DETERMINACIN

BACTERIANA
Ladino Jos, Reyes Harold, Rodrguez Paula & Tovar Angie

METODOLOGA

Preparacin de
medios caseros

2 sin control
Y 2 sin control

Gelatina
Caldo sin carne
Ketaquenazol

Pruebas
bioqumicas
1. Bacterias
desconocidas
2. Uso de panel para
enterobacterias
3. Prueba de
sensibilidad
4. Prueba de catalasa

Recuento de
bacterias
variables y
coliformes
Caldo bilis Y
Agar
MacConky
Revisin
bibliogrfica

Siembra de
microorganismos
Tincin de
Gram para una
muestra de los
4 medios

Sembrar las
muestras en
medio agar

Realizar observaciones
de bacterias para
identificarlas

Anlisis de
resultados

RESULTADOS E INTERPRETACIN
o Bacteria X
o Gram Negativa

o Cadena de bacilos
o Aerobia facultativa
o MOTILIDAD: Negativa, organismo sin flagelo.

o CATALASA: Positivo, con burbujeo medio

REACCIONES
PRUEBA AGAR TSI
Resultado de pruebas

Bisel

Amarillo Metaboliza glucosa

Fondo

Metaboliza lactosa o sacarosa

Produccin de gas

Negativo

Precipitado oscuro

Negativo

Explicacin
Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados
para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono
fermentables. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del
indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se
reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el
tpico sulfuro de hierro de color negro.
Mecanismo de accin agar TSI:
El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de
hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y
producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de
sodio mantiene el balance osmtico.

PRUEBAS DE CRECIMIENTO EN
ANTIBIOGRAMA

Ampicilina

Altamente sensible

Cefalexina

Altamente sensible

Gentamicina

Medianamente sensible

Explicacin
Ampicilina: actan inhibiendo la ltima tapa de la sntesis de la pared celular bacteriana unindose a unas protenas
especficas llamadas pbps (penicillin-binding proteins) localizadas en la pared celular. al impedir que la pared celular se
construya correctamente, la ampicilina ocasiona, en ltimo trmino, la lisis de la bacteria y su muerte, esto es,
interfieren con la sntesis de la pared celular durante la replicacin celular. Esto se debe a su efecto inhibidor de la
sntesis de la pared celular de la bacteria en sus ltimas dos etapas (3 y 4), unindose a las PBP (protenas fijadoras de
penicilinas), lo que lleva a la destruccin de la pared y la consiguiente lisis celular. La ampicilina inhibe la formacin de
puentes en la capa de peptidoglicano (la que proporciona rigidez a la pared celular). La mayor efectividad ocurre en
la fase logartmica de crecimiento, cuando se estn formando los puentes de pptidoglicano, y tiene menor efecto en
clulas en la fase estacionaria de crecimiento.

Cefalexina; es un agente bactericida que acta inhibiendo la sntesis de la pared bacteriana originando defectos en
la pared bacteriana, estos defectos alteran su permeabilidad y originan la muerte de la bacteria.
Gentamicina: son antibiticos bactericidas y ejercen su accin penetrando en la clula e interfiriendo con el proceso
de sntesis proteica. penetran en la clula por transporte dependiente de oxigeno (membrana citoplasmtica), se une
a una porcin (30S) del ribosoma estreptomicina impide el comienzo de la lectura Otros aminoglucsidos inducen
errores de lectura, a dems, actan directamente sobre membrana para ser rpidamente bactericidas. la
gentamicina se une a la subunidad S30 del ribosoma bacteriano, impidiendo la transcripcin del DNA bacteriano y, por
tanto, la sntesis de protenas en los microorganismos susceptibles.

Una vez dentro de la clula, los aminoglucsidos se unen de manera irreversible a la subunidad 30S del ribosoma
bacteriano. Esta unin interfiere con la elongacin de la cadena peptdica. Tambin causan lecturas incorrectas del
cdigo gentico formndose protenas anmalas. Algunas de estas son protenas de membrana y el resultado es la
formacin de canales que permiten el ingreso de ms drogas a la clula.

Explicacin

Para ejercer su accin deben ingresar en la clula bacteriana. Esto ocurre en 2 etapas
por un mecanismo de transporte activo. En la primera fase, el ingreso a la clula
depende del potencial transmembrana generado por el metabolismo aerobio. La
segunda fase es de ingreso acelerado, y se ve favorecida por la unin previa del
aminoglucsido al ribosoma bacteriano. Ciertas condiciones que reducen el potencial
elctrico de la membrana como la anaerobiosis o el bajo pH del medio, disminuyen el
ingreso de estos compuestos al citoplasma bacteriano.

ENTEROBACTERIA
o Enterobaciloscoco
o Enterobacteria gram negativa
o Aerobia facultativa

o Catalasa: positiva, burbujeo medio

o Motilidad: negativa, organismo sin flagelo.

Explicacin

La entenobacteria que nos correspondi es un entenobaciloscoco , gram negativa,

aerobia facultativa lo que quiere decir que pueden desarrollarse tanto en presencia
como en ausencia de oxgeno.
Esta entenobacteria respondi a la prueba de motilidad de manera negativa lo cual nos
indica que no presenta flagelo.
Para la prueba de la enzima Catalasa, fue positiva lo cual nos quiere decir que cataliza
la descomposicin del perxido de hidrgeno (H202) en oxgeno y agua.

CARBOHIDRATOS
PRUEBA DE CARBOHIDRATOS

REACCIN

Fermentacin de glucosa

Positiva

Fermentacin de lactosa

Positiva

Fermentacin de sacarosa

Positiva

Fermentacin de manitol

Negativa

Fermentacin de rafinosa

Positiva

Fermentacin de ramnosa

Positiva

Fermentacin de maltosa

Positiva

Fermentacin de melobiosa

Positiva

Hidrolisis de esculina

Positiva

Explicacin

Para la prueba bioqumica correspondiente a carbohidratos , esta bacteria respondi positivamente a la fermentacin de glucosa,
lactosa , sacarosa , rafinosa, ramnosa , maltosa melabiosa y a la hidrolisis de esculina.

Glucosa: Las bacterias de la placa utilizan como principal sustrato metablico a los azucares provenientes de la dieta del huesped y,
dado que los hidratos de carbono de alto peso molecular, no refinados, son poco solubles en agua o saliva y no pueden difundir bien a
travs de la matriz intermicrobiana, las fuentes energticas principales para la nutricin y el metabolismo bacteriano son los disacridos
como la sacarosa (glucosa + fructosa) y la lactosa (glucosa + maltosa) y los monosacridos glucosa y fructosa.

Lactosa: al ser esta bacteria fermentadora de lactosa utiliza el cido ctrico como su nica fuente de carbono , produciendo acetoina .

Sacarosa: Se sabe que ciertas especies de bacterias producen una enzima, la invertasa y que concentraciones bien pequeas de sta
enzima transforma rpidamente a la sacarosa en glucosa y fructosa. Por medio de enzimas como glucosil y fructosiltransferasas (GTFs y
FTFs), se producen polmeros de glucano y fructano, a partir de la sacarosa.

Ramnosa: es una metilpentosa derivada estructuralmente de la manosa (6-Desoximanosa); la fermentacin de la ramnosa produce la
acidificacin del medio .

Maltosa: Por hidrlisis forma un nico producto: la glucosa. Al ser un azcar de fcil digestin, la maltosa se utiliza en alimentos infantiles
y en bebidas como la leche malteada. Se fermenta por medio de levaduras y es fundamental en la elaboracin de la cerveza.

Hidrolisis de Esculina: La hidrlisis de la esculina la convierte en esculetina la cual con iones hierro forma un complejo de color verde oliva
hasta negro. Esta hidrlisis es considerada una caracterstica constante de los estreptococos del grupo D y se utiliza para diferenciarlos
de otros grupos. fue asociada como un instrumento taxonmico en la descripcin de la familia Enterobacteriaceae, La prueba de bilisesculina agar es usada en bacteriologa como una ayuda ms para la identificacin de especies de Streptococcus, algunos bacilos
gram-negativos y de Listeria monocytogenes

AMINOCIDOS
PRUEBA DE AMINOCIDOS

REACCIN

Indol

Negativa

Triptofno D-aminasa

Negativa

Descarboxilacin de lisina

Oscuro

Descarboxilacin de arginina

Oscuro

Descarboxilacin de ornitina

Oscuro

Explicacin
La prueba del indol es una prueba bioqumica realizada en especies bacterianas para determinar la habilidad
del organismo de romper el indol del aminocido triptfano. Esta divisin molecular es lograda por una serie de
enzimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con frecuencia triptofanasa;
Las bacterias que resultan indol positivas al romper el indol del triptfano,es la que se genera por desaminacin
reductiva a partir de triptfano a travs de la molcula de cido indolpirvico intermedia. Triptofanasa cataliza
la reaccin de desaminacin, durante el cual se elimina el grupo amina de la molcula de triptfano. Los
productos finales de la reaccin son indol, cido pirvico, el amonaco y la energa. El fosfato de piridoxal se
requiere como una coenzima. El indol, es uno de los productos de la degradacin metablicas del amino
acido triptofano. Las bacterias que producen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el
triptofano con produccin de Indol, acido piruvico y amoniaco. La prueba del indo esta basada en la
formacin de un complejo rojo cuando el Indol reacciona con el grupo aldehdo p-dimetilaminobenzaldehido.
TDA: El color de mbar a marrn se debe al resultado positivo a triptfano desaminasa (TDA), comn a todos
los organismos del grupo PMP. Alrededor del 50% de las cepas de P. vulgaris producen colonias de color azul en
un medio de mbar a marrn en forma de amonio
DESCARBOXILACIN DE LA LISINA Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo
de producir una enzima que descarboxila el aminocido lisina de Las enterobacterias, por fermentacin de la
glucosa producen cido, el cual hace virar el indicador a color amarillo. Si la bacteria posee una lisina
descarboxilasa, por la descarboxilacin de la lisina se producir una amina, la cual neutralizar el cido
producido por la fermentacin de la glucosa retornando el medio a su color original violeta.

Explicacin

El caldo descarboxilasa , es el medio base mas comnmente utilizado para determinar la capacidad de
descarboxilacion de amino-cidos por las Enterobacterias; El amino-acido por ensayar se aade al medio base
antes de inocular el microorganismo en estudio. Se debe emplear paralelamente un control que consiste en un
tubo con medio base sin el amino-acido. Ambos se incuban anoxignicamente adicionando una capa de aceite
mineral estril; Durante las etapas iniciales de incubacin ambos tubos se vuelven amarillos debido a la
fermentacin de la pequea cantidad de glucosa del medio (pH 5.6). Si el amino-acido es descarboxilado se
forman aminas alcalinas y el medio retorna a su color prpura inicial.

Los amino-cido Lisina, Arginina y Ornitina son 3 amino-cidos ensayados y producen las siguientes aminas
especficas.

Lisina

Ornitina

Putrescina (Descarboxilasa)

Arginina

Citrulina ( Dihidrolasa)

El desarrollo de un color amarillo en el tubo control indica que el microorganismo es viable y que el pH del medio
ha disminuido lo suficiente para activar las enzimas descarboxilasas. El retorno al color prpura o violeta del tubo
que contiene el amino-acido indica una reaccin positiva debido a la liberacin de aminas por descarboxilacion.

Cadaverina (Descarboxilasa)

OTRAS PRUEBAS
PRUEBAS

REACCIN

Citrato Simmons

Negativa

Produccin de H2S

Negativa

Hidrolisis de urea

Negativa

Uso de malonato

Negativa

Fermentacin de adonitol

Negativa

Fermentacin mioinositol

Negativa

Fermentacin Sorbitol

Negativa

Produccin B D Galactosidasa

Negativa

Voges Proskauer (VP)

Negativa

Explicacin sobre las otras pruebas

En estas pruebas, todas dieron negativas, as que a continuacin se describe los componentes del medio el por qu dio
negativo:

Citrato de Simmons: En el medio de cultivo, el fosfato mono amnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio
es la nica fuente de carbono, estos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. El medio de cultivo es
diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de
amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad. Al dar como resultado el color
verde (Negativo) y no azul (Positivo) indica que en el medio pueden encontrarse dos tipos de bacterias: E. coli o S. flexneri.

Produccin de H2S: Esta prueba determina la capacidad de un microorganismo para atacar el aminocido LISINA
descarboxilndolo o desaminndolo, la fermentacin de glucosa, la produccin o no de gases (CO2), junto con la
produccin o no de cido sulfhdrico (H2S). Muchas bacterias poseen descarboxilasas que atacan el aminocido lisina,
con liberacin de aminas de reaccin alcalina y con produccin de CO2. Para que acten las descarboxilasas se requiere
PH cido que se obtiene por la fermentacin de la glucosa que tiene el medio. La desaminacin de la lisina es un proceso
oxidativo que se manifiesta por la aparicin de color rojo en el tendido, siendo el fondo del tubo amarillo por fermentacin
de la glucosa que posee el medio. Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO, necesario para las bacterias
puedan producir H2S y como indicador H2S, CITRATO FERRICO DE AMONIO el cual reacciona con el H2S produciendo un
precipitado negro e insoluble de sulfato ferroso. Estas indicaciones dan a entender, que el resultado de la muestra (color
amarillo) es negativo, lo cual vuelve a indicar que pueden ser: Escherichia, Shigella, Klebsiela, Enterobacteria, Hafnia,
Serratia, P.vulgaris, P.mitbilis, Morganella, Yersinia, Erwinia o Pectobacterium.

Explicacin sobre las otras pruebas

Hidrolisis de la urea: El sustrato de urea es una diamina del cido carbnico, denominada carbamida. Todas las amidas
(RCO- NH2) son rpidamente hidrolizadas. La hidrlisis de la urea es catalizada por una enzima especfica que es la ureasa,
esta es una enzima microbiana importante, relacionada con la descomposicin de los compuestos orgnicos. Las enzimas
bacterianas se clasifican en adaptativas o constitutivas. Una enzima adaptativa o inducida es aquella que es producida por
una bacteria solamente cuando se encuentra presente su sustrato especfico. La ureasa es una enzima constitutiva ya que la
sintetizan ciertas bacterias sin tener en cuenta si hay o no el sustrato urea. El indicador de PH es rojo de fenol, el cual en
alcalinidad vira a un color violeta indicando una prueba POSITIVA. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA.

Uso de malonato: Esta prueba sirve para poner en manifiesto a los microrganismos que en el caldo FENIL ALAININA
MALONATO tienen la capacidad de desaminar la FENILALANINA y de utilizar el MALOTO como nica fuente de carbono. La
bacteria puede utilizar el MALONATO de SODIO como nica fuente de carbono con la consiguiente alcalinidad del medio. S
la prueba cambia al color azul indica que la PRUEBA es POSITIVA, si continua de color verde la PRUEBA es NEGATIVA.

Fermentacin de adonitol, mioinositol y sorbitol: Esta prueba estudia la fermentacin de azucares, si es negativo es de color
rojo o anaranjado y si es postivo es amarillo. El resultado fue Negativo por lo que probablemente sea Escherichia, Shigella,
Edwardsiella, enterobacteria, Hafnia, Serratia y Morganella s el resultado hubiera sido Positivo indicara que el
microorganismo pertenece al gnero Klebsiella, Citrobacter, P.vulgaris y P. mitbilis.

Explicacin sobre las otras pruebas

Produccin B D Galactosidasa: Las enzimas exonucleares de tipo proteltico, gelatinasas, son secretadas por
ciertas bacterias para desdoblar a las protenas del medio y, esta capacidad ayuda a la identificacin bacteriana.
El resultado fue negativo, por el color amarillo del medio.

Prueba de Voges Proskauer (VP): Esta prueba determina la capacidad de algunos organismos de produccin de la
acetona a partir de la fermentacin de glucosa. Cuando es Positivo muestra coloracin roja -rosado en la
superficie del medio (presencia de acetona) y si es Negativo (Como nuestro resultado) presenta color amarillo.
Negativa puede ser Escherichia coli o K. ozaenae.

PRUEBAS DE CRECIMIENTO EN
ANTIBIOGRAMA

Ampicilina

Resistente

Cefalexina

Medianamente sensible

Gentamicina

Medianamente sensible

Explicacin
Cefalexina, ampicilina , son antibiticos betalactmicos derivados de la penicilina, Los antibiticos lactmicos son bacteriolticos, y actan inhibiendo la sntesis de la barrera de peptidoglicanos de la pared
celular bacteriana. La barrera de peptidoglicanos es importante para la integridad estructural de la pared
celular, especialmente para los microorganismos Gram positivos. El paso final de la sntesis de los
peptidoglicanos, la transpeptidacin, se facilita por unas transpeptidasas conocidas como "penicillin
binding proteins" (PBPs, protenas de anclaje de penicilinas). Los -lactmicos son anlogos de la D-alanil-Dalanina, el aminocido terminal de las subunidades peptdicas precursoras de la barrera peptidoglicana
que se est formando. La similitud estructural que existe entre los antibiticos -lactmicos y la D-alanil-Dalanina facilita su anclaje al centro activo de las PBPs. El ncleo -lactmico de la molcula se une
irreversiblemente al PBP. Esta unin irreversible evita el paso final (la transpeptidacin) de la formacin de la
barrera de peptidoglicanos, interrumpiendo la sntesis de la pared. Es posible, adems, que la inhibicin de
los PBPs (mediante dicha unin irreversible), haga tambin que se activen enzimas autolticos de la pared
celular bacteriana.
La gentamicina es un antibitico aminoglucsido, este se une a la subunidad S30 del ribosoma bacteriano,
impidiendo la transcripcin del DNA bacteriano y, por tanto, la sntesis de protenas en los microorganismos
susceptibles.

CONCLUSIONES

Haciendo seguimiento de claves de

determinacin en enterobacterias por
pruebas bioqumicas, no es congruente
con algn gnero en especfico, es
dismil en varias pruebas. Sin embargo
cabe
anotar
una
posible
contaminacin en el test.
El genero al que ms se asemeja es a
Shigella.
LOPARDO, H, et al 2016, Pg. 84

REFERENCIAS

LOPARDO HORACIO A, PREDARI SILVIA C, VAY CARLOS, MANUAL DE MICROBIOLOGA

CLNICA DE LA ASOCIACIN ARGENTINA DE MICROBIOLOGA, Vol. 1. Actualizado Mayo,
2016
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/tsi.pdf