Cromatografa en capa fina Cromatografa en Columna

1. Objetivos:

Conocer la aplicacin de la cromatografa en capa fina.

Determinar los factores que afectan al Rf.

Determinar los factores que intervienen en la cromatografa en columna.

2. Introduccin:
La cromatografa se define como la separacin de una mezcla de dos o ms compuestos
por distribucin entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra una fase mvil.
Varios tipos de cromatografa son posibles, dependiendo de la naturaleza de las dos fases
involucradas: slido-lquido (capa fina, papel o columna), lquido- lquido y gases- lquido
(fase vapor). El mtodo depende de la adsorcin, este es un fenmeno de superficie en
donde interaccionan electrostticamente los solutos, de acuerdo a su polaridad la
interaccin es fuerte o dbil.
Separacin slido-lquido
La fase slida, fase estacionaria, corresponde al adsorbente que debe ser un material que
no se disuelva en la fase lquida; los materiales ms comnmente utilizados, en orden al
aumento de la fuerza de interaccin de enlace hacia compuestos polares, son: celulosa,
silicato de magnesio, sulfato de calcio, cido silcico, gel de slice, almina, xido de
magnesio, carbn activado. Estos adsorbentes son usados en finos granos, usualmente
de un tamao de malla de 100 a 200 para capa fina y de 200 a 400 para columna.
La accin del adsorbente se basa en la atraccin intermolecular tal como atraccin dipolodipolo o de enlaces de hidrgeno.
El eluyente corresponde a la fase mvil de la cromatografa, siendo, por lo general,
disolventes o mezclas de stos. Dentro de los eluyentes ms utilizados de acuerdo al
incremento de polaridad y poder de disolventes hacia grupos funcionales polares: ter de
petrleo, ciclo hexano, tetracloruro de carbono, benceno, cloroformo, cloruro de metileno,
ter dietlico, acetato de etilo, acetona, etanol, metanol, agua, cido actico.
Cuando se desea llevar a cabo la separacin de una mezcla de compuestos, lo ms
recomendable es iniciar la elucin con un disolvente no polar; eluyendo posteriormente,
con disolventes de media polaridad, hasta finalizar con los de mayor polaridad, separando
al inicio, los compuestos menos polares de la mezcla a separar y terminar con los
compuestos mas polares (fase normal).
Secuencia de elucin por compuestos
Hidrocarburos
Olefinas
teres
Halogenuros de alquilo
Aromticos
Cetonas
Aldehdos
Esteres
Alcoholes
Aminas
cidos y bases fuertes

Elucin rpida con disolventes

no polares

Elucin lenta, necesita un

disolvente polar

Parmetros que afectan la separacin:

La versatilidad de la cromatografa depende de muchos factores que deben ser
considerados:
Eleccin del adsorbente adecuado.
Polaridad del disolvente o disolventes seleccionados.
Velocidad de elucin.
Cromatografa en capa fina
Es una tcnica para la separacin rpida y el anlisis cualitativo de pequeas cantidades
de muestra. Este tipo de cromatografa se fundamenta en la separacin por particin
slido-lquido, fase mvil (eluyente) y fase slida (adsorbente), llevndose a cabo la
elucin en forma ascendente (por capilaridad).
El adsorbente se encuentra adherido a una superficie lisa formando una capa delgada de
aproximadamente 100m de espesor, en la cual una pequea cantidad de mezcla (220g) es adsorbida para su separacin. La muestra a separar se aplica con una
micropipeta cerca de la base de la placa, luego la placa se introduce en una cmara de
elucin. Cuando la muestra ha terminado de eluir (el disolvente ha recorrido la placa hasta
1 cm antes del borde superior), la placa se retira de la cmara de elucin y se deja secar,
procedindose a revelar la placa.
Cromatografa en Columna
La cromatografa de columna es una tcnica basada en la adsorcin y solubilidad. Es una
tcnica de particin slido-lquido, puesto que existe un equilibrio dinmico entre la
adsorcin y desorcin (elucin).
Los compuestos no polares interaccionan dbilmente con el adsorbente mediante fuerzas
de Van der Waals, mientras que las interacciones ms fuertes se manifiestan en
compuestos polares que van desde fuerzas del tipo dipolo- dipolo hasta interacciones ms
directas como: formacin de sales, enlace de coordinacin o puentes de hidrgeno.
La cromatografa de columna est constituida por un tubo de vidrio en posicin vertical en
el cual, por la parte baja, se colectara las diferentes fracciones. En el fondo del tubo se
introduce un pequeo trozo de algodn que cumple la funcin de un filtro que impide que
el gel de slice salga. Una vez colocado el algodn, se coloca una delgada capa de arena,
la cual no permite que el algodn se mueva de su posicin, posteriormente por la parte
superior se introduce el adsorbente, el cual ha sido previamente suspendido en el
disolvente seleccionado (va hmeda) para la separacin con el objeto de eliminar
burbujas que se encuentran en las partculas de adsorbente.
Cromatografa de permeacin en gel: conocida tambin como cromatografa de
exclusin es una variante de la CLAE que consiste en una columna cromatogrfica
empacada de tal manera que las partculas de dicho empacamiento tienen diferentes
tamaos de poros con el fin de que las molculas de soluto sean retenidas basndose en
su forma y tamao y no en el peso molecular.
Cromatografa de exclusin de iones: se tienen separaciones que dependen de
factores como tamao de partcula de resina, forma inica e incluso distribucin de
ismeros. Esto permite separar especies que de otra forma eluiran al mismo tiempo. Las
separaciones se llevan a cabo en resinas de intercambio con base en poliestireno de alta
capacidad como eluyentes, cidos minerales diluidos.
Cromatografa de intercambio inico: se lleva a cabo con empaques de columna que
tiene grupos funcionales cargados unidos a una matriz polimrica. Los grupos funcionales
enlazados permanentemente y asociados con contraiones de carga opuesta. El

mecanismo de retencin ms comn es el intercambio simple de los iones de la muestra y

de la fase mvil con el grupo cargado de la fase estacionaria.
Cromatografa de fluidos supercrticos: la temperatura crtica de una sustancia es la
temperatura por encima de la cual no puede existir en la fase lquida independientemente
de la presin. La presin crtica es la presin de vapor de una sustancia a su temperatura
crtica. Una sustancia a temperaturas y presiones por encima de su temperatura y de su
presin crtica (punto crtico) se denomina fluido supercrtico.
Cromatografa de afinidad: separa las protenas en funcin de su especificidad de
fijacin de ligandos. Los ligandos de afinidad son molculas polimricas que sirven de
soporte porque estn unidas covalentemente sobre la columna cromatogrfica o matriz
inerte que debe tener una estructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de
cambio de pH, detergentes y agentes disociantes.
Cromatografa de lquidos de alta resolucin: es la tcnica analtica de separacin
ms ampliamente utilizada, las razones son la sensibilidad, su fcil adaptacin a las
determinaciones cuantitativas exactas, es ideal para la separacin de especies no
voltiles o termolbiles y por su gran aplicabilidad a sustancias que son de inters en la
industria.
Electroforesis: el fundamento de la tcnica consiste en depositar sobre un medio poroso
una mezcla de especies cargadas. Por aplicacin de un campo elctrico entre los
extremos del soporte poroso las especies se separan en funcin de sus cargas y su
movilidad inica en ese medio. Cuanto ms sea elevado el voltaje y la intensidad en
menos tiempo se produce la separacin; sin embargo valores altos de estas variables
provocan un aumento de temperatura, con la consiguiente evaporacin del disolvente y
acumulacin de sales del tampn, lo cual es indeseable.
Electroforesis capilar: la seccin transversal del aparato de electroforesis se puede
reducir de forma drstica al realizar la electroforesis en el interior de un tubo capilar de
dimetro interno menor a 0.1 mm y una longitud de 50 cm a 1m. Es efectivo llevar de sta
forma la tcnica porque la resistencia elctrica de la disolucin es tan alta que la corriente
se mantiene baja, en consecuencia se pueden mantener voltajes ms altos sin
calentamiento excesivo. La tcnica tiene gran poder de resolucin y se han desarrollado
mtodos para llevar a cabo la electroforesis incluso en molculas neutras no inicas.
3. Mtodo experimental:
Cromatografa en capa fina

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Cromatografa en Columna

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5. Anlisis y Discusin de Resultados:

Cromatografa en capa fina
Para saber la distancia que ha recorrido el soluto y el eluyente se utiliza la frmula:

Rf=

distancia del soluto

distancia eluyente

Aspirina

Rf=

2.2cm
5.2cm

Rf= 0.42cm
Muestra:

Rf=

4.7cm
5.2cm

Rf= 0.90 cm

Soluto

Distancia recorrida

Aspirina
Muestra

Distancia
Eluyente

2.2 cm
4.7 cm

Rf
0.42cm

5.2 cm

0.90cm

Cromatografa en Columna
Volumen Muerto: 5ml (cayo la primera gota)
6. Cuestionario:
1. Indique las caractersticas y utilidades de los papeles filtro Whatman N 1, 3 y 4.
Papel filtro

Caractersticas

Utilidades

Whatman N 1
Superficie suave,
porosidad media,
retencin de
partculas >11m,
presenta una mayor
velocidad de filtracin.

Whatman N 3

Superficie
levemente
granulada, retencin de
partculas >6m
altamente absorbente,
doble grosor que el 1
con an ms capacidad
de retencin de
partculas finas y de
saturacin.
Muy popular para uso Para gran capacidad
general, supervisin de precipitado y
de contaminacin del mayor resistencia
aire y ensayos
hmeda. Adecuada
qumicos de suelos,
para filtracin por
aplicaciones de
aspiracin, se usa
laboratorio usndose
para transportar
con frecuencia para la muestras.
clarificacin de
lquidos.

Whatman N 4
Superficie suave,
porosidad gruesa,
retencin de
partculas >20-25m,
extremadamente
rpido y con
capacidad retentiva.
Utilizar en la
supervisin de la
contaminacin
del aire y para la
limpieza de rutina de
lquidos biolgicos.
Retiene partculas
gruesas, precipitados
gelatinosos.