1.

Mtodo de Kjeldahl
Se caracteriza por el uso de ebullicin, cido sulfrico concentrado que efecta la
destruccin oxidativa de la materia orgnica de la muestra y la reduccin del nitrgeno
orgnico a amonaco el amonio es retenido como bisulfato de amonio y puede ser
determinado in situ o por destilacin alcalina y titulacin.
Dificultades qumicas y prcticas
o

Digestin prolongada.

Conversin cuantitativa de nitrgeno a amonaco.

Espumosidad excesiva.

Accin corrosiva de cido sulfrico sobre el sistema de extraccin de humos.

Catalizadores metlicos utilizados

o

Oxido de mercurio

Selenio o mezcla de sulfato de cobre y selenio

Mezcla de sulfato de cobre y dixido de titanio

Ventajas del mtodo de Kjeldahl

o Apropiado para varios tipos de productos.
o

Alta fiabilidad.

Usado como mtodo de referencia.

Desventajas del mtodo de Kjeldahl

o Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.
o

Uso de catalizadores txicos o caros.

Eleccin del factor de conversin.

2. Mtodo de Dumas
Se caracteriza por pirolisis completa de la muestra y medicin del contenido de nitrgeno
de los gases de combustin.

El nitrgeno puede ser medido con manmetro despus de absorber el dixido de

carbono en una solucin alcalina o por conductividad trmica en mtodos automatizados.
Ventaja
o

Muestra equivalencias satisfactorias al compararlo con el mtodo de Kjeldahl en

anlisis de forrajes y alimentos infantiles, aunque con valores levemente mayores.

Desventajas
o

Incluye nitrgeno inorgnico.

Requiere pequeas cantidades de muestra 5-50 mg, finamente dividida y

homognea para minimizar el error de muestreo.

Este mtodo no puede aplicarse a material hmedo por lo que debe efectuarse un
secado previo.

3. Mtodos radioqumicos
a) Activacin neutrnica
Se irradia una cantidad pesada de muestra con neutrones lo que produce el paso de l4N
a 13N. Este positrn tiene una vida media de 10 minutos y emite radiaciones gamma las
que se registran en un contador de centelleo. Las cuentas se relacionan con el contenido
de nitrgeno de la muestra.
Ventajas
o

Simple; rpido.

Sin problemas de contaminacin.

Los valores encontrados presentan

buena correlacin con el mtodo de Kjeldahl.

Desventaja
o

El costo de infraestructura es muy elevado.

b) Activacin protnica
Similar al anterior con la variante de que la muestra se irradia con protones y se efecta la
conversin de 14N a 14O, un istopo que decae con la emisin de un protn y de

radiaciones gamma las que son registradas y relacionadas con el contenido de nitrgeno
de la muestra.
4. Mtodos qumicos
a) Mtodo de Biuret
La reaccin se caracteriza por una coloracin prpura cuando los iones cpricos son
complejados por los enlaces peptdicos a pH alcalino. El matiz del color depende del tipo
de protena y su intensidad depende del contenido de protena presente.

Reactivo utilizado
o

Solucin alcalina conteniendo iones cpricos complejados con tartrato de sodio y

potasio.

Lectura
o

550 nm, a 263 nm se aumenta la sensibilidad en 10 veces.

Desventaja
o

Se ha encontrado poca aplicacin en anlisis de alimentos debido a la presencia

de interferentes como azcares reductores que reducen el ion cprico en medio
alcalino produciendo resultados insatisfactorios. Ejemplo: leche.

b) Mtodo "dye-binding"
Se caracteriza por la formacin de un cogulo de protena, coloreado e insoluble producto
de la reaccin de la protena con una solucin coloreada de cido sulfnico a pH 2. El
anin coloreado se une por asociaciones electrostticas a los sitios bsicos de la protena,
por ejemplo a los grupos M-amino de lisina, guanidina de arginina, imidazol de histidina y
aminos terminales. Adems se producen atracciones intermoleculares por interacciones
hidrofbicas entre la protena y la mitad no inica del anin y entre el anin unido a
protena y la mitad no inica del anin en solucin.
El cogulo se separa por filtracin y se mide colorimtricamente el exceso de tintura en el
sobrenadante. Esta medida se relaciona con el contenido de protena.

Lectura
A595nm
Consideraciones
El mtodo es emprico por lo que se debe buscar la concentracin de tintura ideal que
sature la protena y forme el cogulo pero que no pierda sensibilidad.
Ventajas
o

Util en anlisis de rutina de muestras similares.

Econmico y rpido.

Preciso como el mtodo de Kjeldhal.

Usado como mtodo de referencia.

Desventajas
o

Dificultad en encontrar tinturas puras.

Desuniformidad en la calidad de las tinturas de un lote de fabricacin a otro, por lo

que se requiere la calibracin del mtodo con cada lote.

No es aplicable a alimentos que varen su contenido en grupos aminos (protelisis,

pardeamiento).

c) Mtodo de destilacin alcalina

La hidrlisis de las amidas en medio alcalino fuerte da origen a amonaco el cual es
destilado y su valor es relacionado con el contenido de protena.
Se ha encontrado que el rendimiento de amonio es altamente reproducible para una
protena dada.
d) Mtodo de Lowry
Cuando se agrega reactivo de Folin a una protena, sta se reduce a un complejo azul de
molibdeno por la oxidacin de los aminocidos tirosina, triptfano, cistina, cisterna e
histidina
Reactivo

cido fosfomolbdico-fosfotngstico

Lectura
o

A750 nm

Ventajas
o

Alta sensibilidad y simple de operar.

Desventajas
o

La respuesta del color vara de acuerdo al tipo de protena.

La intensidad del color no es estrictamente proporcional a la concentracin de

protena.

Los iones potasio, magnesio, EDTA e hidratos de carbono interfieren en

la reaccin.

e) Mtodo de titulacin con formol

A la muestra neutralizada con lcali se le agrega formaldehido en exceso el cual
reacciona con cada grupo bsico de lisina y arginina. El exceso de formaldehido se
neutraliza con un exceso de lcali estndar el cual se titula, y se relaciona con el
contenido de protena.
Desventaja
o

Su reproducibilidad es menor a la de otros mtodos alternativos.

5. Mtodos fsicos
a) Espectroscopia infrarroja
o

Se aprovecha la absorcin del grupo amida del enlace peptdico a 6,46 Tm.

Ventajas
o

Rpido, anlisis de multicomponentes No destructivo.

Desventajas
o

Interferido por agua.

Proceso de calibracin complejo.

b) Espectroscopia infrarroja reflectante

La muestra se ilumina con seis longitudes de onda cercanas a la radiacin infrarroja (0,752,5 Tm) y se detecta la luz reflejada.
Es necesaria la calibracin contra un conjunto de muestras estadsticamente
significativas, analizadas por mtodos de referencia tradicionales.
Ventajas
o

Rpido, anlisis de multicomponentes.

Aplicable a materiales slidos.

Cuantifica protena en presencia de agua.

Desventajas
o

Interfieren almidones y lpidos.

Desplazamiento de espectro de reflectancia por humedad contenida en

las partculas.

Proceso de calibracin complejo.

c) Espectrofotometra ultravioleta
Mide protenas en solucin con absorcin mxima a 280 nm atribuible a los anillos
aromticos de tirosina y triptfano y entre 180-220nm.
Ventajas
o

Rpido, no destructivo.

til para monitorear efluentes en columnas cromatografas.

Desventaja

Interferencia de otros compuestos (cidos nucleicos, nucletidos).

d) Mtodos refractomtricos
Mide la refraccin directa de la protena en solucin o el cambio de ndice de refraccin
causado por la remocin de la protena de la solucin.

e) Mtodo turbidimtrico

Mide la reduccin de la intensidad de la luz al pasar por una suspensin de partculas de

protenas. Este cambio se relaciona con el contenido de protena.
f) Espectroscopia electrnica
Irradiacin del material con rayos X y cuantificacin de los fotoelectrones liberados
caractersticos al tomo de N del grupo amida de la protena.
Ventaja
o

Buena correlacin con contenido de N total.

o Pueden determinarse simultneamente otros grupos de inters (grupos sulfuras de

aminocidos).