Determinacin de protenas por absorcin UV

Michele Learmonth

Alastair Aitken y

1. Introduccin
1.1. cerca de absorbancia de UV (280 nm)
Cuantificacin de la cantidad de protena en una solucin es posible en un espectrmetro simple.
Absorcin de la radiacin en el UV cercano por las protenas depende del contenido de Tyr y Trp (y en
muy pequea medida de la cantidad de Phe y disulfuro de bonos). Por lo tanto, 4280varies
grandemente entre diversas protenas (para una solucin de 1 mg/mL, desde 0 hasta 4 para algunas
protenas ricas en tirosina lana, aunque la mayora de los valores est en el rango 0.5-1.5 [1]). Las
ventajas de este mtodo son que es sencillo, y la muestra es recuperable. El mtodo tiene algunas
desventajas, incluyendo la interferencia de otros cromforos, y se determinar el valor de absorcin
especfica para una determinada protena. La extincin del cido nucleic en la regin 280 nm puede
ser tanto como 10 veces
de protena en su misma longitud de onda, y por lo tanto, un pequeo porcentaje de cido nucleico
puede influir grandemente en la absorcin.
1.2. ahora absorbancia de UV
El enlace peptdico se absorbe fuertemente en el UV lejano con un mximo en alrededor de 190 nm.
Esta muy fuerte de la absorcin de las protenas en estas longitudes de onda se ha utilizado en la
determinacin de protenas. Debido a las dificultades causadas por la absorcin de oxgeno y la salida
baja de espectrofotmetros convencionales en esta longitud de onda, las mediciones se hacen ms
convenientemente en 205 nm, donde la absorbancia es la mitad que a 190 nm. Mayora de las
protenas tiene coeficientes de extincin a 205 nm para una solucin de 1 mg/mL de 30-35 y entre 20
y 24 a 210 nm (2).
Varias cadenas laterales, incluyendo los de Trp, Phe, Tyr, His, Cys, Met y Arg (en ese orden
descendente), hacen contribuciones para la A205(3). Las ventajas de este mtodo son la simplicidad y
sensibilidad. Como en el mtodo descrito en la seccin 3.1. la muestra es recuperable, y adems hay
poca variacin en la respuesta entre protenas diferentes, permitiendo casi absoluta determinacin de
las protenas. Desventajas de este mtodo incluyen la necesidad de la correcta calibracin del
espectrofotmetro en el UV lejano. Muchos tampones y otros componentes, como los grupos hemo o
piridoxal, absorben fuertemente en esta regin.
2. los materiales
1. 0.1MK2SO 4 (pH 7.0).
2. tampn de fosfato de potasio 5 mM, pH 7.0.
3. no inico detergente (0.01% Brij 35)
4. Guanidinio-HC1.
5. filtro de 0.2-1amMillipore (Watford, Reino Unido).
6. UV-visible espectrmetro: la lmpara de hidrgeno debe seleccionarse para la intensidad mxima en
la longitud de onda particular.
7. las celdillas, cuarzo, para < 215 nm.

3. mtodos
3.1. estimacin de la protena por cerca de absorbancia de UV (280 nm)
1. un espectrofotmetro fiable es necesario. La solucin de protena debe diluirse en el buffer a una
concentracin que es dentro de la gama exacta del instrumento (ver notas 1 y 2).
2. la solucin de protena a medir puede ser en una amplia gama de amortiguadores, por lo que es
generalmente no
problema para encontrar uno que es apropiado para la protena que puede estar ya en un bfer
especial necesario para un paso de purificacin o ensayo de actividad enzimtica, por ejemplo (ver
notas 3 y 4).
3. medir la absorbancia de la solucin de protenas a 280 nm, usando las celdillas de cuarzo o las
celdillas que se saben para ser transparente a esta longitud de onda, llena con un volumen de solucin
suficiente para cubrir la abertura por donde pasa el haz de luz.
4. el valor obtenido depende de la longitud del camino del cuvet. Si no de 1 cm, se debe ajustar por el
factor apropiado. La ley de Beer-Lambert establece que: A (absorbancia) = e c / (1) donde ~ =
coeficiente de extincin, c = concentracin en mol/L y l = longitud del camino ptico en cm. Por lo
tanto, si se conoce e, medicin de la A da la concentracin directamente, e se cita normalmente para

una longitud de 1 cm de paso.

5. la absorbancia de la ofUV de valor real para una protena dada se determinar por un mtodo
absoluto, por ejemplo, calculada a partir de la composicin de aminocidos, que pueden bedetermined
por anlisis de aminocidos (4). Luego se calcula la absorbancia de UV de una protena segn la
siguiente frmula: A280 (1 mg/mL) = (5690nw + 1280ny + 120nc) / m (2) donde nw, ny y Carolina del
norte el nmero de residuos de Cys, Trp y Tyr en el polipptido de la masa M y 5690, 1280 y 120 son
los coeficientes de extincin respectivo para estos residuos (ver Nota 5).
3.2. estimacin de la protena por absorbancia UV lejano
1. la solucin de la protena se diluye con una solucin de cloruro sdico (0,9% p/v) hasta la extincin a
215 nm < 1,5 (ver notas 1 y 6).
2. alternativamente, diluir la muestra en otro buffer no absorbentes de UV como 0.1MK2SO4, que
contiene tampn de fosfato de potasio 5 m m ajustado a pH 7.0 (ver Nota 6).
3. medir la absorbancia a las longitudes de onda adecuadas (A280y A205 o A225and A215,
dependiendo de la frmula a aplicarse), usando un espectrmetro equipado con una lmpara de
hidrgeno que es exacta en estas longitudes de onda, con las celdillas de cuarzo llenadas un volumen
de solucin
suficiente para cubrir la abertura por donde el haz de luz pasa (detalles en la seccin 3.1.).
4. el A2o5 para una solucin de 1 mg/mL de protena (, 42051 mg/mL) canbe calculado dentro de +
2%, segn la frmula emprica propuesta por mbitos (2) (ver notas de 7-10): A2051 mg/mL = 27 +
120 (A280/A205) (3)
5. como alternativa, pueden realizar mediciones en longitudes de onda ms largo (5):
Concentracin de la protena (~tg/mL) = 144 (, 4215-A225) (4)
La extincin a 225 nm se resta del que a 215 nm; la diferencia multiplicada por 144 da la
concentracin de protena en la muestra en ~ g/mL. Con una protena particular bajo condiciones
especficas medidas precisas de concentracin para dentro 5 ~tg/L son posibles.

4. notas
l. es mejor medir la absorbancia en el rango 0.05-1.0 (entre 10 y 90% de la radiacin incidente). En
alrededor de 0,3 absorbancia (50% absorcin), la precisin es mayor.
2. albmina de suero bovino se utiliza con frecuencia como una protena estndar; 1 mg/mL tiene una
A280of 0.66.
3. si la solucin es turbia, la aparente A280will aumentarse por dispersin de la luz. Filtracin (0,2-~
filtro de Millipore de tm) o clarificacin de la solucin por centrifugacin puede llevarse a cabo.
Soluciones turbias, puede aplicarse una correccin aproximada conveniente por
restar el A310 (protenas no normalmente absorben en esta longitud de onda menos que contienen
cromforos particular) de la A280.
4. A bajas concentraciones, la protena puede ser perdida de solucin por adsorcin en el cuvet; la
fuerza inica alta ayuda a prevenir esto. Detergente no inico de la ofa de inclusin (0.01% Brij 35) en
el buffer tambin puede ayudar a prevenir estas prdidas.
5. La presencia de cromforos nonprotein (p. ej., heme, piridoxal) puede aumentar A28o. Si los cidos
nucleicos estn presentes (que absorben fuertemente en 260 nanmetro), puede aplicarse la siguiente
frmula. Esto da una estimacin precisa de los contenidos de protena mediante la eliminacin de la
contribucin a la absorbancia por nucletidos a 280 nm, mediante la medicin de la A260which es en
gran parte debido al ltimo (6).
Protenas (mg/mL) = 1.55 A280-0.76 A260 (5)
Otras frmulas (usando principios similares de diferencias de absorbancia) empleados para determinar
protena en la posible presencia de los cidos nucleicos son los siguientes (7,8):
Protenas (mg/mL) = (A235 - A280) / 2.51 (6)
Protenas (mg/mL) = 0.183 A230 - 0.075.8 A260 (7)
6. soluciones de protena obedecen la ley de Beer-Lambert en 215 nm siempre que la extincin sea <
2.0.
7. estrictamente hablando, este valor se aplica a la protena de guanidinio 6M-HC1, pero el valor
en buffer es generalmente dentro del 10% de este valor, y la absorbancia relativa en HC1 de
guanidinio y almacenador intermediario puede ser determinado fcilmente por paralelo diluciones de
una solucin madre.

8. Cloruro de sodio, sulfato de amonio, borato, fosfato y Tris no interferir, mientras que 0.1Macetate,
succinato, citrato, ftalato, barbitrico show y alta absorcin en 215 nm.
9. La absorcin de protenas en la gama de 215-225 nm es prcticamente independiente del pH entre
valores de pH 4-8.
10. El coeficiente de extincin especfico de un nmero ofproteins y pptidos en 205 nm y 210 nm (3)
se ha determinado. El coeficiente de extincin promedio para una solucin de 1 mg/mL de protenas
del suero 40 a 210 nm es 20.5 + 0.14. En esta longitud de onda, una concentracin de protena de
2 ~tg/mL da A = 0,04 (5).
Referencias