PRACTICA N: 02

INVESTIGACION DE SALMONELLA
GENERALIDADES

El gnero Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Son bacilos gram

negativos, de 0,7-1,5 x 2-5 m, anaerobios facultativos, no formadores de esporas,
generalmente mviles por flagelos pertricos (excepto S. gallinarum). Fermentan glucosa,
maltosa y manitol, pero no fermentan lactosa ni sacarosa. Son generalmente catalasa
positiva, oxidasa negativa y reducen nitratos a nitritos. Son viables en diferentes
condiciones ambientales, sobreviven a la refrigeracin y congelacin y mueren por
calentamiento (mayor a los 70 C). El serotipo de Salmonella est determinado por los
siguientes tres tipos de antgenos: el antgeno somtico (O), el antgeno flagelar (H) y el
antgeno de virulencia (Vi). Los antgenos somticos son lipopolisacridos componentes
de la pared celular y se han identificado 60 antgenos diferentes. Los antgenos flagelares
son protenas localizadas en el flagelo mvil. El antgeno de virulencia es un polisacrido
termolbil localizado en la cpsula. Antes del 1 de Julio de 1963 se utilizaban 3 espe cies
de Salmonella: S. typhi, S. choleraesuis y S. enteritidis y la mayora de los serotipos
pertenecan a esta ltima especie. En la actualidad, todas las especies y subgrupos
anteriores de Salmonella y Arizona se consideran de la misma especie, pero pueden
separarse en 6 subgrupos. La nica excepcin la constituye S. bongori que por estudios
de hibridacin de ADN se constat que es una especie distinta. Por lo tanto, existen 2

especies y 6 subespecies de S. entrica en el esquema actual utilizado por el Centers for

Disease Control and Prevention (CDC).
a. Salmonella entrica:

S. entrica subespecie entrica (I): comprende la mayora de los serotipos

S. entrica subespecie salamae (II)
S. entrica subespecie arizonae (IIIa)
S. entrica subespecie diarizonae (IIIb)
S. entrica subespecie houtenae (IV)
S. entrica subespecie indica (VI)

b. Salmonella bongori (antes subespecie V)

La mayora de las serovariedades aisladas del hombre y de los animales de sangre
caliente pertencen a la subespecie I (entrica) y llevan un nombre relacionado con el lugar
geogrfico donde fueron aisladas. Como las serovariedades no tienen nivel taxonmico
de especie, escapan al Cdigo Internacional de Nomenclatura Bacteriana y por ello
deben escribirse en letra tipo romano, no itlica, por ejemplo: Salmonella entrica
subespecie entrica serovariedad Typhimurium. Las serovariedades de las subespecies
restantes y S. bongori se designan con el nombre de la subespecie seguido de la frmula
antignica, por ejemplo: Salmonella subespecie IV 50: b:- (S. entrica subespecie
houtenae 50: b:-).
La serotipificacin es til para definir, monitorear y controlar brotes y epidemias. Un
segundo mtodo de clasificacin que se utiliza con frecuencia es el esquema de
Kaufmann-White. En este esquema, varios serotipos de Salmonella se clasifican dentro
de once serogrupos. Los mismos estn basados en un antgeno mayor y uno o varios
antgenos somticos menores. Recientemente se ha desarrollado un tercer esquema de
clasificacin basado en las tcnicas de hibridacin del ADN.
OBJETIVOS

Describir la metodologa llevada a cabo por el Laboratorio de Microbiologa para

realizar la deteccin, aislamiento e identificacin de Salmonella spp. en muestras
de alimentos.

MATERIALES

Muestra de estudio: QUESO proveniente de la ciudad de Puno.

Frascos con 100 ml de Agua Peptonada (0.1) mas Tween 80.
Pipetas de 10 ml. Y 1 ml 1/10 esteriles.
Balanza de presicion de 2500 g. de capacidad.
Incubadora regulada a 35-37 C.
Placas con Agar BPLS (Agar Verde Brillante-Rojo de Fenol-Lactosa-Sacarosa)
Placas con Agar ENDO-S (Agar fuscina-lactosa seg . ENDO , tipo S)
Rotor digital
Cuchillo esteril.
Espatula esteril.

PRINCIPIOS
1. AGAR BPLS: Medio de enriquecimiento altamente selectivo para el aislamiento
de Salmonella spp., excepto Salmonella typhi y Salmonella paratyphi, a partir de
muestras clnicas, alimentos, y otros materiales de importancia sanitaria.
Corresponde

las

recomendaciones

de

la

Internacional

Organization

for

Standardization (ISO-1975).
Forma de actuacin: Actua segn el mismo principio que el Agar BPL. No obstante, su
base nutritiva-mas rica y abundante-permite un crecimiento mejor de Salmonella. El
crecimiento simultaneo , tambin mas intenso , de grmenes acompaantes , se
impide notablemente por el contenido mas elevado de verde brillante. Puesto que las
Salmonellas no pueden degradar la Lactosa ni la Sacarosa, el contenido en sacarosa
permite adems el reconocimiento de la flora acompaante Lactosa-Positiva dbil o
Lactosa-Negativa pero Sacarosa-Positiva.
Composicion (g/litro)
Peptona de carne 5,0
Peptona de casena 5,0
Extracto de carne 5,0
Sodio cloruro 3,0
Di-Sodio hidrogenofosfato 2,0
Lactosa 10,0
Sacarosa 10,0
Rojo de fenol 0.08
Verde brillante 0.0125
Agar-agar 12,0
Empleo e interpretacin

Sembrar directamente con el material objeto de investigacin, o a partir de un

cultivo previo de enriquecimiento. Deben utilizarse en paralelo medios de cultivo
menos inhibidores.
Incubacin: 18 a 24 horas, a 37C.
Colonias
Rojo-rosadas con halo rojo.
Verde-anarillentas

con

Microorganismos
Lactosa-negativos y sacarosa-negativos:
halo

amarillento

verde-

Salmonella y otros.
Lactosa-positivos o sacarosa-positivos: E.
coli,

Citrobacter,

Proteus

vulgaris,

Klebsiella y otros. No obstante, a veces,

inhibicin completa.

2. AGAR ENDO S Agar selectivo para demostracin de bacterias instestinales

patgenas de los grupos salmonella y shigella segn ENDO (1903).
Forma de actuacin: Las bacterias Gram Positivas son predominantemente inhibidas
por el sulfito y la fuscina. E.coli y coliformes degradadores de la lactosa producen
aldehdo y acido. El aldehdo libera a la fucsina de la combinacin fucsina- sulfito la
cual tie entonces fuertemente de rojo a las colonias. Las colonias de grmenes
lactosa negativo permanecen palidas.
Composicion (g/litro)
Peptona de casena 5,0
Extracto de carne 3,0
Sodio cloruro 3,0
Di-Potasio hidrogenofosfato 2,0
Lactosa 10,0
Fucsina 0,25
Sodio Sulfito 1.5
Agar-agar 12,0
Empleo e interpretacin
Sembrar las placas en estria, por agotamiento.
Incubacin: 24 horas, a 37C.
Colonias
Incoloras , claras

Microorganismos
Lactosa-negativos:Salmonella, Shigellas y

Rojas:

otros.
Lactosa-positivos :

Rojas, ocasionalmente con brillo metalico.

Escherichia coli.

Rojas hasta rosadas.

Enterobacter

Klebsiella

algunos

Citrobacter y otros.

PROCEDIMIENTO
Pesar 10 g. de la muestra (Queso).

Dilucin 10-1: Desmenuzar la muestra y verterlo con mucho cuidado en un frasco

con agua peptonada (100 ml) y homogenizar en el rotor digital.

Metodologa en AGAR BPLS:

Verter 0.1 ml de la dilucin 10-1 a la placa con Agar BPLS

 Dilucion 10-2: Separar 1ml de la primera dilucin a un tubo de ensayo de 10 ml. De

agua peptonada y verter 0.1 ml de esta a una placa con agar BPLS.

Dilucion 10-3: Separar 1ml de la segunda dilucin a un tubo de ensayo de 10 ml.

De agua peptonada y verter 0.1 ml de esta a una placa con agar BPLS.

 Incubar las placas a 37 C por 24 horas.

RESULTADOS
No se encontr colonias rojas-rosadas con halo rojos en ninguna de las 3 diluciones
siendo nuestros resultados NEGATIVOS para Salmonella.

CONCLUSIONES
Segn la metodologa empleada no se detecto, aislo ni se identifico Salmonella sp. En la
muestra de estudio (Queso).
Metodologa en AGAR ENDO S
Verter 0.1 ml de la dilucin 10-1 a la placa con Agar ENDO.
Dilucion 10-2: Separar 1ml de la primera dilucin a un tubo de ensayo de 10 ml. De
agua peptonada y verter 0.1 ml de esta a una placa con agar ENDO.
Dilucion 10-3: Separar 1ml de la segunda dilucin a un tubo de ensayo de 10 ml.
De agua peptonada y verter 0.1 ml de esta a una placa con agar ENDO.

 Incubar las placas a 37 C por 24 horas.

RESULTADOS
Ausencia de UFC de Salmonella en 10 gr de muestra ,(Queso) en las 3 diluciones siendo
nuestros resultados NEGATIVOS para Salmonella.

CONCLUSIONES
Segn la metodologa empleada no se aislo UFC de Salmonella sp.de la muestra en
estudio (Queso). En el medio Agar ENDO.