonte:DRAIZE et al., 1944.
0
1
2
3
Tabela 7 Tabela de graduao da classificao do produto aps teste de irritao ocular.
Classe
ndice de
irritao ocular
Classificao
0 14,9
no irritante
M24h<2,4 = Classe I; se M24h>2,4 ir p/ Classe II
Observaes
II
15 24,9
irritante leve
1)M48h<2,4=Classe II, se M48h>2,4 ir p/ item 2

2)M72h<2,4=Classe II, se M72h>2,4 ir p/ Classe III
III
25 49,9
irritante
moderado
1)M7d<20 ir p/ item 2, se M7d>20 ir p/ Classe IV

2)L7d<10 em pelo menos 3 animais = Classe III, se
L7d>30 em pelo menos 1 animal = Classe IV
IV
50 79,9
80 - 110
V
L: leitura de cada coelho
M: mdia das leituras
1)M7d<40 ir p/ item 2, se M7d>40 ir p/ Classe V

irritante severo 2)L7d<30 em pelo menos 3 animais = Classe IV, se
L7d >80 em pelo menos 1 animal = Classe V
irritante
mximo
1)M7d>40 ir p/ item 2
2)L7d>60 em pelo menos 1 animal = Classe V
Fonte: INCQS, 2002
4.9.2. Avaliao in vitro

As avaliaes in vitro foram feitas atravs de anlise da citotoxicidade ou
reatividade biolgica em culturas celulares. O mtodo utilizado foi difuso em gar
(USP 28, 2005).
4.9.2.1. Avaliao do potencial de citotoxicidade in vitro

Avaliaram-se duas amostras de xampu de cetoconazol: Xb-ceto com teor de
103,3 % (amostra no degradada) e Xb-ceto com teor de 41,4 % (amostra degradada
aps exposio lmpada UV-C). As amostras foram avaliadas sem diluio.
Os ensaios foram realizados na Seo de Culturas Celulares do Instituto
Adolfo Lutz (IAL), em capela de fluxo laminar vertical, alojada em sala limpa, com
sistema de filtro absoluto e presso positiva. Todo trabalho foi desenvolvido

empregando material esterilizado e tcnicas asspticas.
4.9.2.1.1. Culturas celulares

Foi utilizada a seguinte linhagem celular: NCTC Clone 929, clula de tecido
conjuntivo de camundongo (ATCC CCL-1). A linhagem foi cultivada em meio
mnimo de Eagle, suplementado com 0,1 mM de aminocidos no essenciais, 1 mM
de piruvato de sdio e 10 % de soro fetal bovino, sem antibitico (MEM com 10 %
SFB).
A manuteno da linhagem foi feita a 36 C, em garrafa de 250 ml e repiques
com intervalos mdios de 72 horas. A disperso da monocamada celular foi
efetuada utilizando uma associao de tripsina 0,2 % e versene 0,02 % (ATV).
Aps a disperso, as clulas foram novamente suspensas no meio de cultura e
distribudas, na garrafa destinada manuteno e nas placas de Petri que foram
utilizadas para a realizao dos ensaios.
4.9.2.1.2. Mtodo de difuso em gar

As clulas foram semeadas em volumes de 5 ml em placas de Petri
(60 x
15 mm), na concentrao de 3 x 105 cls/ml. A incubao foi realizada por 48 horas

a 37 C em atmosfera mida contendo 5 % de CO2. Aps este perodo, com a
monocamada de clulas j formada, o meio de cultura foi desprezado e adicionado
volume de 5 ml de overlay, em cada placa de Petri. Este meio composto de partes
iguais de MEM duas vezes concentrado e gar (BBL-Becton Dickinson) a 1,8 %
contendo 0,01 % de vermelho neutro (Merck), como corante vital. No momento do
uso o gar foi fundido e misturado com o MEM, ambos temperatura de 44 1 C.
Discos de 0,5 cm de dimetro, de papel de filtro atxico, foram embebidos na
amostra e posicionados sobre a camada de gar, antes da solidificao completa. As

placas foram incubadas novamente em estufa a 37 C com 5 % de CO2 por 24
horas.
Foram utilizados fragmentos de ltex como controle positivo e discos de
papel atxico como controle negativo. Para a determinao de cada amostra
utilizaram-se quatro placas.
As placas foram observadas macroscpica e microscopicamente e a
citotoxicidade foi constatada pela presena de halo claro ao redor da amostra
testada. Fez-se a determinao do tamanho do halo formado, com auxlio de
paqumetro. A mdia das leituras das quatro placas foi calculada.
A partir das medidas dos halos formados, os ndices de zona (IZ) foram
graduados segundo a USP 28 (2005) (Tabela 8).
Tabela 8 ndice de zona e descrio da reatividade para a avaliao do potencial de

citotoxicidade in vitro mtodo de difuso em gar.
ndice de zona (IZ)
Descrio da reatividade
Classificao
ausncia de efeito sob a amostra
nenhuma
alterao ou degenerao celular sob a amostra
fraca
halo claro somente sob a amostra
leve
halo entre 0,5 e 1,0 cm ao redor da amostra
moderada
halo claro maior que 1,0 cm
severa
Fonte: USP 28, (2005).
RESULTADOS E DISCUSSO
Resultados e discusso 77
5.1. MATRIA-PRIMA
As matrias-primas e a SQR utilizadas no desenvolvimento deste trabalho,
foram armazenadas em recipientes ao abrigo da luz. A manipulao das mesmas
sempre foi realizada em ambiente escuro.
5.1.1. Anlise qualitativa da matria-prima

As duas amostras de cetoconazol foram comparadas com a substncia
qumica de referncia. Ambas apresentaram-se como p branco.
5.1.1.2. Determinao do ponto de fuso

Determinou-se o ponto de fuso de Ceto1 e Ceto2, e aps fez-se a
comparao com os dados da literatura.
Para a determinao do ponto de fuso, o equipamento, METTLER
TOLEDO modelo FP90, utiliza trs capilares contendo as amostras. Estes so
aquecidos com faixa de aquecimento definida enquanto os capilares so iluminados,
por uma lmpada, via um tubo de luz. Trs fotossensores medem continuamente a
intensidade da luz transmitida atravs das amostras. Os sensores ficam situados na
parede exterior e transformam a luz transmitida em um sinal eltrico proporcional.
Os valores encontrados para as matrias-primas e a especificao
farmacopica encontram-se na Tabela 9.
Tabela 9 -Valores obtidos na determinao do ponto de fuso de Ceto1 e Ceto2, atravs do

equipamento METTLER TOLEDO modelo FP90 .
Especificao Farmacopica
(C) (USP 28)
Ponto de Fuso (C)

Ceto1
Ponto de Fuso (C)

Ceto2
150,0
151,4
150,1
151,5
150,2
151,3
Mdia
150,1
151,4
DPR
0,1
0,1
148-152
5.1.1.3. Rotao especfica

A atividade ptica funo da estrutura qumica da substncia e de sua
concentrao. A determinao do poder rotatrio serve para estabelecer tanto a
identidade quanto a pureza da substncia (F. Bras IV, 1988).
O poder rotatrio especfico []
D
20
de uma substncia slida o ngulo de
rotao, medido no comprimento de onda da raia D de sdio, = 589,3 nm,

temperatura de 20 C 0,5 C, calculado em funo de uma camada de 1 dm de
espessura de uma soluo que contm a substncia.
Os valores encontrados para Ceto1 e Ceto2 foram de 0,090 e 0,156,
respectivamente. Sendo assim os resultados esto de acordo com o preconizado pela
USP 28 (2005) que indica valores entre -1 e +1 .

A cromatografia em camada delgada consiste na separao dos componentes
de uma mistura atravs da migrao diferencial sobre uma camada delgada de
adsorvente retido sobre uma superfcie plana (COLLINS et al., 1997). Para o
cetoconazol, o eluente escolhido, preconizado na USP 28 (2005), foi constitudo de
n-hexano, acetato de etila, metanol, gua e cido actico glacial (42:40:15:2:1
V/V/V/V/V).
Aps o desenvolvimento do cromatograma, as placas foram secas e
reveladas. As manchas nas placas (extino de fluorescncia) foram visualizadas
atravs de luz ultravioleta (254 nm), pois o adsorvente da placa estava impregnado
com reagentes fluorescentes. Alm disso, as placas foram expostas a vapores de
iodo em recipiente fechado, onde os compostos orgnicos se tornaram visveis
(manchas marrons).
O resultado obtido demonstrou similaridade das manchas entre amostra e
SQR. O valor de Rf encontrado para Soluo teste 1 e 2, Soluo padro e Soluo
padro diluda foi de 0,33. Nenhuma mancha secundria foi observada.
5.1.1.5. Espectrofotometria de absoro na regio do infravermelho

A
radiao
no
infravermelho
corresponde
parte
do
espectro
eletromagntico situada entre as regies do visvel e das microondas. Embora o

espectro no infravermelho seja caracterstico da molcula como um todo, certos
grupos de tomos do origem a bandas que ocorrem mais ou menos na mesma
freqncia, independentemente da estrutura da molcula. justamente a presena
destas bandas caractersticas de grupos que permite, atravs de simples exame do
espectro e consulta a tabelas, a identificao de estruturas (SILVERSTEIN e
WEBSTER, 2000).
As matrias-primas e a SQR apresentaram as mesmas bandas de absoro na

regio do infravermelho, como pode ser observado na Tabela 10, com suas devidas
atribuies. O espectro na regio do infravermelho para o cetoconazol SQR, Ceto1
e Ceto2 encontram-se representados nas Figuras 2, 3 e 4, respectivamente.
%T
90.00
90.00
80.00
80.00
60.00
60.00
40.00
40.00
20.00
20.00
10.00
4000.0
10.00
2000.0
1500.0
1000.0
600.0
Figura 2 - Espectro na regio do infravermelho do cetoconazol SQR.
%T
90.00
90.00
80.00
80.00
60.00
60.00
40.00
40.00
20.00
20.00
10.00
4000.0
10.00
2000.0
1500.0
1000.0
600.0
Figura 3 - Espectro na regio do infravermelho da matria-prima denominada Ceto1.
%T
90.00
90.00
80.00
80.00
60.00
60.00
40.00
40.00
20.00
20.00
10.00
4000.0
10.00
2000.0
1500.0
1000.0
Figura 4 - Espectro na regio do infravermelho da matria-prima denominada Ceto2.

Tabela 10 Freqncias de absoro das principais bandas do cetoconazol e suas respectivas
atribuies, na regio do infravermelho.
Banda (cm 1)
Atribuies
3119,3
Deformao axial do C-H do anel aromtico
2883,9 e 2831,8
Deformao axial do C-H de grupamentos metila e

metileno
1647,4
Deformao axial do C=O de grupamento amida
1512,4
Deformao axial do C=C do anel aromtico
1458,4
Deformao angular do C-H de grupamentos metila

e metileno
1259,7
Deformao axial de C-N do anel imidazlico
1244,2
Deformao axial de C-O-C de grupamento ter
1051,3
Deformao axial de C-Cl do anel aromtico
814,1 e 673,2
Deformao angular fora do plano de C-H de anel

aromtico
5.1.1.6. Espectrofotometria na regio do ultravioleta

Aps a obteno dos espectros de absoro na regio do ultravioleta para
SQR (Figura 5), Ceto1 (Figura 6) e Ceto2 (Figura 7), pde-se observar que as
matrias-primas apresentaram os mximos de absoro nos mesmos comprimentos
de onda que a SQR. Alm disso os espectros obtidos apresentaram o mesmo perfil
de absoro.
Figura 5 Espectro de absoro na regio do ultravioleta para SQR, utilizando equipamento

SHIMADZU UV-1601 PC e cubetas de quartzo de 1 cm de percurso ptico.
Figura 6 Espectro de absoro na regio do ultravioleta para Ceto1, utilizando equipamento

Figura 7 Espectro de absoro na regio do ultravioleta para Ceto2, utilizando equipamento

5.1.1.7. Perda por dessecao

Os valores de umidade encontrados foram de 0,008 % para Ceto1 e 0 % para
Ceto2. Os valores encontram-se dentro da faixa especificada pela USP 28 (2005)
que deve ser inferior a 0,5 % de umidade.

5.1.2.1. Volumetria em meio no-aquoso (VMNA)
Ceto1 e Ceto2 foram quantificados por volumetria em meio no-aquoso,
segundo USP 28 (2005). Foram feitas trs determinaes de cada matria-prima. Na
Tabela 11 encontram-se os teores e a especificao farmacopica.
Tabela 11 Valores obtidos na determinao do teor de Ceto1 e Ceto2 atravs de mtodo de

VMNA descrito no item 4.3.2.1.
Especificao Farmacopica
(%) (USP 28)
Teor (%)
Ceto1
Teor (%)
Ceto2
99,9
101,1
99,9
99,0
100,1
99,7
Mdia
100,0
99,9
DPR
0,1
1,1
98,0-102,0
Aps as anlises qualitativas e quantitativas das matrias-primas (Ceto1 e 2)

concluiu-se que as mesmas encontravam-se de acordo com as especificaes
farmacopicas (USP 28, 2005).
A matria-prima denominada Ceto1 foi utilizada para o preparo da
formulao (Xb-ceto) que foi utilizada para o desenvolvimento e validao dos dois
mtodos de anlise quantitativa: cromatografia lquida de alta eficincia e ensaio
microbiolgico. A matria-prima Ceto2 foi empregada nos estudos de estabilidade
do frmaco e avaliao da segurana biolgica do xampu de cetoconazol.
5.2. FORMAS FARMACUTICAS

5.2.1. Xampu de cetoconazol 2 % preparado no laboratrio (Xb-Ceto)
Segundo THOMA e KBLER (1997), os excipientes podem influenciar
fortemente a fotoestabilidade de substncias, portanto a escolha da formulao de
Xb-ceto foi feita tentando utilizar o menor nmero de excipientes possveis, para
diminuir a possvel interferncia dos mesmos. Adicionou-se formulao os
excipientes necessrios para o desenvolvimento do xampu.
Como tensoativo para o Xb-ceto, optou-se pelo lauril ter sulfato de sdio
(Figura 8) que um tensoativo aninico. Os mecanismos fsico-qumicos que
caracterizam a detergncia so (WOLF et al., 2001):
9 diminuio da fora de ligao entre a queratina e as sujidades atravs da
diminuio da tenso superficial, de modo a facilitar a remoo das
partculas,
9 transferncia da oleosidade para o veculo aquoso,
9 disperso/suspenso do leo e das partculas de sujidades na espuma.
R-O(CH2CH2O)nCH2CH2-O-SO3-Na+
R uma mistura de grupos alquila C12-14 e n = 1 a 4
Figura 8 - Estrutura qumica do lauril ter sulfato de sdio
Como agente estabilizador de espuma foi empregada a dietanolamida de

cido graxo de coco. Algumas vezes estes compostos tambm contribuem para
aumentar a viscosidade do produto final. Para a preparao de xampus comum a
adio de estabilizadores de espuma, pois freqente a associao da detergncia
ao poder de espuma, entretanto estas propriedades nem sempre so concomitantes,
j que existem tensoativos eficazes na detergncia e que possuem fraco poder de
espuma (BOUILLON, 1996).
A viscosidade do Xb-ceto 2 % foi aumentada atravs da adio de cloreto de
sdio, que teve como conseqncia um aumento na resistncia ao movimento.
Adicionou-se, tambm, formulao, metilparabeno que um conservante da
classe dos hidroxibenzoatos. Sua estrutura qumica est representada na Figura 9.
O
O
CH3
HO
Figura 9 - Estrututa qumica do metilparabeno
O controle apropriado do pH desempenha papel fundamental na obteno de

formulaes farmacuticas eficazes e com as caractersticas mais adequadas para os
fins a que se destinam (PRISTA et al., 1995). Na realidade, o valor apropriado de
pH importante, pois este pode alterar a solubilidade e a estabilidade do frmaco na
formulao, causar irritao ao paciente e, ainda, pode alterar o efeito teraputico.
Em geral, o pH ideal para os xampus est na faixa de 5,5 a 6,5, sendo que
desta forma no ocorre irritao ao usurio (FERREIRA, 2002). Considerando que
o cetoconazol solvel em meio cido, optou-se pela solubilizao do frmaco em
HCl M e aps ajuste do pH final com NaOH M para 5,5. Utilizou-se o HCl, pois em
trabalhos anteriores (STAUB et al., 2002) verificou-se a baixa solubilidade do
cetoconazol em solues diludas de cido ctrico pela formao de precipitado no
fundo do frasco. Com HCl, o frmaco permaneceu solvel, isto , no se observou
precipitado no fundo do frasco. Entretanto, todas as formulaes avaliadas, em HCl
ou cido ctrico, desenvolveram colorao avermelhada.
A gua, responsvel pela diluio do tensoativo, uma matria-prima
utilizada em alta concentrao nas formulaes de xampu. Para o Xb-ceto, as
qualidades da mesma foram asseguradas.
5.2.2. Xampu comercial de cetoconazol 2% (Form1 e Form2)

As formulaes comerciais so muito mais complexas que o xampu
preparado no laboratrio, por possurem vrios excipientes. A Form1 utiliza como
tensoativos o lauril poliglicol-ter sulfosuccinato sdico e o sulfato sdico de lauril
poliglicol-ter.
Foram utilizadas as alcanolamidas de cidos graxos (dietanolamida de cido
lurico, mirstico, palmtico, esterico e olico) como funo de formadores de
espuma. Laurdimneo de colgeno hidrolisado foi utilizado para obteno de um
cabelo mais suave e macio, pois apresenta propriedades condicionantes. Dioleato de
macrogol-120 metil glicose apresenta propriedades espessantes. Como conservante
foi utilizada a imiduria.
O HCl foi utilizado como agente de solubilizao do cetoconazol e,
provavelmente, a eritrosina sdica, empregada como corante, tenha sido adicionada
devido modificao de cor que o produto sofre com o passar do tempo.
A Form2 contm, como tensoativos, lauril ter sulfato de sdio e lauril ter
sulfosuccinato de sdio. A dietanolamina de cido graxo de coco foi empregada,
pois agente estabilizador da espuma. Como conservante foi utilizada a
imidazolidinil uria.
Para solubilizao do frmaco e ajuste do pH foram utilizados HCl e NaOH,
respectivamente. O cloreto de sdio e o trioleato de metil glicose foram empregados
como agentes espessantes. Provavelmente o corante vermelho Ponceaux 4R foi
adicionado, pois o produto adquire colorao avermelhada.
5.2.3. Soluo metanlica 2 % (Sol-ceto)

Com o objetivo de avaliar o frmaco sem a interferncia dos excipientes do
xampu, preparou-se uma soluo metanlica de cetoconazol a 2 %. Utilizou-se a
mesma concentrao da substncia ativa que utilizada para o xampu, pois segundo
TONNESEN (2001) a concentrao do frmaco influencia o processo de
fotodegradao.
5.3. ANLISE DAS FORMAS FARMACUTICAS

5.3.1. Anlise qualitativa
A amostra de xampu (Xb-ceto) adquiriu colorao avermelhada 1 dia aps a
preparao da mesma. A soluo (Sol-ceto) levou mais tempo para adquirir
colorao avermelhada (duas semanas). importante salientar que as amostras
utilizadas para a validao dos mtodos foram armazenadas protegidas da luz. Para
as amostras comerciais (Form1 e Form2), no foi possvel fazer a anlise quanto
formao de cor devido presena de corante.
O Xb-ceto e a Sol-ceto no apresentaram odor forte. As amostras comerciais
continham fragrncias.

A determinao da densidade relativa das formulaes de xampu foi
realizada logo aps a preparao do Xb-ceto e no momento da aquisio das
formulaes comerciais. Os resultados encontram-se na Tabela 12.
Tabela 12 - Valores da determinao da densidade de Xb-ceto, Form1 e Form2.
Amostra
Densidade relativa
Xb-ceto
1,028
Form1
1,062
Form2
1,030
importante salientar que a concentrao do cetoconazol no Xb-ceto foi

expressa em g/ml. Portanto, para a determinao do teor do frmaco no xampu,
atravs dos mtodos desenvolvidos e validados, a pesagem da amostra era realizada,
sendo necessria a correo da massa. Para as formulaes comerciais a
concentrao foi expressa em g/g.
A determinao do pH foi realizada logo aps a aquisio das formulaes
comerciais. Para a Form1 o valor encontrado foi de 6,58 e para a Form2 foi de 6,72.
Para a amostra Xb-ceto o pH de 5,5 foi ajustado no momento da preparao da
formulao.

A extrao com solvente uma tcnica muito utilizada para separar um
composto orgnico de solues ou suspenses aquosas onde se encontra.
A extrao do cetoconazol do xampu fundamentou-se no fato de que o
frmaco solvel em solvente orgnico e pouco solvel em gua. Aps a adio do
diclorometano e agitao ocorreu a formao de duas fases, sendo que a substncia

passou em maior parte da fase aquosa para o solvente.
Optou-se pela extrao com trs pores de solvente, apesar de K
(coeficiente de partio) ser grande, uma poro significativa do soluto ficaria
presente em ambas as fases aps uma extrao simples. Sendo assim, fez-se a
extrao do soluto com trs pores de diclorometano; desta forma a extrao foi
praticamente total.
Para as amostras de cetoconazol extradas do xampu, optou-se pelo mesmo
eluente escolhido para a matria-prima (item 4.3.1.4.), pois, aps vrias tentativas, o
melhor resultado foi encontrado com o mesmo.
Aps o desenvolvimento do cromatograma, as placas foram secas e
reveladas. Da mesma forma que para a matria-prima, as manchas nas placas foram
visualizadas atravs de luz ultravioleta (254 nm) e expostas a vapores de iodo em
recipiente fechado.
O resultado obtido (Figura 10) demonstra a similaridade das manchas entre
amostras e padro. O valor de Rf encontrado foi de 0,33. Observou-se uma mancha
secundria na amostra Xb-ceto com Rf de 0,75, sendo a mancha atribuda ao
conservante -metilparabeno- constituinte da formulao, uma vez que foi feito um
branco (formulao sem o cetoconazol) e observou-se a presena da mancha. Para
as outras amostras no foram observadas manchas secundrias.
Figura 10 Representao do cromatograma em camada delgada, utilizando n-hexano, acetato de

etila, metanol, gua e cido actico (42:40:15:2:1 V/V/V/V/V) como eluente. Valor de Rf do
cetoconazol de 0,33. Soluo padro (1), Soluo padro diluda (2), Form1 (3), Form2 (4), Xbceto (5) e Sol-ceto (6)

No existem metodologias oficiais para o doseamento de cetoconazol em
xampu. Para o desenvolvimento deste trabalho, foi necessrio o desenvolvimento e
a validao de mtodos que tornassem possvel a determinao do teor do frmaco
nas formulaes, para posterior estudo da estabilidade do mesmo. Para tanto, dois
mtodos foram desenvolvidos e validados: a cromatografia lquida de alta eficincia
e o ensaio microbiolgico.
5.3.2.1. Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)

A cromatografia lquida de alta eficincia uma tcnica freqentemente
empregada na quantificao de frmacos em formulaes farmacuticas
(WATSON, 1999).
As condies cromatogrficas utilizadas no desenvolvimento e validao do
mtodo por CLAE foram adaptadas de trabalhos descritos na literatura. Algumas
modificaes foram realizadas com o objetivo de otimizar a quantificao do
frmaco na forma farmacutica xampu. A proposta foi desenvolver um mtodo
rpido e sensvel, validando os parmetros que do confiabilidade ao mesmo.
Para a anlise de muitos frmacos empregam-se detectores UV/Vis,
fornecendo assim um mtodo de anlise exato, preciso e robusto. A cromatografia
juntamente com a deteco UV/Vis capaz de monitorar a estabilidade de frmacos
e formulaes, detectando produtos de degradao. Portanto, o mtodo foi escolhido
para determinar o teor do cetoconazol durante o estudo de estabilidade, assim como
a deteco de produtos de degradao formados.
Segundo a USP 28 (2005) para a quantificao do frmaco em suspenso
oral e comprimidos, os comprimentos de onda empregados so 223 e 225 nm,
respectivamente. Optou-se em desenvolver o mtodo em de 225 nm, onde o
frmaco apresenta uma boa absoro.
A partir dos dados relatados na literatura, foram experimentalmente testadas
diferentes composies de fases mveis, variando-se, basicamente, a proporo da
fase
orgnica.
Sendo
assim,
optou-se
pela
seguinte
fase
mvel:
monoisopropilamina-metanol 2:500 / acetato de amnio-gua 1:200 (7:3).

O acetato de amnio foi utilizado, pois melhorou os parmetros
cromatogrficos do pico relativo ao cetoconazol. O on amnio comporta-se como
cido fraco e a dissoluo de seus sais resulta em solues cidas ou neutras
(DISCHER, 1966).
A monoisopropilamina foi adicionada fase mvel com o objetivo de reduzir

a assimetria do pico. Segundo WATSON (1999), a amina fica adsorvida aos
grupamentos silanis livres presentes nas colunas de fase reversa, impedindo que as
substncias com caractersticas bsicas interajam com estes grupamentos,
aumentando a cauda do pico.
Considerando que a coluna empregada (LiChrospher 100 RP-8, 5 m (150
mm x 4,6 mm)) base de slica, optou-se por acidificar a fase mvel, devido
presena da monoisopropilamina que eleva o pH, pois essas colunas no suportam
pHs muito alcalinos. Sendo assim, o pH final da soluo foi ajustado para 5,5 com
cido actico.
O cetoconazol uma base fraca e apresenta dois valores de pKa. A molcula
(Figura 11) possui quatro nitrognios na estrutura, sendo que somente dois
apresentam carter cido-base. Os nitrognios B e D so neutros, pois os pares
de eltrons contribuem para a aromaticidade do anel imidazlico e ressonncia com
o grupo carbonila adjacente, respectivamente. Provavelmente o nitrognio A do
anel imidazlico seja o nitrognio mais bsico da molcula, apresentando o maior
valor de pKa (6,5). O nitrognio C, conjugado com o anel aromtico, apresenta o
valor de pKa menor (2,9), pois o par de eltrons est em ressonncia, levando a uma
diminuio da sua disponibilidade para protonao (CURRIE et al., 1996).
A
N
N
CH2
D
CH3C
O
C
N
Cl
O
OCH2
Cl
O
Figura 11 Estrutura do cetoconazol.
Utilizando a equao 7 (WATSON, 1999) pode-se dizer que no pH de 5,5,

considerando o pKa de 6,5, cerca de 90 % do frmaco estar ionizado. Sendo assim,
nesse pH ocorre uma diminuio no tempo de reteno e na assimetria do pico, pois
a molcula estando ionizada apresenta maior afinidade pela fase mvel que polar.
Base: % ionizada = 10 pKa pH x 100

1 + 10 pKa - pH
Equao 7
As Figuras 12, 13, 14 e 15 apresentam os cromatogramas do cetoconazol

SQR, Xb-ceto, Form1 e Form2, respectivamente. Os parmetros cromatogrficos
relativos ao pico do frmaco foram os seguintes: tempo de reteno de 4,1 minutos,
fator de capacidade de 25,8, resoluo de 3,19, fator de cauda de 1,38 e nmero de
pratos tericos de 1800. Para a amostra de Xb-ceto o pico com tempo de reteno
de 1,8 minutos relativo ao conservante metilparabeno presente na formulao.
No cromatograma da Form1 tambm aparece pico no tempo de reteno de 1,8
minutos que foi atribudo a um dos constituintes da formulao.
600
500
mAU
400
300
200
100
4
Minutes
Figura 12 Cromatograma do cetoconazol SQR (300 g/ml), obtido por CLAE com comprimento
de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol
(2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel.
600
mAU
400
200
Minutes
Figura 13 - Cromatograma da amostra Xb-ceto (320 g/ml), obtido por CLAE com comprimento
600
mAU
400
200
Minutes
Figura 14 - Cromatograma da amostra Form1 (320 g/ml), obtido por CLAE com comprimento de
onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol
600
mAU
400
200
Minutes
Figura 15 - Cromatograma da amostra Form2 (320 g/ml), obtido por CLAE com comprimento de
5.3.2.1.1. Linearidade
A linearidade de um procedimento analtico a capacidade de obter
resultados diretamente proporcionais concentrao da substncia em anlise. A
linearidade pode ser determinada atravs da elaborao de curvas padro com no
mnimo cinco nveis de concentrao (ICH, 1996b).
Na Tabela 13 esto apresentados os valores das reas obtidas na elaborao
da curva padro, atravs de cromatografia lquida de alta eficincia.
Tabela 13 - Valores das reas obtidas na elaborao da curva padro do cetoconazol por CLAE
monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5
como fase mvel.
Concentrao
SQR (g/ml)
Dia 1*
Dia 2*
Dia 3*
Mdia
DPR
60,0
3605365
3490946
3566009
3554107
1,6
120,0
7095180
6914808
6936409
6982132
1,4
240,0
13754679
13729973
13816348
13767000
0,3
360,0
20659315
20930560
20603896
20731257
0,8
27409143
27319381
480,0
*cada valor representa a mdia de trs injees
27139266
27289263
0,5
A Figura 16 indica a representao grfica da curva padro com a sua

respectiva equao da reta, obtida por regresso linear atravs do mtodo dos
mnimos quadrados.
A Tabela 39 (Anexo 1) apresenta os resultados dos tratamentos estatsticos
sobre os valores das reas encontradas na obteno da curva padro por
cromatografia lquida de alta eficincia.
rea
y = 56671x + 183697
r = 0,9999
3,00E+07
2,50E+07
2,00E+07
1,50E+07
1,00E+07
5,00E+06
0,00E+00
0
100
200
300
400
500
Concentrao (g/ml)
Figura 16 - Representao grfica da mdia das trs curvas padro de cetoconazol e sua respectiva
equao da reta, obtidas por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase
reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V)
(7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel.
5.3.2.1.2. Preciso
A preciso do mtodo analtico representa o grau de concordncia entre os
resultados de anlises individuais quando o procedimento aplicado repetidamente
a mltiplas alquotas de uma amostra homognea (ICH, 1996b).
Os valores experimentais encontrados na determinao das amostras Xbceto, Form1 e Form2 pelo mtodo de cromatografia lquida de alta eficincia esto
apresentados nas Tabelas 14, 15 e 16, respectivamente.
Tabela 14 Valores experimentais obtidos na determinao de cetoconazol em xampu (Xb-Ceto)

por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e
como fase mvel.
Dias
1
Teor (mg/ml)*
20,1; 19,9
20,3; 20,0
20,3; 20,1
20,5; 20,6
20,6; 20,7
20,1; 20,7
20,6; 20,9
20,9; 21,1
21,1; 21,1
Teor (%)*
100,4; 99,3
101,5; 100,1
101,3; 100,7
102,6; 102,8
102,9; 103,3
100,6; 103,3
103,0; 104,6
104,5; 105,3
105,3; 105,4
Mdia (%)
DPR
100,6
0,8
102,6
1,0
104,7
0,9
102,6
Mdia entre dias
0,4
DPR entre dias

*cada valor representa a mdia de trs injees
Tabela 15 Valores experimentais obtidos na determinao de cetoconazol em xampu (Form1)

como fase mvel.
Dias
1
Teor (mg/ml)*
19,8; 20,1
20,1; 20,1
20,0; 20,0
19,3; 19,6
19,5; 19,5
19,6; 19,6
20,0; 20,1
19,9; 19,9
20,0; 19,9
Teor (%)*
99,1; 100,3
100,7; 100,5
100,1; 100,0
96,3; 97,9
97,7; 97,6
97,9; 97,8
100,2; 100,5
99,3; 99,6
100,2; 99,5
Mdia entre dias

DPR entre dias
* cada valor representa a mdia de trs injees
Mdia (%)
DPR
100,1
0,5
97,5
0,6
99,9
0,5
99,2
0,3
Tabela 16 Valores experimentais obtidos na determinao de cetoconazol em xampu (Form2)

como fase mvel.
Dias
1
Teor (mg/ml)*
20,4; 20,4
20,0; 20,3
20,1; 20,5
20,0; 20,1
20,1; 20,0
20,3; 20,1
20,3; 20,5
20,2; 20,1
20,2; 20,2
Teor (%)*
101,8; 102,0
99,8; 101,7
100,6; 102,5
100,2; 100,6
100,5; 99,8
101,4; 100,4
101,7; 102,5
100,8; 100,6
101,0; 101,2
Mdia entre dias

DPR entre dias
* cada valor representa a mdia de trs injees
Mdia (%)
DPR
101,4
1,0
100,5
0,5
101,3
0,7
101,1
0,5
5.3.2.1.3. Especificidade
A especificidade de um mtodo definida como a habilidade de avaliar de
forma inequvoca a substncia de interesse na presena de componentes que
poderiam interferir com a sua determinao numa mistura complexa. Aps a anlise
do cromatograma do Xb (item 4.4.1.1.) verificou-se que os excipientes no
interferem no pico relativo ao cetoconazol, pois o tempo de reteno dos excipientes
foi de 1,8 minutos (Figura 17).
A especificidade de um mtodo analtico dentre outras formas, pode ser
avaliada atravs da determinao da pureza do pico cromatogrfico, utilizando
detector de arranjo de diodos (ANVISA, 2003), o qual mostra grfica e
numericamente, a similaridade do espectro do pico da substncia de interesse.
Sendo assim, a pureza do pico do cetoconazol em Form1 e Form2 foi determinada
atravs da pureza total do pico (Figuras 18 e 19).
1000
1000
800
800
600
600
400
400
200
200
Minutes
Figura 17 - Cromatograma do placebo (Xb), obtido por CLAE com comprimento de onda de
225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato
de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel.
cetoconazol de 0,999993, obtido por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando
coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua
(1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel.
mAU
mAU
cetoconazol de 0,999997, obtido por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando
A pureza total do pico calculada atravs da comparao de todos os

espectros de um pico cromatogrfico com o espectro de referncia, sendo que o
espectro do pice do pico utilizado como referncia. Quanto mais prximo de 1,0
for o ndice de similaridade, mais similar ou mais puro o pico cromatogrfico
(SHIMADZU, 2001).
5.3.2.1.4. Exatido
A exatido do mtodo foi avaliada atravs do teste de recuperao para a
amostra Xb-ceto, cujos resultados podem ser observados na Tabela 17.
Tabela 17 - Valores experimentais obtidos no teste de recuperao para amostra Xb-ceto atravs de
como fase mvel.
Amostra
Concentrao adicionada
(g/ml)
Concentrao recuperada
(g/ml)*
Recuperao
(%)
R1
44,0
43,3
98,4
R2
88,0
85,5
97,1
R3
132,0
126,8
96,0
97,2
Mdia
1,2
DPR
*cada valor representa a mdia de trs dias de anlise, sendo a amostra injetada em
triplicata
A exatido tambm pode ser inferida desde que a linearidade, preciso e

especificidade tenham sido estabelecidas. Assim pode-se inferir que o mtodo
utilizado exato, tambm, para as formulaes comerciais (Form1 e Form2), visto
que esses parmetros foram avaliados (ICH, 1996b).
5.3.2.1.5. Robustez
A robustez indica a capacidade do mtodo de fornecer resultados confiveis
mesmo quando alguns parmetros so modificados. Para a CLAE algumas
modificaes que podem ser feitas so variaes no pH ou na composio da fase
mvel e avaliao da estabilidade da soluo SQR.
A soluo de cetoconazol SQR demonstrou-se estvel durante os trs dias de
anlise. A Tabela 18 mostra os valores de reas absolutas obtidas durante os dias de
anlise. Este ensaio visa a avaliar se as solues utilizadas na validao do mtodo
permanecero estveis durante o perodo de execuo dos ensaios.
Tabela 18 Valores de reas absolutas da soluo de cetoconazol SQR (300 g/ml), nos trs dias
de anlise, obtido por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase
reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V)
Tempo (dias)
reas
16016133
16214461
16153803
DPR
0,6
As modificaes feitas na fase mvel alteraram sensivelmente o tempo de

reteno do frmaco, entretando as reas absolutas obtidas no variaram. A
diminuio da fase orgnica aumentou o tempo de reteno do frmaco (Figura 20),
que passou de 4,1 para 5,7 minutos; no entanto, os demais parmetros no sofreram
alterao. No se observou a formao de picos secundrios.
800
600
mAU
400
200
Minutes
Figura 20 - Cromatograma da soluo de cetoconazol SQR (300 g/ml), obtido por CLAE com
comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e fase mvel com diferente
proporo de metanol e gua (6,5:3,5 v/v) pH 5,5.
A diminuio do pH diminuiu o tempo de reteno (Figura 21). No pH de 4,5

o frmaco est totalmente ionizado tendo menor afinidade pela coluna. Entretanto, o
tempo de reteno (2,5 minutos) obtido com o menor valor de pH no teria uma boa
resoluo do pico do frmaco, considerando que nos cromatogramas das amostras
de xampu, os excipientes apresentam um tempo de reteno de 1,8 minutos.
mAU
400
200
Minutes
Figura 21 - Cromatograma da soluo de cetoconazol SQR (300 g/ml), obtido por CLAE com
comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilaminametanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 4,5 como fase mvel.
5.3.2.1.6. Limites de deteco e quantificao

O limite de deteco a menor quantidade da substncia ativa que pode ser
detectada. O valor encontrado a partir das curvas padro do cetoconazol foi de
0,076 g/ml.
O limite de quantificao a quantidade mnima de amostra que pode ser
quantificada com preciso e exatido adequadas. A partir das curvas padro do
cetoconazol o limite de quantificao encontrado para a substncia ativa foi de

0,23 g/ml.
5.3.2.1.7. Validade do ensaio

A linearidade do mtodo foi avaliada atravs do desenvolvimento de trs
curvas padro. A anlise de regresso linear forneceu a equao da reta y = 56671x
+ 183697, com coeficiente de correlao de 0,9999. A regresso linear foi
significativa para p < 0,05 e desvio da linearidade no significativo.
A preciso do mtodo foi determinada, atravs do desvio padro relativo,
entre os teores obtidos nas amostras de Xb-ceto, Form1 e Form2. O DPR de cada
amostra variou entre 0,8 e 1,0 % para Xb-ceto, 0,5 e 0,6 % para Form1 e 0,5 e
1,0 % para Form2.
O mtodo mostrou-se especfico e no teste de recuperao, determinado na
amostra Xb-ceto, o valor mdio observado foi de 97,2 %, com DPR de 1,2 %. Para
as amostras comerciais a exatido do mtodo pde ser inferida, pois foi determinada
a linearidade, a preciso e a especificidade do mesmo.
Os limites de deteco e quantificao encontrados foram de 0,076 g/ml e
0,23 g/ml, respectivamente.
O mtodo de cromatografia lquida de alta eficincia foi validado mostrandose linear, preciso, especfico, exato e robusto (STAUB e BERGOLD, 2004).
5.3.2.2. Ensaio microbiolgico

A atividade (potncia) de quimioterpicos pode ser demonstrada, com
condies adequadas, atravs do efeito de inibio do crescimento de
microrganismos. Uma diminuio da atividade microbiana pode revelar
modificaes sutis na atividade dos frmacos, no demonstradas por mtodos
qumicos (USP 28, 2005).
Foi desenvolvido o delineamento 3 x 3 de acordo com a Farmacopia
Brasileira (F. Bras IV, 1988) e Farmacopia Europia (Ph. Eur., 2002), isto , em
cada placa de Petri foram distribuidas trs concentraes do padro e trs
concentraes da amostra. No delineamento 3 x 3, a diferena dos halos de inibio
obtidos entre padro e amostra menor, pois todos estando na mesma placa,
encontram-se nas mesmas condies, uma vez que o crescimento do microrganismo
o mesmo em toda placa. Sendo assim, a variao que pode vir a ocorrer entre
padro e amostra menor, facilitando o desenvolvimento e validao do mtodo.
Vrios
parmetros
podem
influenciar
desempenho
do
ensaio
microbiolgico; alguns fatores foram avaliados antes da validao do mtodo.

O primeiro passo, foi a avaliao da resposta da amostra frente ao padro.
Observou-se que a SQR, quando adicionada na placa sem a presena dos
excipientes do xampu, formava halos muito maiores que os halos formados pela
amostra. Isso ocorre, pois os constituintes da formulao interferem na difuso do
frmaco na placa. Como a difuso da substncia no gar determinante do tamanho
da zona de inibio de crescimento, optou-se por adicionar o xampu base ao balo
volumtrico, aps a pesagem da SQR e solubilizao da mesma em cido, no
preparo das solues de cetoconazol SQR.
Alm disso, importante ressaltar que, tanto no preparo das solues de
cetoconazol SQR quanto das solues amostras, foi adicionado polissorbato 80.
Como se tratava de uma formulao contendo conservante (metilparabeno), foi
necessria a inibio do mesmo, para que esse no atuasse sobre o microrganismo.
Foi adicionado 1 % de polissorbato 80 na diluio inicial, pois esse capaz de inibir

fenis e derivados (PINTO et al., 2000). Para tanto, durante o desenvolvimento do
mtodo, foi avaliado um branco, isto , todos constituintes da formulao na
ausncia do frmaco em anlise, adicionado, da mesma forma que padro e amostra,
de polissorbato 80. Pode-se observar que, no cilindro que continha o branco, no
ocorreu formao de halo de inibio.
Optou-se por trabalhar com a Candida albicans, pois o cetoconazol
bastante ativo contra esse microrganismo, sendo um dos frmacos de escolha no
tratamento de candidase. Alm disso, o crescimento do microrganismo foi
homogneo e os halos de inibio formados apresentaram-se bem definidos.
Ao se iniciar a aplicao de uma metodologia, deve ser feita a padronizao
do inculo, a partir de testes preliminares. A concentrao do inculo empregada
deve ser suficiente para apresentar crescimento homogneo do microrganismo,
propiciando um contraste com a zona de inibio de crescimento, sem apresentar
colnias isoladas. Os melhores resultados e o crescimento mais uniforme foram
obtidos com o inculo com concentrao de 0,5 %.
Utilizou-se lcool metlico como diluente inicial para uma melhor extrao
do frmaco, uma vez que o cetoconazol solvel nesse solvente. A diluio final
no pode ser feita em solvente orgnico, no mtodo de cilindros em placas, pois o
microrganismo seria tambm inibido pelo solvente alm do antifngico. Sendo
assim, avaliou-se solues tampo em diferentes pH como diluente final. Observouse que, em soluo tampo pH 6,0, os halos de inibio formados foram maiores e
mais uniformes. importante ressaltar que o pH do sistema deve ser compatvel
com o crescimento microbiano e com a estabilidade e atividade das substncias
testadas.
As concentraes utilizadas na curva de dosagem devem estar em progresso
geomtrica, uma vez que existe relao linear entre o logaritmo da concentrao e o
dimetro dos halos de inibio de crescimento. As concentraes de 20,0; 100,0 e
500 g/ml foram empregadas, pois apresentaram excelentes resultados, atravs de

anlise estatstica. A razo entre doses escolhida foi de 5, pois os halos formados,
tiveram maior diferena no tamanho entre as trs concentraes utilizadas, tanto
para amostra quanto para padro, facilitando a anlise dos resultados.
A tentativa de trabalhar com discos de papel, como reservatrio da soluo
contendo o frmaco, foi avaliada, pois o disco permite a aplicao de amostras
diludas em solvente orgnico alm de facilitar a manipulao das placas. No
entanto, os resultados obtidos no foram satisfatrios, pois os halos formados no
foram uniformes. Optou-se, ento, pelo mtodo de cilindros em placas.
A velocidade de crescimento do microrganismo afetada diretamente pela
composio do meio. Dois meios de cultura com pequenas diferenas entre si foram
avaliados, e observou-se que com o gar Sabouraud dextrose 2 %, o crescimento do
microrganismo na placa com um inculo de 0,5 %, foi melhor.
Em relao incubao, deve haver uma combinao entre tempo e
temperatura. Com tempo de 16 horas de incubao o microrganismo cresceu, mas o
crescimento no ficou uniforme. Com 24 horas de incubao, os halos formados
ficaram pequenos. Portanto, os melhores resultados foram com 18 horas de
incubao com temperatura de 35 2 C.
5.3.2.2.1. Linearidade
Os valores dos dimetros dos halos de inibio do crescimento do
microrganismo, obtidos para as solues em diferentes concentraes de padro de
cetoconazol e amostra de xampu de cetoconazol (Xb-ceto), encontram-se na Tabela
19. A Figura 22 representa a placa com os halos de inibio formados pelo
cetoconazol amostra e pelo cetoconazol SQR.
Tabela 19 - Valores dos dimetros dos halos de inibio, no doseamento de xampu de cetoconazol
(Xb-ceto), obtidos atravs de ensaio microbiolgico - mtodo de difuso em garcilindros em
placas utilizando meio de cultura gar Sabouraud-dextrose 2%, Candida albicans como
microrganismo teste, tempo de incubao de 18 horas e temperatura de 35 2 C.
Concentrao
(g/ml)
Dimetro dos halos

de inibio (mm)*
13,73; 13,82
20,0
14,04; 13,98
P1
13,86; 12,56
17,37; 17,54
100,0
17,50; 17,58
P2
17,91; 16,77
20,34; 20,57
500,0
20,37; 20,39
P3
21,09; 21,52
13,91; 13,72
20,0
13,64; 13,69
A1
13,84; 12,62
17,47; 17,84
100,0
17,85; 17,77
A2
18,08; 16,62
20,55; 20,64
500,0
20,56; 20,65
A3
21,18; 21,62
*cada valor representa a mdia de oito halos de inibio
Dimetro mdio
DPR
13,67
4,0
17,45
2,2
20,71
2,3
13,57
3,5
17,61
3,0
20,87
2,1

utilizando Candida albicans ATCC 10231 como microrganismo teste, meio de cultura gar
Sabouraud-dextrose 2%, tempo de incubao de 18 horas e temperatura de 35 2 C. Cetoconazol
SQR com concentraes de 20 (P1); 100 (P2) e 500 (P3) g/ml e xampu de cetoconazol (Xb-ceto)
com concentraes de 20 (A1); 100 (A2) e 500 (A3) g/ml.
A representao grfica da curva padro e a equao da reta, determinada
dimetro dos halos de inibio

(mm)
pelo mtodo dos mnimos quadrados, esto representados na Figura 23.
y = 5,0286x + 7,2195
25
R = 0,9982
20
15
10
5
0
1
1,5
2,5
log conc.( g/ml)
Figura 23 - Representao grfica da curva padro de cetoconazol e sua respectiva equao da

reta, obtida atravs de ensaio microbiolgico - mtodo de difuso em garcilindros em placas
utilizando meio de cultura gar Sabouraud-dextrose 2%, Candida albicans como microrganismo
teste, tempo de incubao de 18 horas e temperatura de 35 2 C.
5.3.2.2.2. Preciso
A preciso do ensaio microbiolgico foi determinada atravs da avaliao
de 24 placas no mesmo dia de anlise, e para a preciso intermediria avaliou-se,
em dias diferentes, um total de 48 placas. Os valores experimentais obtidos na
determinao quantitativa de cetoconazol em xampu esto descritos na Tabela 20, e
a validade do ensaio foi comprovada pela anlise de varincia (ANOVA) (Tabela
40, Anexo 1).
Tabela 20 Valores experimentais obtidos na determinao de xampu de cetoconazol (Xb-ceto)

atravs de ensaio microbiolgico mtodo de difuso em gar cilindros em placas utilizando
meio de cultura gar Sabouraud-dextrose 2%, Candida albicans como microrganismo teste,
tempo de incubao de 18 horas e temperatura de 35 2 C.
Dia 1
Dia 2
Amostra
Teor (mg/ml)*
Teor (%)*
21,6
108,1
20,7
103,5
20,0
100,2
20,8
104,1
20,4
102,2
20,5
102,6
Mdia entre dias

DPR entre dias
* cada valor representa a mdia de oito halos de inibio
Mdia
DPR
103,9
3,8
103,0
1,0
103,5
2,6
5.3.2.2.3. Exatido
A exatido do mtodo foi demonstrada atravs do teste de recuperao da
SQR adicionada nas diferentes concentraes testadas. Os resultados esto
apresentados na Tabela 21.
Aps a anlise dos resultados obtidos, verificou-se que uma das
concentraes testadas apresentou teor mais elevado (105,7 %), que pode ser
explicado, pois o ensaio microbiolgico apresenta maior variao quando
comparado a mtodos instrumentais.
Tabela 21 - Valores experimentais obtidos no teste de recuperao atravs de ensaio

microbiolgico mtodo de difuso em gar cilindros em placas utilizando meio de cultura gar
Sabouraud-dextrose 2%, Candida albicans como microrganismo teste, tempo de incubao de 18
horas e temperatura de 35 2 C.
Concentrao
adicionada (g/ml)
Concentrao
recuperada (g/ml)*
Recuperao (%)
R1
10,0
9,9
99,4
R2
30,0
31,7
105,7
R3
90,0
90,5
100,5
Mdia
DPR
*cada valor representa a mdia de 10 halos de inibio
101,9
3,3
5.3.2.2.4. Validade do ensaio

A linearidade do mtodo foi avaliada atravs do desenvolvimento de duas
curvas padro, em dois dias. A anlise de regresso linear forneceu a equao da
reta y = 5,0286x + 7,2195, com coeficiente de correlao de 0,9982.
A preciso do mtodo foi determinada avaliando o coeficiente de variao
percentual entre os teores obtidos nas amostras de xampu de cetoconazol.
Observou-se um teor mdio no primeiro dia de 103,9 % (DPR = 3,8 %) e no
segundo dia de 103,0 % (DPR = 1,0 %); o teor obtido ao final dos dois dias de
anlise foi de 103,5 % (DPR = 2,6 %).
Para avaliao do mtodo foi realizada a anlise de varincia (ANOVA). A
partir dos resultados observou-se que no h desvio de paralelismo (quadrtico e
diferena de quadrtico) bem como no existe diferena significativa entre placas.
Observou-se diferena significativa na regresso e nos valores entre doses, estando
o mtodo de acordo com as especificaes estabelecidas pela F. Bras. IV (1988).
No teste de recuperao, o valor mdio observado foi de 101,9 %, com DPR

de 3,3 %.
O ensaio microbiolgico mtodo de difuso em gar cilindros em placas
desenvolvido, foi validado, mostrando-se linear, preciso e exato (STAUB et al.,
2005).
5.3.2.3. Anlise comparativa dos mtodos

Os resultados das determinaes do teor de cetoconazol em xampu (Xbceto), atravs da cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) e ensaio
microbiolgico mtodo de difuso em gar cilindros em placa, esto
Tabela 22 Teores obtidos na determinao do xampu de cetoconazol (Xb-ceto), atravs de

cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) e ensaio microbiolgico mtodo de difuso em
gar cilindros em placa.
Teores CLAE
Teores Microbiolgico
(mg/ml)
(%)
(mg/ml)
(%)
20,4
102,2
21,6
108,1
20,6
102,9
20,7
103,5
20,6
102,9
20,0
100,2
20,5
102,4
20,8
104,1
20,6
103,1
20,4
102,2
20,4
102,0
20,5
102,6
Mdia
102,6 %
Mdia
103,5 %
DPR
0,4 %
DPR
2,6 %
A anlise estatstica empregada, para a comparao dos dois mtodos

utilizados para a quantificao do cetoconazol na forma farmacutica xampu (Xbceto), foi a distribuio de t de Student. Emprega-se esta distribuio para
anlise de pequenas amostras.
Na comparao dos mtodos desenvolvidos e validados, cromatografia
lquida de alta eficincia (CLAE) e ensaio microbiolgico - mtodo de difuso em
gar cilindros em placa, o valor te tcalc foi de 0,494 e o valor de t0,05;10 de
2,228. Sendo assim, no se observou diferena significativa entre os mtodos
propostos para a quantificao de cetoconazol na forma farmacutica xampu, pois
tcalc foi menor que ttab. As mdias dos valores experimentais obtidos pelos
mtodos CLAE e microbiolgico foram 102,6 % e 103,5 %, respectivamente.
Os mtodos mostraram-se adequados para a quantificao de cetoconazol na
forma farmacutica.
5.4. ESTUDOS DE FOTOESTABILIDADE

Os fatores que podem alterar um produto farmacutico com o tempo so:
temperatura, radiaes, umidade, oxignio, solventes, variaes no pH, interaes e
contaminaes microbianas, entre outros.
Recentemente a decomposio de frmacos, como resultado da absoro da
energia da radiao luminosa, tem recebido maior ateno devido estrutura
qumica complexa de muitos compostos. Diferentes tipos de reaes podem ser
desencadeadas por ao da luz, como reduo, oxidao, hidrlise, isomerizao,
alterao no anel, remoo de vrios substituintes (LACHMAN et al., 2001).
A reao fotoqumica um processo complexo que ocorre em dois estgios.
A primeira reao devido absoro de ftons, isto , envolve um estado de
excitao da molcula, produzindo produtos intermedirios (radicais). Estes
produtos intermedirios podem reagir formando um produto final estvel sendo esta
a reao secundria (TONESSEN, 2001).
Geralmente, os processos de degradao so reaes qumicas que
consomem energia e que podem acelerar-se pelo aumento da temperatura. A
maioria dos mtodos de envelhecimento acelerado se fundamentam em medies da
velocidade de degradao em temperaturas superiores ambiente. Entretanto, se a
degradao provocada por uma reao fotoltica, esta no pode ser acelerada pelo
aumento da temperatura, pois a energia de ativao muito baixa. A velocidade do
processo pode ser incrementada por irradiao com fontes luminosas de intensidade
relativamente alta (NUDELMAN, 1975).
O estudo de degradao de frmacos sob ao da luz UV/Visvel relevante
para o desenvolvimento de formulaes farmacuticas, pois a exposio luz pode
influenciar a estabilidade, levando a modificaes fsico-qumicas como colorao
ou descolorao do produto e a exposio inapropriada do frmaco luz pode
originar produtos txicos de fotodegradao.
Os testes para avaliao da fotoestabilidade de um produto consistem em
duas etapas: teste de degradao forada e testes confirmatrios (ICH, 1996a). O
objetivo da degradao forada avaliar a fotossensibilidade total do produto e
elucidar o caminho da degradao. Os estudos confirmatrios devem ser realizados
para propiciar informaes necessrias sobre a manipulao e embalagem do
produto. Para tanto, fez-se avaliao das formulaes de cetoconazol frente luz
UV-A, UV-C e luz natural.
Aps os testes de degradao do cetoconazol, a determinao do teor das
amostras foi realizada atravs de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE).
Atualmente, quase todos os ensaios de estabilidade de frmacos recorrem CLAE
como mtodo de anlise, pois esta consegue separar e quantificar a substncia ativa
juntamente com seus produtos de degradao.
Alm da CLAE, utilizou-se o doseamento microbiolgico, para avaliao da

formulao Xb-ceto, pois este mtodo esclarece dvidas a respeito da possvel
perda de atividade da substncia em anlise (USP 28, 2005).
5.4.1. Avaliao do cetoconazol frente luz UV-C e luz UV-A

Segundo o ICH (1996a), uma das opes de fonte luminosa para ser utilizada
em testes de fotoestabilidade uma lmpada fluorescente UV tendo distribuio
espectral de 320 a 400 nm com mximos de emisso entre 350 e 370 nm. Para
obteno da degradao do cetoconazol utilizaram-se duas fontes de radiao UV.
Uma radiao UV-A (lmpada Blacklight blue lamp Orion (352 nm) 30 W,
130 V), com mximo de emisso conforme preconizado pelo ICH e outra radiao
UV-C (lmpada Light express LE UV (254 nm), 30 W) com o objetivo de uma
maior degradao do produto, pois quanto menor o comprimento de onda () da
radiao, mais energia absorvida. Conseqentemente, as radiaes absorvidas na
gama do ultravioleta contribuem mais facilmente para o incio de reaes qumicas
do que aquelas absorvidas a partir de outras com comprimento de onda maior.
5.4.1.1. Amostras expostas luz UV

A. Matria-prima
A degradao forada pode ser realizada em estado slido e em soluo. Na
forma slida os estudos podem ser realizados na matria-prima pura e, tambm, em
pastilhas contendo o frmaco e brometo de potssio (MARCINIEC et al., 1997).
Sendo assim, a matria-prima de cetoconazol foi colocada em vidro de relgio na
cmara contendo as lmpadas. Observou-se que a parte superior do p se tornava
vermelha e a parte inferior (no exposta luz) no alterava a cor. Concluiu-se que
no seria possvel avaliar a matria-prima desta forma. Optou-se, ento, pela
transferncia de alquotas de 1 ml de uma soluo metanlica de cetoconazol, para
vidro de relgio, com posterior evaporao do solvente at a obteno de um filme

homogneo da matria-prima. O teor obtido no tempo zero foi de 101,4 % e aps 48
horas de exposio da matria-prima lmpada UV-A o teor obtido foi de 49,5 %.
Para a matria-prima exposta lmpada UV-C, o perodo de exposio foi
menor, pois como explicado acima, a degradao nessa regio do ultravioleta
maior. Sendo assim os tempos de anlise foram de 0, 2, 6 e 8 horas. Pode-se
observar na Figura 24 uma diminuio no teor do frmaco, sendo que em 8 horas a
concentrao obtida foi de 77,5 %.
100
Teor (%)
80
60
40
20
0
0
Tempo (horas)
Figura 24 Representao grfica dos teores de cetoconazol matria-prima obtidos por CLAE,
aps exposio lmpada UV-C (Light express LE UV (254 nm)) por um perodo de 8 horas.
importante salientar que foi possvel detectar a presena de produtos de

degradao nos cromatogramas no tempo de reteno de 3,4 minutos (Figura 25)
tanto para as amostras expostas lmpada UV-C como UV-A. Alm disso, com o
aumento da exposio luz, a matria-prima foi se tornando mais avermelhada.
THOMA e KBLER (1996c) avaliaram a fotodegradao de alguns
antifngicos. O cetoconazol (matria-prima e em soluo metanlica), aps
exposio luz, apresentou a formao de vrios produtos de degradao que foram
detectados atravs de CLAE. Entretanto, os produtos formados no foram
identificados.
600
500
mAU
400
300
200
100
M inutes
Figura 25 - Cromatograma do cetoconazol matria-prima (concentrao terica de 400 g/ml),

aps exposio lmpada UV-C por 8 horas, obtido atravs de CLAE com comprimento de onda
de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)
/acetato de amnio-gua (1:200, p/V) (7:3, V/V) pH 5,5 como fase mvel.

Segundo THOMA e KBLER (1996b), para o estudo de degradao do
frmaco em soluo, pode-se utilizar como solvente o lcool metlico. Para tanto,
1 ml da soluo metanlica de cetoconazol foi acondicionada em cubeta de plstico.
Utilizaram-se cubetas para os testes, pois estes recipientes deixam passar radiaes
na regio do ultravioleta. Os recipientes de vidro so transparentes somente a partir
de 300 nm.
Os resultados encontrados para amostras expostas lmpada UV-A e UV-C
esto representados na Figura 26 e Tabela 23.
100
T eor (%)
80
60
40
20
0
0
10
15
20
25
T empo (horas)
Figura 26 - Representao grfica dos teores da soluo metanlica de cetoconazol obtidos por
CLAE, aps exposio lmpada UV-C [] (Light express LE UV (254 nm)) e UV-A [ ]
(Blacklight blue lamp Orion (352 nm)) por um perodo de 24 horas.
Tabela 23 Valores dos teores de cetoconazol em soluo metanlica (Sol-ceto), aps exposio
s lampadas UV-A e UV-C, obtidos atravs de CLAE.
Tempo
(horas)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Teores soluo metanlica

(lmpada UV-A)
mg/ml
(%)
20,0
100,0
19,1
95,5
18,8
94,2
18,6
93,0
17,7
88,7
15,4
76,8
16,1
80,7
16,8
83,9
16,1
80,7
16,6
82,8
17,4
86,8
17,3
86,4
15,6
78,2

(lmpada UV-C)
mg/ml
(%)
20,0
100,0
14,7
73,4
11,7
58,5
9,1
45,3
7,6
37,8
5,9
29,6
6,1
30,3
4,5
22,7
4,7
23,6
4,6
22,8
4,1
20,5
3,6
18,2
3,3
16,3
Verificou-se que a soluo metanlica (Sol-ceto) submetida lmpada

UV-A, por um perodo de 24 horas, apresentou teor de cetoconazol de 78,2 % e a
Sol-ceto exposta por 24 horas luz UV-C apresentou teor de 16,3 % de
cetoconazol. Com os resultados obtidos constatou-se que o frmaco sofreu
degradao por ao das lmpadas UV-A e UV-C.
Assim como na matria-prima, foi possvel detectar nas solues metanlicas

a presena de produtos de degradao nos cromatogramas no tempo de reteno de
3,4 minutos (Figuras 27, 28 e 29) e a alterao na cor do produto, tanto para as
amostras expostas lmpada UV-C como UV-A. Os cromatogramas das amostras
expostas lmpada UV-C apresentaram o surgimento de vrios outros picos
secundrios, alm do produto no tempo 3,4 minutos.
600
mAU
400
200
Minutes

400 g/ml), aps exposio lmpada UV-A por 8 horas, obtidos atravs de CLAE com
600
mAU
400
200
Minutes

mAU
400
200
Minutes

Os produtos de degradao aparecem com maior intensidade aps exposio

lmpada UV-C. O produto de degradao majoritrio aparece no tempo de 3,4
minutos para ambas as lmpadas.
C. Xampu de cetoconazol 2 % (Xb-ceto)

A fim de verificar alterao no peso do produto, as amostras foram pesadas
antes e aps exposio luz. No entanto, no se observaram variaes.
Os resultados obtidos para a formulao aps exposio s lmpadas UV-C e
UV-A, por um perodo de 24 horas, foram de 57,1 e 93,4 %, respectivamente. Na
Figura 30 e Tabela 24 esto representados os valores encontrados durante o estudo
de estabilidade da formulao.
100
Teor (%)
80
60
40
20
0
0
10
15
20
25
Tempo (horas)
Figura 30 - Representao grfica dos teores de xampu de cetoconazol obtidos por CLAE, aps
exposio lmpada UV-C [] (Light express LE UV (254 nm)) e lmpada UV-A [ ] (Blacklight
blue lamp Orion (352 nm)) por um perodo de 24 horas.
Tabela 24 Valores dos teores de cetoconazol em xampu (Xb-ceto), aps exposio s lampadas
UV-A e UV-C, obtidos atravs de CLAE.
Tempo
(horas)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Teores xampu
(lmpada UV-A)
mg/ml
(%)
20,0
100,0
20,0
100,2
20,0
100,1
20,0
99,9
19,7
98,3
19,3
96,4
19,5
97,4
19,4
97,0
19,3
96,3
19,2
96,1
19,1
95,5
18,9
94,3
18,7
93,4
Teores xampu
(lmpada UV-C)
mg/ml
(%)
20,0
19,6
18,7
17,5
15,8
14,8
14,3
13,3
12,9
13,3
12,7
12,2
11,4
100,0
97,9
93,4
87,4
79,2
73,8
71,7
66,4
64,7
66,7
63,6
61,0
57,1
Para a formulao Xb-ceto tambm foi possvel verificar que o produto

sofreu degradao aps exposio s lmpadas. Alm disso, observou-se a presena
do produto de degradao majoritrio no tempo 3,4 minutos (Figuras 31 e 32). No
tempo 1,6 minutos possvel observar alguma alterao indicando a presena de
produtos de degradao, apesar de os mesmos apresentarem tempo de reteno
similar aos excipientes (1,8 minutos).
600
m AU
400
200
M inutes
Figura 31 -Cromatograma do Xb-ceto (concentrao terica 320 g/ml), aps exposio lmpada
UV-A por 24 horas, obtidos atravs de CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando
600
mAU
400
200
Minutes
Figura 32 -Cromatograma do Xb-ceto (concentrao terica 320 g/ml), aps exposio lmpada
UV-C por 24 horas, obtidos atravs de CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando
Com o objetivo de verificar a atividade do cetoconazol em xampu, aps

exposio luz e deteco dos seus produtos de degradao atravs de CLAE,
procedeu-se o ensaio microbiolgico descrito no item 4.5.2.2. Para tanto, amostras
de Xb-ceto expostas lmpada UV-C por 0, 6 e 22 horas foram avaliadas atravs de
ensaio microbiolgicomtodo de difuso em garcilindros em placa, e os teores
obtidos foram comparados com mtodo de CLAE. Os resultados esto apresentados
na Tabela 25.
Tabela 25 Teores obtidos atravs de ensaio microbiolgico e CLAE para amostras de Xb-ceto
expostas lmpada UV-C por um perodo de 0, 6 e 22 horas.
Tempo
(horas)
Teores (%)
Microbiolgico
Teores (%)
CLAE
97,6
100,0
78,4
87,4
22
57,4
61,0
Aps avaliao dos teores obtidos, verifica-se a diminuio na atividade do

cetoconazol em xampu, exposto lmpada UV-C, frente ao microrganismo teste
(Candida albicans). No cromatograma das amostras avaliadas nos tempos 6 e 22
horas foi possvel verificar a presena dos produtos de degradao majoritrios nos
tempos 3,4 e 1,6 minutos. Na Figura 33 esto representados os halos de inibio
formados, onde pode-se observar uma diminuio significativa no tamanho dos
halos da amostra degradada.
A comparao entre as placas da amostra ntegra e amostra degradada
(Figuras 22 e 33) demonstrou que o produto diminuiu a atividade, pois os halos
formados, aps exposio do produto luz, foram menores.

utilizando Candida albicans ATCC 10231 como microrganismo teste, meio de cultura gar
Sabouraud-dextrose 2%, tempo de incubao de 18 horas e temperatura de 35 2 C. Cetoconazol
SQR com concentraes de 20 (P1); 100 (P2) e 500 (P3) g/ml e xampu de cetoconazol (Xb-ceto),
aps exposio lmpada UV-C por 22 horas, com concentraes de 20 (D1); 100 (D2) e 500 (D3)
g/ml.
A temperatura da lmpada foi monitorada durante todos os experimentos.

Para a lmpada UV-C a temperatura mxima atingida foi de 31 C e para a lmpada
UV-A foi de 27 C. Para minimizar o efeito da temperatura utilizou-se um branco,
isto , a amostra era colocada na cmara nas mesmas condies, envolta com papel
alumnio para proteo da luz. Observou-se que o teor do frmaco continuou o
mesmo, durante todo o tempo que ficou na cmara; alm disso o cromatograma no
apresentou picos secundrios (cromatogramas no apresentados).
Todas as formulaes estudadas e a prpria matria-prima de cetoconazol
apresentaram colorao avermelhada quando expostas luz (UV-A e UV-C), sendo
que com o aumento do tempo de exposio do frmaco radiao, a colorao se
intensificava. Alm disso, observou-se, que com ambas as lmpadas o teor do
frmaco diminuiu e que na lmpada UV-C a diminuio foi mais acentuada, devido
radiao mais energtica. Os resultados indicaram a instabilidade do cetoconazol

frente luz, sofrendo maior degradao na forma de soluo ou como matriaprima.
5.4.2. Avaliao do cetoconazol frente luz natural

Optou-se por armazenar as formulaes de xampu, produzidas no
laboratrio, em frascos plsticos transparentes para uma maior incidncia da luz na
formulao, e em frascos plsticos opacos para observar se os mesmos protegem
das radiaes, uma vez que em farmcias magistrais o xampu de cetoconazol
comercializado em frascos plsticos opacos. As formulaes adquiridas de
indstrias farmacuticas ficaram armazenadas no frasco de comercializao
(plstico opaco).
As solues metanlicas foram armazenadas da mesma forma que o xampu.
Todas as amostras ficaram prximo da janela, simulando as condies do produto
aps serem adquiridas pelo consumidor.
5.4.2.1. Amostras expostas luz natural

A. Matria-prima
Para verificar a fotoestabilidade da matria-prima, utilizaram-se pastilhas de
brometo de potssio e cetoconazol. As pastilhas foram submetidas diretamente
anlise por espectrofotometria na regio do infravermelho. A correlao pico a pico
constitui boa prova de identidade, visto ser muito pouco provvel que dois
compostos diferentes tenham o mesmo espectro no infravermelho, exceo de
pares de enantimeros (SILVERSTEIN e WEBSTER, 2000).
Aps nove meses de exposio luz natural no foi possvel detectar

alterao no espectro. Entretanto, a pastilha adquiriu uma colorao avermelhada
logo nas primeiras semanas.

As solues metanlicas (Sol-ceto) foram analisadas por um perodo de 26
meses. A soluo armazenada em frasco transparente desenvolveu cor na primeira
semana aps o armazenamento. A soluo armazenada em frasco opaco apresentou
leve colorao avermelhada somente aps duas semanas.
Observou-se que as amostras acondicionadas em frascos transparentes
tiveram diminuio no teor do frmaco (75,8 %) e para as amostras acondicionadas
em frascos opacos pde-se observar aumento nos teores de cetoconazol (121,8 %)
(Figura 34 e Tabela 26).
Devido a este aumento nos teores de cetoconazol foi feita a determinao da
pureza do pico cromatogrfico relativo ao frmaco, com auxlio de detector de
arranjo de diodos. A pureza obtida foi de 0,99998 indicando que o pico apresentavase puro. Considerando o longo perodo de anlise das amostras, verificou-se que,
provavelmente, tenha ocorrido evaporao do metanol, pois o solvente muito
voltil, aumentando a concentrao do frmaco nas solues.
120
Teor (%)
100
80
60
40
20
0
0
10
15
20
25
Tempo (meses)
Figura 34 - Representao grfica dos teores da soluo metanlica de cetoconazol obtidos por
CLAE. Amostras armazenadas em frasco transparente [] e em frasco opaco [ ] expostas luz
natural por um perodo de 26 meses.
Tabela 26 Valores dos teores da soluo metanlica de cetoconazol (Sol-ceto), aps exposio
luz natural, obtidos atravs de CLAE.
Tempo
(meses)
0
1
2
4
6
8
10
12
14
17
19
22
26

(frasco trasparente)
mg/ml
(%)
20,0
100,0
19,8
99,1
20,5
102,4
19,5
97,7
19,5
97,4
17,6
88,1
18,0
89,9
16,2
81,2
16,1
80,5
15,2
76,0
15,2
76,2
15,0
75,1
15,2
75,8

(frasco opaco)
mg/ml
(%)
20,0
20,0
20,7
20,2
20,5
20,0
20,3
20,3
21,4
21,9
25,1
24,4
-
100,0
100,1
103,6
100,9
102,7
100,1
101,6
101,6
107,2
109,3
125,5
121,8
-
Os desvios padres relativos (DPR) obtidos no estudo da fotoestabilidade da

Sol-ceto, exposta luz natural, esto apresentados na Tabela 41 (Anexo 1).
Foi possvel detectar, alm da intensa mudana de cor das formulaes, a
presena de produtos de degradao (em torno de 3,4 minutos) nos cromatogramas
(Figura 35) das amostras expostas luz natural. As formulaes armazenadas em
frascos opacos apresentaram leve colorao avermelhada e aps anlise dos
cromatogramas (Figura 36) no foi possvel visualizar a presena de produtos
formados. Entretanto, ampliando a escala pde-se detectar que o tempo de reteno

de 3,4 minutos apresenta alterao (Figura 37). No se observou diminuio do teor
do frmaco, pois o mesmo estava ao abrigo da luz, no entanto a alterao de cor da
formulao indica que o produto formado, mesmo em pequenas quantidades,
produz forte colorao.
Segundo KUMMER e colaboradores (1991), solues etanlicas de
cetoconazol (2,5 e 5,0 g/ml) mostraram-se estveis, por um perodo de 28 dias, em
presena da luz natural. Provavelmente, estes resultados foram encontrados devido
baixa concentrao de cetoconazol empregada e ao curto perodo de avaliao das
amostras frente luz.
600
mAU
400
200
Minutes
Figura 35 - Cromatograma da Sol-ceto (concentrao terica 400 g/ml) armazenada em frasco

transparente, aps exposio luz natural por 26 meses, obtidos atravs de CLAE com
1250
1000
mAU
750
500
250
Minutes
Figura 36 - Cromatograma da Sol-ceto (concentrao terica 400 g/ml) armazenada em frasco

opaco, aps exposio luz natural por 26 meses, obtidos atravs de CLAE com comprimento de
40
30
mAU
20
10
-10
0
Minutes
Figura 37 - Cromatograma com escala ampliada da Sol-ceto (concentrao terica 400 g/ml)
armazenada em frasco opaco, aps exposio luz natural por 26 meses, obtidos atravs de CLAE
como fase mvel.
Alm da CLAE, a CCD permite identificar o frmaco quando este

cromatografado juntamente com a substncia de referncia, bem como, verificar a
presena de impurezas e produtos de degradao. Atravs da CCD foi possvel
detectar a presena de produtos de degradao (manchas secundrias) na soluo
metanlica armazenada em frasco transparente, entretanto, no foi possvel fazer
uma separao dos produtos visualizados. O cetoconazol continuou com o mesmo
Rf e as manchas secundrias tiveram um Rf com valor menor, isto , os produtos de
degradao tm polaridade maior que o cetoconazol. Para a soluo armazenada em
frasco opaco no foram visualizadas manchas secundrias.
C. Xampu de cetoconazol 2 % (Xb-ceto) e formulaes comerciais (Form1 e

Form2)
As formulaes de xampu (Xb-ceto) e as formulaes comerciais (Form1 e
Form2) ficaram expostas luz natural por um perodo de 26 e 17 meses,
respectivamente. Para a avaliao das formulaes comerciais, procurou-se obter as
mesmas com o menor tempo de fabricao, isto , que tivessem sido recentemente
produzidas. A Form1 foi adquirida aps cinco meses da data de fabricao e a
Form2 aps um ms da fabricao.
Durante a realizao dos estudos de fotoestabilidade, foi feita a avaliao da
densidade e do pH de todas as formulaes de xampu (Xb-ceto, Form1 e Form2), os
quais permaneceram estveis.
Aps a anlise da Figura 38 e da Tabela 27 pode-se constatar que houve
diminuio no teor do cetoconazol nas formulaes Xb-ceto armazenadas em frasco
transparente (78,1 %) e em frasco opaco (94,8 %). Alm disso, nos cromatogramas
foi possvel detectar os produtos de degradao formados (Figuras 39 e 40). Atravs
de CCD foi possvel visualizar manchas secundrias. Segundo HEPP (1999), aps
anlise do xampu de cetoconazol frente luz natural, determinado atravs de
espectrofotometria na regio do UV, tambm foi possvel verificar alterao no

espectro, indicando a formao de produtos de degradao.
100
Teor (%)
80
60
40
20
0
0
10
15
20
25
Tempo (meses)
Figura 38 - Representao grfica dos teores do xampu de cetoconazol (Xb-ceto) obtidos por
CLAE. Amostras armazenados em frasco transparente [] e em frasco opaco [ ] expostas luz
natural por um perodo de 26 meses.
Tabela 27 Valores dos teores do xampu de cetoconazol (Xb-ceto), aps exposio luz natural,
obtidos atravs de CLAE.
Tempo
(meses)
0
1
2
4
6
8
10
12
14
17
19
22
26
Teores xampu
(frasco trasparente)
mg/ml
(%)
20,0
100,0
20,2
101,0
20,5
102,4
19,2
96,2
18,6
92,8
18,7
93,7
18,1
90,7
17,2
86,2
16,5
82,5
15,7
78,7
15,2
76,2
16,6
82,9
15,6
78,1
Teores xampu
(frasco opaco)
mg/ml
(%)
20,0
20,2
20,4
19,5
19,2
20,2
19,3
19,5
18,8
19,2
18,8
19,1
19,0
100,0
101,0
101,9
97,7
96,0
100,8
96,7
97,7
94,2
96,2
94,0
95,3
94,8
Os desvios padres relativos (DPR) obtidos no estudo da fotoestabilidade do

Xb-ceto, exposto luz natural, esto apresentados na Tabela 41 (Anexo 1).
600
mAU
400
200
Minutes
Figura 39 - Cromatograma do Xb-ceto (concentrao terica 320 g/ml) armazenado em frasco

transparente, aps exposio luz natural por 26 meses, obtidos atravs de CLAE com
600
mAU
400
200
Minutes
Figura 40 - Cromatograma do Xb-ceto (concentrao terica 320 g/ml) armazenado em frasco

opaco, aps exposio luz natural por 26 meses, obtidos atravs de CLAE com comprimento de
No entanto, mesmo uma formulao simples como Xb-ceto manteve teores

no inferiores a 90 % por um perodo de 10 meses, independente do tipo de frasco
em que foi armazenada.
Para o Xb-ceto e a Sol-ceto, armazenados em frascos transparentes, as
primeiras alteraes no cromatograma ocorreram em torno de 6 e 8 meses de
exposio luz natural, respectivamente. O Xb-ceto armazenado em frasco opaco
apresentou a formao de produtos de degradao somente a partir de 14 meses, e
para a Sol-ceto em frasco opaco no se observou a formao de produtos de
degradao. Assim sendo, os resultados indicam que a presena da luz favorece a
instabilidade do frmaco.
Para as formulaes comerciais no se observou diminuio do teor do
frmaco (Figura 41 e Tabela 28) durante o perodo de anlise. Alm disso, no foi
detectada a presena de produtos de degradao.
100
Teor (%)
80
60
40
20
0
0
10
15
Tempo (meses)
Figura 41 - Representao grfica dos teores do xampu de cetoconazol (Form1 [] e Form2 [ ])

obtidos por CLAE. Amostras armazenadas nos frascos de comercializao, expostas luz natural
por um perodo de 17 meses.
Tabela 28 Valores dos teores das formulaes comerciais (Form1 e Form2), aps exposio luz
natural, obtidos atravs de CLAE.
Tempo
(meses)
0
3
6
11
17
Teores Form1
mg/g
(%)
19,8
99,2
20,2
100,8
19,2
96,1
19,4
97,2
19,3
96,7
Teores Form2
mg/g
(%)
20,2
101,1
20,2
100,9
19,9
99,5
20,2
100,8
20,3
101,4
Os desvios padres relativos (DPR) obtidos no estudo da fotoestabilidade das

formulaes comerciais, expostas luz natural, esto apresentados na Tabela 42
(Anexo 1).
Da mesma forma que amostras de Xb-ceto expostas lmpada UV-C foram
avaliadas atravs de ensaio microbiolgico, fez-se a determinao da atividade do
antifngico frente ao microrganismo Candida albicans, de amostras Xb-ceto
expostas luz natural por 17 meses. Observou-se uma diminuio significativa nos
teores da amostra armazenada em frasco transparente. Os teores obtidos esto
Tabela 29 Teores obtidos atravs de ensaio microbiolgico e CLAE para amostras de Xb-ceto,
expostas luz natural, por um perodo de 17 meses.
Amostras
Teores (%)
Microbiolgico
Teores (%)
CLAE
Xb-ceto em frasco
transparente
74,9
78,7
Xb-ceto em frasco
opaco
95,1
96,2
Pde-se constatar que o pH cido do xampu, mesmo na ausncia de luz,

propiciou maior instabilidade do frmaco, pois o Xb-ceto, armazenado protegido da
luz, apresentou diminuio no teor, e a Sol-ceto, armazenada em frasco opaco, no
apresentou alterao. Os resultados encontrados esto de acordo com SKIBA e
colaboradores (2000) que demonstraram que o cetoconazol mais instvel em pH
cido.
Segundo THOMA e KBLER (1997) e TONNESEN (2001), os excipientes
podem influenciar a fotodecomposio da substncia ativa. Podem iniciar, propagar
ou participar da reao fotoqumica. Entretanto, para o xampu de cetoconazol
constatou-se que os excipientes atuaram dando proteo ao frmaco, uma vez que
comparando os teores obtidos nas formulaes de xampu e nas solues
metanlicas de cetoconazol, expostas luz (UV ou Visvel), observou-se que a
diminuio do teor do frmaco geralmente foi maior em soluo. A matria-prima
tambm apresentou rpida degradao quando em presena de luz.
5.5. ESTABILIDADE QUMICA

5.5.1. Degradao cida e alcalina
Considerando os resultados obtidos no estudo de fotoestabilidade em meio
cido (Xb-ceto), procedeu-se avaliao do cetoconazol frente a cido e base.
Constatou-se que o teor do cetoconazol (matria-prima), aps 4 horas em HCl M,
foi de 95,6 % e os teores obtidos para as formas farmacuticas Xb-ceto, Form1 e
Form2 foram 94,3, 93,9 e 94,7 %, respectivamente. Durante a avaliao dos
produtos frente a cido foi possvel verificar a formao de produtos de degradao,
em todos os cromatogramas, no tempo de reteno de 3,4 minutos (Figura 42).
600
mAU
400
200
Minutes
Figura 42- Cromatograma do Xb-ceto (concentrao terica 320 g/ml) em presena de HCl M,
por 4 horas, obtido atravs de CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de
fase reversa C-8 e monoisopropilamina-metanol (2:500, V/V)/acetato de amnio-gua (1:200, p/V)
Os teores obtidos para as amostras frente ao NaOH M por 4 horas foram

101,7, 99,1, 99,3 e 99,7 % para matria-prima, Xb-ceto, Form1 e Form2,
respectivamente. No foi possvel verificar alterao no cromatograma, indicando
maior estabilidade do frmaco em meio alcalino. A partir dos resultados
encontrados comprova-se a maior instabilidade do cetoconazol em pHs muito
cidos.
5.5.2. Degradao com perxido de hidrognio

A fim de verificar se ocorria oxidao do frmaco, o cetoconazol matriaprima e em formas farmacuticas foi exposto ao perxido de hidrognio 30 %, por
30 minutos, sob agitao. Os teores obtidos do frmaco foram de 30,4, 68,8, 74,8 e
75,4 % para a matria-prima, Xb-ceto, Form1 e Form2, respectivamente. Deixou-se
a matria-prima em repouso por 4 horas, tornando a avali-la aps este perodo,
encontrando teor de 7,7 %. Foi possvel verificar, em todos os cromatogramas, a

presena do produto de degradao em torno do tempo 3,4 minutos (Figuras 43 e
44). O pico do perxido de hidrognio aparece em 1,8 minutos (Figura 45).
250
200
mAU
150
100
50
Minutes
Figura 43 - Cromatograma do cetoconazol matria-prima (concentrao terica 320 g/ml) em

presena de perxido de hidrognio 30 %, por 30 minutos, obtido atravs de CLAE com
400
mAU
300
200
100
0
0
Minutes
Figura 44 - Cromatograma do cetoconazol matria-prima (concentrao terica 320 g/ml) em

presena de perxido de hidrognio 30 %, por 4 horas, obtido atravs de CLAE com comprimento
400
mAU
300
200
100
0
0
Minutes
Figura 45 - Cromatograma do perxido de hidrognio 30 %, obtido atravs de CLAE com

5.6. ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DOS PRODUTOS DE

DEGRADAO
Durante a realizao dos estudos de estabilidade fotoqumica e qumica do
cetoconazol foi possvel detectar a formao de diversos produtos de degradao.
Entretanto, observou-se maior alterao no cromatograma no tempo de reteno de
3,4 minutos para matria-prima, xampu e soluo metanlica.
Aps testes preliminares para o desenvolvimento do mtodo empregado para
o isolamento dos produtos de interesse (CLAE semipreparativa), foi possvel
verificar a presena de dois produtos de degradao majoritrios no tempo de
reteno de 3,4 minutos. Assim sendo, optou-se pelo isolamento destes dois
produtos que foram denominados Fr1 e Fr2, para posterior realizao de mtodos
espectroscpicos para identificao.
Para verificar se os produtos de degradao (Fr1 e Fr2), formados em soluo
e em xampu frente s luzes UV ou visvel, eram os mesmos, foi empregada a CLAE
com auxlio de detector de arranjo de diodos. Segundo WATSON (1999), o detector
de arranjo de diodos um tipo avanado de detector UV sendo til na determinao
de pureza de misturas complexas, onde picos cromatogrficos podem estar
sobrepostos. Alm disso, capaz de fornecer espectros de UV de cada pico
cromatogrfico colaborando na identificao de substncias no conhecidas.
Aps anlise dos espectros obtidos (Figuras 46, 47, 48 e 49) foi possvel
verificar que os produtos de degradao, formados em soluo e em xampu aps
exposio s luzes UV ou visvel, apresentavam o mesmo perfil. Sendo assim,
optou-se por isolar as duas fraes em soluo metanlica frente luz UV-C.
Nestas condies a degradao do frmaco mais acelerada, pois quanto menor o
da radiao mais energia absorvida. Alm disso, na formulao de xampu os
excipientes fornecem uma certa proteo ao frmaco sendo a degradao mais lenta.
Spectrum at time 16.36 min.
150
mAU
100
50
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
nm
Figura 46 Espectro de absoro na regio do UV e Visvel da Fr1 para amostra de Sol-ceto frente
luz UV-C por 30 horas, obtido com auxlio de detector de arranjo de diodos atravs de CLAE
semipreparativa, utilizando coluna Waters Spherisorb C-8 e metanol-gua-acetato de amnio
(7:3:0,0025 V/V/p) como fase mvel.
mAU
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
nm
Figura 47 Espectro de absoro na regio do UV e Visvel da Fr1 para amostra de Xb-ceto frente
luz natural por 26 meses, obtido com auxlio de detector de arranjo de diodos atravs de CLAE

150
mAU
100
50
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
nm
Figura 48 Espectro de absoro na regio do UV e Visvel da Fr2 para amostra de Sol-ceto frente
luz UV-C por 30 horas, obtidos com auxlio de detector de arranjo de diodos atravs de CLAE
20
mAU
15
10
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
nm
Figura 49 Espectro de absoro na regio do UV e Visvel da Fr2 para amostra de Xb-ceto frente
luz natural por 26 meses, obtido com auxlio de detector de arranjo de diodos atravs de CLAE
5.6.1. Cromatografia lquida de alta eficincia semipreparativa

As condies cromatogrficas, utilizadas para o isolamento de produtos de
degradao, foram totalmente alteradas em comparao CLAE analtica. O tempo
de corrida da anlise foi de 30 minutos, o cetoconazol apresentou tempo de reteno
de 25 minutos e as fraes denominadas Fr1 e Fr2 apresentaram tempos de reteno
em torno de 16,4 e 19,2 minutos, respectivamente (Figura 50).
100
80
mAU
60
40
20
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
Minutes
Figura 50 Cromatograma da soluo metanlica de cetoconazol, exposta luz UV-C por

30 horas, obtido atravs de CLAE semipreparativa com comprimento de onda de 225 nm,
utilizando coluna Waters Spherisorb C-8 e metanol-gua-acetato de amnio (7:3:0,0025 V/V/p)
como fase mvel.
5.6.2. Determinao da pureza

Durante a coleta das fraes fez-se o monitoramento da pureza das mesmas.
Fr1 e Fr2 foram avaliadas atravs da determinao da pureza do pico
cromatogrfico, utilizando detector de arranjo de diodos, o qual mostra grfica e
numericamente, a similaridade do espectro do pico da substncia de interesse. As
Figuras 51 e 52 apresentam os cromatogramas dos produtos isolados e as Figuras 53
e 54 apresentam as curvas de pureza para Fr1 e Fr2, respectivamente.
150
mAU
100
50
-50
0
Minutes
150
mAU
100
50
Minutes
Figura 53 - Curva de pureza apresentada para Fr1, indicando a pureza total do pico de 0,999968,
obtido por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e
como fase mvel.
Figura 54 - Curva de pureza apresentada para Fr2, indicando a pureza total do pico de 0,999999,
obtido por CLAE com comprimento de onda de 225 nm, utilizando coluna de fase reversa C-8 e
como fase mvel.
Com o auxlio do detector de arranjo de diodos foram traados espectros de

absoro nas regies do UV e visvel para o cetoconazol (Figura 55), Fr1(Figura 46)
e Fr2 (Figura 48). A frao isolada (Fr1) apresenta mximos de absoro em 200,
225, 238 e 290 nm, no apresentando absoro na regio do visvel, e a frao
isolada (Fr2) apresenta mximos de absoro em 203, 220, 232, 238 e 288 nm, no
apresentando absoro na regio do visvel. O pico relativo ao cetoconazol
apresentou mximos de absoro em 200, 231 e 291 nm.
800
800
600
600
400
400
200
200
mAU
mAU
250
300
350
400
450
500
nm
550
600
650
700
750
800
Figura 55 Espectro de absoro na regio do UV e Visvel do pico relativo ao cetoconazol para

amostra de Sol-ceto frente luz UV-C, obtido com auxlio de detector de arranjo de diodos atravs
de CLAE semipreparativa, utilizando coluna Waters Spherisorb C-8 e metanol-gua-acetato de
amnio (7:3:0,0025 V/V/p) como fase mvel.
Aps a constatao da pureza das fraes, as mesmas foram colocadas em

evaporador rotatrio sob presso reduzida, para evaporao do solvente, tendo o
cuidado com a temperatura. O metanol evaporou rapidamente restando no balo
apenas gua, acetato de amnio e o produto de degradao. Com o objetivo de
evitar a interferncia do acetato de amnio, procedeu-se extrao do produto de
degradao com clorofrmio, uma vez que os produtos formados mostraram-se bem
solveis neste solvente. Aps evaporou-se o clorofrmio em evaporador rotatrio.
Isolou-se 4 mg de cada um dos produtos e os mesmos apresentaram-se como

um p branco e foram mantidos em dessecador at realizao dos espectros.
5.6.3. Anlise do cetoconazol

Aps reviso de literatura no foram encontrados trabalhos apresentando
espectros de RMN para o cetoconazol. Sendo assim, foi necessria a anlise
espectroscpica do cetoconazol SQR. As Figuras 56 e 57 apresentam a estrutura e o
espectro de RMN 1H do cetoconazol SQR, respectivamente. Na Tabela 30 esto
apresentados os deslocamentos qumicos (), multiplicidade, constante de
acoplamento (J) e o nmero de hidrognios dos sinais observados no espectro
ampliado.
12
N
10
13
N
16
C
H3 C
34
27
28
23
20
32
30
31
22
25
24
21
8
CH2
7
1
Cl
2
O
O
CH2 15
18
A
5
4
Cl
Figura 56 Estrutura qumica do cetoconazol com identificao de carbonos e anis aromticos
Tabela 30 Valores de deslocamentos qumicos (ppm), multiplicidade, constante de acoplamento

(J), nmero de hidrognios e a atribuio dos hidrognios para espectro de RMN-1H do
cetoconazol SQR, obtido em espectrmetro BRUKER (200 MHz), utilizando clorofrmio
deuterado como solvente.
Deslocamentos
qumicos ()
ppm
2,06
2,96
3,27
3,54
3,66
3,80
4,28
4,42
Multiplicidade* e
constante de
Nmero de
Atribuio
acoplamento (J)
hidrognios
(Figura 56)
s
3
34
m
4
H axiais (27, 28, 30, 31)
m
1
16
m
2
18
m
4
H equatoriais (27, 28, 30, 31)
m
1
16
m
1
15
Sistema AB,
2
8
J (14,7Hz)
Sistema AABB
4
21, 22, 24, 25
6,67-6,84
J (8,9 Hz)
s
1
13 ou 12
6,92
s
1
12 ou 13
6,95
dd, J (1,6Hz e 8Hz)
1
5
7,18
d, J (1,6Hz)
1
3
7,39
d, J (8Hz)
1
6
7,51
s
1
10
7,62
* s = singleto, d = dubleto, dd = duplo dubleto, m = multipleto
A Figura 58 apresenta o espectro totalmente desacoplado de RMN
13
C do
cetoconazol SQR. Na Tabela 31 esto apresentados os deslocamentos qumicos ()

dos sinais observados no espectro ampliado.

cetoconazol SQR a partir dos espectros de RMN-13C, obtido em espectrmetro VARIAN (300
MHz), utilizando clorofrmio deuterado como solvente e TMS como referncia interna.
Carbono
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C10
C12
C13
C15
C16
C18
C20
C21 e C25
C22 e C24
C23
C27
C28
C30
C31
C32
C34
Deslocamentos qumicos () ppm

134,43
135,64
127,04
132,79
121,01
128,32
107,81
51,03
138,63
129,34
131,15
74,57
67,35
67,42
152,68
115,05
118,58
145,50
50,48
41,27
46,18
50,84
168,77
21,18
Com auxlio da LC-MS obteve-se o cromatograma (Figura 59) da amostra

que foi degradada em presena da luz UV-C. Aps foi feito o espectro de massas do
pico relativo ao cetoconazol (tempo de reteno de 24,7 minutos).
A Figura 60 apresenta o espectro de massas do cetoconazol. O cetoconazol
protonado perde a acetila e origina m/z de 491, de acordo com CHEN e
colaboradores (2002). O fragmento em m/z de 220 corresponde perda de
C14H13O2N2Cl2 do on molecular e o aparecimento do pico em 82 m/z relativo
poro do anel imidazlico.
Figura 60 Espectro de massas do pico relativo ao cetoconazol, obtido atravs de sistema de

espectrometria de massas ionizao eletrospray acoplado ao sistema de CLAE, utilizando coluna
Waters Spherisorb S5 C8 (10 x 250 mm) e metanol-gua-acetato de amnio (7:3:0,0025 V/V/p)
como fase mvel.
5.6.4. Anlise do produto de degradao denominado Fr1

O espectro de RMN-1H do produto de degradao isolado, denominado Fr1,
est apresentado na Figura 61. Na Tabela 32 esto apresentados os deslocamentos
qumicos (), multiplicidade, constante de acoplamento (J) e o nmero de
hidrognios dos sinais observados no espectro ampliado.

(J), nmero de hidrognios e a atribuio dos hidrognios para espectro de RMN-1H do Fr1, obtido
em espectrmetro BRUKER AMX 500 (500 MHz), utilizando clorofrmio deuterado como
solvente e TMS como referncia interna.
Deslocamentos
qumicos ()
ppm
2,12
3,05
3,58-3,79
4,10
4,18
4,25
Multiplicidade* e
constante de
Nmero de
Atribuio
acoplamento (J)
hidrognios
(Figura 64)
s
3
34
m
4
H axiais (27, 28, 30, 31)
m
4
m
2
18
m
1
16
Sistema AB,
2
8
J (13,3 Hz)
m
1
16
4,35
m
1
15
4,71
Sistema AABB
4
21, 22, 24,25
6,85-6,90
J (6,8 Hz)
s
1
12 ou 13
6,92
s
1
13 ou 12
7,15
dd, J (1,8 Hz e 8,3 Hz)
1
5
7,33
d, J (8,3 Hz)
1
6
7,48
m
1
3
7,52
m
1
4
7,71
s
1
10
8,05
Aps a anlise do espectro de RMN-1H obtido para o produto de degradao

denominado Fr1 foi possvel verificar alterao quando comparado ao espectro do
cetoconazol SQR. Verifica-se importante modificao na regio do anel
aromtico A (Figura 64). possvel observar a presena de um hidrognio a mais
na regio, indicando a possvel perda do cloro na posio do carbono 4 e entrada de
hidrognio. O anel orto-substitudo pode ser verificado, pois o espectro apresenta os

4 hidrognios do anel sendo que o mais desblindado o hidrognio da posio 4.
Alm disso, verificou-se tambm que os hidrognios das posies 13, 15, 16 e 18
ficaram mais desblindados, e os dois hidrognios da posio 8 ficaram mais
blindados.
Aps anlise do espectro totalmente desacoplado de
13
C para a Fr1 (Figura
62) foi possvel observar a existncia dos sinais que esto apresentados na Tabela
33. Com auxlio dos subespectros DEPT (intensificao sem distoro por
transferncia de polarizao), os sinais puderam ser discriminados em CH3, CH2 e
CH. Os sinais dos carbonos quaternrios foram identificados em comparao com o
espectro totalmente desacoplado.
Tabela 33 Valores de deslocamentos qumicos (ppm) e atribuies dos carbonos para Fr1 a partir
dos espectros de RMN-13C, obtido em espectrmetro BRUKER AMX 500 (500 MHz), utilizando
Carbono
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C10
C12
C13
C15
C16
C18
C20
C21 e C25
C22 e C24
C23
C27
C28
C30
C31
C32
C34

131,45
136,30
123,94
127,73
120,17
125,61
105,26
51,99
130,89
128,34
129,80
76,00
67,01
68,04
153,03
115,56
118,81
146,06
50,64
41,48
46,37
51,02
168,98
19,15
Na Fr1 foi possvel verificar que todos os carbonos da molcula de

cetoconazol continuam presentes e, alm disso, verificou-se a presena de CH que
foi atribudo ao carbono 4 (=127,73) e a ausncia de um C quaternrio,
demonstrando a perda do cloro e entrada de hidrognio (anel orto-substitudo).
A espectrometria de massas em conjunto com a cromatografia lquida um

mtodo muito til para determinar ou confirmar a identidade de frmacos e seus
metablitos, impurezas e produtos de degradao. Segundo WATSON (1999), na
espectrometria de massas os fragmentos moleculares so gerados em uma regio de
alto vcuo ou imediatamente antes da amostra entrar na regio de alto vcuo,
podendo utilizar uma variedade de mtodos para a produo do on.
Com auxlio da LC-MS obteve-se o cromatograma (Figura 59) da amostra
que foi degradada em presena da luz UV-C e a partir do pico relativo Fr1 (tempo
de reteno de 16,42 minutos) foi feito o espectro de massas (Figura 63).
Foi possvel verificar que os resultados obtidos na espectroscopia de RMN
esto de acordo com os resultados obtidos atravs da anlise do espectro de massas.
Analisando o espectro da Fr1 verifica-se o pico base em 497 m/z, indicativo da
massa molecular do produto. Como o peso molecular do cetoconazol 531 a perda
de um tomo de cloro do anel aromtico e entrada de um hidrognio leva a
formao de um produto com menor peso molecular.
No espectro tambm foi possvel verificar a perda da acetila originando m/z
de 455 e o fragmento em m/z de 220 corresponde a perda de C14H13O2N2Cl do on
molecular.
Figura 63 Espectro de massas do pico relativo a Fr1, obtido atravs de sistema de espectrometria
de massas ionizao eletrospray acoplado ao sistema de CLAE, utilizando coluna Waters
Spherisorb S5 C8 (10 x 250 mm) e metanol-gua-acetato de amnio (7:3:0,0025 V/V/p) como
fase mvel.
Aps a anlise do conjunto de espectros obtidos para a Fr1, verificou-se que

o cetoconazol, sob ao da luz, perde o cloro da posio 4. A estrutura proposta est
apresentada na Figura 64.
12
N
10
13
N
16
28 27
H3 C
34
C
32
N
30
N
31
24 25
23
8
CH2
7
1
Cl
2
O
20
CH2 15
18
22 21
A
5
4
H
Figura 64 Estrutura proposta para produto de degradao isolado denominado Fr1: 1-acetil-4{4-[2-(2-clorofenil)-2-(1H-imidazolil-1-metil)-1,3-dioxolanil-4-metoxi]fenil}piperazina).
5.6.5. Anlise do produto isolado denominado Fr2

O espectro de RMN-1H do produto de degradao isolado, denominado Fr2,
est apresentado na Figura 65. Na Tabela 34 esto apresentados os deslocamentos
qumicos (), multiplicidade, constante de acoplamento (J) e o nmero de
hidrognios dos sinais observados no espectro ampliado.
Aps a anlise do espectro de RMN-1H obtido para Fr2 tambm foi possvel
verificar alterao quando comparado ao espectro do cetoconazol SQR. Da mesma
forma que a Fr1, verifica-se importante modificao na regio do anel aromtico A
(Figura 68). O surgimento do sistema AABB facilmente observado, indicando
substituio para do anel aromtico. Segundo PAVIA e colaboradores (2001), anis
aromticos para-substitudos so facilmente reconhecidos, pois apresentam quatro
linhas padro.
No espectro da Fr2 tambm pode-se verificar que os hidrognios relativos
posio 8 sofreram maior alterao no deslocamento qumico. Isto pode ser
explicado, pois, com a perda do cloro (eletronegativo), os hidrognios ficaram mais

blindados.

(J), nmero de hidrognios e a atribuio dos hidrognios para espectro de RMN-1H do Fr2, obtido
em espectrmetro BRUKER AMX 500 (500 MHz), utilizando clorofrmio deuterado como
solvente e TMS como referncia interna.
Deslocamentos
qumicos ()
ppm
2,12
3,05
3,26
3,6
3,65-3,80
3,83
4,15
Multiplicidade* e
constante de
Nmero de
Atribuio
acoplamento (J)
hidrognios
(Figura 68)
s
3
34
m
4
H axiais (27, 28, 30, 31)
m
1
16
m
2
18
m
4
m
1
16
Sistema AB,
2
8
J (4,8 Hz)
m
1
15
4,35
Sistema AABB,
4
21, 22, 24,25
6,72-6,90
J (8,9 Hz)
s
1
12 ou 13
6,92
s
1
13 ou 12
6,98
Sistema AABB
4
2, 3, 5, 6
7,34-7,46
J (8,4 Hz)
s
1
10
7,5
Aps anlise do espectro totalmente desacoplado de
13
C para a Fr2 (Figura
66) foi possvel observar a existncia dos sinais que esto apresentados na Tabela
35. Da mesma forma que para a Fr1, com auxlio dos subespectros DEPT, os sinais
puderam ser discriminados em CH3, CH2 e CH. Verifica-se a formao de um anel
para-substitudo pois os CHs do anel A (C2 e C6) e (C3 e C5) apresentaram
deslocamentos qumicos equivalentes.
Tabela 35 Valores de deslocamentos qumicos (ppm) e atribuies dos carbonos para Fr2 a partir
dos espectros de RMN-13C, obtido em espectrmetro BRUKER AMX 500 (500 MHz), utilizando
Carbono
C1
C2 e C6
C3 e C5
C4
C7
C8
C10
C12
C13
C15
C16
C18
C20
C21 e C25
C22 e C24
C23
C27
C28
C30
C31
C32
C34

135,18
128,46
127,26
137,92
108,12
53,75
131,66
128,45
130,56
74,89
67,46
67,95
152,98
115,30
118,79
145,75
50,70
41,50
46,39
51,06
168,97
21,30
O espectro de massas da Fr2 obtido com auxlio da LC-MS est apresentado

na Figura 67. possvel verificar o pico mais intenso em 499 m/z, indicativo da
massa molecular do produto formado. Da mesma forma que para a Fr1, verificou-se
a perda de um tomo de cloro do anel aromtico A e entrada de um hidrognio.
Entretanto, para a Fr1 verificou-se a presena do pico base de 497 m/z e para a Fr2
de 499 m/z. Esta diferena pode ser explicada pois, provavelmente, na Fr2 a
molcula estava protonada nos nitrognios A e C (Figura 11). No espectro,
tambm, foi possvel verificar a perda da acetila originando m/z 457 e o fragmento
em m/z de 220 corresponde a perda de C14H13O2N2Cl do on molecular.
Figura 67 Espectro de massas do pico relativo a Fr2, obtido atravs de sistema de espectrometria
de massas ionizao eletrospray acoplado ao sistema de CLAE, utilizando coluna Waters
Spherisorb S5 C8 (10 x 250 mm) e metanol-gua-acetato de amnio (7:3:0,0025 V/V/p) como
fase mvel.
Aps a anlise do conjunto de espectros da Fr2, verificou-se que o

cetoconazol, sob ao da luz, perde o cloro da posio 2. A estrutura proposta para
Fr2 est apresentada na Figura 68.
12
N
10
13
N
16
28 27
H3 C
34
C
32
N
30
N
31
24 25
23
8
CH2
7
1
H
2
O
20
22 21
CH2 15
18
A
5
4
Cl
Figura 68 Estrutura proposta para produto de degradao isolado denominado Fr2: (1-acetil-4{4-[2-(4-clorofenil)-2-(1H-imidazolil-1-metil)-1,3-dioxilanil-4-metoxi]fenil}piperazina).
Verificou-se que os dois produtos isolados sofreram a perda de cloro, sendo

que para a Fr1 foi o cloro da posio 4 e para a Fr2 foi o cloro da posio 2. Os dois
produtos isolados no so responsveis pela alterao de cor que a formulao
sofre. Provavelmente, a alterao na colorao do produto final ocorra devido
presena de outros produtos de degradao em pequenas quantidades, uma vez que
foram isolados os produtos majoritrios.
5.7. AVALIAO DA SEGURANA BIOLGICA

Deve-se considerar como candidatos potenciais a estes testes, matriasprimas e produtos acabados que se enquadram no grupo dos produtos de higiene
pessoal, cosmticos e perfumes, frmacos e materiais de acondicionamento (PINTO
et al., 2000).
Para os ensaios utilizaram-se duas amostras de xampu, a amostra de Xb-ceto
com teor de 103,3 % e amostra com teor de 41,4 %, que havia sido exposta
lmpada UV-C. O objetivo dos ensaios foi a comparao dos resultados entre as
duas formulaes para verificar se os produtos de degradao formados poderiam
aumentar o grau de irritao do produto.
A amostra Xb (xampu base) no foi avaliada, pois reconhecido que, na
maioria das vezes, o agente tensoativo responsvel pela irritao no olho do
coelho. Sendo assim, optou-se por no avaliar esse produto para que fosse utilizado
um nmero menor de animais.
O teste de Draize, por utilizar animais, na avaliao da irritao dos produtos,
bastante questionado. Esse problema resultou em vrios estudos direcionados a
mtodos que utilizam tecidos e clulas vivas.
Objetivando validao de mtodos alternativos ao teste de Draize, comisso
formada pelo governo britnico e membros da comunidade europia desenvolveram
estudo interlaboratorial para sugerir mtodos subtitutos dos ensaios in vivo. Aps
obteno dos resultados concluiu-se que alguns mtodos poderiam predizer o
potencial de irritao ocular, mas com preciso muito baixa e utilidade prtica
questionvel (BALLS et al., 1995).
A COLIPA (European Cosmetic, Toiletry and Perfumary Association)
tambm desenvolveu estudos de validao de mtodos alternativos com o objetivo
de avaliar a sua habilidade de predizer o potencial de irritao ocular. Os resultados
obtidos indicaram que os mtodos no poderiam ser considerados como vlidos

para substituir o teste de Draize (BRANTON et al., 1997).
Atualmente, muitos estudos tm sido feitos para obteno de mtodos in
vitro, que possam ser padronizados e validados, podendo ser utilizados como
substituio ao teste de Draize, sem a utilizao dos animais.
Sendo assim, foi necessria a realizao de dois testes para a avaliao da
segurana biolgica dos produtos: teste de irritao ocular e avaliao do potencial
de citotoxicidade in vitro.
5.7.1. Avaliao da toxicidade aguda com efeito local

Efetuou-se o teste de irritao ocular em coelho, pois o mesmo indicado
para produtos com potencial considervel de contato acidental com os olhos; dentre
eles pode-se citar: sabonetes levemente cidos ou bsicos, xampus, solues de
limpeza, cremes e loes, delineadores e outros.
Os coelhos foram examinados 24, 48, 72 h e sete dias aps a instilao do
xampu no olho direito. O olho no tratado serviu como controle. Os resultados
obtidos para as amostras encontram-se nas Tabelas 36 e 37.
Tabela 36 Valores obtidos aps o teste de irritao ocular, segundo escala de Draize (item
4.9.1.1.), para amostra de Xb-ceto no degradada.
Coelho
24 horas
48 horas
72 horas
7 dias
21
17
10
21
12
33
24
17
33
33
17
23
17
Mdia
26,20
20,60
12,00
2,40
Tabela 37 Valores obtidos aps o teste de irritao ocular, segundo escala de Draize (item
4.9.1.1.), para amostra de Xb-ceto degradada.
Coelho
24 horas
48 horas
72 horas
7 dias
21
15
17
19
17
12
10
12
10
Mdia
16,20
12,00
6,40
0,80
Com os valores obtidos determinou-se o grau de irritao das amostras. Para

o Xb-ceto no degradado (teor de 103,3 %) o produto mostrou-se irritante moderado
(Classe III), da mesma forma, o Xb-ceto contendo os produtos de degradao (teor

de 41,4 %) mostrou-se um produto irritante moderado (Classe III).
5.7.2. Avaliao in vitro

O desenvolvimento dos meios lquidos e a descoberta dos antibiticos, por
volta dos anos 40, propiciaram os experimentos com culturas de tecido, fornecendo
a base de diversas pesquisas. A primeira linhagem celular isolada a partir de tecido
subcutneo de camundongo, recebeu o nome de linhagem L. Desta linhagem, em
1948, por tcnica de clonagem ocorreu o isolamento de uma nova linhagem
denominada NCTC clone 929, at hoje utilizada nos estudos de citotoxicidade
(CRUZ, 2003).
A linhagem celular utilizada na realizao deste teste foi NCTC Clone 929
(ATCC CCL-1), clulas de tecido conjuntivo de camundongo, proveniente da
American Type Culture Collection. Atualmente, esse banco de clulas fornece
linhagens certificadas e elabora manuais de controle de qualidade, onde todos os
cuidados para caracterizao e manuteno de uma linhagem so descritos. Estes
procedimentos podem ser adotados por todos os laboratrios que utilizam as clulas
na pesquisa e no diagnstico.
As culturas celulares assumem importncia nos testes de toxicidade pois so
sensveis, reprodutveis, fceis de estabelecer e gerenciar, com menores custos.
Atualmente, sistemas de clulas encontram utilizao para avaliar o potencial
citotxico de componentes cosmticos, materiais mdico-hospitalares, produtos
farmacuticos e qumicos. A citotoxicidade baseada nos efeitos da substncia-teste
sobre a integridade celular, crescimento celular e alteraes de parmetros
especficos bioqumicos ou fisiolgicos (PINTO et al., 2000).
O mtodo de difuso em gar emprega uma camada de clulas, qual se
sobrepe meio de cultura para clulas (Eagle) adicionado de 1,5 ou 1,0 % de gar.
incorporado ao meio, vermelho neutro, que capaz de corar as clulas saudveis

(corante vital). A superfcie de gar proporciona um sistema flexvel para testar uma
variedade de amostras: slidos, ps e amostras lquidas impregnadas em discos de
papel.
A verificao da viabilidade celular pelo uso de corantes vitais um dos
parmetros empregados. Utilizou-se o vermelho neutro (cloridrato de 3-amino-7dimetilamino-2-metilfenazina) que em pH fisiolgico passa facilmente atravs da
membrana plasmtica e se concentra no interior dos lisossomos. A perda deste
gradiente de pH por mortalidade/morbidade da clula ou a perda da permeao da
membrana inibe a incorporao do corante (HARBELL et al., 1997).
O grau de citotoxicidade baseado na extenso de clulas descoradas ao
redor das amostras (tamanho do halo formado), assim como em ndice de lise,
parmetros macro e microscpicos, respectivamente.
Os resultados obtidos, aps leitura dos halos formados, esto apresentados na
Tabela 38.
Tabela 38 Valores dos ndices de zona obtidos aps a leitura das placas de culturas celulares,
utilizando mtodo de difuso em gar e linhagem celular NCTC Clone 929 (ATCC CCL-1), para as
amostras de Xb-ceto e Xb-ceto degradado.
Placas
IZ
Xb-ceto
(103,3 %)
IZ
Xb-ceto degradado
(41,4 %)
Controle
positivo
Controle
negativo
IZ: ndice de zona obtido aps leitura das placas
As duas formulaes apresentaram severo efeito txico, ao redor da amostra,

para a linhagem celular NCTC Clone 929 (ATCC CCL-1).
Com os resultados obtidos na avaliao das amostras de xampu, pelo teste de
irritao ocular e avaliao do potencial de citotoxicidade in vitro, pode-se verificar
que no houve diferena entre as amostras, isto , a formulao contendo os
produtos de degradao no apresentou grau de irritao superior ao do xampu
contendo cetoconazol no degradado.
Como j comentado anteriormente, possvel que o grau de irritao,
verificado para as duas amostras avaliadas, seja devido ao tensoativo, dificultando a
avaliao da irritao causada pelo cetoconazol e seus produtos de degradao.
Entretanto, o objetivo do trabalho era verificar se poderia ocorrer uma alterao no
grau de irritao da amostra, em funo da presena dos produtos de degradao.
Observou-se diferena nos resultados obtidos entre os dois mtodos
empregados; isso pode ser explicado pois os dados obtidos in vitro nem sempre
extrapolam corretamente os resultados obtidos atravs de estudos in vivo. No teste
de irritao ocular h mais de um mecanismo envolvido, pois o olho um sistema
complexo. Sendo assim, um nico ensaio in vitro no suficiente para uma
completa avaliao. Por este motivo, at agora, nenhum nico teste in vitro foi
amplamente aceito como alternativo ao teste de Draize.
CONCLUSES
Concluses 179
9 As matrias-primas de cetoconazol avaliadas atravs de caractersticas

organolpticas, cromatografia em camada delgada, determinao do ponto de
fuso, rotao especfica e espectrofotometria na regio do ultravioleta e
infravermelho apresentaram conformidade com a sua SQR.
9 As matrias-primas, quantificadas atravs de volumetria em meio no-aquoso,
apresentaram conformidade com especificao farmacopica.
9 As formas farmacuticas, contendo cetoconazol, foram avaliadas atravs de
cromatografia em camada delgada, determinao da densidade e do pH,
encontrando resultados adequados.
9 O mtodo desenvolvido por cromatografia lquida de alta eficincia foi validado
dentro das condies estabelecidas, demonstrando ser linear, preciso, especfico,
exato e robusto para a quantificao de cetoconazol na forma farmacutica
xampu.
9 O ensaio microbiolgico mtodo de difuso em gar cilindros em placas foi
validado dentro das condies estabelecidas, demonstrando ser linear, preciso e
exato para a quantificao de cetoconazol na forma farmacutica xampu.
9 A anlise comparativa entre os mtodos propostos, cromatografia lquida de alta
eficincia e ensaio microbiolgico, demonstrou que no houve diferena

significativa nos teores de cetoconazol em xampu, nas condies experimentais
utilizadas.
9 Para o estudo da fotoestabilidade utilizando lmpadas UV-A e UV-C:
todas as amostras avaliadas sofreram degradao, sendo que a degradao na
lmpada UV-C foi maior. Atravs de cromatografia lquida de alta eficincia
foi possvel detectar os produtos de degradao majoritrios em todas as
amostras, sendo a degradao do frmaco maior na forma de soluo ou como
matria-prima;
Concluses 180
Foi
observada
diminuio
na
atividade
do
cetoconazol
frente
ao
microrganismo teste (Candida albicans), quando amostras de xampu, expostas

lmpada UV-C, foram avaliadas atravs do ensaio microbiolgico.
9 Para as amostras expostas luz natural:
a soluo metanlica de cetoconazol, em frasco transparente, desenvolveu
colorao avermelhada, diminuio no teor e foi possvel visualizar a presena
de produtos de degradao;
a soluo metanlica de cetoconazol, em frasco opaco, desenvolveu leve
colorao avermelhada e aumento no teor do frmaco, provavelmente devido
evaporao do solvente. No foi possvel visualizar os produtos de
degradao. Entretanto, aps ampliao da escala, se verificou alterao do
cromatograma indicando que mesmo em pequenas quantidades, o produto de
degradao produz colorao;
o xampu de cetoconazol (Xb-ceto), em frasco transparente, desenvolveu
colorao avermelhada, diminuio no teor e foi possvel visualizar a presena
de produtos de degradao. A amostra manteve teores no inferiores a 90 %
por um perodo de 10 meses;
o xampu de cetoconazol (Xb-ceto), em frasco opaco, desenvolveu colorao
avermelhada, diminuio no teor e foi possvel visualizar a presena de
produtos de degradao. Entretanto, a amostra manteve teores no inferiores a
90 % durante todo o perodo de anlise (26 meses);
os teores das formulaes comerciais no diminuram significativamente
durante o perodo de anlise (17 meses). No foi possvel detectar a presena
de produtos de degradao;
amostras de xampu (Xb-ceto), expostas luz natural por 17 meses, foram
avaliadas atravs do ensaio microbiolgico. Foi observada diminuio na
atividade do cetoconazol frente ao microrganismo teste (Candida albicans);
Concluses 181
constatou-se que o frmaco sofre degradao fotoqumica, pois todas as

amostras expostas luz tiveram degradao maior em comparao com as
amostras protegidas da luz.
9 No estudo da estabilidade qumica, o xampu de cetoconazol sofreu degradao
cida (94,3 %) e por ao do perxido de hidrognio (68,8 %). O cetoconazol
(matria-prima) apresentou forte degradao por ao do perxido de hidrognio
(30,4 %).
9 O pH cido e a exposio luz favorecem a instabilidade do cetoconazol.
9 Aps estudo de fotoestabilidade foram isolados dois produtos de degradao
majoritrios, denominados Fr1 e Fr2. Estes foram identificados, atravs de
espectroscopia de RMN e espectrometria de massas, sendo verificado a perda de
cloro das posies 4 (Fr1) e 2 (Fr2).
9 Verificou-se que a cor desenvolvida nas formulaes no proveniente dos
produtos majoritrios que foram isolados e elucidados, demonstrando que o
produto que leva a alterao de cor da formulao se forma em menor
quantidade.
9 O teste de irritao ocular em coelho demonstrou que a presena dos produtos de
degradao nas formulaes, mesmo em quantidades elevadas, no aumentou a
irritao ocular em coelho.
9 A avaliao da citotoxicidade permitiu verificar que a presena dos produtos de
degradao, mesmo em quantidades elevadas, no aumentou o grau de irritao
das amostras.
CONSIDERAES FINAIS
Consideraes finais 185
A produo de medicamentos de qualidade e a conservao desta durante a

comercializao do produto, interessa tanto aos fabricantes quanto aos
consumidores. Portanto o estudo da estabilidade de matrias-primas e formas
farmacuticas de fundamental importncia.
reconhecido que o cetoconazol em algumas formas farmacuticas, em
especial o xampu, altera a colorao muito rapidamente. Face a isso este trabalho
teve como objetivo principal o estudo da estabilidade fotoqumica do cetoconazol
na forma farmacutica xampu.
Para o desenvolvimento do trabalho foram desenvolvidos e validados
mtodos de anlise quantitativa do xampu de cetoconazol. O frmaco, no apresenta
mtodos de anlise para a forma farmacutica xampu em compndios oficiais.
Assim sendo, os mtodos validados permitiram a publicao de artigos:
STAUB, I., SCHAPOVAL, E.E.S., BERGOLD, A.M. Microbiological assay
of ketoconazole in shampoo. International Journal of Pharmaceutics,
v. 292, p. 195-199, 2005.
STAUB, I., BERGOLD, A.M. Determination of ketoconazole in shampoo by
high performance liquid chromatography. Acta Farmaceutica Bonaerense,
v. 23, n. 3, p. 387-390, 2004.
No estudo de fotoestabilidade foi possvel verificar que o frmaco sofre
alterao em presena da luz, sendo que dois produtos de degradao majoritrios
foram isolados e identificados atravs de RMN 1H e 13C. A estrutura proposta para
produto de degradao isolado denominado Fr1 1-acetil-4-{4-[2-(2-clorofenil)-2(1H-imidazolil-1-metil)-1,3-dioxolanil-4-metoxi]fenil}piperazina) e para a Fr2
1-acetil-4-{4-[2-(4-clorofenil)-2-(1H-imidazolil-1-metil)-1,3-dioxolanil-4-metoxi]
fenil}piperazina).
Com os resultados obtidos, tambm foi possvel verificar, que com o
aumento do tempo de exposio do frmaco luz, a colorao vermelha
Consideraes finais 186
intensificava. Os dois produtos isolados no so responsveis pela alterao na cor

da formulao; provavelmente o produto de degradao que leva ao
desenvolvimento de cor seja formado em pequena quantidade sendo difcil o seu
isolamento. Um artigo contendo os resultados do estudo de estabilidade est sendo
redigido para posterior publicao.
Verificou-se que o frmaco, aps exposio intensa luz, diminui a atividade
antifngica, entretanto seu grau de irritao, verificado atravs de testes in vitro e in
vivo, no alterado na formulao contendo produtos de degradao em
comparao formulao ntegra.
Sendo assim, para a matria-prima e formas farmacuticas contendo o
cetoconazol adequada proteo da luz deve ser adotada durante sua produo e
armazenamento.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Referncias bibliogrficas 189
ABDEL-MOETY, E.M., KHATTAB, F.I., KELANI, K.M., ABOU ALALAMEIN, A.M. Chromatographic determination of clotrimazole, ketoconazole
and fluconazole in pharmaceutical formulations. Il Farmaco, v. 57, p. 931-938,
2002.
ABOUNASSIF, M. A., EL SHAZLY, B. M. D1-differential potentiometric and
proton NMR spectrometric determinations of ketoconazole and its formulations.
Analytical Letters, v. 22, p. 2233-2247, 1989.
ALLEN, L.V., ERICKSON, M.A. Stability of ketoconazole, metolazone,
metronidazole,
procainamide
hydrochloride,
and
spirinolactone
in
extemporaneously compounded oral liquids. American Society of Health-System
Pharmacists, v. 53, p. 2073-2078, 1996.
AL-MESHAL, M.A. Determination of ketoconazole in plasma and dosage forms by
high performace liquid chromatography and microbiological method. Analytical
Letters, v. 22, p. 2249-2263, 1989.
ANSEL, H.C., POPOVICH, N.G., ALLEN, L.V. Formas farmacuticas e sistemas
de liberao de frmacos. 6 ed. So Paulo: Premier, 2000. 397 p.
ANVISA: Brasil. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria.
Resoluo-RE n 899, 20. mai.2003., DOU., 02. jun.2003. Disponvel em:
<http//www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/89903re.htm>.
AOAC. Association of Official Analytical Chemists. Official Methods of Analysis.
15.ed. Arlington, 1990. v.1.
BALLS, M., BOTHAM, P.A., BRUNER, L.H., SPIELMANN, H. The EC/HO
international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.
Toxicology in Vitro: an International Journal Published in Association with BIBRA,
v. 9, p. 871-929, 1995. Resumo.
BARCHIESI, F., ARZENI, D., COMPAGNUCCI, P., Di FRANCESCO, L.F.,
GIACOMETTI, A., SCALISE, G. In vitro activity of five antifungal agents against
clinical isolates of Saccharomyces cerevisiae. Medical Mycology: Official
Publication of the International Society for Human and Animal Mycology, v. 36, p.
437-440, 1998.
BISSCHOP, M.P., MERKUS, J.M., SCHEYGROND, H., VAN CUTSEN, J., VAN
KUY, A. Treatment of vaginal candidiasis with ketoconazole, a new, orally active,
antimycotic. European Journal of Obstettrics and Gynecology and Reproductive
Biology, v. 9, p. 253-259. 1979. Resumo.
BORELLI, D., BRAN, J.L., FUENTES, J., LEGENDRE, R., LEIDERMAN, E.,
LEVINE, H.B., RESTREPO, A., STEVENS, D.A. Ketoconazole, an oral
antifungal: laboratory and clinical assessment of imidazole drugs. Journal of
Postgraduate Medicine, v. 55, p. 657-661, 1979. Resumo.
BOUILLON, C. Shampoos. Clinics in Dermatology, v. 14, p. 113-121, 1996.
BRANTON, P.G., BRUNER, L.H., CHAMBERLAIN, M., SILVA, O., DUPUIS,
J., EARL, L.K., LOVELL, D.P., PAPE, W.J.W., UTTLEY, M., BAGLEY, D.M.,
BAKER, F.W., BRACHER, M., COURTELLEMONT, P., DECLERCQ, L.,
FREEMAN, S., ATEILING, W., WALKER, A.P., CARR, G.J., DAMI, N.,
THOMAS, G., HARBELL, J., JONES, P.A., PFANNENBECKER, U., SOUTHEE,
J.A., TCHENG, M., ARGEMBEAUX, H., CASTELLI, D., CLOTHIER, R.,
ESDAILE, D.J., ITIGAKI, H., JUNG, K., KASAI, Y., KOJIMA, H., KRISTEN, U.,
LARNICOL, M., LEWIS, R.W., MARENUS, K., MORENO, O., PETERSON, A.,
RASMUSSEN, E.S., ROBLES, C., STERN, M. A summary report of the COLIPA
international validation study on alternatives to the Draize rabbit eye irritation test.
Toxicology in Vitro: an International Journal Published Association with BIBRA,
v. 11, p. 141-179, 1997. Resumo.
CARR, M.M., PRYCE, D.M., IVE, F.A. Treatment of seborrhoeic dermatitis with
ketoconazole: Response of seborrhoeic dermatitis of the scalp to topical
ketoconazole. British Journal of Dermatology, v. 116, p. 213-216, 1987. Resumo.
CHEN, Y., FELDER, L., JIANG, X., NAIDONG, W. Determination of
ketoconazole in human plasma by high-performance liquid chromatography-tandem
mass spectrometry. Journal of Chromatography B, v. 774, p. 67-78, 2002.
CRUZ, A.S. Testes de citotoxicidade in vitro como alternativa ao teste in vivo de
Draize na avaliao de produtos cosmticos. Tese de Doutorado- Universidade de
So Paulo, 103 p. 2003.
COLLINS, C.H., BRAGA, G.L., BONATO, P.S. (Ed.) Introduo a mtodos
cromatogrficos. 7 ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1997. 279 p.
COX, F.W., STILLER, R.L., SOUTH, D.A., STEVENS, D.A. Oral ketoconazole
for dermatophyte infections. Journal of the American Academy of Dermatology.
v. 6, p. 455-462, 1982. Resumo.
CURRIE, B., ROCHE, V., ZITO, S.W. Medicinal chemistry case study workbook.
New York: Williams e Wilkins, 1996.
DISCHER, C.A. Qumica Inorgnica Farmacutica. Madrid: Alhambra, 1966. 583
p.
DLEN, L.F.P. Estudos de estabilidade de produtos cosmticos. Cosmetics e

Toiletries. v. 13, p. 54-64, 2001.
DOBREV, H., ZISSOVA, L. Effect of ketoconazole 2 % shampoo on scalp sebum
level in patients with seborrhoeic dermatitis. Acta Dermato-Venereologica, v. 77,
p. 132-134, 1997. Resumo.
DRAIZE, J.H., WOODARD, G., CALVERY, H.O. Methods for the study of
irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous
membranes. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, v. 82,
p. 377-390, 1944.
DUROVICOVA, J., SIEGFRIED, L., SABOL, M., DUROVIC, E. Susceptibility of
Candida albicans isolated in oral pre-cancerous lesions to selected antifungal
agents. Biologia, v. 56, p. 61-64, 2001.
EL-SHABOURI, S.R., EMARA, K.M., KHASHABA, P.Y., MOHAMED, A.M.
Charge-transfer complexation for spectrophotometric assay of certain imidazole
antifungal drugs. Analytical Letters, v. 31, p. 1367-1385, 1998. Resumo.
ERCHIGA, V.C., MARTOS, A.O., CASAO, A.V., ERCHIGA, A.C., FAJARDO,
F.S. Malassezia globosa as the causative agent of pityriasis versicolor. British
Journal of Dermatology, v. 143, p. 799-803, 2000.
ESPINEL-INGROF, A. History of medical mycology in the United States. Clinical
Microbiology Reviews, v. 9, p. 235-272, 1996.
FAERGEMANN, J. Treatment of seborrhoeic dermatitis of the scalp with
ketoconazole shampoo. A double-blind study. Acta Dermato-Venereologica, v. 70,
p. 171-172, 1990. Resumo.
FAERGEMANN, J. Management of seborrheic dermatitis and pityriasis versicolor.
American Journal of Clinical Dermatology, v. 1, p. 75-80, 2000.
F. Bras. IV. FARMACOPIA BRASILEIRA. 4 ed. So Paulo: Atheneu, 1988.
Parte I.
FERREIRA, A. O. Guia prtico da farmcia magistral. 2 ed. Juiz de Fora:
Pharmabooks, 2002. 847 p.
FOYE, W.O., LEMKE, T.L., WILLIAMS, D.A. Principles of medicinal chemistry.
5 ed. New York: Williams and Wilkins, 2002. 1114 p.
FREEDBERG, I.M., EISEN, A.Z., WOLFF, K., AUSTEN, K.F., GOLDSMITH,

L.A., KATZ, S.I. (Ed.) Fitzpatricks dermatology in general medicine. 6 ed. New
York: MacGraw-Hill, 2003. v. 2. 2594 p.
GERNTHOLTZ, T., PASCOE, M.D., BOTHA, J.F., HALKETT, J., KAHN, D. The
use of a cyclosporin-ketoconazole combination: making renal transplantation
affordable in developing countries. European Journal of Clinical Pharmacology,
v. 60, p. 143-148, 2004. Resumo.
GO, I.H., WIENTJENS, D.P., KOSTER, M. A double-blind trial of 1 %
ketoconazole shampoo versus placebo in the treatment of dandruff. Mycoses, v. 35,
p. 103-105, 1992. Resumo.
GOKMEN, O., SENOZ, S., GULEKLI, B., ISIK, A.Z. Comparison of four different
treatment regimes in hirsutism related to polycystic ovary syndrome. Gynecological
Endocrinology, v. 10, p. 249-255, 1996. Resumo.
GREER, D.L. Successful treatment of tinea capitis with 2 % ketoconazole shampoo.
International Journal of Dermatology, v. 39, p. 302-304, 2000.
GRAYBILL, J.R., WILLIAMS D.M., VAN CUTSEN, E., DRUTZ, D.J.
Combination therapy of experimental histoplasmosis and cryptococcosis with
amphotericin B and ketoconazole. Reviews of Infectious Diseases, v. 2, p. 551-558,
1980. Resumo.
GUPTA, A.K., BLUHM, R., SUMMERBELL, R. Pityriasis versicolor. European
Academy of Dermatology and Venereology, v. 16, p. 19-33, 2002.
GUPTA, A.K., BLUHM, R. Seborrheic dermatitis. European Academy of
Dermatology and Venereology, v. 18, p. 13-26, 2004.
GUPTA, A.K., MADZIA, S.E., BATRA, R. Etiology and management of
seborrheic dermatitis. Dermatology , v. 208, p. 89-93, 2004.
HARBELL, J.W., KOONTZ, S.W., LEWIS, R.W., LOVELL, D., ACOSTA, D.
Cell cytotoxicity assays. Food and Chemical Toxicology: an International Journal
Published for the British Industrial Biological Research Association, v. 35, p. 79126, 1997.
HARDMAN, J.G.; LIMBIRD, L.E. (Ed.) As bases farmacolgicas da teraputica.
9 ed. Rio de Janeiro: MacGraw-Hill Interamericana, 1996.1269 p.
HEERES, J., BACKX, L.J., MOSTMANS, J.H., VAN CUTSEN, J. Antimycotic
imidazoles. Part 4. Synthesis and antifungal activity of ketoconazole, a new potent
orally active broad-spectrum antifungal agent. Journal of Medicinal Chemistry,

v. 22, p. 1003-1005, 1979. Resumo.
HENNING, H., KASPER, B., LUDERS, C.J. Ketoconazole-induced hepatitis. Case
report. Zeitschrift fur Gastroenterologie, v. 21, p. 709-715, 1983. Resumo.
HEPP, K. Estabilidade do cetoconazol em shampoos. Porto Alegre: Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Faculdade de Farmcia, 1999. Trabalho de
Concluso da Disciplina de Estgio Curricular em Farmcia.
HEWITT, W. Microbiological assay: an introduction to quantitative principles and
evaluation. New York: Academic Press, 1977.
HEYDEN, Y.V., NGUYET, A.N.M., DETAEVERNIER, M.R., MASSART, D.L.,
VERCAMMEN, J.P. Simultaneous determination of ketoconazole and
formaldehyde in a shampoo: liquid chromatography method development and
validation. Journal of Chromatography A, v. 958, p. 191-201, 2002.
ICH Harmonised Tripartite Guideline. Stability Testing: Photostability Testing of
New Drug Substances and Products. In: International Conference on Harmonisation
of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,
1996a.
ICH Harmonised Tripartite Guideline. Validation of Analytical Procedures:
Methodology, Q2B. In: International Conference on Harmonisation of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, 1996b.
INCQS Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade. Manual INCQS
n. 66.3330.0004, 2002.
JACKSON, E.M. Worldwide availability of coaltar shampoos threatened. American
Journal of Contact Dermatitis, v. 7, p. 131-134, 1996.
JORDAN, W.C. The effectiveness of combined saquinavir and ketoconazole
treatment in reducing HIV viral load. Journal of the National Medical Association,
v. 90, p. 622-624, 1998. Resumo.
KEDOR-HACKMANN, E.R.M., NERY, M.F.M., SANTORO, M.I.R.M.
Determination of ketoconazole in pharmaceutical preparations by ultraviolet
spectrophotometry and high performance liquid chromatography. Analytical Letters,
v. 27, p. 363-376, 1994.
KELANI, K., BEBAWY, L.I., ABDEL-FATTAH, L., AHMAD, A.K.S.
Spectrophotometric determination of some n-donating drugs using DDQ. Analytical
Letters, v. 30, p. 1843-1860, 1997.
KEOGH, A., SPATT, P., MCCOSKER, C., MACDONALD, P., MUNDY, J.,
KAAN, A. Ketoconazole to reduce the need for cyclosporine after cardiac
transplantation. New England Journal of Medicine, v. 333, p. 628-633, 1995.
Resumo.
KOROLKOVAS, A. Anlise farmacutica. Rio de Janeiro: Guanabara Dois, 1984.
p. 119-143.
KOROLKOVAS, A., FRANA, F.F.A.C., CUNHA, B.C.A. Dicionrio teraputico
guanabara. 10 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2003/2004.
KUMMER, K.P., OKONOMAH, A.D., BRADSHA,W.G. Stability of ketoconazole
in ethanolic solutions. Drug Development and Industrial Pharmacy, v. 17, p. 577580, 1991.
LACHMAN, L., LIEBERMAN, H.A., KANIG, J.L. Teoria e Prtica na Indstria
Farmacutica. Lisboa: Fundao Calouste, 2001. v. 2.
LANGE, D.S., RICHARDS, H.M., GUARNIERI, J., HUMENIUK, J.M., SAVIN,
R.C., REYES, B.A., HIKMAN, J., PARISER, D.M., PARISER, R.J., SHEREETZ,
E.F., GROSSMAN, R.M., GISOLDI, E.M., KLAUSNER, M.A. Ketoconazole 2 %
shampoo in the treatment of tinea versicolor: a multicenter, randomized, doubleblind, placebo-controlled trial. Journal of the American Academy of Dermatology,
v. 39, p. 944-950, 1998. Resumo.
LAVERDIERE, M., HOBAN, D., RESTIERI, C., HABEL,F. In vitro activity of
three new triazoles and one echinocandian against Candida bloodstream isolates
from cancer patients. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 50, p. 119-123,
2002.
LEGENDRE, R., STELTZ, M. A multi-center, double-blind comparison of
ketoconazole and griseofulvin in the treatment of infections due to dermatophytes.
Reviews of Infectious Diseases, v. 2, p. 586-591, 1980. Medline. Resumo.
MAERTENS, J.A. History of the development of azole derivatives. Clinical
Microbiology and Infection, v. 10, p. 1-10, 2004.
MARCINIEC, B.; BUGAI, A.; KEDZIORA, W.
Kinetic studies of the
photodegradation of nitroimidazole derivatives in the solid state. Pharmazie, v.52,
p.220-223, 1997.
NENOFF, P., HAUSTEIN, U.F. The effect of antiseborrhoeic agents on
Pytirosporum ovale in vitro. Hautarzt, v. 45, p. 464-467, 1994.
NGUYET, A.N.M., TALLIEU, L., VERCAMMEN, J.P., MASSART, D.L.,

HEYDEN, Y.V.Validation of an HPLC method on short columns to assay
ketoconazole and formaldehyde in shampoo. Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, v. 32, p. 1-19, 2003.
NUDELMAN, N.S. Estabilidad de medicamentos. Buenos Aires: El Ateneu, 1975.
187 p.
PAVIA, D.L., LAMPMAN, G.M., KRIZ, G.S. Introduction to spectroscopy: a
guide for students of organic chemistry. 3ed. Melbourne: Brooks/Cole, 2001. 579 p.
PETER, R.U., RICHARZ, U.B. Successful treatment and prophylaxis of scalp
seborrhoeic dermatitis and dandruff with 2 % ketoconazole shampoo: results of a
multicentre, doble-blind, placebo-controlled trial. British Journal of Dermatology,
v. 132, p. 441-445, 1995. Resumo.
Ph. Eur. EUROPEAN PHARMACOPOEIA. 4ed. Strasbourg: Convention on
elaboration of an European Pharmacopoeia, 2002.
PIERARD-FRANCHIMONT, C., PIERARD, G.E., ARRESE, J.E., DE DONKER,
P. Effect of ketoconazole 1 % and 2 % shampoos on severe dandruff and
seborrhoeic dermatitis: Clinical, squamometric and mycological assessments.
Dermatology, v. 202, p. 171-176, 2001. Resumo.
PIERARD-FRANCHIMONT, C., PIERARD, G.E. A double blind placebocontrolled study of ketoconazole + desonide gel combination in the treatment of
facial seborrheic dermatitis. Dermatology, v. 204, p. 334-337, 2002. Resumo
PINTO, T.J.A., KANEKO, T.M., OHARA, M.T. Controle biolgico de qualidade
de produtos farmacuticos, correlatos e cosmticos. So Paulo: Atheneu, 2000.
309 p.
PRISTA, L.N., BAHIA, M.F.G., VILAR, E. Dermatofarmcia e cosmtica. Edio
da associao nacional de farmcias. Lisboa, 1995.
REYNOLDS, J.E.F. (Ed). Martindale-The extra pharmacopoeia. 31 ed. London:
Royal Pharmaceutical Society, 1996. 2739 p.
SADEGHI, S., SHAMSIPUR, M. A new extractive-spectrophotometric method for
the determination of ketoconazole from pharmaceutical preparations. Analytical
Letters, v. 31, p. 2691-2705, 1998.
SAMPAIO, S.A.P., RIVITTI, E.A. Dermatologia. So Paulo: Artes Mdicas, 1998.
1155 p.
SHAPIRO, J., MADDIN, S. Medicated shampoos. Clinics in Dermatology, v. 14,

p. 123-128, 1996.
SHIMADZU: Manual Shimadzu CLASS-VPTM. Chromatography Data System.
Instruction Manual. Version 6.1. Kyoto: Shimadzu Scientific Instrument, 2001.
SILVERSTEIN, R.M., WEBSTER, F.X. Identificao espectromtrica de
compostos orgnicos. 6 ed. Rio de Janeiro: LTC, 2000. 460 p.
SKIBA, M., SKIBA-LAHIANI, M., MARCHAIS, H., DUCLOS, R., ARNAUD, P.
Stability assessment of ketoconazole in aqueous formulations. International Journal
of Pharmaceutics, v. 198, p. 1-6. 2000.
SOBH, M., EL-AGROUDY, A., MOUSTAFA, F., HARRAS, F., EL-BEDEWY,
M., GHONEIM, M. Coadministration of ketoconazole to cyclosporin-treated kidney
transplant recipients: a prospective randomized study. American Journal of
Nephrology, v. 15, p. 493-499, 1995.
SQUIQUERA, L., PLOTKIN, L., GALIMBERTI, R., LEONI, J. Analysis of the
antifungal activity of ketoconazole, zinc pyrithione, and ciclopirox olamine against
Pityrosporum ovale. A diffusion assay for cultures in solid media. Journal of the
European Academy of Dermatology and Venereology, v. 7, p. 26-29, 1996.
SQUIRE, R.A., GOODE, K. A randomized, single-blind, single-centre clinical trial
to evaluate comparative clinical efficacy of shampoos containing ciclopirox olamine
(1.5 %) and salicylic acid (3 %), or ketoconazole ( 2 % Nizoral) for the treatment of
dandruff/seborrhoeic dermatitis. The Journal of Dermatological Treatment, v. 13,
p. 51-60, 2002.
STAUB, I., ADAMS, A.I.H., BERGOLD, A.M., FREHLICH, P.E. Avaliao da
integridade da frmula do xampu de cetoconazol. Infarma, v. 14, p. 74-76, 2002.
STAUB, I., BERGOLD, A.M. Determination of ketoconazole in shampoo by high
performance liquid chromatography. Acta Frarmaceutica Bonaerense, v. 23, p.
387-390, 2004.
STAUB, I., SCHAPOVAL, E.E.S., BERGOLD, A.M. Microbiological assay of
ketoconazole in shampoo. International Journal of Pharmaceutics, v. 292, p. 195199, 2005.
STRIPPOLI, V., PIACENTINI, A., DAURIA, F.D., SIMONETTI, N. Antifungal
activity of ketoconazole and other azoles against Malassezia furfur in vitro and in
vivo. Infection, v. 25, p. 303-306, 1997.
THOMA, K., KBLER, N. Einfluss der Wellennlnge auf die Photozersetzung von
Arzneistoffen. Pharmazie, v. 51, p. 660-664, 1996a.
THOMA, K., KBLER, N. Photoinstabilitt von Arzneistoffen und ihre
analytischen Nachweismglichkeiten. Pharmazie, v. 51, p. 919-923, 1996b.
THOMA, K., KBLER, N. Untersuchung der Photostabilitt von Antimykotika 1.
Mitteilung: Photostabilitt von Polyenantibiotika. Pharmazie, v. 51, p. 885-893,
1996c.
THOMA, K., KBLER, N. Einfluss von Hilsstoffen auf die Photozersetzung von
Arzneistoffen. Pharmazie, v. 52, p. 122-129, 1997.
TONNESEN, H.H. Formulation and stability testing of photolabile drugs.
International Journal of Pharmaceutics, v. 225, p. 1-14, 2001.
TONON, D.C., SOARES, M.S., ANDREAZZA, I.F., BRESOLIN, T.M.B.,
ANDREAZZA, R.C.S. Avaliao do cetococonazol em formulaes magistrais.
VIII Encontro Estadual de Farmacuticos e Bioqumicos, 1999. Livro de Resumos.
Florianpolis.
TRACHTENBERG, J., HALPERN, N., PONT, A. Ketoconazole: a novel and rapid
treatment for advanced prostatic cancer. Journal of Urology, v. 130, p. 152-153,
1983. Resumo.
USP 28. THE UNITED STATES Pharmacopoeia. 28.ed. Rockville: United States
Pharmacopeial Convention, 2005.
VAN CUTSEN, J. The antifungal activity of ketoconazole. American Journal of
Medicine, v. 74, p. 9-15, 1983. Resumo.
VANDEN-BOSSCHE, H., ENGELEN, M., ROCHETTE, F. Antifungal agents of
use in animal health chemical, biochemical and pharmacological aspects. Journal
of Veterinary Pharmacology and Therapeutics, v. 26, p. 5-29, 2003.
VANGERVEN, F., ODDS, F.C. The anti-Malassezia furfur activity in vitro and in
experimental dermatitis of 6 imidazole antifungal agents bifonazole, clotrimazole,
flutrimazole, ketoconazole, miconazole and sertaconazole. Mycoses, v. 38, p. 389393, 1995.
VELIKINAC, I., CUDINA, O., JANKOVIC, I., AGBABA, D., VLADIMIROV, S.
Comparison of capillary zone electrophoresis and high performance liquid
chromatography methods for quantitative determination of ketoconazole in drug
formulations. Il Farmaco, v. 59, p. 419-424, 2004.
VERONESI, R., FOCACCIA, R. (Ed.) Tratado de infectologia. 8 ed. So Paulo:

Atheneu, 1998. v. 2. 1015 p.
WATSON, D.G. Pharmaceutical analysis. A textbook for pharmacy students and
pharmaceutical chemists. London: Churchill Livingstone, 1999. 337 p.
WILKINSON, J.B., MOORE, R.J. Harrys cosmeticology. 7 ed. New York:
Chemical Publishing, 1982. 934 p.
WOLF, R., WOLF, D., TZN, B., TZN, Y. Soaps, shampoos and detergents.
Clinics in Dermatology, v. 19, p. 393-397, 2001.
Anexo 1
ANEXO 1
Anexo 1
Tabela 39 - Anlise de varincia (ANOVA) das reas determinadas para a obteno da curva
padro do cetoconazol por CLAE.
Fontes de Variao
GL
Soma dos
Quadrados
Entre
1,13777E+15
2,84442E+14
22047,13*
3,48
Regresso linear
1,13767E+15
1,13767E+15
88181,11*
4,96
Desvio de linearidade
9,55225E+10
3,18408E+10
2,47
3,71
Resduo
10
1,29015E+11
1,29015E+10
14
Total
* significativo para p < 0,05
1,13789E+15
Varincia
F calc
F tab
Tabela 40 ANOVA dos dados obtidos no ensaio microbiolgico mtodo de difuso em garcilindros em placas utilizando meio de cultura gar Sabouraud-dextrose 2%, Candida albicans
como microrganismo teste, tempo de incubao de 18 horas e temperatura de 35 2 C.
Fontes de variao
GL
Soma dos
Quadrados
Preparao
0,048
0,048
0,23
4,20
Regresso
308,669
308,669
1458,29 *
4,20
Desvio de paralelismo
0,093
0,093
0,44
4,20
Quadrtico
0,826
0,826
3,90
4,20
Diferena de quadrtico
0,034
0,034
0,16
4,20
Entre doses
309,669
61,934
292,60 *
2,60
Entre placas
1,566
0,313
1,48
2,60
Dentro (erro)
25
5,292
0,212
35
316,526
Total
* significativo para p<0,05
Quadrado
Mdio
F calc
F tab
Anexo 1
Tabela 41 DPR dos teores encontrados no estudo de fotoestabilidade da soluo metanlica (Solceto) e do xampu (Xb-ceto) aps exposio luz natural.
Tempo
(meses)
0
1
2
4
6
8
10
12
14
17
19
22
26
DPR (%)
(Soluo metanlica)
frasco
frasco
transparente
opaco
0,6
0,6
0,7
0,2
0,9
0,8
0,5
0,8
1,6
0,6
1,2
0,4
1,1
0,1
0,5
0,5
0,5
2,3
0,4
1,0
0,5
1,8
1,3
2,9
1,9
DPR (%)
(Xampu)
frasco
transparente
0,1
1,9
1,0
0,3
1,8
0,7
1,3
0,4
0,2
1,3
1,4
0,8
1,6
frasco
opaco
0,1
1,8
1,5
0,7
1,3
1,9
2,6
2,8
2,6
2,5
0,7
2,9
2,4
Tabela 42 DPR dos teores encontrados no estudo de fotoestabilidade das formulaes comerciais
(Form1 e Form2).
Tempo
(meses)
0
3
6
11
17
DPR (%)
Form1
1,4
0,1
0,3
1,3
1,6
Form2
0,5
3,7
4,0
0,2
1,8

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Avaliao da fotoestabilidade do cetoconazol e determinao da atividade

Porto Alegre, 2005.