Manual Micamb

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental
INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA
MANUAL DE LABORATORIO
DE
MICROBIOLOGA AMBIENTAL
ELABORADO POR:
Q.B.P. MIRIAM JUREZ JUREZ
M. EN C. GLORIA LPEZ JIMNEZ.
ING. VERONICA GABRIELA LUNA FONTAINE
Q.F.B. MARA DE LOURDES MORENO RIVERA
Julio 2011
NDICE
NO. DE LA
PRCTICA
i
TITULO DE LA PRACTICA
PGINA
PRESENTACIN
ii
INSTRUCCIONES GENERALES
OBSERVACIN DE ORGANISMOS PROCARIOTES
TCNICAS MICROBIOLGICAS: TINCINES
TECNICAS MICROBIOLGICAS: ESTERILIZACIN
15
TECNICAS MICROBIOLGICAS: CULTIVO
20
TCNICAS MICROBIOLGICAS: AISLAMIENTO
25
RUTAS METABLICAS: RESPIRACIN Y FERMENTACIN
31
CICLOS BIOGEOQUMICOS: CICLO DEL NITRGENO
39
5a
CRECIMIENTO MICROBIANO
43
5b
FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO MICROBIANO
49
MUESTREO, RECUENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DEL AGUA:

INDICADORES SANITARIOS, BACTERIAS PATGENAS
55
MUESTREO, RECUENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DEL SUELO: 63

ACTINOMICETOS, CELULOLTICOS, AMILOLTICOS
MUESTREO, RECUENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DEL AIRE : 65

AUTTROFAS, HETERTROFAS, PATGENAS
MEDIOS DE CULTIVO, COLORANTES Y REACTIVOS
68
APNDICE
INSTRUCCIONES GENERALES DEL LABORATORIO

1.DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS DENTRO DEL LABORATORIO
Se impartirn dos sesiones por semana de 1.5 horas cada sesin principiar y terminar a la hora indicada.
Solo se tendrn 5 minutos de tolerancia despus de esta no se puede entrar al laboratorio.
Se tomara lista al inicio de la prctica.
Se anotarn las faltas y asistencias com todo rigor y por ningun motivo se pondrn retardos
Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la prctica y sin el consentimiento del profesor se
considerara que no asisti a la prctica
Las faltas en el laboratorio se calificarn con cero
La asistencia al laboratorio es obligatoria, ya que uno de los objetivos del trabajo prctico es que El alumno
adquiera habilidades y destrezas mediante estas experiencias .
En caso de llegar tarde no se permitira la entrada a menos que sea discusin con su correspondiente falta.
El reporte se entregar una semana despus de realizada la discusin.
El alumno utilizar el instructivo de laboratorio en cada sesin.
Los datos obtenidos en la prctica se anotarn en la seccin de reporte de datos de su manual.
2. NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
El alumno asistir al laboratorio con bata blanca debidamente abrochada.
No se permitir utilizar pipetas sin su tapn de algodn.
En la zona de trabajo del laboratrio no se permitir comer, beber, fumar, jugar, guardar alimentos.
No se podrn utilizar celulares, audifonos, ipods, ni aplicar cosmticos.
Durante el desarrollo de la prctica queda prohibida la entrada a personas ajenas al grupo.
El laboratorio deber mantenerse ordenado y limpio, retirando del mismo, cualquier material que no tenga
relacin con el trabajo.
Las superfcies de trabajo se descontaminarn al iniciar y terminar el trabajo de siembra.
Los alumnos se lavarn las manos antes y despus de haber concludo el trabajo en el laboratorio.
Todo el material contaminado se descontaminarn o se esterilizarn antes de ser eliminados o de volver a
utilizarlos.
Slo se permitir el paso a la zona de trabajo del laboratorio a los alumnos inscritos. Durante el trabajo se
mantendrn cerradas las puertas del laboratorio
Todos los accidentes y exposiciones a material infeccioso se notificarn inmediatamente al profesor
responsable del grupo. Se realizara un protocolo por escrito de estos eventos.
Se prohbe llevarse objetos o sustancias a la boca durante la prctica.
Los artculos personales como bolsas, mochilas debern colocarse en los lugares asignados.
Las personas con el cabello largo debern traerlo amarrado o en su defecto utilizar una cofia.
Los hombres deben evitar la barba o bien usarla muy corta.
Todos los recipientes para almacenar sustancias deben estar etiquetados, los frascos sin etiqueta, cajas petri,
matraces, tubos etc. que no tengan etiqueta sern automticamente desechados.
Se proporcionarn recipientes adecuados para el material de desecho y el material de vidrio roto se colocar en
un recipiente especial para ello,
Revisar que las llaves de agua y gas estn siempre bien cerradas al final de cada prctica.
Los medios de cultivo debern estar tapados perfectamente para evitar su hidratacin.
Utilizar un vidrio de reloj, papel aluminio o charolitas especiales para pesar, tomando las muestras con
esptulas limpias. Despus de utilizar la balanza, limpiar el platillo, con un pincel.
Si no se sabe utilizar algn equipo, solicitar apoyo al profesor antes de iniciar el experimento.
3. EVALUACIN DE LABORATORIO.
El laboratorio se evala de la siguiente manera:
Trabajo prctico
4 puntos
Cumplimiento de tareas
1 punto
Reporte de la prctica
2.5 puntos
Discusin
2.5 puntos
Nota: Solo se promediar el laboratorio si aprueba la teora.
El reporte se evala en los siguientes aspectos:
Objetivos y bibliografa
0.5 puntos
Resultados y cuestionario
0.5 puntos
Discusin y anlisis de resultados 1.0 punto
Conclusiones
0.5 puntos.
Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones prcticas, aprobar el 80% de
las prcticas efectuadas y obtener un promedio mnimo de 6.
Al inicio de cada prctica, el alumno entregar un diagrama de bloques del trabajo que se desarrollar en el
laboratorio, esta actividad se evaluar en lo que corresponde a cumplimiento de tareas.
La calificacin del trabajo prctico se obtendr promediando las sesiones de las que conste la prctica. Si el alumno
no cumple en alguna de las 3 etapas, se le calificar con cero en la sesin correspondiente.
La calificacin final del laboratorio ser el promedio de las calificaciones de todas las prcticas.
Se subirn al SAES las calificaciones de las prcticas de laboratorio correspondientes a cada periodo de evaluacin,
para que se promedie con la calificacin de teora.
Si el alumno no asiste a una sesin tendr cero en trabajo prctico, si la justifica se mantiene esa calificacin pero
no se contar la falta para el cmputo final de asistencias.
Se elegir un reporte al azar de cada equipo, revisando que todos los miembros del equipo hayan elaborado el
reporte. El alumno que no entregue reporte tendr una calificacin de cero.
A cada equipo le corresponder esterilizar y lavar material utilizado en alguna de las prcticas, no deber dejar el
material rezagado en su gaveta ya que el material se utiliza constantemente. Si el material no es lavado por el
equipo correspondiente tendrn una calificacin de cero.
2. ORGANIZACIN CON LOS ALUMNOS

2.1 Para poder entrar al laboratorio el alumno deber traer:
Bata de algodn de manga larga con todos los botones, blanca, limpia, sin pintas.
Manual de laboratorio engargolado
Asa bacteriolgica
Una foto tamao infantil.
Marcador Indeleble
2.2 Por equipo debern traer:

Un rollo de masking-tape ancho
una caja de porta objetos
Un frasco de barniz de uas transparente
Un metro de franela
Encendedor
Tijeras de punta recta
Jabn para manos liquido

Colores
Rollo de papel sanitario
Regla graduada
Pinza de punta roma
Ligas, 3 botes de lmina
PRACTICA 1: OBSERVACIN DE ORGANISMOS PROCARIOTES

1.INTRODUCCIN
La Microbiologa es la ciencia que estudia los organismos que no se pueden distinguir a simple vista y para lo cual
se necesita la ayuda de un microscopio. Entre los organismos microscpicos que estudia la Microbiologa, se
encuentran las bacterias, los mohos, las levaduras, los protozoarios y las algas. Los ltimos cuatro grupos
microbianos se estudiaron en el curso de Biologa de Eucariotes. Cuando el estudio se enfoca a los organismos
procariotes, se refiere particularmente a las bacterias.
Las bacterias de acuerdo a la clasificacin de los cinco reinos de Whittaker (1969), pertenecen al Reino Monera;
segn la clasificacin de Margulis (1988) pertenecen al Dominio Prokarya y al Reino Bacteria.
Para la observacin de los organismos procariotes, se requiere un microscopio, debido al tamao tan pequeo de
ellos y para optimizar su observacin se aplican algunos mtodos para alinear los haces de luz que atraviesan las
diferentes lentes de stos microscopios. El mtodo ms utilizado es el de Khler, y se aplica en microscopios de
alta calidad para iluminar uniformemente y slo la superficie necesaria de una preparacin. De esta forma, no se
utiliza iluminacin innecesaria. Adems, con este tipo de iluminacin se evitan, en la medida de lo posible, reflejos
de luz molestos, como los procedentes de las paredes interiores del tubo del microscopio. Las preparaciones
perfectamente iluminadas son un requisito imprescindible para conseguir imgenes impecables.
2.OBJETIVO GENERAL
Ajustar la iluminacin de un microscopio compuesto por el mtodo de Khler, observar la morfologa microscpica
de organismos procariotes y comparar con la morfologa microscpica de organismos eucariotes.
2.1 OBJETIVOS PARTICULARES:
1.- Ajustar la iluminacin de la preparacin de acuerdo al mtodo de Khler.
2.-Observar en el microscopio compuesto, las preparaciones fijas de bacterias teidas con tincin simple y
preparaciones frescas.
3.- Determinar la forma, agrupacin y movilidad de los organismos procariotes
4.- Observar protozoarios y algas en diferentes muestras de agua.
3.MATERIAL Y REACTIVOS POR EQUIPO:
Microscopio compuesto
Aceite de inmersin
Papel seda
Portaobjetos
Cubreobjetos
Gotero con bulbo
Pizetas con alcohol al 70%
Preparaciones fijas de procariotes:
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Desulfovibrio sp.
Staphylococcus sp.
Streptococcus sp.
Material que deber traer el equipo de alumnos
Agua de un lago
Agua de pecera
Agua de un charco
4. DESARROLLO DE LA PRCTICA
4.1.- Cuidado y limpieza del microscopio
1.1 Limpiar las partculas de polvo, con un bulbo inyector de aire o un pincel.
1.2 Limpiar el ocular y el objetivo con papel seda humedecido con una mezcla de etanol al 40 %, ter al 20 %.
4.2.- Iluminacin por el mtodo de Khler.
El microscopio compuesto posee dos diafragmas: un diafragma de campo, situado a nivel de la lmpara y un
diafragma de abertura, situado debajo del condensador. La tcnica de Khler, ajusta la apertura de ambos
diafragmas para redireccionar los haces luminosos y optimizar la cantidad de luz en la muestra, por lo que se
incrementa el contraste y la resolucin de la muestra.
Luz amarilla (bajo voltaje)
Ajustar la distancia interpupilar
Ajustar las dioptras
Abrir el diafragma de campo e iris
Subir completamente el condensador con la lente frontal introducida
Enfocar la preparacin con el objetivo 4X 10X, ajustar la imagen

con los tornillos macro y micromtrico
Observar y cerrar el diafragma dispuesto en el pie del microscopio
Bajar el condensador, hasta obtener la mxima nitidez de la imagen del

diafragma (hexgono definido)
Centrar el diafragma de campo luminoso en el campo visual con los tornillos

del condensador
Abrir el diafragma de campo luminoso casi hasta el borde del campo visual,
centrando con la mayor precisin y abrirlo hasta que desaparezca detrs del borde
del campo visual
Regular el contraste de la imagen con ayuda del diafragma del condensador.
Insertar el filtro azul, regular la intensidad de la luz con el control del voltaje
Al cambiar de objetivo: enfocar con el micromtrico y regular la cantidad de
luz con el diafragma del condensador.
4.3 OBSERVACIN DE PREPARACIONES FIJAS

Enfocar las preparaciones fijas de clulas procariotes con el objetivo de 10X y 40X; una vez ubicado el frotis, colocar
una pequea gota de aceite de inmersin sobre el frotis y enfocar la preparacin con el objetivo de 100X, cuidando
de no tocar con el aceite los objetivos 10X y 40X. Realizar los dibujos en relacin a la forma, agrupacin,
tamao y movilidad de las clulas.
4.4 OBSERVACIN DE PREPARACIONES EN FRESCO
Observacin en fresco de bacterias
4.2.1 Colocar una gota de la suspensin de bacteria, con una pipeta Pasteur sobre un portaobjetos, colocando
encima un cubreobjetos y observar con los objetivos 10X y 40X, dibujando lo observado.
Observacin en fresco del agua de lago, pecera, charco.
4.2.2 Colocar una gota del agua con una pipeta Pasteur sobre un portaobjetos colocando encima un cubreobjetos y
observar con los objetivos 10X y 40X, dibujando lo observado.
Nota: Realizar los dibujos en relacin a la forma, agrupacin y movilidad de las clulas.
5.- RESULTADOS
Microorganismo
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Desulfovibrio sp
Staphylococcus sp.
Streptococcus sp
Microorganismo
1.
2.
3.
4.
Tabla 1 preparaciones fijas.

Forma
Agrupacin
Tabla 2 preparaciones en fresco.

Forma
Agrupacin
Movilidad
Movilidad
6. ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS

Con base a lo observado discuta los siguientes aspectos:
a) Uso del microscopio
b) Ajuste de la iluminacin con la tcnica Khler
c) Observacin de la movilidad de los microorganismos

d) Del cuidado del microscopio, en su uso y transporte
7.- CUESTIONARIO
1. En relacin al tamao, la forma y la agrupacin, describe las diferencias que observaste entre las bacterias,
compara con las clulas de eucariotes que hayas encontrado en las referencias bibliogrficas y con lo que
observaste en la prctica.
2. Describe brevemente las observaciones de las preparaciones en fresco es posible observar forma, tamao,
movilidad? Para qu sirve una preparacin fija y una en fresco?
3. Existen otras tcnicas para la optimizacin de la iluminacin en los microscopios compuestos?, compara con la
tcnica de Khler.
4. En forma de conclusin, compara los resultados en relacin con los objetivos particulares de la prctica y lo
publicado en las referencias bibliogrficas.
8.- REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS DE LA PRCTICA
Cebulla W. (1990). Qualitative microscopy en Handbook of incident light microscopy by Carl Zeiss, West Germany.
68 Pgs.
Madigan, Martinko, Parker (2005). Brock Biology of the microorganisms. 10th edition, Prentice Hall,. 892 Pgs.
9.-ENLISTA LAS REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS QUE CONSULTASTE, DE ACUERDO AL SIGUIENTE
FORMATO.
Autor (es) iniciando con los apellidos e inicial del nombre, ao de publicacin, Ttulo del captulo del libro, ttulo del
libro, edicin, pas, pginas.
PRACTICA No. 2a
TCNICAS MICROBIOLGICAS: TINCIONES
1. INTRODUCCIN
El estudio de las clulas procariotas se inicia con el anlisis de la morfologa de las clulas aisladas o grupos de
clulas, que se observan por medio de un microscopio. La observacin microscpica constituye la primera
etapa en el estudio de las bacterias con fines taxonmicos y permite conocer algunas de sus caractersticas
como: tamao, forma y modo de agrupacin. Estos caracteres constituyen la Morfologa microscpica de
la clula, asimismo, permite la observacin de ciertas estructuras celulares como: pared celular, cpsulas,
esporas y flagelos.
La morfologa microscpica de las clulas procariotas puede ser examinada de dos formas: a) observando al
microorganismo vivo y sin teir, y b) observando las clulas muertas fijadas a un portaobjeto y teidas con
colorantes. Las bacterias vivas son generalmente incoloras y ofrecen por lo general un contraste insuficiente
con el medio acuoso en el cual estn suspendidas, como para ser claramente visibles en el microscopio. Al
realizarse una tincin, este contraste se incrementa notablemente.
Forma.- La mayora de las clulas bacterianas tienen formas celulares caractersticas que se mantienen ms o
menos constantes en cultivos jvenes que crecen activamente en buenas condiciones. Sin embargo, puede darse
que en cultivos viejos, donde la estructura celular se est desintegrando, aparezcan formas degenerativas o formas
de involucin. (Figura 1)
Cocos - La forma esfrica de una bacteria recibe el nombre de coco.
Bacilos - Las clulas con forma cilndrica o de bastones reciben el nombre de bacilos.
Espirilos - El tercer grupo morfolgico principal de bacterias est formado por las formas espirales, que en el caso
de espirales largas adquieren forma de hlice.
Vibrios .- Las clulas tienen forma de coma, se encuentran aisladas.
Otros - Bacterias cuadradas con lados y esquinas rectos, aislados de ambientes extremadamente salados
Agrupaciones.- Al dividirse una clula, las clulas hijas pueden o no separarse inmediatamente. La combinacin de
los diferentes planos de divisin y la probabilidad de separacin clula hija de la clula madre, conducen a
agrupaciones caractersticas de las bacterias (Figura 1).
Estrellas
Cuadrada
Figura 1 Formas y agrupaciones de procariotes

Cocos Los subtipos morfolgicos de los cocos se distinguen segn la disposicin de las clulas unas con otras. La
divisin en un plano da lugar a pares de organismos, diplococos. Cuando la tendencia a quedar unidos es ms
intensa, el resultado es una cadena de clulas, estreptococos consistentes en 4 a 10 o con ms de 20 clulas

(cadenas largas) que muchas veces tienen aspectos de diplococos unidos en serie, ejemplo de este tipo es
Streptococcus epidermidis. La divisin regular en dos planos, uno respecto al otro a 90 , resulta en ttradas y la
divisin regular en tres planos da lugar a paquetes cbicos de ocho clulas, como los que se dan en el gnero
Sarcina. La divisin irregular en dos o tres planos, lleva a acmulos irregulares en forma de racimos de uva
denominado estafilococos, cuyo ejemplo caracterstico es Staphylococcus aureus
Bacilos : Algunas de las formas bacilares adoptan agrupaciones caractersticas, consecuencia de movimientos
despus de la divisin celular. En algunos tipos de bacilos hay tendencia a formar cadenas, el tipo morfolgico
denominado estreptobacilo En el caso de las cadenas formadas por bacilos, stas pueden ser cortas o largas.
Definicin de trminos:
Frotis.- El material que se va a observar debe ser fijado o pegado sobre el portaobjeto, de manera que durante la
tincin, la solucin de colorante no arrastre o lave la capa de clulas colocada sobre el portaobjeto.
Tinciones.- Al agregar algunos colorantes, las clulas o las estructuras se observan con nitidez, por lo cual se
obtienen las siguientes ventajas:
Al teir los microorganismos se incrementa el contraste con sus alrededores y por tanto son mucho ms visibles.
Ciertas tinciones pueden ayudar a identificar estructuras de las clulas que de otra manera no podran ser vistas
(cpsulas, esporas)
Se puede utilizar un objetivo con aceite de inmersin para obtener una amplificacin mayor de la imagen
Pueden ser utilizadas con fines taxonmicos, ya que no todos los microorganismos presentan la misma afinidad
por los distintos colorantes.
Colorantes
Los colorantes reaccionan qumicamente con la clula bacteriana pero no con sus alrededores, permitiendo
as distinguirlas. Por lo que, la mayor ventaja de la tincin es proveer un contraste entre el microorganismo y sus
alrededores, permitiendo de esta forma una diferenciacin entre distintos tipos de morfologa, y permitiendo el
estudio de estructuras como la pared celular, cpsulas y esporas.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los
materiales celulares.
Los colorantes bsicos o colorantes catinicos, cargados positivamente, se combinan fuertemente con
los constituyentes celulares cidos cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los
polisacridos. La clula bacteriana, que en medio de pH cercano a la neutralidad, est cargada
negativamente, se combina con los colorantes bsicos, cargados positivamente, con lo cual queda teida.
Como ejemplo de colorantes bsicos tenemos, el Cristal violeta, la safranina y el azul de metileno.
Los colorantes cidos o aninicos, cargados negativamente, son molculas que se combinan con constituyentes
celulares cargados positivamente, como pueden ser muchas protenas. Ejemplos de estos colorantes son la
eosina, fucsina cida, rojo Congo.
Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles, que se combinan con los lpidos de la clula, revelando la
ubicacin de los depsitos de grasa en la misma. Un ejemplo de este grupo es el Sudn negro.
Tipos de tinciones
Las tcnicas de tincin se pueden clasificar en primera instancia como:
1. Tincin positiva, Implica el uso de colorantes para teir las clulas y aumentar su contraste de manera
que se pueda observar ms fcilmente una muestra al microscopio.
2. Tincin negativa.- Se utilizan colorantes que no tien al microorganismo, sino que colorean al medio que los
rodea; por lo tanto, lo que se ve es el perfil de las clulas. Las sustancias utilizadas son materiales opacos que no
tienen afinidad por los constituyentes celulares. Un ejemplo de este tipo de colorante es la tinta china (suspensin
de partculas de carbono coloidal) y la nigrosina.
Tambien se clasifican como:
3. Tinciones simples Se denomina as, porque solo se utiliza un colorante, generalmente bsico. Con este tipo de
coloracin no se pretende diferenciar microorganismos o estructuras celulares. Las tcnicas de coloracin simple
pueden ser positivas cuando el colorante es fijado por las clulas apareciendo los microorganismos de color oscuro
10
o coloreado sobre un fondo luminoso o claro, y son negativas cuando los microorganismos no fijan el colorante, en
cuyo caso el fondo es el que se tie y los microorganismos aparecen brillantes sobre fondo oscuro.
4. Tinciones diferenciales son tcnicas en donde se somete la muestra a ms de una solucin colorante de
forma que no se tien de la misma manera todos los componentes celulares, por ejemplo: Tincin de Gram,
Tincin de Ziehl Nielsen
4.1 Tincin de Gram.
El mtodo fue descubierto por Christian Gram (Dans), en 1884, quien observ que en cortes histolgicos que
contenan bacterias coloreadas con violeta de genciana y tratadas con solucin acuosa de yodo, este colorante
podra ser removido del corte histolgico con el empleo de alcohol, pero no de las bacterias. Posteriormente
descubri que no todas las bacterias retenan al violeta de genciana sino que algunas eran decoloradas por accin
de una mezcla alcohol-acetona. Esta tcnica permite diferenciar a dos grandes grupos de procariotas en funcin de
la composicin de la pared celular. Las procariotas que contienen un alto contenido de pptidoglucanas
(aproximadamente el 90%) y un bajo contenido de lpidos (aproximadamente 10%), dan reaccin de Gram positiva
y los procariotes que contienen un bajo contenido de pptidoglucanas (aproximadamente el 10%) y un alto
contenido de lpidos (aproximadamente 90%), dan la Reaccin de Gram negativa
5. Tinciones estructurales o especficas: estas tcnicas se emplean para el reconocimiento de estructuras
celulares (cpsulas, esporas, flagelos, etc.), ejemplo: Tincin de Shaeffer y Fulton (para endosporas), Tincin con
Tinta china( cpsula).
Existen diversos tipos de esporas microbianas, pero la espora bacteriana tiene especial importancia ya que son
organelos de gran resistencia que se producen en el interior de la clula, por lo que reciben el nombre de
endosporas.
La endospora es una estructura compuesta, de dipicolinato de calcio en eL centro, dentro de su compleja cubierta
que consta de siete capas que contienen murena. Pocos gneros de bacterias son capaces de formar endosporas,
siendo los principales: Bacillus y Clostridium.
La funcin de las endosporas no es la reproduccin, ya que de un bacilo que forma una espora solo surge una
bacteria por germinacin.Tanto el tamao, como la forma y posicin de la espora en la clula bacteriana son
caracteres relativamente constantes de cada especie, ya que poseen cierto valor para distinguir entre s los
diferentes tipos de bacterias esporuladas. La posicin de la espora en la clula puede ser central, sub-terminal o
terminal y de forma redonda u ovalada. La espora puede tambin ser ms grande que el dimetro de la bacteria o
menor que ste. Las endosporas bacterianas son muy resistentes y refractarias a la desecacin, a los agentes
qumicos y sobre todo a temperaturas elevadas, ya que pueden sobrevivir expuestas a altas temperaturas durante
largos perodos a diferencia de las bacterias vegetativas normales que mueren con breves exposiciones.
2. OBJETIVO GENERAL
Desarrollar la habilidad para la preparacin de frotis y diferentes tinciones, as como la descripcin de la morfologa
microscpica de clulas procariotes.
2.1 OBJETIVOS ESPECFICOS
Realizar frotis (preparaciones fijas)
Realizar tinciones simples, diferenciales y especficas
Observar forma y tipo de agrupacin de los microorganismos
Observar cpsulas y esporas
Observar movilidad bacteriana
3. MATERIAL Y CEPAS MICROBIANAS
Por equipo:
1 kit para tincin de Gram
1 Kit para tincin de Shaeffer y Fulton
Tinta china o Nigrosina
6 portaobjetos
Gradilla
Asa bacteriolgica
11
Lmpara de alcohol
Hisopos
Encendedor
Microscopio
Puente de tincin
Aceite de inmersin
Mechero Bunsen
Papel absorbente
Microorganismos:
Cultivo de Escherichia coli en medio slido.
Cultivo de Bacillus subtilis en medio lquido
Cultivo de Klebsiella pneumoniae en medio slido
Cultivo de Staphylococcus epidermidis en medio lquido
Frotis
Se debern emplear portaobjetos limpios, desengrasados y sin raspaduras para evitar interferencias en la
observacin. Realizar por triplicado el procedimiento siguiente:
1. Con un asa bacteriolgica previa esterilizacin por incineracin al rojo y fra, se toma la muestra de Bacillus
subtilis, para lo cual se retira el tapn de algodn del tubo de ensayo que contiene el cultivo, sostenindolo
entre el dedo meique y la palma de la mano y se flamea la boca del tubo en la llama del mechero; se toma
la muestra con el asa y antes de tapar se flamea nuevamente la boca del tubo. Se deposita el material
extrado con el asa sobre el portaobjeto y se extiende en forma de elipse en 1 cm2, formando una
capa fina. Dejar secar al aire
2. Colocar una gota de agua en un extremo del portaobjetos, y con el asa bacteriolgica estril, tomar una
pequea cantidad de cultivo de Escherichia coli, emulsionar y extender uniformemente en una superficie
aproximada de 1 cm2, dejar secar al aire.
3. Identificar adecuadamente cada frotis
4. Fijacin: Una vez que la preparacin est seca, se pasa el portaobjeto (con la preparacin seca hacia
arriba) tres veces por la llama del mechero, en forma rpida como lo indica el profesor y con el calor
suficiente que se tolere en el dorso de la mano. El calor, tiene por objeto matar los microorganismos y
coagular el protoplasma celular para adherir las clulas al portaobjeto. El fijador ideal preserva las
estructuras celulares sin modificaciones. Adems del calor, se pueden utilizar otros agentes tales como:
alcohol, cido crmico, fenol.
5. Los frotis deben ser delgados y uniformes para permitir el paso de la luz a travs de ellos y facilitar su
observacin
B. Tincin Simple.
1. Colocar una gota del colorante (azul de metileno o safranina) sobre el frotis y dejarlo actuar 1 minuto.
2. Lavar con agua corriente hasta eliminar exceso de colorante.
3. Dejar secar al aire.
4. Observar a 10X y 40X en el microscopio compuesto.
5. Colocar una gota de aceite de inmersin y observar con el objetivo de inmersin.
5. Dibujar lo observado.
C. Tincin de Gram (Figura 2)
1. Cubrir un frotis con cristal violeta y dejar actuar durante un minuto.
2. Lavar con agua corriente, cuidando que no se arrastre la muestra y sacudir para eliminar el exceso de agua.
3. Cubrir el frotis con solucin de lugol y dejar actuar por un minuto.
4. Lavar con agua corriente.
5. Decolorar la primera etapa con la mezcla alcohol-acetona, aproximadamente 10 segundos
7. Cubrir el frotis con Safranina y dejar actuar por 1 minuto.
12

9. dejar secar al aire.
10. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin y observar al microscopio con objetivo de
inmersin.
Interpretacin:
Las bacterias Gram positivas retienen el complejo cristal violeta - lugol y se tien de color violeta o azul violceo
Las bacterias Gram negativas se tien en rojo rosa.
Dibujar, destacando la forma y el color de cada frotis.
Figura 2 Tincin de Gram

D. Tincin de esporas por el mtodo de Schaeffer y Fulton
1. Colocar un frotis sobre un soporte y agregar suficiente solucin de verde de malaquita al 5%.
2. Flamear la preparacin pasando por debajo de sta la lmpara de alcohol hasta observar una ligera emisin de
vapores por espacio de minuto y medio, evitando que se evapore totalmente el colorante, agregar ms si es
necesario de lo contrario corres el riesgo de que se quede pegado el colorante y calcinar a tu microorganismo.
3. Lavar al chorro del agua, hasta eliminar exceso de colorante.
4. Cubrir la preparacin con solucin de contraste, Safranina al 5%, y dejar actuar el colorante durante un minuto y
medio.
5. Lavar al chorro del agua hasta eliminar el exceso de colorante.
6. Secar al aire
7. Observar al microscopio con objetivo de inmersin en aceite.
8. Dibujar, destacando la forma y el color de cada frotis.
Interpretacin:
Las esporas debern estar teidas de color verde y los cuerpos bacilares en rojo.
E. Tincin negativa de cpsula
1. Colocar una pequea asada del cultivo de Klebsiella pneumoniae sobre el portaobjetos
2. Agregar una gota de Nigrosina o tinta china y mezclar suavemente
3. con la ayuda de otro portaobjetos limpio se extiende la mezcla para formar una pelcula delgada.
4. Dejar secar al aire, sin fijar
13
5. Observar a inmersin
Interpretacin: Observar halos transparentes, sin teir, alrededor de las clulas
F. Determinacin de movilidad en gota pendiente
1. Colocar una gota de cada cultivo de bacteria sobre un cubreobjetos, si el cultivo es en medio slido, suspender la
asada en una gotita de agua
2. colocar un portaobjetos excavado, invertir cuidadosamente de forma que se mantenga la gota suspendida y
observar a seco fuerte (40 X)
3. Dibujar lo observado, indicando si hubo movilidad o no de las clulas analizadas
5. RESULTADOS
Describir con esquemas cada una de las tinciones realizadas en la prctica, colorear de acuerdo a la tincin
trabajada.
Informar los resultados obtenidos en la siguiente tabla
Forma
Agrupacin
Gram
Movilidad
6. ANLISIS Y DISCUSIN
Analiza tus resultados y compralos con lo descrito en la bibliografa consultada. Enfatiza en el fundamento de las
tinciones.
Revisa porqu se mueven los microorganismos y determina si tu observaste la movilidad como se describe en los
libros.
7. CUESTIONARIO
1. Consultar la estructura qumica de 2 colorantes cidos y 2 bsicos. Que significa grupo cromforo y grupo
auxocromo en los colorantes
2. Cul el ndice de refraccin del aceite de inmersin y porqu se utiliza para observar a las bacterias?
3. Cul es el fundamento de la Tincin Diferencial de Gram y de la Tincin diferencial de Ziehl Nielsen?
4. Cul es la funcin que desempea el Lugol en esta coloracin?
5. Escribir el nombre cientfico (Gnero y especie), de 5 bacterias Gram positivas y 5 Gram negativas.
6. Por qu algunos microorganismos Gram positivos en un cultivo joven se vuelven Gram negativos cuando
envejecen?
7. Indicar 5 gneros de bacterias esporuladas
8. A qu se debe la movilidad de las bacterias? En qu consiste el movimiento Browniano?
9. Menciona 5 gneros de bacterias mviles
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS DE LA PRCTICA
1. Brock, T.D. Biologa de los Microorganismos. Ed. Prentice-Hall. 1996.
2. Stanier, R.Y.M. Microbiologa. Ed. Prentice-Hall. 1997.
9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS CONSULTADAS
Autor (es) iniciando con los apellidos e inicial del nombre, ao de publicacin, Ttulo del captulo del libro, ttulo del
libro, edicin, pas, pginas.
14
PRACTICA No. 2b
TCNICAS MICROBIOLGICAS: ESTERILIZACIN
1. INTRODUCCIN
La esterilizacin es el proceso por el cual se eliminan o destruyen los microorganismos. Se dice que es un proceso
porque durante su desarrollo depende de varios factores como son la temperatura, dosis de radiacin, o
concentracin del agente letal, tiempo de la exposicin, presin, entre otros. Los procesos de esterilizacin pueden
ser fsicos o qumicos. Entre los procesos fsicos se encuentran el calor, la microfiltracin y la radiacin. El calor que
se aplica durante el proceso puede ser por vapor de agua (calor hmedo) o bien en un horno de alta temperatura
conocido como calor seco. La muerte de las bacterias por el calor hmedo es consecuencia de la desnaturalizacin
de sus protenas. El calor, se puede aplicar a numerosos instrumentos, materiales y substancias, con el propsito de
matar a las bacterias que ellos contengan. Existen numerosos factores que condicionan la efectividad del proceso:
Cantidad de agua, temperatura, presin, tiempo de contacto, superficie de esterilizacin, pH, la presencia o no de
esporas, composicin del medio de suspensin, etc.
Las clulas vegetativas y las endosporas bacterianas de un mismo organismo varan considerablemente en cuanto
a su resistencia al calor. La muerte de los microorganismos es ms rpida a pH cido. Las concentraciones
elevadas de azcares, protenas o grasas disminuyen la penetracin del calor y habitualmente aumentan la
resistencia de los organismos al calor, mientras que las elevadas concentraciones de sal pueden incrementar o bien
reducir la resistencia al calor, dependiendo del organismo.
Calor seco.-Este tipo de esterilizacin incluye al flameo, incineracin y los hornos de aire caliente. La esterilizacin
celular se produce principalmente por la oxidacin de las protenas vitales, a las esporas de Geobacillus
sthearothermophilus o de Aspergillus niger que se destruyen a 160 C en una hora y son los bioindicadores de este
proceso.
Calor hmedo. Es un proceso rpido y es efectuado con vapor a presin. La muerte microbiana se produce por la
desnaturalizacin de las protenas, en un sistema cerrado libre de aire, se requiere de 121 C, 1.05 atmsferas de
presin (15 libras) por 15 minutos y se aplica a materiales que no se afectan por la humedad y la temperatura, las
esporas de Geobacillus sthearothermophilus, son los bioindicadores utilizados.
Microfiltracin o filtracin a travs de membranas, se aplica principalmente para soluciones termolbiles, es
decir que son susceptibles de degradacin por el calor. Se utilizan membranas o cartuchos de porosidad de 0.22
0.45 micrones
La filtracin puede usarse para esterilizar lquidos termosensibles o gases. Un filtro es un dispositivo con poros
demasiado pequeos para que pasen los microorganismos, pero suficientemente grandes para permitir el paso de
un lquido o un gas. Algunas de las clulas bacterianas de mayor tamao miden ms de 10 m de dimetro,
mientras que las ms pequeas en la escala de tamaos tienen un dimetro menor a 0.3 m. Los filtros de
profundidad estn constituidos por una lmina fibrosa o tapete hecho de matrices dispuestas al azar de fibras de
papel, asbesto o vidrio que se solapan, este filtro atrapa las partculas en la imbricada trama y urbidumbre que se
crea a travs del espesor de la estructura, son porosos y se usan como prefiltros para eliminar las partculas de
gran tamao que pudieran interferir en la microfiltracin tanto para soluciones como para aire. El filtro de
membrana (Fig. 1) se compone de polmeros con una elevada resistencia, como el acetato de celulosa, nitrato de
celulosa o polisulfonas
Fig. 1 a) Porta membrana y b) membrana para microfiltracin
El tercer tipo de filtro para uso comn es el filtro de nucleacin (Nucleopore). Estos filtros se han obtenido tratando
pelculas muy finas de policarbonatos (10 m de grosor) con radiacin nuclear y fracturando la pelcula con un
producto qumico. El microorganismo que se ha utilizado como testigo de esterilizacin por este proceso es
Pseudomonas diminuta que tiene un dimetro aproximado de 0.50 micrones.
15
Limpieza del material. El material de vidrio e instrumental que se utiliza en la realizacin de estudios
microbiolgicos debe estar limpio, seco y libre de residuos de detergentes u otros contaminantes como germicidas,
desinfectantes, vitaminas, aminocidos, etc. que interfieran en el desarrollo de los microorganismos. Adems de la
limpieza y el secado previo del material, es importante la envoltura del material que se va a someter a esterilizacin,
para la conservacin de la esterilidad posterior al proceso.
Los materiales que se van a esterilizar por calor hmedo, requieren ser envueltos en materiales con superficies
porosas, para que el vapor penetre libremente por todo el interior de los materiales a esterilizar.
Para esterilizar por calor seco el material no requiere ser poroso, solo se necesita que transfiera fcilmente el calor
por contacto.
2. OBJETIVO GENERAL
Adquirir el conocimiento y los cuidados necesarios para esterilizar por los mtodos con calor.
Desarrollar la habilidad para preparar material para su esterilizacin
Esterilizar por los mtodos de calor seco y calor hmedo
3.0 MATERIAL Y REACTIVOS
Papel aluminio
Papel Kraft
Algodn
3 tubos de ensaye de 16 X 150 mm
3 tubos de ensaye de 13 X 100 mm
3 cajas Petri de vidrio1 matraz de 125 mL
1 matraz de 500 mL
3 pipetas de diferentes volmenes
Termmetro
2 Mecheros
Encendedor
Masking tape
Asa bacteriolgica
1 pinza de diseccin
1 tijera
1 gradilla
1 canastilla
1 cilindro pipetero
1 cilindro para cajas de Petri
1 vaso de precipitados
ligas
botes de metal
Swinnex de 13 mm de dimetro
Membranas de 0.45 um de 13 mm de dimetro
Autoclave a 116C y 121 C
Horno de calor seco a 160 C.
Incubadora a 37 C
A) Lavado de material de vidrio e instrumental.
1. Si existe material que ha estado en contacto con cultivo de microorganismos, ste debe ser esterilizado en
autoclave a 121 C, 1.05 atm de presin durante 15 minutos.
2. Recolectar los desechos del material esterilizado en bolsas de plstico biodegradables.
3. Enjuagar con agua de la llave.
4. Frotar con una solucin detergente, utilizando escobillones para las pipetas, los tubos y los matraces y una fibra
suave para las cajas Petri, el material plano y el instrumental metlico.
5. Enjuagar suficientemente con agua de la llave.
6. Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente.
B) Preparacin del material para esterilizacin por calor hmedo.
1. Tubos de ensayo.
1.1 Tapar 3 tubos de ensayo con tapones de algodn siguiendo las indicaciones del profesor.
1.2 Colocar los tubos en un bote con orificios en la base y taparlos con papel Kraft, asegurarlos con una liga, anotar
fecha, equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.
16
2. Cajas de Petri.
2.1 Envolver 3 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel, la cantidad
de cajas envueltas, fecha, equipo, laboratorio y grupo.
3. Pipetas.
3.1 Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando que no quede muy compacto
utilizando para ello una aguja de diseccin.
3.2 Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodn.
3.3 Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo con maskingtape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el nmero de equipo de laboratorio. Con
una flecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.
4. Matraces.
4.1 Colocar en la boca de cada matraz un tapn compacto de algodn, envuelto con gasa y elaborado siguiendo las
instrucciones del profesor.
4.2 Con papel Kraft, confeccionar un gorro ligeramente ms grande que el tapn de algodn.
4.2 En una tira de masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo; adherir el masking-tape al matraz. No anotar los
datos sobre la capucha de papel.
5. Pinzas y tijeras.
5.1 Envolver con papel Kraft una pinza o una tijera sealando con una flecha la punta y colocarlos en un bote de
metal con orificios.
5.2 Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.
Manejo de Autoclave.
1. Asegurarse de que haya un buen nivel de agua en el autoclave. Si no hay suficiente, agregarla hasta que casi
llegue a la parrilla inferior.
2. Introducir el material que se va a esterilizar procurando que quede bien colocado para evitar algn problema y
cerrar la puerta ajustndola bien. Debe de quedar hermticamente cerrado.
3. Abrir la vlvula de salida de vapor y encender la fuente de calor de la autoclave.
4. A medida que suba la temperatura del agua (ver el termmetro), empezar a salir una mezcla de vapor-aire por
la vlvula de salida de vapor, dejar que escape esta mezcla hasta que solo salga un flujo continuo de vapor y el aire
haya sido eliminado; a esto se le llama purgar el autoclave.
5. Una vez purgado el autoclave, cerrar la vlvula de salida de vapor y dejar que la presin suba hasta 15 libras por
pulgada cuadrada (vigilar el manmetro), lo que proporciona una temperatura de 121 C.
6. En ese momento empezar a contar el tiempo.
7. Transcurridos 15 minutos a 15 libras de presin, apagar la fuente de calor y dejar que el autoclave se enfre slo
(no abrir la vlvula de salida de vapor), hasta que la presin haya bajado a cero libras.
8. Abrir la autoclave y sacar el material con precaucin.
C. Preparacin del material para esterilizacin por calor seco.
1. Tubos de ensaye.
1.1 Colocar en 3 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en un bote de metal.
1.2 Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape indicador.
2. Cajas de Petri.
2.1 Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri algunas cajas en posicin invertida
perfectamente secas (POR ESTE MTODO NUNCA SE ESTERILIZA MATERIAL CONTAMINADO).
2.2 Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el nmero de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la fecha.
Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.
17
3. Pipetas.
3.1 Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando que no quede muy compactado.
3.2 Flamear las boquillas en la flama del mechero a fin de eliminar el exceso de algodn.
3.3 Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas.
3.4 Anotar en una tira de papel kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la tira entre la
tapa del cilindro pipetero.
4. Matraces.
4.1 Colocar en la boca de un matraz de 125 mL una tapa de papel aluminio.
4.2 En una tira de papel kraft anotar feche, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetndolo con maskingtape indicador.
5. Pinzas y Tijeras.
5.1 Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera.
5.2 En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura.
Manejo del Horno.
1. Para efectos de esta prctica, encender el horno elctrico y mediante el termostato, elevar la temperatura hasta
que llegue a 160 C y mantener esta temperatura constante.
2. Introducir el material a esterilizar y cerrar la puerta. Esperar a que la temperatura del horno alcance los 160C.
3. Empezar a contar 60 minutos de exposicin a esa temperatura.
4. Despus de este perodo, apagar el horno, abrir la puerta y sacar el material. Si an est caliente, usar un guante
de asbesto.
D. Esterilizacin por calor hmedo.
1. Preparar 3 tubos de ensaye de 16x150 mm con 5 mL de caldo nutritivo sin esterilizar y etiquetar tubos 1, 2, 3.
2. Mantener el tubo nmero 1 sin esterilizar.
3. En el segundo tubo de ensaye sin esterilizar y que contiene caldo nutritivo, colocar una tira de esporas de
Geobacillus sthearothermophilus, tapar el tubo con un tapn de algodn y someterlo a una temperatura de 116 C
durante 15 minutos y una presin de 10 lb/pulg.
4. En el tercer tubo de ensaye sin esterilizar y que contiene el caldo nutritivo, colocar una tira de esporas de
Geobacillus sthearothermophilus, tapar el tubo con un tapn de algodn. Esterilizarlo a 121 C durante 15 minutos.
Tener cuidado de eliminar todo el aire del sistema, iniciar la cuenta del tiempo cuando la presin sea de 15 lb/pulg.
5. Incubar los tres tubos a 35 C + 2 C durante 48 a 72 horas. No olvidar etiquetar los tubos con los datos del
equipo.
6. Observar diariamente los tubos incubados durante 3 das. Anotar cualquier cambio en cuanto a la aparicin de
turbidez.
E. Esterilizacin por calor seco.
1. Colocar el material preparado para esterilizar por calor seco en el horno, revisar que la temperatura ascienda a
160 C, y empezar a tomar el tiempo, durante una hora.
2. En un tubo de ensaye sin esterilizar, colocar una tira de papel filtro que contenga esporas de Bacillus subtilis var
nger, cubrir la boca del tubo con papel aluminio. Esterilizar a 160 C durante 1 hora. En caso de que no se te
proporcione la tira impregnada con esporas introduce una ampolleta que ya contenga el papel filtro impregnada con
esporas.
3. Despus de transcurrido el tiempo de esterilizacin, apagar el horno y esperar a que el termmetro indique la
temperatura ambiente. Abrir y retirar con mucho cuidado el material con guantes de asbesto.
4. Con ayuda de la pinza estril y bajo condiciones aspticas, colocar la tira de papel filtro conteniendo las esporas
del microorganismo indicador a un tubo de ensaye que contenga 10 mL de caldo nutritivo estril. Incubar a 35 + 2
C de 48 a 72 horas.
18
5. Incubar una tira reactiva con las esporas sin esterilizar para que sea el testigo positivo.
6. Observar diariamente y anotar cualquier cambio en cuanto a la aparicin de turbidez.
Interpretacin de resultados
Tubos con turbidez: Proceso incorrecto de esterilizacin, material contaminado.
Tubos sin turbidez: Condiciones correctas de esterilizacin, material estril.
Testigo positivo: Deber presentar turbidez (desarrollo microbiano)
Testigo con esporas esterilizado: Sin turbidez, c ondiciones correctas de esterilizacin,
5. RESULTADOS
En una tabla, anota los resultados de cada material, solucin o medio de cultivo que hayas esterilizado, en la misma
tabla, correlaciona el tipo de envoltura que utilizaste con el proceso de esterilizacin al que fue sometido el material.
Compara tus resultados, con lo descrito en la bibliografa:
6.1 Parmetros de cada proceso de esterilizacin,
6.2 Limpieza del material
6.3 Preparacin del material para esterilizar
6.4 Puntos crticos durante la preparacin y los procesos de esterilizacin
7. CUESTIONARIO
1. Dibujar y describir un Autoclave y un Horno de calor seco.
2. Qu tipo de material se puede esterilizar en el Horno de calor seco y en el Autoclave? Dar ejemplos.
3. Cul es la temperatura y el tiempo que se requieren para lograr la esterilizacin en el Horno de calor seco?
4. Por qu es necesario ajustar el tiempo y la temperatura para lograr la esterilizacin?
5. Describe a la filtracin como un mtodo para esterilizar lquidos que no pueden esterilizarse por calor. Explica sus
ventajas y menciona dos ejemplos.
6. Describe la radiacin ultravioleta como un mtodo para esterilizar material e instrumental. Explica sus ventajas
sobre los otros mtodos de esterilizacin y menciona dos ejemplos.
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFCAS DE LA PRCTICA
Denyer S.P., Hodges N. A., Gorman S.P. Pharmaceutical Microbiology, Ed. Blackwell, 7a Edicin, pag. 346
9.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFCAS CONSULTADAS
19
PRACTICA No. 2c
TCNICAS MICROBIOLGICAS: CULTIVO
1. INTRODUCCIN
MEDIOS DE CULTIVO
Como resultado del pequeo tamao de los microorganismos, la nica manera de obtener informacin sobre ellos
es estudiando sus poblaciones. Tales poblaciones se obtienen al hacer crecer los microorganismos bajo condiciones
ms o menos bien definidas, como cultivos. El cultivo es el crecimiento de las poblaciones microbianas en
ambientes artificiales bajo condiciones de laboratorio. Al confeccionar un medio de cultivo, la meta principal consiste
en proporcionar una mezcla equilibrada de los nutrientes requeridos a concentraciones que permitan el crecimiento
del microorganismo. Estas concentraciones deben ser las adecuadas ya que muchos nutrientes se hacen
inhibidores del crecimiento o resultan txicos al elevar su concentracin, adems aun cuando el crecimiento pueda
tener lugar en un medio concentrado, las actividades metablicas de la poblacin microbiana en crecimiento en un
momento determinado llegar a cambiar la naturaleza el medio ambiente hasta el punto de hacerse altamente
desfavorable, con lo cual la poblacin se hace fisiolgicamente anormal o bien muere. Esto puede ocurrir debido a
un cambio drstico en el pH, por acumulacin de metabolitos orgnicos txicos, o en caso de los aerobios estrictos,
por agotamiento del oxgeno.
El punto de arranque racional para la preparacin de medios es componer una base mineral que proporcione todos
los nutrientes que pueden suministrarse a cualquier organismo en forma inorgnica. Este medio base puede
suplementarse si es necesario, con una fuente de carbono, una fuente de energa una fuente de nitrgeno y
algn factor de crecimiento requerido. Estos suplementos varan de acuerdo con las propiedades nutricionales del
organismo en particular que se desea cultivar.
Medios simples. Con base a el nmero de componentes los medios se denominan simples consisten en una
mezcla bien balanceada de nutrientes en agua, con salinidad y pH controlados, sin componentes especialmente
complejos ni agentes inhibidores. Se utilizan para aislar, contar y conservar microorganismos de fcil desarrollo. A
este grupo pertenecen: el caldo nutritivo, Agar Nutritivo, Agar cuenta estndar.
Medios enriquecidos. Los medios enriquecidos se obtienen agregando a un medio simple base, componentes
ricos en nutrientes orgnicos tales como sangre, huevo, leche, extractos de vsceras o vegetales. Su aplicacin es
para microorganismos especialmente exigentes en sus demandas nutricionales: gelosa sangre para el
Streptococcus pyogenes, medio de Lowenstein para Mycobacterium tuberculosis o gelosa triptosa para Brucella
Medios sintticos. Son medios de cultivo qumicamente definidos. Un medio de cultivo sinttico es el medio ELG
para Escherichia coli (tabla 1). Esta especie puede sintetizar sus constituyentes celulares a partir de la glucosa y de
algunas sales minerales a partir de la glucosa y de algunas sales inorgnicas. La glucosa puede servir como fuente
de energa y fuente de carbono.
Tabla 1. Medio ELG
Ingredientes
G/L
Glucosa
K2HPO4
KH2PO4
MgSO4
(NH4)2SO4
Agua
5
7
2
0.08
1
1000 ml
Medios complejos. Contienen ingredientes de composicin qumica desconocida. Como ejemplo, de medio
complejo es la Gelosa sangre (Tabla 2), que aunque tiene pocos componentes, se desconoce la composicin
qumica de la infusin de carne y de la sangre que se le agrega.
20
Tabla 2. Gelosa sangre
Ingredientes
Infusin de carne
Triptosa
G/L
1000 ml
10 g
Cloruro de Sodio
Agar
5g
15g
Medios selectivos. Con base en su selectividad los medios se clasifican como selectivos y diferenciales. En un
medio inoculado con una variedad de organismos, solo aquellos que puedan crecer en l se reproducirn y todos los
dems organismos sern inhibidos. Con frecuencia se aade penicilina, estreptomicina, actidiona, azida de
sodio y otros antibiticos adecuados con el fin de evitar el desarrollo de grmenes indeseables, mientras crecen en
el medio las especies de inters, as tambin se les pueden agregar sales como taurocolato, desoxicolato,
tioglicolato y telurito de potasio entre otros. En algunos casos tambin se agregan colorantes en concentraciones
elevadas tales como cristal violeta, fucsina. Por ejemplo, el medio de Baird-Parker se utiliza para el aislamiento
selectivo y enumeracin de estafilococos coagulasa-positivos (Tabla 3).
Tabla 3 Base de Agar Baird Parker
Ingredientes
Peptona de casena
Extracto de carne
Extracto de levadura
Cloruro de Litio
Agar
Glicina
Piruvato de Sodio
pH final 6.8 +- 0.2
g/L
10.0
5.0
1.0
5.0
17.0
12.0
10.0
Usos. A este medio se le agregan telurito de potasio y emulsin de yema de huevo. Las colonias tpicas de
Staphylococcus aureus son negras, brillantes, convexas y rodeadas por colonias claras de 2 a 5 mm de dimetro
aproximadamente. Otros microorganismos que pueden desarrollarse ocasionalmente son del gnero Micrococcus
que forman colonias oscuras o negras; las levaduras que forman colonias de color castao oscuro mate.
Medios de cultivo diferenciales. La adicin de ciertos reactivos o sustancias qumicas a los medios de cultivo trae
como resultado un determinado tipo de crecimiento bacteriano o de cambios despus de la siembra e incubacin del
medio, lo cual permite diferenciar distintos tipos de bacterias. Los medios diferenciales contienen un indicador que
les permite el reconocimiento de organismos con una actividad metablica particular. Como ejemplo de medios
diferenciales se encuentra el Agar de Eosina y Azul de Metileno (EMB), por su contenido en lactosa y sacarosa
permite diferenciar a Salmonella y Shigella que no asimilan lactosa y sacarosa de otras enterobacterias que no
asimilan lactosa pero son sacarosa positivas, tales como Proteus vulgaris, Citrobacter y Aeromonas. La microflora
Gram positiva es inhibida por los colorantes de la formula (Tabla 4). Es un medio adecuado para cultivar Escherichia
coli, ya que sus colonias presentan caractersticas particulares como el brillo metlico.
Tabla 4. Agar EMB
Ingredientes
g/L
Peptona de gelatina
10.000
Lactosa
5.000
Sacarosa
5.000
Fosfato dipotsico
2.000
Eiosina
0.400
Azul de Metileno
0.065
Agar
13.500
PH final 7.2 +- 0.2
21
Medios indicadores. Estn constituidos por un medio base adicionando una sustancia especfica que permite
poner de manifiesto una determinada reaccin metablica como la fermentacin de un carbohidrato (caldo lactosa),
o la produccin de un cido orgnico, la actividad enzimtica del microorganismo (produccin de ureasa) o la
asimilacin de algn sustrato. Como ejemplo de estos medios indicadores se encuentran algunos que se mencionan
en la tabla 5.
Tabla 5. Ejemplos de medios de cultivo indicadores:
Medio
Microorganismo
Indicador
Caldo de cultivo y rojo de fenol

Fermentacin de carbohidratos
Agar con hierro y triple azcar (TSI) Organismos fermentadores de dextrosa,
lactosa, sacarosa.
Medio de movilidad con indol y
Cepas mviles, productoras de H2S
sulfuro
Rojo de metilo y Voges proskauer Organismos fermentadores de lactosa
(MR-VP)
Tubos con agar y urea
Miembros del grupo Proteus
Agar con fenilalanina
Grupo Proteus
Caldo para descarboxilacin
Diferenciacin de enterobacteriaceae
Leche tornasol
Clostridium
Caldo con nitrato
Reductores de nitrato a nitritos
Rojo fenol rojo a amarillo

rojo de fenol,
sulfato ferroso
Tiosulfato sdico
Rojo de metilo
Rojo de fenol
Cloruro frrico
Rojo de cresol
Tornasol
Nitrato de potasio
En la formulacin de un medio de cultivo deben considerarse, no solo el tipo de microorganismo, sino tambin el tipo
de muestra que se va a analizar, y el objetivo final que se persiga: aislamiento, recuento o identificacin.
2. OBJETIVO GENERAL
Preparar medios de cultivo de uso especfico.
2.1 OBJETIVOS PARTICULARES
Preparar medios sintticos, simples, diferenciales e indicadores para el cultivo de microorganismos.
3. MATERIALES Y MTODOS
Por equipo
Agar nutritivo
agar EMB
glucosa
SIM
NaCl g.r.
1 varilla de vidrio acodada
Fosfato monobsico de potasio
Sulfato de amonio
cucharas desechables
8 cajas Petri estriles
Asa bacteriolgica
Mechero
Encendedor.
Gradilla
4 Matraz Erlenmeyer.de 250 mL
Fosfato dibsico de potasio
Sulfato de magnesio
1 Matraz Erlenmeyer.de 500 mL
5 tubos de 16 X 150
4.1.- Recomendaciones generales para la preparacin de los medios de cultivo
Preparar solo los volmenes de cada medio que se va a utilizar.
Utilizar agua destilada y material de vidrio libre detergentes.
Para los medios deshidratados, guardar en su frasco y en lugares frescos, secos y protegidos de la luz,
22
Emplear recipientes con una capacidad 2 veces mayor al volumen que se va a preparar para evitar la proyeccin
en el momento de la ebullicin
Aadir un la mitad del volumen de agua para permitir la disolucin completa y despus completar el volumen total
En general los medios se disuelven hasta disolucin completa para aclararse, pero debe evitarse que se derramen.
Usar soporte universal con rejilla de tela de asbesto. NO deben calentarse a la flama directa del mechero
El pH de los medios debe ajustarse antes de la esterilizacin y con el medio a una temperatura de 25 oC. Si el
medio contiene agar debe lavarse perfectamente el electrodo del potencimetro despus de usarlo.
Es conveniente evitar el sobrecalentamiento durante la esterilizacin por calor para evitar la prdida de materiales
nutritivos y cambiar la consistencia del medio.
Antes de inocular un medio debe comprobarse la esterilidad de cada lote, incubando un 3-4% del total de placas
durante 2 das a 37oC.
Los medios de cultivo ya preparados y esterilizados deben mantenerse en refrigeracin (4oC) y protegidos de la
luz. Antes de emplearlos verificar que no exista contaminacin, precipitacin, cambio de color o de consistencia etc.
Un medio contenido en un matraz puede ser esterilizado una segunda ocasin.
4.2 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO EN TUBOS DE ENSAYE
Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad necesaria del medio.
Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua destilada.
Calentar suavemente hasta disolverlo completamente
Vaciar 3 mL de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 X 100 mm limpios, taparlos con un tapn de
algodn-gasa.
Etiquetar los tubos y colocarlos en un bote y tapar con papel Kraft. Esterilizar en autoclave a la temperatura y
tiempo que indica la etiqueta del envase (121 oC durante 15 minutos y 15 libras de presin). Dejar enfriar la
autoclave.
Colocar los tubos en una superficie inclinada y dejar que solidifiquen. Los tubos con medio semislido SIM. No se
inclinan.
Incubar dos tubos con el medio de cultivo preparado a 37C por 48 h, como testigo negativo de contaminacin
durante el proceso de preparacin de los medios de cultivo, identificados con el nombre del medio de cultivo, fecha y
equipo
4.3 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO EN CAJAS PETRI
Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad que indique el
profesor.
Colocar el medio en un matraz con el doble del volumen y adicionarle el agua necesaria. Calentar suavemente
hasta disolucin completa
Tapar el matraz con un tapn de algodn gasa y gorro de papel Kraft
Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (121 oC durante 15 min y 15
libras de presin). Dejar enfriar la autoclave y enfriar los matraces a 45C.
En condiciones aspticas transferir de 15 a 20 mL de cada medio en cajas de Petri estriles y dejar que solidifiquen
a la temperatura ambiente.
Incubar una caja de Petri con el medio de cultivo preparado equipo a 37C por 48 h, en posicin invertida, como
testigo negativo de contaminacin durante el proceso de preparacin de los medios de cultivo, identificada con el
nombre del medio de cultivo, fecha y equipo.
4.4 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO EN MATRACES
Pesar cuidadosamente la cantidad que se indica en la etiqueta del envase para preparar la cantidad que indique el
profesor.
Colocar el medio en un matraz y adicionarle el agua necesaria. Ajustar el pH
Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.
23
Tapar el matraz con tapn de algodn y papel Kraft

Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (121C durante 15 minutos y
15 libras de presin). Dejar enfriar la autoclave.
4.5 PREPARACIN DE MEDIO DE CULTIVO A PARTIR DE INGREDIENTES
Pesar cuidadosamente la cantidad de cada uno de los ingredientes que se indica en la formulacin del medio
ELG, para preparar la cantidad que indique el profesor.
Colocar un ingrediente en un matraz y adicionarle el agua necesaria hasta disolver, agregar uno a uno hasta
disolucin, ajustar el pH si lo indica la formulacin, completar con agua destilada hasta el volumen final requerido.
Tapar el matraz con tapn de algodn y papel Kraft
Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (121C durante 15 minutos y
15 libras de presin). Dejar enfriar la autoclave.
5. RESULTADOS
5.1 En una tabla, presentar los diferentes medios de cultivo preparados, indicando si fueron colocados en tubo,
cajas de petri o matraz.
5.2 En un cuadro sinptico, indicar la frmula del medio de cultivo preparado y el uso para el cual se destina. Anotar
el resultado del testigo de contaminacin.
5.3 Clasificar los medios de cultivo preparados de acuerdo a los criterios establecidos en la prctica.
Realizar la discusin con base a la composicin del medio de cultivo, el papel que desempean cada uno de los
componentes, el uso y compara con lo que se establece en la Norma Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993.
7.CUESTIONARIO
1.- Indica tres diferentes fuentes de carbono orgnicas y tres inorgnicas
2.- Indica una fuente de Nitrgeno orgnica y una inorgnica
3.- Cul es el papel del fosfato monobsico de potasio y del fosfato dibsico de potasio en un medio de cultivo?
4.- Por qu se necesita ajustar el valor del pH en los medios de cultivo?
5.- Cul es el papel de las sales biliares en algunos medios de cultivo?
6.- Buscar la formulacin del medio SIM y clasificar segn los criterios establecidos e indicar la funcin de cada uno
de los ingredientes.
8.- REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS CONSULTADAS
Atlas, R., Microbiology, Maxwell-McMillan, Co. 1998.
Koneman, Diagnstico Microbiolgico, Ed. Panamericana, 1997.
Lymch, M.J.; et al. Mtodos de laboratorio. Ed. Panamericana. 1996.
Brock, T.D. Biologa de los Microorganismos. Ed. Prentice-Hall. 1996.
Stanier, R.Y.M. Microbiologa. Ed. Prentice-Hall. 1997.
9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS CONSULTADAS
24
PRACTICA No.2d
TCNICAS MICROBIOLGICAS: AISLAMIENTO
1. INTRODUCCIN
La segunda etapa para caracterizar e identificar a los microorganismos procariotas y determinar sus necesidades
nutricionales, su respuesta al medio ambiente, actividad metablica, patogenicidad, etc., es necesario aislarlos del
medio en que se encuentran (suelo, agua contaminada, alimentos, sitios contaminados, aire, etc.), para obtener
cultivos puros o axnicos, es decir, cultivos que se originan de una sola clona y pertenecen a una sola especie.
Existen procedimientos a travs de los cuales se pueden aislar los microorganismos, entre los ms utilizados se
encuentran: la estra cruzada, las diluciones decimales (con sus variantes por vaciado en placa y extensin con
varilla de vidrio) y por la tcnica de Hungate.
El aislamiento por estra cruzada, establece un gradiente de dilucin por medio de las estras cruzadas en la
superficie de un medio slido, dando origen a colonias aisladas, con esta tcnica no se puede contar, solo nos
permite aislar y analizar la morfologa colonial (Figura 1).
Figura 1. Aislamiento por estra cruzada

El aislamiento por diluciones decimales (Figura 2), establece un gradiente de dilucin decimal en un medio
lquido, lo cual permite aislar los microorganismos en las diluciones ms altas, y para poner de manifiesto a los
microorganismos aislados se utilizan dos tcnicas: el vaciado en placa y la extensin con varilla de vidrio (Figura
3)
Fig. 2 Diluciones decimales
Fig. 3 Aislamiento por vaciado en placa

y por extensin con varilla de vidrio
La tcnica por vaciado en placa, se utiliza para obtener colonias aisladas y para contar nmero de bacterias en la
muestra. La tcnica consiste en colocar una alcuota de la dilucin de la muestra en un medio slido fundido y
mantenido a 45C, se homogeniza y se deja gelificar, posteriormente se incuba a una temperatura adecuada hasta
obtener crecimiento visible. Los microorganismos se desarrollan sobre la superficie e incluidas en el medio de
cultivo.
25
La tcnica por extensin con varilla de vidrio, se utiliza para aislar, contar y analizar morfologa colonial de las
bacterias. La tcnica consiste en colocar una alcuota de la dilucin sobre un medio de cultivo previamente
gelificado, la cual se distribuye uniformemente sobre la superficie del medio de cultivo con una esptula de vidrio
estril. Los microorganismos solo se desarrollan en la superficie del medio de cultivo.
El aislamiento por la Tcnica de Hungate, establece un gradiente de dilucin en medio de cultivo slido fundido
contenido en un tubo de Hungate y mantenido a 45C, el cual es posteriormente rotado bajo enfriamiento para que
las colonias aisladas queden embebidas en el medio de cultivo gelificado y adherido a la pared del tubo. Esta
tcnica se utiliza para aislar y contar nmero de bacterias en la muestra.
Morfologa colonial
Cuando una clula bacteriana es inoculada sobre la superficie de un medio nutritivo slido, sta comienza a
reproducirse exponencialmente; despus de formarse algunos miles o millones de clulas, se hace visible esa masa
celular, a la cual llamamos colonia. Una vez que se obtienen colonias de microorganismos, se analiza la
morfologa colonial bajo los siguientes criterios generales, Forma, tamao, color, bordes, superficie, elevacin,
opacidad, consistencia y aspecto, destacando cualquier otra caracterstica que ayude a la identificacin del
microorganismo (Figura 4)
Forma: puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide, etc.
Tamao: estimar el dimetro en mm.
Superficie: lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concntricos, etc.
Elevacin: aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umbilicada
Borde: liso, ondulado, lobulado, rizado , festoneado, filamentoso
Color: blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc.
Opacidad: transparente, opaca, translcida
Consistencia: dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa
Aspecto: hmedo, seco
Luz reflejada: mate o brillante
Luz transmitida: transparente, translcida, opaca
Figura 4. Morfologa colonial de procariotes

Cabe mencionar que tambin se analiza el crecimiento del microorganismo en medio lquido, anotando las
caractersticas de crecimiento.
2. OBJETIVO GENERAL
Aislar, contar y describir la morfologa colonial de microorganismos procariotes obtenidos de diferentes hbitats
26

Aislar microorganismos procariotes por la tcnica de estra cruzada, diluciones decimales con vaciado en placa y
extensin con varilla de vidrio.
Cuantificar los microorganismos aislados con base a los criterios establecidos en la NOM-092-SSA1-1994
Describir la morfologa colonial de los microorganismos aislados
3. MATERIAL Y REACTIVOS
Por equipo
7 pipetas estriles de 2 mL
1 matraz con 120 mL de agar cuenta estndar
- 3 placas Petri con agar nutritivo estril.
- 3 placas Petri con agar EMB estril.
- 6 placas Petri estriles
- 6 placas con agar cuenta estndar estril
- 1 matraz con 90 ml de solucin salina al 0.85% estril
-6 tubos de 16 X 150 mm con 9 mL de solucin salina al 0.85 % estril
- 3 Tubos de ensayo conteniendo agar nutritivo inclinado.
- 1 varilla de vidrio acodada
-cucharas desechables
- Asa bacteriolgica.
- Mechero
- Cerillos encendedor.
- Gradilla.
-Kit para tincin de Gram y aceite de inmersin
- Porta y cubre objetos.
- Etanol al 70 % y Etanol al 100%
Microorganismos:
Suspensin de: Escherichia coli, Bacillus subtilis.
- Suspensin mixta de bacterias
- Muestras de agua tratada
-Muestras de suelo del jardn
TCNICA DE AISLAMIENTO POR ESTRA CRUZADA
Al inicio del trabajo en el laboratorio, establecer una zona asptica entre dos mecheros encendidos sobre la
mesa de trabajo previamente desinfectada. Realizar todas las operaciones de cultivo y aislamiento bajo esta
zona asptica.
1. Siguiendo las instrucciones del profesor, incinerar al rojo vivo el asa bacteriolgica, iniciando por el filamento y
terminando en la circunferencia del asa.
2. Destapar el tubo que contiene el cultivo de E. coli y tomar el inculo con el asa estril, depositando el inculo
sobre la superficie de la placa de EMB (Agar Eosina Azul de Metileno), deslizar el asa con el inculo sobre el medio
de cultivo y hacer una serie de estras como indique el profesor (Ver esquema).
4. incinerar y enfriar el asa en el agar antes de realizar otro estriado.
5. Despus de finalizar las estras cerrar la caja, etiquetarla y colocarla en posicin invertida sobre la mesa.
6. Realizar las siembras por duplicado.
7. Etiquetar las placas con fecha, tcnica y microorganismo.
8. Incubar las bacterias a 37 C durante 24 horas.
9. Repetir el procedimiento en las placas que contienen Agar nutritivo.
10. Describir la morfologa colonial de una colonia aislada, en EMB y Agar Nutritivo
27
TCNICA DE AISLAMIENTO POR DILUCIONES DECIMALES (Tres equipos trabajan con agua y tres con
suelo)
NOTA: Es importante tomar en cuenta las siguientes consideraciones antes de realizar las diluciones.
a. Etiquetar perfectamente los tubos con la dilucin correspondiente.
b. Cada vez que se realice una dilucin, agitar perfectamente antes de tomar la alcuota correspondiente.
c. Realizar cada dilucin con una pipeta estril diferente.
d. Introducir la pipeta en su envoltura original para su esterilizacin o colocar la pipeta en un frasco con benzal.
e. Cuidar de no salirse del rea asptica para evitar alguna contaminacin.
Preparacin de diluciones
1. Colocar la balanza en la zona asptica y pesar 10 g de la muestra de suelo con la ayuda de una cuchara
previamente desinfectada con al alcohol al 70%, transferir la muestra a un matraz que contiene 90 mL de solucin
salina estril al 0.85% (Dilucin 10 -1).
2. Homogenizar y esperar a que sedimente.
3. Realizar diluciones decimales de 10-2 a 10-7. Transferir un mL de la dilucin 10-1 a un tubo que contenga 9 ml de
solucin salina 0.85 % estril y as sucesivamente hasta 10-7
4. Para la muestra de agua, transferir 10 mL de la muestra al matraz que contiene 90 mL de solucin salina al 0.85%
estril (Dilucin 10-1) y proseguir como se menciona en el numeral 3.
90 mL SS
10-1
10-2
10-3
1:10
1:100
1:1000
10 g de suelo
10 mL de agua
contaminada en
90 mL de SS estril
9 mL SS
9 mL SS
10-4
10-5
1:10 000
1:100 000
9 mL SS
9 mL SS
10-6
1:1000 000
9 mL SS
10-7
1:10 00 0000
9 mL SS
PREPARACIN DE DILUCIONES DECIMALES
a) EXTENSIN CON VARILLA DE VIDRIO

1. Con una pipeta estril de 1 mL tomar 0.1 mL de la dilucin 10-5 de la muestra (suelo o agua) y colocarla en el
centro de la superficie de una caja de Petri que contiene agar cuenta estndar gelificado.
2. Sumergir una varilla de vidrio acodada en etanol, dejar escurrir y pasarla por la flama del mechero.
28
3. Enfriar la varilla de vidrio en un extremo de la superficie de la caja con Agar y con ella extender la alcuota por
toda la superficie.
4. Una vez extendida la muestra tapar la caja Petri y colocar la varilla en el vaso con etanol
5. Permitir que seque la superficie de la caja, cerca de la flama del mechero, de la misma manera inocular la
segunda caja y repetir con las diluciones 10-6 y 10-7.
6. Etiquetar las cajas con fecha, tcnica, grupo, equipo, dilucin y nombre del microorganismo.
7. Incubar las cajas en posicin invertida a 37 C durante 24 horas.
8. Contar solamente las colonias de las cajas que se encuentren entre 25 y 250 UFC.
9. Multiplicar el nmero de unidades formadoras por el inverso de la dilucin y reportar UFC/ mL o g. Revisar la
NOM-092-SSA1-1994. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Secretaria de Salud Mxico.
TCNICA EXTENSIN CON VARILLA
b) TCNICA DE VACIADO EN PLACA

1. Con una pipeta estril tomar 1.0 mL de la dilucin 10-5 de la muestra bacteriana y colocarla en el centro de una
caja Petri vaca estril, en condiciones aspticas. Se puede utilizar la misma pipeta utilizada en la tcnica anterior.
2. Vaciar 15 ml de Agar cuenta estndar, mantenido a 45 C, homogeneizar por rotacin sobre la superficie de la
mesa, siguiendo las indicaciones del profesor.
3. Dejar enfriar el medio durante unos minutos.
4. Repetir el procedimiento con la dilucin 10-6 y 10-7 recordando que el sembrado de las diluciones se hace por
duplicado.
5. Incubar las cajas en posicin invertida a 37 C por 24 horas.
29
6. Contar solamente las colonias de las cajas que se encuentren entre 25 y 250 UFC.
7. Multiplicar el nmero de unidades formadoras por el inverso de la dilucin y reportar UFC/ mL o g. Revisar la
NOM-092-SSA1-1994. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa. Secretaria de Salud Mxico.
OBTENCIN DE COLONIAS AISLADAS
1. Seleccionar una colonia morfolgicamente distinguible y aislada para su observacin y descripcin, realizarle
tincin de Gram y observar al microscopio. La colonia aislada deber estar formada por un solo tipo de
microorganismos, homogneos microscpicamente en forma, tamao y tincin.
2. Sembrar la colonia aislada, por estra simple en un tubo de agar nutritivo e incubar en las mismas condiciones
para crecimiento de bacterias.
5.0 RESULTADOS, ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS

Describir morfologa colonial y dibujar morfologa microscpica de los aislados
Anotar las ventajas y desventajas de las tcnicas de aislamiento empleadas, medio empleado y nmero de
dilucin.
Comparar los resultados obtenidos para el suelo y el agua en los diferentes equipos, con base al nmero de
microorganismos obtenidos por gramo o mililitro de suelo.
Discutir los clculos con base a los criterios establecidos en la NOM-092-SSA-1994
6. CUESTIONARIO
A.Realizar un esquema del aislamiento de una cepa bacteriana
B.Qu es un cultivo axnico o puro?
C. Qu importancia tiene la obtencin de un cultivo puro?
D. Cul es el fundamento de la tcnica de aislamiento por estra cruzada?
E. Cul es el fundamento de la tcnica de aislamiento por vaciado en placa?
F. En qu casos se utiliza la tcnica de extensin con varilla?
G. Para qu se hacen las diluciones? Es posible sembrar una muestra en forma directa?
7.- REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS CONSULTADAS
30
PRACTICA No. 3
RUTAS METABLICAS PARA LA OBTENCIN DE ENERGA: RESPIRACIN Y FERMENTACIN
1.0 INTRODUCCION
Los estudios de clasificacin e identificacin de las bacterias pueden iniciarse con la deteccin de sus
requerimientos de Oxgeno. Las bacterias, varan considerablemente en sus requerimientos de oxgeno gaseoso.
Algunas bacterias no crecen en ausencia de oxgeno (bacterias aerobias), mientras que, otras no se desarrollan en
presencia de l (bacterias anaerobias). Otras ms se adaptan a su presencia o ausencia (bacterias anaerobias
facultativas). Otras bacterias denominadas microaeroflicas, requieren pequeas cantidades de oxgeno libre y las
bacterias aerotolerantes pueden crecer a presiones de oxgeno menores que la presin atmosfrica. El Oxgeno es
el aceptor final de electrones en la respiracin aerobia, y la enzima Citocromo oxidasa le transfiere el par
electrnico, formando agua como producto final. Por otra parte, el perxido de Hidrgeno es el producto final del
metabolismo oxidativo aerbico de los carbohidratos, si se acumula es letal para las clulas bacterianas, pero
algunos microorganismos producen la enzima catalasa que es una hemoprotena (Protena del Hierro y azufre) que
transforma al Perxido de Hidrgeno en Oxgeno y agua; ambas enzimas estn presentes en los organismos
aerobios y anaerobios facultativos. En tanto que en la respiracin anaerobia, las sales inorgnicas como el Sulfato,
Fierro, Azufre, Nitrato, Manganeso, fungen como aceptores finales de electrones.
Los microorganismos pueden asimilar los carbohidratos por va oxidativa (respiracin) en presencia de oxgeno o
por va fermentativa en ausencia de oxgeno, esta caracterstica particular de cada bacteria nos permite establecer
los criterios para su identificacin. Los productos del rompimiento de los carbohidratos por los microorganismos son
principalmente cidos orgnicos como el cido Pirvico, ac. Lctico, ac. Actico y en algunos casos, la produccin
de CO2. Los microorganismos anaerobios fermentan compuestos orgnicos por un proceso denominado fosforilacin
a nivel de sustrato y en el laboratorio se ilustra con la fermentacin de carbohidratos.
Determinacin del tipo de metabolismo oxidativo o fermentativo en el Medio OF
Las bacterias fermentadoras producen cido en los dos tubos con y sin sello de aceite mineral. Las bacterias
oxidativas presentan produccin de cido solo en el tubo sin aceite mineral. Las bacterias que no utilizan por
ninguna va el carbohidrato presente en el medio, no alteran el medio OF. La interpretacin de los resultados de los
tubos OF, se realiza de acuerdo al crecimiento y al cambio del indicador que se presenta en los tubos como se
indica en el esquema de la Figura 1.
Figura 1. Esquema de Fermentacin-Oxidacin en el medio OF

Asimilacin oxidativa o fermentativa de carbohidratos en Caldo Rojo de fenol.- En los tubos con los
carbohidratos y rojo de fenol, se determina si hay oxidacin o fermentacin de carbohidratos por cambio de color
del indicador de rojo a amarillo y produccin de gas (Figura 2)
Figura 2. Esquema para la interpretacin de la asimilacin de carbohidratos
31
Utilizacin de Citrato o Malonato como fuente de carbono y energa.

Algunas bacterias tienen la capacidad de utilizar el Citrato o el Malonato provenientes del Ciclo de Krebs, como
fuente carbono y energa, por lo que la asimilacin aerobia de estos compuestos se manifiesta por el crecimiento en
la zona de la estra.
Determinacin de la enzima Citocromo oxidasa
La enzima citocromo oxidasa, transfiere el par electrnico al reactivo p-fenilen metilen diamina, en lugar del
Oxgeno, dando como resultado un compuesto colorido.
Determinacin de la enzima catalasa
La catalasa transforma al Perxido de Hidrgeno en Oxgeno y agua, si est presente en el cultivo, se detecta la
presencia de burbujas (Oxgeno).
2.0 Objetivos
2.1 Objetivo general
Realizar la primera etapa en la identificacin de las bacterias, determinando sus requerimientos de oxgeno y el tipo
de metabolismo utilizado para la asimilacin de carbohidratos.
2.2 Objetivos particulares
Cultivar tres gneros bacterianos en presencia y ausencia de oxgeno.
Determinar el tipo de metabolismo oxidativo o fermentativo en el Medio OF
Determinar la asimilacin oxidativa o fermentativa de carbohidratos en Caldo Rojo de fenol
Determinar la fermentacin de carbohidratos en Medio VP-MR
Realizar el cultivo de bacterias en medios de cultivo conteniendo Citrato o Malonato como fuente de
carbono y energa.
Determinar la presencia de Citocromo oxidasa y Catalasa en los cultivos bacterianos
3.0 MATERIALES Y REACTIVOS POR EQUIPO
3.1 Cepas bacterianas
Pseudomonas aeruginosa.
Escherichia coli
Proteus sp
Cepa aislada en la prctica anterior
3.2 Medios de cultivo (Por alumno)
Cada Alumno trabajar una de las cepas de coleccin y su cepa aislada en la prctica anterior:
4 Tubos con 4 mL de Medio OF con glucosa como fuente de carbono
4 Tubos con 4 mL de Medio OF con lactosa como fuente de carbono
4 Tubos con 4 mL de Medio OF con Sacarosa como fuente de carbono
2 Tubos con 8 mL de caldo rojo de fenol, campana de Durham y Glucosa
2 Tubos con 8 mL de caldo rojo de fenol, campana de Durham y Lactosa
2 Tubos con 8 mL de caldo rojo de fenol, campana de Durham y sacarosa
2 tubos con Agar TSI
4 Tubos con 3 mL de Medio MR-VP
2 Tubos con 3 mL de Citrato de Simmmons
2Tubos con 3 mL de Caldo Malonato
1 Papel impregnado con p-feniletilendiamina
Solucin de Perxido de Hidrgeno al 3%
1 Frasco con aceite mineral estril.
32
Alfa naftol y KOH

4.0 DESARROLLO EXPERIMENTAL
Etiquetar cada tubo con el nombre de la Cepa bacteriana, Nombre del alumno, grupo y fecha.
Realizar una suspensin de la cepa pura en un tubo que contenga 5 mL de solucin salina estril.
Inocular en este orden las pruebas bioqumicas.
Incubar a 35 C durante 24 horas e incubar una serie de medios de cultivo sin inocular para observar las
reacciones por cambios de coloracin
MEDIOS DE CULTIVO
FORMA DE INOCULAR
tubos con Caldo rojo fenol glucosa
tubos con Caldo rojo fenol lactosa
tubos con Caldo rojo fenol sacarosa
2 tubos con 4 mL de Medio OF con glucosa
2 tubos con 4 mL de Medio OF con lactosa
2 tubos con 4 mL de Medio OF con Sacarosa
2 tubos con Agar TSI
Medio MR-VP (Rojo de metilo)
Medio MR-VP (Voges-Proskauer
Utilizacin de citrato (Citrato de Simmmons)
Utilizacin de malonato (Caldo Malonato)
Prueba de citocromo oxidasa
Prueba de la catalasa
Por asada
Por asada
Por asada
Por picadura y a un tubo agregar 0.5 mL de aceite mineral
Por asada y picadura
Por asada
Por asada, Incubar 48 horas
Por estra
Por asada
Por asada. En una tira de papel impregnada del reactivo de
oxidasa, colocar una asada de cada cultivo, por separado.
Por asada
4.5 Esquemas para inocular los diferentes medios de cultivo
Determinacin del metabolismo oxidtivo/fermentativo en medio Hugf y Leifson
33
Utilizacin de Citrato como nica fuente de carbono
34
Utilizacin de Malonato como nica fuente de carbono
Presencia de la enzima Citocromo- oxidasa.
Presencia de la enzima catalasa
35
5.0 RESULTADOS
Leer las pruebas bioqumicas tomando en cuenta las indicaciones de la siguiente tabla.
FERMENTACIN Y RESPIRACIN
MEDIOS DE
CULTIVO
2 tubos con Caldo
rojo fenol glucosa
2 tubos con Caldo
rojo fenol lactosa
2 tubos con Caldo
rojo fenol sacarosa
2 tubos con 4 ml de
Medio OF con
glucosa
FORMA DE LEER
RESULTADOS
+Positiva: el medio se torna amarillo con la produccin de

gas, la campana est llena de gas
- Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.
+ Positiva: el medio se torna amarillo con la produccin de
+ Positiva: el medio se torna amarillo con la produccin de
TUBO SIN SELLO DE ACEITE
Oxidativo: + positivo cidoamarillo, - negativo verde, sin
cambios
Fermentativo: + positivo cidoamarillo, - negativo verde,
sin cambios
Sacarolitico: + positivo cidoamarillo, - negativo verde, sin
cambios.
TUBO CON SELLO DE ACEITE
Oxidativo: + positivo cidoamarillo, - negativo verde, sin
cambios
Fermentativo: + positivo acidoamarillo, - negativo verde,
sin cambios
Sacarolitico: + positivo acidoamarillo, - negativo verde, sin
cambios.
2 tubos con 4 mL de Lo mismo que el prrafo anterior

Medio OF con
lactosa
2 tubos con 4 mL de Lo mismo que el prrafo anterior
Medio OF con
Sacarosa
2 tubos con Agar TSI Fermentacin de Lactosa y Sacarosa, Utilizacin de glucosa,
produccin de cido sulfhdrico
Medio MR-VP (Rojo Agregar 2 gotas de rojo de metilo, agitar ligeramente
de metilo)
+ Positiva: Color rojo en la superficie del medio de cultivo
(Produccin de acetil-metil-carbinol).
-Negativa: No hay cambio en el color
Medio MR-VP
agregar 6 gotas de naftol y 2 gotas de KOH, sin agitar.
(Voges-Proskauer
+Positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo.
- Negativa: El cultivo no cambia de color
Utilizacin de citrato + Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a
36
de sodio
(Citrato de
Simmmons)
azul intenso
- Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color.
Utilizacin de
malonato de sodio
(Caldo Malonato)
Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinizacin (color

azul).
Negativa: No hay desarrollo
Presencia de
citocromo oxidasa
Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un pedazo de

papel filtro impregnada con el reactivo (N.N.N.N-tetrametil-pfenilendiamina).
+ Positiva: aparicin de un color azul violeta.
- Negativa: No hay cambio de color.
Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un
portaobjetos que contiene 2 gotas de perxido de hidrogeno y
observar.
+ Positiva: Presencia de burbujas de oxgeno.
- Negativa: Ausencia de burbujas de oxgeno.
Presencia de
catalasa
6.0 ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS

1.- Discute e ilustra con las rutas metablicas que utilizan los microorganismos para la respiracin o fermentacin de
carbohidratos.
Discutir la importancia de las pruebas bioqumicas realizadas para la identificacin de microorganismos as como el
uso de las tablas para identificar a los microorganismos.
2.- Que Indicadores se utilizan en los medios utilizados en las pruebas de esta prctica y en que se fundamenta
cada prueba de fermentacin y enzimtica?
3.- Que otras enzimas utilizan los microorganismos que utilizan la respiracin aerobia?
4.- Que otras enzimas utilizan los microorganismos que utilizan la respiracin anaerobia durante la reduccin
desasimilatoria de sulfatos y nitratos?
5.- De acuerdo a los resultados obtenidos y comparando con una tabla metablica o bioqumica que tipo de
metabolismo tienen cada uno de los microorganismos utilizados en esta prctica?
6. Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al anlisis y discusin de stos, a la bibliografa
consultada y a los objetivos de la prctica.
7.0 CUESTIONARIO
1. Qu pasara si las pruebas bioqumicas se dejaran ms de 24 horas?
2. Por qu siempre que se identifica una bacteria se pone una serie de pruebas bioqumicas sin inocular?
3. Explicar por qu en las pruebas de fermentacin de azcares en tubos con campana de Durham se emplea un
indicador de pH, cual es el indicador y cul es su rango de sensibilidad.
4. Qu otros azcares se pueden utilizar para la fermentacin de azcares?
5. Cul es el fundamento de las pruebas de utilizacin de citrato y malonato y cual es el indicador de pH que se
emplea en estas pruebas bioqumicas?
6. Cmo se determina el metabolismo oxidativo y/o fermentativo de la glucosa?
7. Cul es el fundamento de la prueba de citocromo oxidasa?
8. Cul es el fundamento de la prueba de la catalasa?
8.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS DE LA PRCTICA
Allen S., Dowell V.R., Sommers H. M. (1989). Diagnstico Microbiolgico. Texto y Atlas color. Editorial Mdica
Panamericana, Mxico D.F., 533 pgs.
37
Koneman. E: W Allen, S.D., Dowell, VR., Sommers, H.M. Diagnstico Microbiolgico. Traduccin: Wasserman. A.
V. Editorial Mdica Panamericana. Mxico. 1984.
Madigan M.T., Martinko J.M., Parker J. (2006). Brock Biologa de los microorganismos. Editorial Pearson Prentice
Hall, 10th edicin. 1025 pgs.wa
Mac Faddin. J.F., Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. Traduccin
Lorenzo, I., Editorial Mdica Panamericana, Mxico. 1984.
MacFaddin, Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias. Ed. Panamericana, S.A. 1997.
Seeley H.W. , Vandemark P.J., Lee J.J. ( 2003). Microbes in action. Laboratory manual of Microbiology. Ed. W. H.
Freeman and Co. New York. 450 pgs.
9.0 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS CONSULTADAS
Bibliografa.- Redacta la bibliografa que consultes de acuerdo a lo establecido en la Prctica No. 1
38
PRCTICA No. 4
CICLOS BIOGEOQUMICOS, (Ciclo del Nitrgeno)
1.0 INTRODUCCIN
El nitrgeno es un constituyente esencial de todos los seres vivos. Es el principal componente de las protenas y los
cidos nucleicos de ah su gran importancia.
La conversin y circulacin de nitrgeno en la biosfera constituyen el segundo proceso ms importante despus de
las transformaciones del carbono dentro de los ciclos biogeoqumicos. En el ciclo del nitrgeno, ste sufre una serie
de transformaciones que involucran compuestos orgnicos e inorgnicos.
Las reacciones principales es este ciclo son las siguientes:
El nitrgeno sufre una serie de transformaciones que involucran compuestos orgnicos e inorgnicos. Estas
reacciones constituyen un ciclo siendo sus procesos principales:
1. Protelisis.- Este proceso puede llegar hasta la formacin de amonio (mineralizacin), consiste en la degradacin
de protenas, liberando generalmente aminocidos o pequeos pptidos.
Estos procesos bioqumicos en los cuales el proceso de degradacin de proteinas es incompleto permite a otros
organismos aprovechar los intermediarios para su propio metabolismo. Muchas bacterias llevan a cabo este proceso
favoreciendo la eliminacin de detritus.
2. Amonificacin (mineralizacin).- El nitrgeno orgnico es reincorporado al ciclo a partir de la materia orgnica en
descomposicin produciendo amonio, CO2 y agua.
3. Nitrificacin.- La oxidacin biolgica del amonio para formar nitritos y nitratos se denomina nitrificacin y las
bacterias responsables de este proceso reciben el nombre de microorganismos nitrificantes. stos, pueden dividirse
en dos grupos principales: Nitrosomonas que es caracterstico de las bacterias que oxidan el amoniaco a nitrito
(nitritacin) y Nitrobacter que representa a las bacterias que oxidan el nitrito a nitrato (nitratacin). Ambos grupos
de bacterias son quimiolitotrficas.
4. Desnitrificacin.- La produccin de nitrgeno gaseoso como resultado de la accin microbiolgica sobre
compuestos de nitrgeno se conoce como desnitrificacin. La accin de los microorganismos es tpicamente sobre
los nitratos y los nitritos, siendo los productos finales de la reaccin: nitrgeno molecular (N2), xido nitroso y
ocasionalmente xido ntrico.
Especies de los gneros Pseudomonas, Achromobacter, Bacillus y Micrococcus son las bacterias desnitrificantes
ms activas, son comnmente aerobias pero estn adaptadas a utilizar nitrato o nitrito en ambientes con baja o nula
presencia de oxgeno libre. El nitrgeno molecular es liberado y llega a formar parte de la atmsfera. Este proceso
equivale a una prdida neta de nitrgeno biolgico de los suelos y aguas del mundo.
5. Fijacin.- La fijacin de nitrgeno es el proceso que indemniza la prdida neta contrada por la desnitrificacin; es
el proceso de activar el nitrgeno del aire que es inerte (N2) y transformarlo en asimilable (NH3). La capacidad para
fijar nitrgeno se halla limitada a los microorganismos procariontes. Desde un punto de vista ecolgico los fijadores
de nitrgeno ms importantes son aquellos que lo fijan en asociacin con plantas. Sin embargo las bacterias de vida
libre realizan una importante aportacin especialmente en suelos pobres o sin abonar. Muchas cianobacterias fijan
nitrgeno que pueden ser la principal fuente de entrada de nitrgeno en diferentes ecosistemas (tundra, ocanos,
etctera).
2.0OBJETIVOS
2.1OBJETIVO GENERAL
2.2.1Describir el ciclo del nitrgeno y el papel de los microorganismos en el proceso de la fijacin de nitrgeno.
2.2.2 Analizar el proceso de la fijacin de nitrgeno que realizan los microorganismos de la muestra.
2.2.3 Distinguir la morfologa colonial y microscpica de las colonias desarrolladas.
39
3.0 MATERIALES Y REACTIVOS

3.1 MATERIAL BIOLGICO
Muestra de suelo rizosfrico (frijol, haba, chcharo, lenteja, trbol u otra leguminosa) o muestra de agua (residual).
3.2 MATERIALES Y EQUIPO
1Varilla de vidrio acodada (varilla de Driglasky)
5Pipetas serolgica de 1 mL Estril
1Pipeta serolgica de 10 mL Estril
1Caja de Petri de 20 x 100 mm Limpia
3.4 REACTIVOS, SOLUCIONES Y MEDIOS DE CULTIVO
1 Frasco de dilucin con 90 mL de solucin salina al 0.85% de NaCl estril .
4Tubos de ensaye de 16 x 150 mm con tapn de rosca con 9 mL de solucin salina al 0.85% estril.
5Tubos de ensaye de 16 x 150 mm con tapn de rosca con 4.5 mL de medio para nitrificadores fase I.
5 Tubos de ensaye de 16 x 150 mm con tapn de rosca con 4.5 mL de medio para nitrificadores fase II.
5Tubos de ensaye de 16 x 150 mm con tapn de rosca con 4.5 mL de medio para desnitrificadotes y campana de
Durham.
6 Cajas de Petri con agar leche.
6 Caja de Petri con agar gelatina.
1Frasco de Reactivo de Griess A.
1Frasco de Reactivo de Griess B.
1Matraz Erlenmeyer de 125 mL con 25 mL de alcohol etlico.
1Frasco con HgCl2 (concentrado).
A) PREPARACIN DE DILUCIONES
Pesar y colocar 10 g de suelo a una botella de dilucin conteniendo 90 mL de solucin salina fisiolgica estril
(NaCl 0.85%) quedando una dilucin de 10-1, tapar la botella y agitar vigorosamente.
Tomar 1 mL de la dilucin anterior y transferir a un tubo con 9 mL de solucin salina estril (dilucin 10-2), de sta
tomar la misma cantidad y transferir a un segundo tubo (dilucin 10-3) y as sucesivamente hasta obtener una
dilucin de
10-5. Cuidar de homogeneizar perfectamente la solucin antes de cada transferencia.
B) PROTEOLISIS
Tomar alcuotas de 0.1 mL de las diluciones 10-2, 10-3 y 10-4 y colocarlas en cajas de agar gelatina y de agar leche.
Distribuir uniformemente en la placa usando una varilla de vidrio acodada estril.
Incubar a 28 C durante 48 h. En las cajas con agar leche, contar aquellas colonias que tienen un halo transparente,
en las cajas de agar gelatina agregar unas gotas de HgCl2 y contar aquellas colonias que presenten tambin un
halo transparente.
C) AMONIFICACIN
Inocular cada tubo que contiene medio de Stuart con 0.5 mL de las diluciones 10-2 a 10-4 (tres tubos por dilucin).
Incubar a 28 C durante 7 das. Incluir un tubo no inoculado como testigo.
Evaluar el proceso de amonificacin a los 8 das; registrando como positivos los tubos que cambiaron el color del
medio de rojo a rosa intenso.
40
D) NITRIFICACIN
FASE I (NITRITACIN)
Inocular a cada tubo conteniendo medio inorgnico con amonio como fuente de nitrgeno (nitritacin) con 0.5 mL
de las diluciones 10-4 a 10-5 (dos tubos por dilucin). Incubar a 28 C durante 14-21 das. Incluir un tubo no inoculado
como testigo.
Despus de la incubacin, agregar cinco gotas de cada uno de los reactivos de Griess a cada tubo a probar. Un
color rosa intenso o rojo, indica la presencia de nitritos. Si el medio no desarrolla color indica que an falta tiempo
de incubacin para que el proceso se lleve a cabo, o bien, que la reaccin ha llegado hasta nitratos.
A los tubos que dieron negativo para nitritos, agregar granalla de zinc. Si se desarrolla un color rojo el tubo ser
positivo para la nitritacin. Slo hacer esta ltima prueba en los tubos con medio para nitritacin
FASE II (NITRATACIN)
Inocular a cada tubo conteniendo medio inorgnico con nitrito como fuente de nitrgeno (nitratacin) con 0.5 mL de
las diluciones 10-4 a 10-5 (dos tubos por dilucin). Incubar a 28 C durante 14-21 das. Incluir un tubo no inoculado
como testigo.
Despus del perodo de incubacin, agregar cinco gotas de cada uno de los reactivos de Griess a cada tubo a
probar. La prueba es positiva para los tubos que no desarrolle color o la reaccin sea dbil. En el tubo testigo se
debe desarrollar un color rojo o rosa intenso.
E) DESNITRIFICACIN
Inocular a cada tubo conteniendo medio para desnitrificadores con 0.5 mL de las diluciones 10-4 a 10-5 (dos tubos
por dilucin). Incubar a 28 C durante 7 das. Incluir un tubo no inoculado como testigo.
Registrar como lectura positiva cuando observe produccin de gas en la campana de Durham.
F) FIJACIN
Hacer un frotis de las bacterias fijadoras de nitrgeno a partir de un ndulo radical de frijol, haba, trbol, alfalfa o de
otra leguminosa.
G) MORFOLOGA MICROSCPICA
Teir los frotis anteriores por la Tcnica de Gram.
Observar al microscopio con el objetivo de inmersin y describir la morfologa microscpica.
5.0 RESULTADOS
5.1Registrar los resultados obtenidos en las tablas 4.1 y 4.2
5.2 Con los resultados obtenidos determinar las UFC/g mL de microorganismos proteolticos y amonificadores.
Tabla 5.1 Nmero de microorganismos representantes de los procesos del Ciclo del Nitrgeno (Cuenta en Placa).
PROCESO
DILUCIN
UFC/g (Base Seca)
CON LECHE
PROTEOLISIS
CON GELATINA
Tabla 5.2 Nmero de microorganismos representantes de los procesos del Ciclo del Nitrgeno.
PROCESO
TUBOS POSITIVOS POR
Ufc/g
DILUCIN
Amonificacin
Nitrificacin
Nitritacin
Nitratacin
Desnitrificacin
41
Dibujar los microorganismos fijadores de nitrgeno observados. Indicando la amplificacin a la que se hicieron las
observaciones.
Para cada una de las fases del Ciclo del Nitrgeno d un ejemplo de un microorganismo que participe en ella.
De acuerdo con la fuente de nitrgeno empleada en cada proceso escribir las reacciones que se llevan a cabo y
analizar. Discutir sobre las implicaciones ecolgicas que representan sus resultados. Elaborar las conclusiones con
base a los resultados obtenidos, al anlisis y discusin de stos, a la bibliografa consultada y a los objetivos de la
prctica.
7.0 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS DE LA PRCTICA
Atlas R. M. Bartha, R. Ecologa Microbiana y Microbiologa Ambiental. 4. Edicin, Addison Wesley. 2002. 130 Pgs.
Madigan, Martinko, Parker. Brock Biology of the microorganims. 10th. edition, Prentice may, 2005. 892 Pgs.
Schlesinger W.H., Biogeoqumica. Editorial Ariel S.A. Barcelona. 2000. 577 Pgs.
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS CONSULTADAS
Redacta la bibliografa que consultes de acuerdo a lo establecido en la Prctica No. 1
42
PRACTICA No.5a
CRECIMIENTO MICROBIANO
1.0 INTRODUCCIN
Al hablar de crecimiento microbiano nos referimos al incremento del nmero de clulas, es decir el crecimiento
poblacional constitudo por millones de clulas.
Al conocer las condiciones para el crecimiento microbiano, podemos predecir la rapidez con que crecern estos en
distintas situaciones y determinan la forma de controlar su crecimiento, estos requerimientos pueden ser fsicos y
qumicos. Los aspectos fsicos incluyen la temperatura, el pH y la presin osmtica y entre los requerimientos
qumicos estn el agua, las fuentes de carbono y nitrgeno, las sustancias minerales, el oxgeno y los factores
orgnicos de crecimiento.
Las bacterias se reproducen generalmente por fisin binaria, una divisin celular da lugar a dos clulas, la divisin
de estas clulas produce cuatro y as sucesivamente.
El tiempo necesario para que una clula se divida y por consiguiente para que su poblacin se duplique, es lo que
se llama tiempo de generacin o tiempo de duplicacin, puesto que, para los organismos unicelulares; cada
duplicacin constituye una nueva generacin, vara considerablemente entre los diferentes microorganismos. La
mayora de las bacterias tienen un tiempo de generacin de una a tres horas.
Hay una serie de mtodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos mtodos miden el nmero de clulas, otros
la masa total de la poblacin. Las medidas de poblacin se refieren normalmente al nmero de clulas que hay en
un mililitro de lquido o en gramo de material slido. Los mtodos de cuantificacin estn basados en mediciones
directas o indirectas de muestras muy pequeas, despus se determina mediante clculos el tamao de la
poblacin total.
Los mtodos recomendados para medir la poblacin son:
Recuento en placa
Diluciones seriadas.
Siembra por vaciado en placa.
Siembra por extensin con varilla.
Filtracin.
Mtodo del nmero ms probable.
Recuento directo al microscopio (cmara de Neubauer).
Hay otros 3 mtodos llamados indirectos:
Turbidimetra.
Actividad metablica.
Peso seco.
Es importante diferenciar entre el crecimiento de las clulas individuales y el crecimiento de poblaciones de clulas
(proliferacin). El crecimiento de una clula es el aumento en su tamao y peso y generalmente es la antesala de la
divisin celular. Por otra parte, la proliferacin es el aumento del nmero de clulas a consecuencia del crecimiento
y la divisin celulares.
Una vez que se proveen de nutrientes necesarios al microorganismo, la clula empieza a crecer y/o a producir
algunos metabolitos.
Fases del crecimiento
En un cultivo microbiano todas las partes estn sujetas a las mismas condiciones de temperatura, pH, concentracin
de nutrientes, en la figura 1, se indican diferentes fases que ocurren en un cultivo, en donde se refleja los cambios
en la biomasa con respecto al tiempo. En cada una de las fases del crecimiento microbiano ocurren cambios en la
poblacin, mismos que determinan la forma de la curva de crecimiento.
I. Fase lag
Es un perodo de adaptacin, cuando un cultivo de microorganismos es llevado de un ambiente a otro. Los
microorganismos sufren una reorganizacin tanto en su velocidad de crecimiento como en sus constituyentes
macromoleculares. Durante esta etapa la masa celular puede cambiar sin cambiar el nmero de clulas.
43
II. Fase exponencial

Es un perodo de balance o de estado estacionario en el crecimiento, durante el cual la velocidad especfica de
crecimiento es constante. La composicin qumica del medio de cultivo est cambiando debido a que los nutrientes
se estn consumiendo y productos metablicos son producidos.
III. Fase estacionaria
Los nutrientes se agotan y los productos txicos se acumulan. La masa total puede permanecer constante pero el
nmero de clulas puede descender. La tasa de crecimiento es igual a la tasa de muerte.
IV. Fase de declinacin o muerte
La tasa de muerte es mayor que la tasa de crecimiento. Los nutrientes se agotan y se acumulan productos txicos
Fig.1 Fases del crecimiento microbiano.

Parmetros de la curva de crecimiento
Si se sigue el crecimiento de un cultivo en lote a travs de la multiplicacin de la masa, nos interesaran tres
parmetros que son la produccin, la tasa de crecimiento y el periodo de latencia.
La produccin es la diferencia entre la masa bacteriana inicial y la mxima:
X = Xmax- X0
La tasa de crecimiento exponencial es una medida de la velocidad del crecimiento celular (velocidad especfica de
crecimiento celular) se designa con la letra griega en la fase exponencial del crecimiento. Se calcula a partir de las
densidades bacterianas X0 y Xt en los tiempos t0 y t, en la fase de crecimiento exponencial segn
= ln Xt ln X0
t t0
El tiempo de duplicacin es td = ln 2 /
Los mtodos que vamos a utilizar en el laboratorio de tcnicas microbiolgicas es el de cuenta viable por extensin
con varilla, y por turbidimetra que es un mtodo indirecto que mide la densidad de una suspensin por su extincin,
en algunas ocasiones se utiliza el nefelmetro.
2.0 OBJETIVOS
2.1 Objetivo General
El alumno aplicar las tcnicas ms utilizadas para el recuento de microorganismos para determinar el crecimiento
microbiano y algunos parmetros matemticos que lo definen.
2.2 Objetivos Especficos
2.2.1 El alumno llevar a cabo el seguimiento de un cultivo sumergido con y sin agitacin a nivel matraz de
Escherichia coli
2.2.2 El alumno cuantificar el nmero de microorganismos viables a travs del recuento por diluciones y vaciado en
placa como unidades formadoras de colonias (UFC) a diferentes intervalos de tiempo.
2.2.3 El alumno estimar el crecimiento microbiano por la tcnica de turbidimetra y comparacin con el nefelmetro
de McFarland.
44
3.0 MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1 MATERIAL
Por cintica (para una seccin del laboratorio):
1matraz nefelomtrico con 50 mL de caldo nutritivo estril (matraz semilla para inocular)
10 Matraces de 125mL con 25 mL de caldo nutritivo estril (matraces de crecimiento)
1 matraz de 1 L con 600 mL de agar cuenta estndar (para el vaciado en placa)
1 juego de nefelmetro de Mac Farland
2 celdas y un portaceldas para espectrofotmetro
120 tubos de 16 x 150 mm con 9 mL de solucin salina (para las diluciones)
Pipetas de 2,5 y 10 ml estriles
40 Cajas de Petri estriles (para el vaciado en placa)
3.2 REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
NaCI peptona
Caldo nutritivo
Agar cuenta estndar
3.3 EQUIPO
Espectrofotmetro
Autoclave
Horno
Incubadora a 37 C
Contador de colonias
3.4 CEPAS:
Cepa de Escherichia coli
PRIMERA SESIN
4.1 PREPARACIN DE MATRAZ SEMILLA
4.1.1 Inocular en condiciones de esterilidad un matraz nefelomtrico conteniendo 50 mL de caldo nutritivo estril con
2.5 mL de una suspensin de Escherichia coli ajustado al tubo 3 del nefelmetro de Mac Farland (aproximadamente
6
3x10 de clulas de E. coli).

Inocular los matraces de cintica con esta suspensin.
NOTAS
A.- El da de la cintica tomar en condiciones de esterilidad 3 mL y medir la turbidez en el espectrofotmetro.
B.- De lo que quede en la pipeta realizar una tincin de Gram para verificar la pureza de nuestro matraz semilla.
C.- Enjuagar una celda espectrofotomtrica con benzal y luego en condiciones de esterilidad enjuagarla con alcohol,
ahora con una pipeta estril tomar 3 mL de caldo nutritivo del matraz de cintica y colocarlo en la celda
espectrofotomtrica y colocarle parafilm (este es el blanco para ajustar el espectro y poder leer cada muestra).
4.2 INOCULACIN DE MATRACES DE CINTICA
4.2.1 Homogeneizar la suspensin microbiana del matraz semilla y tomar una muestra de 2.5 mL de esta
suspensin en condiciones de esterilidad e inocular el mismo volumen a 10 matraces (de 125 mL) con 25 mL de
caldo nutritivo estril (etiquetados previamente desde t0 hasta t9 para la cintica y homogeneizarlos nuevamente.
4.2.2 Cada uno de los matraces corresponder a un tiempo de cintica de 90 minutos, el primer matraz (tiempo
cero) se separa de los dems para procesar como se indica en el punto 4.4.2, los dems matraces se colocan en
agitacin aproximadamente a 120 rpm y se retirarn de la agitadora en cada muestreo para tratarlos como el primer
matraz.
45
4.2.3 Despus de retirar cada 90 minutos los matraces correspondientes y tratarlos como en el punto 4.4.2 se
guardan en refrigeracin para continuar en la siguiente sesin con el tratamiento de las muestras para la
determinacin de cuenta viable y en UFC/mL.
4.3 MUESTREO PARA DETERMINACIN DE TURBIDIMETRA Y RETIRO DE MATRACES DE CINTICA
4.3.1 Con una pipeta de 5 mL tomar inmediatamente la primera muestra de 3 mL en condiciones aspticas, sta
ser la muestra de tiempo cero (t0), se ocupa para la tcnica de turbidimetra. Despus colocar el matraz en
refrigeracin para su posterior tratamiento de cuenta viable.
4.3.2. Cada hora, o segn los tiempos establecidos, en condiciones de esterilidad se retiran los matraces
correspondintes y se toma una muestra de 3 mL para determinar la absorbancia por turbidimetra. Recuerda que
inmediatamente despus de tomar la muestra debes colocar el matraz en refrigeracin.
4.4 DETERMINACIN DEL CRECIMIENTO POR TURBIDIMETRIA
Tiempo
t0
Dilucin 10-5,
10-6
t1
t2
t3
t4
t5
t6
t7
t8
t9
t10
10-6,
10-7
10-7,
10-8
10-8,
10-9
10-9,
10-10
10-11,
10-12
10-12,
10-13
10-13,
10-14
10-14,
10-15
10-15,
10-16
10-15,
10-16
4.4.1 Prender el espectrofotmetro con el paso de luz bloqueado y ajustar a 100% de transmitancia y cero de
absorbancia con la celda que contiene el caldo nutritivo (blanco) a una longitud de onda de 540 nanmetros (seguir
indicaciones y recomendaciones de uso por los profesores).
4.4.2 Tomar 3 mL de muestra de cada una de los matraces desde el tiempo cero hasta el tiempo final en
condiciones de esterilidad y colocarla en la celda espectrofotomtrica. Tapar la celda con parafilm, y leer en el
espectrofotmetro para registrar la absorbancia; esta lectura corresponde a la turbidimetra adquirida por aparicin
de clulas a lo largo de la cintica.
4.4.3 Despus de obtener la lectura desecha el contenido en benzal, y enjuaga la celda con benzal, para
posteriormente enjuagarlo con agua, junto al espectro tenemos los frascos de desecho.
No olvidar colocar los matraces en refrigeracin para continuar con la tcnica de recuento de colonias en la
siguiente sesin.
SEGUNDA SESIN
4.5 DILUCIONES PARA REDUCCIN DE CARGA MICROBIANA
4.5.1 Sacar de refrigeracin los matraces de la cintica y homogenizar cada uno antes de abrirlos en condiciones
aspticas
4.5.2 Tomar un mililitro del matraz de cintica, bajo condiciones aspticas y pasarlo a un tubo que contenga 9 mL
-1
de solucin salina fisiolgica, para realizar la dilucin 10 . Mezclar el tubo, tomar un mililitro y colcarlo en otro tubo
-2
con 9 mL de solucin salina para obtener la dilucin 10 .

4.5.3 El nmero de diluciones que se realicen depender del crecimiento que se encuentre por turbidimetra, si la
-6
-7
turbidez alcanza una absorbancia de 0.2, entonces realizar hasta las diluciones 10 y 10 . Conforme aumente el
nmero de microorganismos aumenta el nmero de diluciones, recordemos que debemos tener un intervalo de
conteo.
4.5.4 Se sugiere seguir la siguiente tabla llegando a las correspondientes diluciones para cada tiempo:
Tabla1. Diluciones a realizar para los diferentes tiempos de la cintica microbiana
4.6 DETERMINACIN DE CUENTA VIABLE POR VACIADO EN PLACA
4.6.1 De las ltimas 2 diluciones realizada a cada tiempo tomar 1 mL y colocarlo en una caja Petri estril
previamente etiquetada, (tcnica, dilucin, equipo y tiempo).
46
4.6.2 Adicionar aproximadamente 15 mL de agar cuenta estndar a una temperatura de 45 C, recordar las
recomendaciones de la tcnica de vaciado en placa.
4.6.3 Homogeneizar por rotacin en la superficie de la mesa y dejar enfriar hasta que solidifique el agar e incubar a
37 C durante 24 horas.
4.6.4 Contar las colonias de cada placa, considerando nicamente las placas que contengan entre 25 y 250
colonias.
4.6.5 Calcula el nmero de bacterias viables por mL de cultivo, multiplicando por el inverso de la dilucin.
5.0 RESULTADOS
5.1 Turbidimetra: anota los resultados obtenidos de lecturas de absorbancia en los tiempos correspondientes.
MUESTRA TIEMPO (min) ABSORBANCIA (nm)
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
5.2 Cuenta viable por vaciado en placa: Anota el nmero de colonias que se desarrollaron en las cajas petri con
agar cuenta estndar.
MUESTRA TIEMPO (min) DILUCIN No. de UFC/mL
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
Anota el nmero de clulas totales que se contabilizaron en cada uno de los tiempos de la cintica.
Con los resultados obtenidos del mtodo de cuenta viable determina el nmero de unidades formadoras de
colonias en los 25 mL del medio de cultivo.
47
Construye una grfica del nmero de UFC/mL vs tiempo, sealando en la curva las diferentes zonas de
crecimiento.
Construye una grfica de Absorbancia vs Tiempo (horas).
Construye una grfica del ln del nmero de UFC/mL vs tiempo (horas).
Determina la velocidad especfica de crecimiento mxima.
Calcula el tiempo de generacin de la cepa estudiada.
6.1 Discute las ventajas y desventajas de los mtodos empleados.
6.2 Analiza y discute sobre la base de lo anterior y a la investigacin bibliogrfica realizada, los resultados obtenidos
en esta prctica.
6.3 Discute la conveniencia o no de construir una curva de calibracin con los resultados de turbidimetra y de
cuenta viable para un microorganismo dado, de ser conveniente explica para qu podr servir.
Elabora las conclusiones sobre la base de los resultados obtenidos, al anlisis y discusin de estos, a la bibliografa
consultada y a los objetivos de la prctica.
7.0 CUESTIONARIO
Es posible diferenciar clulas muertas de las vivas en todos los mtodos utilizados?
Define el trmino crecimiento microbiano
Define el trmino Velocidad Especfica de Crecimiento
Menciona los factores de que depende la fase de muerte
Explica fisiolgicamente qu sucede en la fase lag.
Por qu es importante la cintica microbiana en la ingeniera ambiental?
8.0 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS DE LA PRCTICA
Atlas, R. W. 1988. Microbiology. Second edition. Mc. Millan Public, U. K. 807 pg.
Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. 1997. Biologa de los Microorganismos. Octava edicin. Prentice Hall, Espaa.
956 pg.
Moat, A. G., J. W. Foster, M. P. Spector. 2002. Microbial Phisiology. Fourth edition. Wiley-Liss, USA. 715 pg.
9.0 REFERENCIAS BIBLIOGRAFCAS CONSULTADAS
Enlistar las referencias bibliogrficas como se te indica en la prctica 1.
48
PRCTICA No. 5b
FACTORES AMBIENTALES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO MICROBIANO
1.0 INTRODUCCIN
El crecimiento microbiano se afecta por diferentes factores fsicos como la Temperatura, Desecacin, Radiaciones,
Ondas sonoras, Presin hidrosttica, Presin osmtica, pH. De igual forma agentes qumicos como los
desinfectantes, antispticos, quimioterpicos, antibiticos, metales pesados y los Halogenuros, tienen efecto letal
sobre la mayora de los microorganismos.
La temperatura es el factor ambiental que ejerce una variada influencia sobre el crecimiento microbiano, el
crecimiento microbiano se ve afectado de manera importante por la temperatura por lo que los microorganismos se
clasifican en psicroflicos: (0 C a 20 C), los mesoflicos crecen entre 20 y 40 C y los termoflicos: crecen entre 40
y 80 C.
El Punto trmico mortal (PTM) es la forma ms comn de determinar la sensibilidad al calor de los
microorganismos, y se define como la temperatura mnima necesaria para que todos los organismos de una
poblacin mueran en 10 minutos.
El tiempo trmico mortal (TTM), es otra constante que se determina para cada microorganismo y es el tiempo
mnimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensin a 70C.
La elevada concentracin de solutos en la clula genera una presin interna que recibe el nombre de presin
osmtica; las bacterias poseen paredes celulares rgidas y por lo general no presentan cambios muy pronunciados
de forma y tamao cuando experimentan plasmlisis o plasmoptisis.
Existen microorganismos que crecen en medios con alta concentracin de solutos y reciben el nombre de
osmofilicos, como son los haloflicos, que crecen en altas concentraciones de sal y los sacaroflicos, que crecen
en altas concentraciones de azcar.
De acuerdo al pH ptimo en el cual se desarrollan, los microorganismos se clasifican en acidfilos, neutrfilos,
basfilos. Los metales pesados presentan actividad antimicrobiana, actan generalmente por medio de la
precipitacin de enzimas o de otras protenas esenciales para la clula o interfieren con algunas funciones celulares,
el mercurio, la plata, el arsnico, el zinc y el cobre son los ms utilizados, se utilizan en bajas concentraciones ya
que tienen buena actividad antimicrobiana.
Compuestos halogenados como el yodo, cloro, el hipoclorito, actan como oxidantes de los constituyentes
celulares, como las protenas.
Los antibiticos se definen como substancias producidas por un microorganismo, la cual a bajas concentraciones
inhibe el crecimiento de los microorganismos, por su modo de accin, los antibiticos se pueden clasificar como
bactericidas, bacteriostticos, macrlidos, polipptidos y grupo miscelneo.
La pasteurizacin es un proceso trmico en el que se aplica un calentamiento moderado seguido de un
enfriamiento brusco, con la finalidad de reducir la carga microbiana presente en productos que son termo sensibles,
este proceso no es un mtodo de esterilizacin, puesto que existen microorganismos que resisten la pasteurizacin,
a los cuales se le conoce con el nombre de termodricos; ejemplo de ellos son algunas especies de los gneros:
Streptococcus, Micrococcus, Corynebacterium, Lactobacillus, Arthrobacter, Bacillus y Clostridium.
2.0 OBJETIVOS
Determinar la influencia de algunos factores ambientales sobre el crecimiento de los microorganismos.
Determinar la temperatura ptima de crecimiento, el punto trmico mortal (PTM) y el tiempo trmico mortal (TTM)
de algunos microorganismos.
Determinar el efecto de la presin osmtica y pH sobre el crecimiento de los microorganismos.
Determinar el efecto de algunos metales pesados, halgenos y antibiticos sobre el crecimiento de los
microorganismos.
49

3.1 MATERIAL POR EQUIPO
Pipetas de 1,2,5 y 10mL estriles.
Tubos de 13x 100mm con 5 mL de caldo nutritivo
Placas con agar nutritivo
Tubos con 9 rnL de solucin salina fisiolgica
Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivos pH 3. 5
Tubos de 13x l00 mm con 3 mL de caldo nutritivo a pH 7.0
Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivo a pH 9.0
Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivo con 1% de cloruro de sodio
Tubos de 13x100 mm con 3 mL de caldo nutritivo con 3% de cloruro de sodio
Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivo con 5% de cloruro de sodio
3 Matraces con 120 mL de agar cuenta estndar
Discos de papel filtro de 1 cm de dimetro
Cajas de Petri estriles
Pinzas de diseccin
Discos de papel filtro impregnados con hipoclorito de sodio
Discos de papel filtro impregnados con yodo
Sensidiscos con diferentes antibiticos

3.2 EQUIP0
1 termmetro
1 refrigerador a 4C
1 incubadora a 25C
1 incubadora a 35C
1 bao Mara a 50C
1 bao Mara a 60C
1 bao Mara a 70C
1 bao Mara a 80C
1 bao Mara a 92C
1 autoclave
Probetas
Horno
3.3 CEPAS MICROBIANAS
Bacillus sp.
Pseudomonas sp.
Escherichia coli
4.1 DETERMINACIN DE LA TEMPERATURA PTIMA DE CRECIMIENTO
4.1.1 Preparar una suspensin del microorganismo se utilizara el mismo microorganismo en todos los experimentos.
4.1.2 Etiquetar 4 tubos con 3 mL de caldo nutritivo con: nombre del microorganismo, fecha, equipo, grupo y con las
siguientes temperaturas, 5C, 28C, 35C y 50C.
4.1.3 Inocular cada uno de los tubos con 0.1 mL de la suspensin microbiana, dejar un tubo sin inocular que servir
como testigo.
4.1.4 Incubar los tubos a la temperatura correspondiente durante 24 horas.
50
4.1.5 Despus de este tiempo observar si hay crecimiento haciendo anotaciones con un signo (+) dependiendo de
cuanto turbidez se observe y si no hay crecimiento con un signo (-).
4.2 DETERMINACIN DEL PUNTO TRMICO MORTAL (PTM)

4.2.1 Etiquetar una serie de 7 tubos conteniendo cada uno 3 mL de caldo nutritivo, con las siguientes temperaturas:
35, 50, 60, 70, 80 y 92 C y un tubo que se mantendr a temperatura ambiente,
4.2.2 Inocular cada tubo con 0. 1 mL de la suspensin microbiana.
4.2.3 Calentar los tubos a las temperaturas correspondientes durante 10 minutos.
4.2.4 Dividir una caja Petri con agar nutritivo en 7 partes (Fig. 1) y marcar con 37, 50, 60, 70, 80, 92 C y el
testigo
4.2.5 Sembrar por estra simple sobre el agar en su correspondiente temperatura.
4.2.6 Incubar la placa durante 48 horas a 25 C si se sembr a mohos y a 35 C, 24 horas si se trata de bacterias y
levaduras.
4.2.7 Observar si hay crecimiento en cada una de las temperaturas.
4.3 DETERMINACION DEL TIEMPO TERMICO MORTAL (TTM)

4.3.1 Etiquetar una serie de 7 tubos conteniendo cada uno 3 mL de caldo nutritivo, con los siguientes tiempos 5, l0,
15, 20, 25 y 30 minutos y un testigo a temperatura ambiente.
4.3.2 Inocular cada tubo con 0, 1 mL de la suspensin microbiana
4.3.3 Calentar los tubos a 70 C en un bao Mara durante los tiempos indicados
4.3.4 Dividir una caja Petri con agar nutritivo en 7 partes (Fig. 1) y marcar con 5, l0, 15, 20, 25 y 30 minutos y un
testigo a temperatura ambiente.
4.2. 5 Sembrar por estra simple sobre el agar en su correspondiente tiempo.
4.2.6 Incubar la placa durante 48 horas a 35 C, 24 horas si se trata de bacterias
4.2.7 Observar si hay crecimiento en cada una de los tiempos.
4.4 TINDALIZACIN DE SUELO DE JARDN

Pesar 100 g de suelo de jardn, tomar 1g de muestra de aproximadamente y conservar en
refrigeracin, el resto de la muestra, calentarla a 100C, durante 1 hora en el horno de calor seco,
51
transcurrido se tiempo incubar la muestra a 37C durante 24 h. Despus de la incubacin, tomar una
muestra de aproximadamente 1g de muestra y conservar en refrigeracin
Repetir este procedimiento durante dos ocasiones ms.
Realizar el recuento microbiano de cada una de las muestras conservadas en refrigeracin, con las
diluciones 10-3, 10-4 y 10-5, por vaciado en placa.
Calcular el porcentaje de reduccin microbiana de la poblacin inicial, es decir antes de la

tindalizacin.
EFECTO DE LOS FACTORES FISICOQUIMICOS EN EL CRECIMIENTO CELULAR

4.5- EFECTO DEL pH
4.5.1 Marcar los 4 tubos de caldo nutritivo con los diferentes pH con: el nombre de la cepa, grupo, equipo.
4.5.2 Inocular con 0. 1 mL de la suspensin cada uno de los tubos.
4.5.3 Incubar los tubos a 35 C durante 24 horas
4.5.4 Despus de este tiempo observar presencia o ausencia de crecimiento observando la turbidez para los
diferentes pH.
4.6-EFECTO DE LA PRESION OSMOTICA SOBRE EL CRECIMIENTO
4.6.1 Etiquetar los tubos que contienen 3 mL de caldo nutritivo con diferentes concentraciones de cloruro de sodio
(1%, 3% y 5%.) con nombre de la cepa, grupo y equipo.
4.6.2 Inocular con 0. 1 mL de la suspensin cada uno de los tubos.
4.6.3 Incubar los tubos a 35 C durante 24
4.6.4 Despus de este tiempo observar presencia o ausencia de crecimiento observando la turbidez para los
diferentes pH.
4.7- METALES PESADOS (Fig.3)
4.7.1 Impregnar discos de papel filtro con los siguientes compuestos. AgNO3, CuSO4
4.7.2 Marcar una caja Petri con agar nutritivo con: nombre de la cepa, grupo, equipo, nombre del metal.
4.7.3 Sembrar por estra masiva la caja y colocar los discos sobre la placa.
4.7.4 Incubar la placa a 35 C durante 24 horas
4.7.5 Observar el crecimiento del microorganismo y medir el halo de inhibicin de c/u de los agentes utilizados.
4.8 COMPUESTOS HALOGENADOS (Fig. 4)
4.8.1 Impregnar discos de papel filtro con los siguientes compuestos: hipoclorito de sodio y de yodo.
4.8.2 Marcar una caja Petri con agar nutritivo con: nombre de la cepa, grupo, equipo, nombre del metal.
4.8.3 Sembrar por estra masiva la caja y colocar los discos sobre la placa.
4.8.4 Incubar la placa a 35 C durante 24 horas
4.8.5 Observar el crecimiento del microorganismo y medir el halo de inhibicin de c/u de los agentes utilizados.
AgNO
3
CuSO
4
Fig. 3 Metales pesados
Fig. 4 Compuestos halogenados
52
4.9 EFECTO DE LA ACTIVIDAD DE ANTIBITICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO (fig. 5)

4.9.1 Marcar una placa con agar nutritivo con el nombre de la cepa, grupo, equipo.
4.9.2 Sembrar la placa por estra masiva.
4.9.3 Colocar un multidisco o discos individuales sobre las placas sembradas con las cepas.
4.9.4 Presionar ligeramente cada disco sobre el cultivo con ayuda de pinzas de diseccin para poner en contacto el
antibitico con la cepa
4.9.5 Incubar las placas a 35 C durante 24 horas.
4.9.6 Despus del tiempo de incubacin medir el dimetro del los halos de inhibicin del crecimiento producido y
anotar los resultados.
Fig. 5 Efecto de la actividad de los antibiticos

5.0 RESULTADOS
5.1 DETERMINACIN DE LA TEMPERATURA PTIMA DE CRECIMIENTO
TEMPERATURA
5C
28C 37C
Turbidez
5.2 PUNTO TRMICO MORTAL
TEMPERATURA
Turbidez
37C
5.3 TIEMPO TRMICO MORTAL

TIEMPO
Turbidez
50C
60C
10
15
70C
55C
80C
20
92C
25
30
5.4 TINDALIZACIN
Porcentaje de reduccin microbiana___________________
5.5 EFECTOS DEL pH
EFECTO DEL Ph
CRECIMIENTO
3.5
5.6 EFECTO DE LA PRESIN OSMTICA

CONCENTRACIN DE NaCl
CRECIMIENTO
5.7 EFECTO DE METALES PESADOS

METAL
DIMETRO DEL HALO DE
INHIBICIN (mm)
5.0
5%
7.0
9.0
7%
Ag
9%
Cu
53
5.8 EFECTO DE COMPUESTOS HALOGENADOS

HALGENO
DIMETRO HALO DE INHIBICIN (mm)
5.9 EFECTO DE LOS ANTIBITICOS
ANTIBIOTICO
DIMETRO HALO DE INHIBICIN (mm)
CLORO
Penicilina
YODO
Eritomicina
otro

Basndose en los resultados anteriores y a la bibliografa consultada, analizar y discutir los resultados obtenidos en
esta prctica, haciendo nfasis en el efecto causado a nivel molecular de los factores estudiados y la importancia
prctica que tiene el conocer el efecto de estos mismos sobre los microorganismos.
Elaborar las conclusiones basndose en los resultados, al anlisis y discusin que se hicieron de estos, a la
bibliografa consultada y a los objetivos de la prctica.
7.0 CUESTIONARIO
1. Menciona tres ejemplos de microorganismo mesoflico, 3 de psicrofilicos y 3 de termoflicos
2. Define el trmino termodrico
3. Menciona 3 ejemplos de microorganismos cuyo pH ptimo de crecimiento sea cido, 3 de pH alcalino y 3 de pH
neutro.
4. Qu significa actividad de un antibitico?
5. Cmo actan los antibiticos utilizados sobre el microorganismo con el que trabajaste?
6. A qu se debe la resistencia a un antibitico?
7. Explica brevemente que es el efecto bactericida, bacteriosttico, fungicida y fungisttIco.
9. Explica la diferencia como actan los diferentes metales pesados utilizados en el
laboratorio.
10. Explica la relacin que existe entre la concentracin del agente qumico y el tiempo de exposicin
th
Madigan, Martinko, Parker. Brock Biology of the microorganisms. 10 edition, Prentice Hall, 2005. 892 Pgs
Escriba la bibliografa consultada para el reporte de esta prctica,
54
PRCTICA No. 6
MUESTREO RECUENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DEL AGUA:
INDICADORES SANITARIOS, BACTERIAS PATGENAS
2.0 INTRODUCCIN
El agua contiene suficientes sustancias nutritivas para permitir el desarrollo de los diferentes microorganismos.
Muchas de las bacterias del agua provienen del contacto con el aire, el suelo, animales o plantas vivas o en
descomposicin, fuentes minerales y materia fecal.
La transmisin a travs del agua de organismos patgenos ha sido la fuente ms grave de epidemias de algunas
enfermedades como: fiebre tifoidea, clera, disentera amibiana, hepatitis infecciosa, etctera.
Un nmero importante de enfermedades son transmitidas a travs del agua. La contaminacin fecal en el agua es
un factor importante ya que las heces contienen una gran variedad de microorganismos, incluyendo
enteropatgenos, los cuales son un riesgo para la salud pblica al estar en contacto con el ser humano. Estos
enteropatgenos incluyen principalmente a las bacterias de los gneros Salmonella, Shigella y Vibrio,
protozoarios como Entamoeba hystolitica o virus, como el de la polio o la hepatitis, que ingresan al agua cuando
sta entra en contacto con la materia fecal. Sin embargo, estos organismos no se encuentran en un nmero tal que
permita su bsqueda de una manera accesible y, sobre todo, confiable. Por otro lado los enteropatgenos en
cuestin aparecen slo ocasionalmente en cantidades suficientes para ser detectados, an en las heces de
individuos enfermos, por lo que se corre el riesgo de consumir agua contaminada solamente por el hecho de no
haber hallado ningn enteropatgenos en las muestras analizadas.
Con esta base sin demostrar necesariamente la presencia directa de organismos enteropatgenos, se puede hacer
un anlisis microbiolgico para poner de manifiesto a microorganismos que sirvan como indicadores de
contaminacin fecal. Los microorganismos del grupo coliforme habitan normalmente en el intestino humano y de
otros animales de sangre caliente, por lo que su presencia en agua da una indicacin sensible de dicho tipo de
contaminacin. Otras cualidades que hacen a los microorganismos del grupo coliforme indicadores ideales de
contaminacin fecal son:
*Presencia constante en materia fecal
*Exclusividad en la materia fecal
*Abundancia en la materia fecal
*Incapacidad de reproduccin en el agua.
*Sobrevivencia semejante a la de los organismos
enteropatgenos.
*Facilidad para demostrarse en el laboratorio
Actualmente se ocupan dos grupos microbianos que renen todas estas caractersticas en un nivel aceptable. Estos
grupos son los organismos coliformes y los enterococos fecales:
Los microorganismos coliformes son bacilos cortos, Gram negativos, aerobios o anaerobios facultativos, no
esporulados que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas en 48 horas. Esta ltima propiedad, dado que
no es comn entre las bacterias, es el punto clave que se utiliza para la identificacin de este grupo microbiano.
En este grupo se incluye a Escherichia coli considerada como el principal indicador de contaminacin fecal, as
como a Klebsiella, Citrobacter y Enterobacter cuya fuente no se limita a un origen fecal y que comnmente son
encontrados en muestras de suelo, plantas y granos.
Existen dos pruebas oficiales para la determinacin de coliformes en muestras de agua.
Norma Mexicana de Anlisis, NMX-AA-042-1987. Calidad del Agua.
Determinacin del Nmero Ms Probable ( NMP ) de coliformes Totales, Coliformes Fecales (Termotolerantes) y
Escherichia coli presuntiva.
Esta norma establece un mtodo para la deteccin y la cuantificacin de los microorganismos coliformes mediante
el cultivo en un medio lquido en tubos mltiples y el clculo de su Nmero Ms Probable (NMP) en la muestra.
55
Este mtodo microbiolgico para detectar la presencia de microorganismos coliformes en el agua contempla tres
fases:
a)
Prueba presuntiva
b)
Prueba confirmativa
En el mtodo se emplean medios de cultivo preparados con lactosa para observar la produccin de cido y gas.
Como medio confirmativo para coliformes totales, el ms generalizado es el caldo bilis lactosa verde brillante
(BLVB). Para confirmar la presencia de coliformes fecales se utiliza tanto el BLVB como el caldo Escherichia coli
(EC). Para confirmar la presencia de Escherichia coli presuntiva, se emplea agua de triptona.
Para la correcta aplicacin de esta Norma, es necesario consultar las siguientes normas
oficiales mexicanas:
NOM-014-SSA1-1993
NOM-041-SSA1-1993
NOM-092-SSA1-1994
NOM-110-SSA1-1993
NOM-112-SSA1-1994
NOM-127-SSA1-1994
NOM-127-SSA1-2003
NOM-008-SCFI-1993
Procedimientos sanitarios para el muestreo de agua para uso y consumo humano

distribuida por sistemas de abastecimiento pblicos y privados.
Agua purificada envasada. Especificaciones sanitarias.
Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa.
Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis bacteriolgico.
Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable
Agua para uso y consumo humano. Lmites permisibles de calidad y tratamientos
a que debe someterse el agua para su potabilizacin.
Salud Ambiental. Agua para uso y consumo humano. Lmites permisibles de
calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilizacin.
Sistema general de unidades de medida.
Agua para uso y consumo humano: Aquella que no contiene contaminantes objetables, ya sean qumicos o
agentes infecciosos y que no causa efectos nocivos al ser humano.
Caractersticas bacteriolgicas: Son aquellas debidas a microorganismos nocivos a la salud humana. Para
efectos de control sanitario se determina el contenido de indicadores generales de contaminacin microbiolgica,
especficamente organismos coliformes totales y organismos coliformes fecales.
Caractersticas fsicas y organolpticas: Son aquellas que se detectan sensorialmente. Para efectos de
evaluacin, el sabor y olor se ponderan por medio de los sentidos y el color y la turbiedad se determinan por medio
de mtodos analticos de laboratorio.
Lmites permisibles de calidad del agua de caractersticas bacteriolgicas
CARACTERISTICA
LIMITE PERMISIBLE
Organismos coliformes totales
2 NMP/100 ml
2 UFC/100 ml
Organismos coliformes fecales No detectable NMP/100 ml
Cero UFC/100 ml
Los resultados de los exmenes bacteriolgicos se deben reportar en unidades de NMP/100 ml (nmero ms
probable por 100 ml),
CARACTERISTICA
LIMITE PERMISIBLE
Color
20 unidades de color verdadero en la escala de platino-cobalto.
Olor y sabor
Agradable (se aceptarn aquellos que sean tolerables para la mayora de los consumidores,
siempre que no sean resultados de condiciones objetables desde el punto de vista biolgico o qumico).
56
Turbiedad
5 unidades de turbiedad nefelomtricas (UTN) o su equivalente en otro mtodo.
2.0 OBJETIVOS
El alumno determinar la calidad sanitaria del agua para consumo humano.
2.2.1 Aplicar adecuadamente las tcnicas para muestrear agua para consumo humano.
2.2.2 Aplicar adecuadamente las tcnicas para cuantificar a los microorganismos indicadores en el agua para
consumo humano.
2.2.3 Interpretar la presencia de organismos coliformes totales y fecales y Escherichia coli como indicadores de
contaminacin fecal reciente en el anlisis de agua para consumo humano.
2.2.4 Interpretar la presencia de organismos mesoflicos aerobios en el anlisis microbiolgico del agua para
consumo humano.
3.1 MEDIOS DE CULTIVO
3 tubos con 10 mL de caldo lactosado de doble concentracin y campana de Durham.
6 tubos con caldo lactosado concentracin sencilla y campana de Durham.
9 tubos con 10 mL de caldo bilis verde brillante al 2% y campana de Durham.
1 matraz con 100 mL de agar cuenta estndar.
1Caja de Petri con medio de agar Eosina Azul de Metileno (EMB)
3.2 MATERIAL
3 cajas Petri
1 pipetas de 2 ml
1 pipeta de 10 mL
Un frasco de boca ancha con 0.1 mL de tiosulfato de sodio por cada 100 mL de muestra esteril.
3.3 REACTIVOS
Tiosulfato de sodio 1%
Reactivo de Kovacs para indol
3.4 EQUIPO
1 autoclave.
1 balanza granataria.
1 refrigerador.
1 incubadora a 35 C.
1Bao Mara 44.5 C
1 horno a 180 C.
3.5 MUESTRAS PARA ANALIZAR

1.
3.
5.
7.
9.
Red municipal
Tinaco
Cisterna
Hielo
Pozo
2.
4.
6.
8.
10.
Filtro
Agua embotellada
Llave
Bao
Agua de fresa
57

MUESTREO
Las muestras para el anlisis bacteriolgico se deben tomar de acuerdo a las instrucciones que le d su profesor.
4.0DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1 PROCEDIMIENTO PARA TOMA DE MUESTRA PARA ANLISIS MICROBIOLOGICO.
EN BOMBA DE MANO O GRIFO DEL SISTEMA DE DISTRIBUCIN.
El agua de los grifos debe provenir directamente del sistema de distribucin. No debe efectuarse toma de muestra
en grifos que presenten fugas entre el tambor y el cuello, ya que el agua puede correr por la parte exterior del grifo y
contaminar la muestra. Deben removerse los accesorios o aditamentos externos como mangueras, boquillas y filtros
de plstico o hule antes de tomar la muestra.
1.- Debe limpiarse el orificio de salida con una torunda de algodn impregnada de solucin de hipoclorito de sodio
con una concentracin de 100 mg/l.
2.- Debe dejarse correr el agua aproximadamente 3 minutos o hasta asegurarse que el agua que contenan las
tuberas ha sido vaciada totalmente.
3.- Cerca del orificio de salida, deben quitarse simultneamente el tapn del frasco y el papel de proteccin,
manejndolos como unidad, evitando que se contaminen el tapn, o el papel de proteccin, o el cuello del frasco.
4.- Debe mantenerse el tapn hacia abajo para evitar contaminacin y procederse a tomar la muestra sin prdida
de tiempo y sin enjuagar el frasco; se debe dejar el espacio libre requerido para la agitacin de la muestra previa al
anlisis (aproximadamente 10% de volumen del frasco). Efectuada la toma de muestra, deben colocarse el tapn y
el papel de proteccin al frasco.
EN CAPTACIN DE UN CUERPO DE AGUA SUPERFICIAL O TANQUE DE ALMACENAMIENTO, CISTERNA.
1.- Deben lavarse manos y antebrazos con agua y jabn,
2.- Debe quitarse el papel de proteccin evitando que se contamine, y
3.- Sumergir el frasco en el agua con el cuello hacia abajo hasta una profundidad de 15 a 30 cm, abrir y enderezar a
continuacin con el cuello hacia arriba (en todos los casos debe evitarse tomar la muestra de la capa superficial o
del fondo, donde puede haber nata o sedimento y en el caso de captacin en cuerpos de agua superficiales, no
deben tomarse muestras muy prximas a la orilla o muy distantes del punto de extraccin); si existe corriente en el
cuerpo de agua, la toma de muestra debe efectuarse con la boca del frasco en contracorriente. Efectuada la toma
de muestra debe colocarse el tapn, sacar el frasco del agua y colocar el papel de proteccin.
EN POZO PROFUNDO.
Si el pozo cuenta con grifo para toma de muestra, debe procederse como se menciono anteriormente.
1.- Si el pozo no cuenta con grifo para toma de muestra, debe abrirse la vlvula de una tubera de desfogue, dejarse
correr el agua por un mnimo de 3 min. y como se menciono anteriormente.
EN POZO SOMERO O FUENTE SIMILAR.
1.- Cuando no es posible tomar la muestra con la extensin del brazo, debe atarse al frasco un sobrepeso usando
el extremo de un cordel limpio.
2.- Deben quitarse simultneamente el tapn y el papel de proteccin, manejndolos como unidad, evitando que se
contaminen el tapn, o el papel de proteccin, o el cuello del frasco.
3.- Debe mantenerse el cuello del frasco hacia abajo y se procede a tomar la muestra, bajando el frasco dentro del
pozo, y desenrollando el cordel lentamente, evitando que el frasco toque las paredes del pozo.
4.- Efectuada la toma de muestra, deben colocarse el tapn y el papel de proteccin al frasco.
EN BOMBA DE MANO O GRIFO DEL SISTEMA DE DISTRIBUCIN O POZO PROFUNDO.
58
1.- Debe dejarse correr el agua aproximadamente por 3 min o hasta asegurarse que el agua que contenan las
tuberas ha sido vaciada totalmente.
2.- El muestreo debe realizarse cuidadosamente, evitando que se contaminen el tapn, boca e interior del envase;
se requiere tomar un poco del agua que se va a analizar, se cierra el envase y agitar fuertemente para enjuagar,
desechando esa agua; se efecta esta operacin dos o tres veces, procediendo enseguida a tomar la muestra.
3.- En captacin de un cuerpo de agua superficial, tanque de almacenamiento, pozo somero o fuente similar, debe
manejarse el envase siguiendo las indicaciones anteriores segn sea su caso.
MANEJO DE MUESTRAS
1.- Las muestras deben colocarse en hielera con bolsas refrigerantes o bolsas de hielo para su transporte al
laboratorio, de preferencia a una temperatura entre los 4 y 10C, cuidando de no congelar las muestras.
2.- El periodo mximo que debe transcurrir entre la toma de muestra para anlisis microbiolgico de 6 horas.
IDENTIFICACIN Y CONTROL DE MUESTRAS
1.-Para la identificacin de las muestras deben etiquetarse los frascos y envases con la siguiente informacin:
2.- Nmero de registro para identificar la muestra, y fecha y hora de muestreo, identificacin del punto o sito de
muestreo, temperatura ambiente y temperatura del agua, pH,
SELECCIN DE PUNTOS DE MUESTREO
La seleccin de puntos de muestreo debe considerarse individualmente para cada sistema de abastecimiento. Sin
embargo, existen criterios que deben tomarse en cuenta para ello. Estos criterios son:
1.- Los puntos de muestreo deben ser representativos de las diferentes fuentes de agua que abastecen el sistema.
2.- Los puntos de muestreo deben ser representativos de los lugares ms susceptibles de contaminacin: puntos
muertos, zonas de baja presin, zonas con antecedentes de problemas de contaminacin, zonas con fugas
frecuentes, zonas densamente pobladas y con alcantarillado insuficiente, tanques de almacenamiento abiertos y
carentes de proteccin, y zonas perifricas del sistema ms alejadas de las instalaciones de tratamiento.
3.- Debe haber una distribucin uniforme de los puntos de muestreo a lo largo del sistema.
4.- Los puntos se localizarn dependiendo del tipo de sistemas de distribucin y en proporcin al nmero de
ramales.
5.- Debe haber como mnimo un punto de muestreo inmediatamente a la salida de las plantas de tratamiento, en su
caso.
4.1 ORGANISMOS COLIFORMES POR LA TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE (Fig. 1)
PRUEBA PRESUNTIVA
Antes del anlisis, mezclar perfectamente la muestra agitndola de manera vigorosa para lograr una distribucin
uniforme de los microorganismos (dependiendo de la naturaleza del agua y el contenido bacteriano esperado, hacer
todas las diluciones necesarias en esta etapa). Ya sea con la muestra original, o con la dilucin elegida, se procede
como sigue:
1.- Inocular tres tubos con caldo lactosado doble concentracin, cada uno con 10 mL de muestra
2.- Inocular tres tubos con caldo lactosado concentracin sencilla cada uno con 1 mL de la muestra.
3.- Inocular tres tubos con caldo lactosado concentracin sencilla cada uno con 0.1 mL de la muestra.
4.- Incubar todos los tubos a 37 C durante 48 horas.
5.- Transcurrido el tiempo de incubacin observar si hubo produccin de gas por su acumulacin en la campana de
Durham. La ausencia de gas en los tubos hace negativa la prueba, aunque haya produccin de cido o haya un
crecimiento evidente.
4.2 PRUEBA CONFIRMATIVA
A partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva:
59
1.-Inocular dos tubos de caldo lactosa bilis verde brillante (BLVB) con dos asadas cada uno.
2.-Para determinar coliformes totales incubar un tubo a 37 C y examinarlo a las 48 horas para ver si hubo
produccin de cido y/o gas. La produccin de cido se detecta por el cambio del medio a un color amarillo.
3.-Para confirmar la presencia de organismos coliformes termotolerantes (organismos coliformes fecales), incubar
otro tubo a 44 C durante 48 horas.
PRUEBA PRESUNTIVA
Caldo lactosado
Incubar a 35C, 24/48 Horas
PRUEBA CONFIRMATORIA
Caldo bilis verde brillante
Incubar un tubo a 37 C y
Dos tubos a 44.5C en
Bao Maria por 48 horas
10 mL
100mL *
1 mL
0.1 mL
10mL
Fig. 1 Determinacin de los Organismos coliformes por la tcnica del Nmero ms probable (NMP)
4.-Para confirmar la presencia de Escherichia coli presuntiva, inocular a partir de los tubos positivos de caldo
lactosado los tubos de agua de peptonada al 0.1%, que sean necesarios. Incubar a 44 C durante 24 horas.
Despus aadir de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de kovacs. El desarrollo de un anillo de color rojo despus de agitar
suavemente denota la presencia de indol. La deteccin de E. coli presuntiva se considera una evidencia
satisfactoria de contaminacin fecal. Sin embargo, pueden efectuarse mayores pruebas para su confirmacin si se
considera necesario.
5.- De los tubos positivos de Caldo Lactosa Verde Brillante Bilis (BLVB) en la prueba confirmativa, sembrar por
estra cruzada una placa de agar Eosina Azul de Metileno (EMB).
6.- Al trmino del tiempo de incubacin de la Prueba Confirmativa, observar la produccin de gas en los tubos.
Registrar el nmero de tubos positivos en la tabla siguiente:
Prueba Confirmativa para Coliformes Totales
Alcuota ( mL )
10
0.1
Tubos Positivos
Prueba Confirmativa para Coliformes Fecales
60
Alcuota ( mL )
10
0.1
Prueba Confirmativa para Escherichia coli presuntiva

Alcuota ( mL )
10
0.1
Tubos Positivos
Tubos Positivos
5.0 RESULTADOS
Anota los resultados de todos los equipos en el siguiente cuadro.
Equipo
Tipo de Agua
Organismos
coliformes totales
Organismos
coliformes fecales
Normas utilizadas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Analice la presencia o ausencia de organismos coliformes totales, fecales y cmo influye el muestreo en el anlisis
de agua para consumo humano. Establece conclusiones grupales con base a los resultados obtenidos por los
equipos de trabajo.
7.0 CUESTIONARIO
1.- Menciona 3 cuidados que se deben de tener al muestrear agua de cisterna, tinaco.
2.- Qu criterios se utilizan para realizar el nmero de diluciones?
3.- Por qu se les llama microorganismos indicadores a los organismos coliformes?
4.- Cuntos organismos coliformes totales y fecales pueden estar presentes en agua potable y que indica este
intervalo?
5.- Qu medios se utilizan para aislar organismos coliformes? Menciona cuales son los inhibidores que contiene y
que microorganismos inhibe ai como la funcin de cada uno de los componentes?
6.- A que se debe la presencia de organismos coliformes fecales en el agua potable.
7.- Menciona en que consiste el proceso de potabilizacin y purificacin de agua?
8.- Qu es desinfeccin, demanda de cloro, qu es cloro residual y que cantidad de cloro lleva el agua potable y se
expresa en ppm?
9.- Cmo inactiva el tiosulfato de sodio al cloro, que reaccin ocurre?
1.-Guas para la Calidad del Agua Potable. Volumen 2 Organizacin Panamericana de la Salud. 1987.
61
2.- Instructivo para la Vigilancia y Certificacin de la Calidad Sanitaria del Agua para Consumo Humano. Comisin
Interna de Salud Ambiental y Ocupacional. Secretara de Salud. 1987.
3.-NOM-127-SSA1-1994 Agua para uso y consumo humano. Lmites permisibles de calidad y tratamientos a que
debe someterse el agua para su potabilizacin.*
4.- PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-181-SSA1-1998, Salud ambiental, agua para uso y
consumo humano. Requisitos sanitarios que deben cumplir las sustancias germicidas para tratamiento de agua,
de tipo domstico.
5.- Romero Rojas Jairo A. Calidad del agua. 2 edicin. 1999. Ed. Escuela Colombiana de Ingeniera.
Describe las referencias consultadas de acuerdo a los criterios establecidos en la prctica 1
62
PRACTICA No.7
MUESTREO RECUENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DEL SUELO:
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS AMILOLTICOS, CELULOLTICOS Y ACTINOMICETOS
1.INTRODUCCIN
La descomposicin de compuestos orgnicos que son producto del metabolismo vegetal es un proceso de gran
importancia porque permite la reincorporacin de sus elementos constituyentes al reciclaje en el ecosistema.
La descomposicin se realiza por medio de actividades enzimticas que finalmente oxidan por completo el sustrato
y permite la asimilacin de los productos por bacterias (Clostridium, Pseudomonas, Xanthomonas, Cellulomonas,
Sporocytophayga) y actinobacterias (Nocardia, Thermnoactinomyces, etc.).
Existe una sucesin de organismos que compiten por la utilizacin del sustrato que comienza por sus azcares,
almidn y protenas ms fcilmente asimilables y termina con la accin de microorganismos con capacidad
enzimtica especfica para los sustratos ms difciles de degradar como la celulosa, hemicelulosa, lignina, quitina,
pectina, etc.
La enzima amilasa hidroliza los polisacridos almidn y glucogno a polmeros de glucosa ms pequeos como
dextrinas y eventualmente al disacrido maltosa.
La celulasa digiere la celulosa para producir el disacrido celobiosa. Despus los disacridos producidos pueden ser
hidrolizados extracelularmente en sus monosacridos constituyentes por medio de la actividad de las enzimas
maltasa y celobiasa, respectivamente.
Las tcnicas comunes de aislamiento requiere la incorporacin de celulosa o almidn como nica fuente de
carbono, segn el caso, en un medio base mineral.
OBJETIVOS
Objetivo General
El alumno aislar microorganismos del suelo: Actinomicetos y con capacidad para degradar polmeros de glucosa
Objetivos Especificos:
Aislar y cuantificar Actinomicetos
Aislar y cuantificar microorganismos del suelo con actividad celuloltica
Aislar y cuantificar microorganismos del suelo con actividad amiloltica
1.1MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO POR EQUIPO
3 Pipetas de 1 mL estriles
1 Caja de petri estril
1 varilla de vidrio acodada.
1 Frasco de dilucin con 90 mL de agua destilada estril
4 tubos de ensaye de 16 x 150 con tapn de rosca con 9 mL de agua destilada estril
8 cajas petri con gelosa almidn
8 cajas petri con agar celulosa rojo congo
8 cajas con Medio Czapeck-Dox
1 frasco con alcohol etlico
1 frasco con lugol
Muestras de suelo de jardn y de suelo erosionado.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
-Pesar 10 g de la muestra y realizar diluciones decimales hasta 10-4
-Sembrar 0.1 mL de las ltimas 3 diluciones en las cajas con el medio para Actinomicetos, Agar celulosa, y gelosa
almidn por la tcnica de extensin con varilla.
63
-Incubar todas las placas a 28 C durante 48 a 72 horas

-Una vez terminada la incubacin agregar a la placa de agar almidn unas gotas de lugol sobre las colonias crecidas
y observar si se forma un halo claro alrededor de la colonia. Contar el nmero de colonias que crecieron en el
medio.
-En las placas de celulosa contar las colonias que crecieron en este medio las que muestren una zona de hidrlisis a
su alrededor.
En las placas con el Medio Czapek-Dox, describir la morfologa colonial de tres colonias aisladas.
-Realizar una tincin de Gram a las diferentes colonias aisladas en cada medio de cultivo, observar la microscopio a
inmersin y describir su morfologa microscpica.
Conservar en tubos inclinados, las cepas aisladas.
5.0 RESULTADOS Y CUESTIONARIO.
Anota los resultados de la cuenta de colonias en los diferentes medios
Agar almidn UFC/g
Agar celulosa UFC/g
Agar Czapeck-Dox UFC/g
Describe la morfologa colonial. Dibuja la morfologa microscpic. Investiga la formulacin de cada uno de los
medios de cultivo utilizado y relaciona la composicin del medio con el aislamiento de los grupos de
microorganismos encontrados.
6.0 ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS.
Discute la importancia de los microorganismos Actinomicetos, celulolticos y amilolticos encontrados en la prctica,
revisa la bibliografa publicada para determinar de qu otros sitios se pueden aislar estos y cul es su utilidad.
7.0 CONCLUSIONES
Elabora las conclusiones con base a los resultados obtenidos, a la participacin de los microorganismos
degradadores de celulosa y almidn en los ciclos biogeoqumicos.
Describe la importancia de encontrar actinomicetos en el suelo.
8.0 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1.- Alexander, M Introduccin to Soil Microbiology, John Wiley & Sons, New York, 2000
2.- Campbell, R. Ecologa Microbiana, Edit Trillas, Mxico, 2001
9. BIBLIOGRAFA
Enumera la bibliografa consultada.
64
PRACTICA 8
MUESTREO RECUENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DEL AIRE:
BACTERIAS MESOFLICAS AEROBIAS Y ORGANISMOS COLIFORMES
INTRODUCCIN
La atmsfera, por no poder sustentar el crecimiento y desarrollo de una comunidad, no puede considerarse como
ecosistema. Por lo que este ambiente se considera, exclusivamente, como medio de transporte para los
organismos.
La cantidad de microorganismos presentes en la atmsfera fluctan de acuerdo con la variacin a lo largo del da y
estacional.. Estos valores estn influenciados principalmente por la temperatura que crea corrientes de aire que
arrastran a los microorganismos que se encuentran en la superficie del suelo, agua, plantas y animales y por la
precipitacin pluvial.
En estudios ecolgicos es importante conocer la variacin en la poblacin de microorganismos en la atmsfera de
un hbitat, en un tiempo determinado. As mismo, es importante conocer los eventos climatolgicos que pueden
permitir una amplia distribucin de las poblaciones microbianas, junto con esporas y semillas de otros
microorganismos.
En virtud de que los microorganismos que son transportados por el aire pertenecen a diferentes orgenes, y su
impacto en las actividades humanas depender del tipo de microorganismos presentes, es necesario establecer
objetivos claros para el aislamiento de microorganismos del aire, por ejemplo, se pueden aislar organismos
coliformes para determinar el grado de contaminacin fecal; detectar la presencia de virus patgenos en espacios
cerrados como los hospitales; cuantificar bacterias patgenas en espacios abiertos o cerrados; cuantificar bacterias
mesoflicas aerobias en sitios con baja carga microbiana en donde se producen medicamentos estriles o vacunas;
determinar cmo est el balance entre bacterias auttrofas y bacterias hetertrofas en una determinada poca del
ao. Para cada caso en particular el xito del aislamiento depender del tipo de muestreo que se realice, el equipo
seleccionado para realizarlo y el diseo del medio de cultivo para el aislamiento particular del grupo microbiano de
inters.
Existen diferentes equipos para muestrear aire, entre otros se encuentran los impactadores de Andersen, de
Bukhard, Impactadores en lquido, Impactadores de centrfuga, cada uno de stos equipos, utiliza un mecanismo
particular para introducir un flujo de aire por un tiempo determinado a travs de una cmara cerrada que finalmente
impacta un medio de cultivo slido, lquido o una membrana que retiene a los microorganismos, para su posterior
identificacin y cuantificacin. Otro mtodo sencillo y accesible para conocer los microorganismos en el aire, es el
mtodo de exposicin por tiempo determinado de cajas Petri con medios de cultivo selectivos que garanticen una
correcta aproximacin de la carga microbiana en el sitio de muestreo, a diferentes alturas.
Dentro de los parmetros fsicos que permiten caracterizar al aire, se tienen: la temperatura, la humedad
atmosfrica, la magnitud y direccin del viento, as como la poca del ao.
OBJETIVO GENERAL
Cuantificar bacterias mesoflicas aerobias y bacterias del grupo coliforme presentes en el aire en un ambiente
abierto.
OBJETIVOS PARTICULARES:
1.- Medir los parmetros fsicos para cada zona de muestreo.
2.-Cuantificar bacterias mesoflicas aerobias y organismos coliformes, por exposicin de placas con medios de
cultivo especficos
3.- Establecer la importancia de los grupos microbianos detectados en los sitios de muestreo.
MATERIAL, MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS POR EQUIPO:

4 cajas Petri con agar casena-peptona-almidn-extracto de levadura (CPS-EL)
65
4 cajas Petri con agar rosa de bengala (ARB)

4 cajas Petri con agar eosina-azul de metileno (EMB)
Termmetro
Psicrmetro
Barmetro
Altmetro
Brjula
PROCEDIMIENTO
1. Medicin de variables fsicas en los sitios de muestreo
1.1 Altitud.
Determinar la altitud en metros sobre el nivel del mar (m.s.n.m.) de los sitios de muestreo, utilizando los valores
obtenidos del altmetro.
1.2 Temperatura.
Para esta determinacin se requiere sujetar el termmetro lo ms alejado posible del extremo donde se encuentra el
bulbo o la bayoneta, de ser posible, se debe sostener con un hilo o alambre. En los sitios de muestreo, suspender el
termmetro durante 5 minutos, transcurrido el tiempo, registrar la lectura evitando realizar manipulaciones
excesivas.
1.3 Humedad relativa atmosfrica.
Para medir la cantidad de vapor de agua existente en la atmsfera, se emplea el psicrmetro, que es el instrumento
de uso ms general que mide la humedad relativa atmosfrica. El psicrmetro est compuesto por dos termmetros,
uno de los cuales se mantiene hmedo constantemente con un lienzo empapado en el agua de un pequeo
recipiente.
La evaporacin en la superficie del lienzo, enfra el bulbo del termmetro, as que los dos termmetros indican
lecturas diferentes. Se obtiene el porcentaje de humedad relativa a partir de la diferencia en las lecturas de ambos
termmetros y su interpolacin en tablas calculadas ya establecidas.
La medicin se realiza como sigue:
a) Humedecer el termmetro cubierto con agua destilada.
b) El par de termmetros (psicrmetro de cabestrillo) son agitados en el aire bien se hace que el aire pase a travs
de ellos por medios mecnicos (por ejemplo: agitando el psicrmetro con la mano), la agitacin se realiza por ms o
menos 20 segundos.
c) Tomar las lecturas de las temperaturas de ambos termmetros cuando el termmetro del bulbo hmedo se haya
estabilizado (debido a la evaporacin del agua de su mecha, el bulbo mojado alcanzar una temperatura ms baja
que aquella del bulbo seco, lo cual indica la verdadera temperatura del aire, cuanto ms baja se la humedad relativa,
ms fcilmente se evaporar el agua de la mecha y mayor ser el descenso del bulbo mojado, o sea, la diferencia
de temperatura entre los dos termmetros).
d) Interpolar las lecturas obtenidas en las tablas del psicrmetro y obtener finalmente el valor del porcentaje de la
humedad relativa.
1.4 Velocidad y direccin del viento.
El viento es un factor ambiental de importancia, especialmente en planicies, costas, altitudes elevadas en las
montaas, influyendo directamente en el incremento de la transpiracin de las plantas. Otros efectos menos directos
incluyen la transpiracin de las masas de aire fro y caliente y el movimiento de las nubes y la niebla que cambian
las relaciones del agua y alteran las condiciones luminosas, mezcla el aire y evita las inversiones de temperatura.
La tasa de movimiento del aire se expresa como la velocidad promedio durante un intervalo de tiempo, como es el
caso de una hora un mes.
La medicin de la velocidad y direccin del viento para cada sitio de muestreo, se realizar observando el entorno
de cada sitio y evaluando la magnitud y la direccin del viento utilizando la escala de Beaufort y orientando la
direccin del flujo de aire con el empleo de una brjula.
2. Cuantificacin de bacterias mesoflicas aerobias y bacterias coliformes
Se expondrn las placas con los medios seleccionados, en cada uno de los sitios de muestreo, como sigue:
66
2.1 Colocar sobre el suelo un juego de dos placas de los siguientes medios de cultivo: CPS-EL, ARB y EMB,
destaparlas y alejarse de ellas. Dejarlas as durante 5 minutos. Transcurrido ese tiempo, acercarse y taparlas. Al
alejarse y al acercarse a las placas, se debe evitar levantar polvo.
2.2 Destapar y colocar a 1.5 m de altura con los brazos extendidos, un segundo juego de placas, exponindolas
horizontalmente, durante 5 minutos, transcurrido este tiempo, taparlas. Marcar todas las cajas y colocarlas en las
condiciones de incubacin establecidas para cada medio de cultivo.
2.3 Incubar las placas para hongos y bacterias (CPS-EL y ARB) a 28 C de 2 a 5 das.
2.4 Incubar las placas para coliformes (EMB) a 37 C de 24 a 48 horas.
3. RESULTADOS
3.1 Determinar en cada caso el promedio de las colonias encontradas para cada estacin y en cada ubicacin
(suelo y hombros) y elabore una tabla comparativa para la parte (B) de la prctica, en donde se considere lo
siguiente:
Unidades formadoras de colonias UFC/5min en el lugar de exposicin.
Estacin/Ubicacin
Bacterias (CPS-EL)
Coliformes (EMB)
Hongos (ARB)
1 suelo
1 hombros
2 suelo
2 hombros
3 suelo
3 hombros
4 suelo
4 hombros
y elaborar una grfica con estos resultados.
3.2 Discutir la distribucin de los microorganismos encontrados en cada sitio de muestreo, de acuerdo con el punto
de toma de muestra y las caractersticas de cada estacin.
3.3 Comparar y discutir los resultados de los factores biticos y abiticos.
3.4 Elaborar una tabla con los resultados de las mediciones de las variables fsicas del aire, como sigue:
Medicin de las variables fsicas del aire.
Estacin
Temparatura (C)
Humedad relativa (%)
Altitud (msnm)
1
2
3
4
Referencias Bibliogrficas:
Atlas, R.M. & R. Bartha. Microbial Ecology. Fundamentals and applications. Addison Wesley Massachusets. 2000.
Madigan, Martinko, Parker. Brock Biology of the microorganisms. 10th edition, Prentice Hall, 2005. 892 Pgs.
Prescott L. M., Harley J. P. & Klein D. A. Microbiologa. McGraw-Hill Interamericana. 2002. 2004.
Bruce E. Rittmann &Perry L. McCarty. Biotecnologa del medio ambiente. Principios y aplicaciones. McGraw-Hill,
Inc. 2001. 745 Pgs.
67
APNDICE
AGAR BACTERIOLGICO
El agar bacteriolgico Bioxon se usa en la preparacin de medios de cultivo microbiolgicos slidos y semoslidos.
Tambin puede utilizarse en concentraciones menores como retardante de la penetracin del oxgeno en medios
lquidos.
AGAR NUTRITIVO
Frmula en g/L de agua destilada:
Peptona de gelatina 5g
Extracto de carne de res 3g
Agar 15g
pH final 6.8 0.2
Mtodo de preparacin:
Suspender 23 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien y dejar en reposo por 15 minutos. Calentar a
ebullicin de 1 a 2 minutos. Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15 minutos.
Determinar la funcionalidad del medio de cultivo con microorganismos tpicos.
AGAR PARA MTODOS ESTNDAR
Peptona de casena 5g
Extracto de levadura 2.5g
Glucosa 1g
Agar 15g
pH final 7.0 0.1
Suspender 23.5 g de polvo en un litro de agua destilada. Disolver al calor y esterilizar a 121 C durante 15 minutos.
Rojo neutro 0.025mg
AGAR CITRATO DE SIMMONS
Fosfato dihidrogenado de amonio1g
Fostato dipotsico 1g
Cloruro de sodio 5g
Citrato de sodio 2g
Sulfato de magnesio0.20g
Agar 15g
Azul d e bromotimol0.8g
pH final 6.9 0.1
Suspender 24.2g de polvo en un litro de agua destilada y dejar remojar durante 5 a 10 minutos. Mezclar bien y
calentar suavemente agitando frecuentemente hasta que el medio hierva un minuto Distribuir 5 ml en tubos de 13 X
100 mm y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Se deja enfriar en posicin inclinada.
AGAR EMB (AGAR EOSINA AZUL DE METILENO)
68

Lactosa 5g
Sacarosa 5g
Fosfato dipotsico 2g
Agar 13.5g
Eosina 0.4g
Azul de metileno 0.065g
pH final 7.2 0.2
Suspender 36 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un
minuto. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
CALDO ROJO DE METILO Y VOGUES PROSKAUER (RM-VP)
Peptona especial No.1 7 g
Glucosa 5 g
Fosfato dipotsico 5 g
Agua destilada 1 000 ml
pH final 6.9 0.2
Suspender 17g del polvo en un litro de agua destilada. Disolver calentando y hervir aproximadamente un minuto si
es necesario .Distribuir 6 ml en tubos de 13 X 100 mm y esterilizar en autoclave durante 12 - 15 minutos a 121C. Al
termino de la incubacin el volumen de este tubo se dividir en dos uno para la prueba del Rojo de metilo y la otra
mitad para la prueba de VP.
CALDO NUTRITIVO.
pH final 6.9 0.2
Suspender el almidn en 100 mL de agua destilada. Disolver los dems ingredientes en 900 mL de agua destilada
con calentamiento y agitacin continua , mezclar ambas suspensiones y esterilizar a 115 C por 15 minutos en
autoclave.
CALDO DE MALONATO DE EWING MODIFICADO.
Formula en g/L de agua destilada.
Extracto de levadura 1g
Sulfato de amonio 2g
Fosfato dipotsico 0.6 g
Fosfato monopotsico0.4g
Cloruro de sodio2g
Malonato de sodio3g
Dextrosa 0.25g
Azul de bromotimol0.025g
pH final 6.7 0.2
Disolver 9.3 g de polvo en un litro de agua destilada. Distribuir en tubos de ensaye adecuado y esterilizar en
autoclave a 121 C durante 15 minutos.
69
CALDO ROJO DE FENOL CON LACTOSA.

Peptona de casena 10g
Cloruro de sodio5g
Rojo de fenol 0.018g
Lactosa 5g
pH final 7.4 0.2
Disolver 20g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar y calentar frecuentemente hasta s u ebullicin y
completa disolucin. Distribuir y esterilizar en autoclave de 116 a 118 C durante 15 minutos.
CALDO NITRATO
Nitrato de potasio 1g
pH final 7 0.2
Mtodo de preparacin :
Pesar exactamente las cantidades, rehidratar con agua destilada y calentar suavemente hasta disolucin total.
Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100.y esterilizar a 121 C durante 15 minutos.
MEDIO BASAL OF O MEDIO DE HUGH Y LEIFSON
Caseina digerida por enzimas pancreticas2g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato dipotsico 0.3g
gar 2.5g
Azul de bromotimol 0.03g
pH final 6.8 0.1
Suspender 9.8 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien, calentar agitando frecuentemente y hervir
durante un minuto. Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Agregar 10 mL de solucin de dextrosa
estril por filtracin a travs de membrana al 10 % a 100 mL de base estril. (Agregar 10 mL de solucin de lactosa
estril al 10 % a 100 mL de base estril y agregar 10 mL de sacarosa estril al 10 % a una tercera porcin de 100
mL. Otra forma de preparar el medio es agregar los carbohidratos antes de la esterilizacin en autoclave y
esterilizar a 118C durante 10 minutos.
SOLUCIONES Y REACTIVOS
Prueba de rojo de metilo.
Rojo de metilo 0,1 g
Alcohol etlico 300 ml
Agua destilada 200 ml
Disolver el rojo de metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba, aadir 5 gotas de
la solucin a 5 ml del cultivo problema.
Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se reporta como
prueba Negativa.
Prueba de Vogues-Proskauer.
70
Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo.

Alfa naftol 5 g
Alcohol etlico absoluto 100 ml
Aadir 0,6 ml de la solucin de alfa naftol y 0,2 ml de una solucin acuosa al 40% de KOH a 1 ml de cultivo.
Resultados: El desarrollo de una coloracin roja en 15 minutos constituye una reaccin Positiva.
Prueba de oxidasa.
N,N,N,N-Tetrametil-p-Fenilendiamino 0,5 g
Agua destilada 100 ml
Conservar en frasco oscuro a 5-10C. El reactivo se conserva durante 14 das.
Sembrar en un tubo de base de gelosa para sangre. Incubar 18 horas a 35C. Agregar 0,3 mL de reactivo.
Resultado: La reaccin positiva se observa por la produccin de un color azul en un minuto.
Reaccin de indol.
REACTIVO DE KOVAC
P-dimetilaminobenzaldehdo 5.0 g
Alcohol amlico.o alcohol isoamlico 750 ml
Acido clorhdrico concentrado 25 ml
Disolver el p-dimetilaminobenzaldehdo en el alcohol amlico y agregar el cido clorhdrico lentamente, gota
a gota y agitando. Debe conservarse en frasco mbar con tapn esmerilado; el color del reactivo va del
amarillo al caf claro. Se debe conservar a 4C.
Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullicin, agitando ocasionalmente hasta
completa disolucin. Enfriar a 60C y ajuste el pH de 7,3 0,1.
-Solucin de cido sulfanilico
Frmula:
cido sulfanilico. 8.0 g
cido actico 5N (una parte de cido actico
Glacial a 2.5 partes de agua)1.0 L
Solucin de agua oxigenada 1:10.
Preparacin:
Preparar momentos antes de usarla. Colocar 1 mL en 9 ml de agua destilada.
Solucin de alfa naftil amina
Frmula:
Dimetil alfa naftil amina.5.0 g
cido actico 5 N 1.0 L
Solucin de alfa naftol
Frmula
Alfa naftol.5.0 g
Etanol.100.0 ml
Reactivo de Ehrlich
Frmula:
Para-dimetil amino benzaldehdo.2.0 g
71
Alcohol etlico absoluto190.0 ml

Acido clorhidrico concentrado.40.0 ml
Solucin de hidrxido de potasio al 40 %
Frmula:
Hidrxido de potasio.40.0 g
Agua destilada100.0 ml
COLORANTES
CRISTAL VIOLETA
FORMULACIN g/100mL.
Cristal violeta2.0
Agua destilada80.0
Etanol al 95%20.0
Oxalato de amonio0.8
Preparacin:
Disolver el cristal violeta en 20 mL de etanol al 95%.
Posteriormente disolver 0.8 g de oxalato de amonio en 80 mL de agua.
Una vez terminadas las soluciones mezclarlas.

YODO (LUGOL).
Formulacin en g/100mL.
Yoduro de potasio2.0
Yodo1.0
Agua destilada100.0
Preparacin:
Disolver 2 gramos de yoduro de potasio en agua destilada.
Agregar el gramo de yodo metlico y disolver.
Aforar a 100 mL con agua destilada y colocarlo en un frasco mbar,

ALCOHOL ACETONA
Formulacin en g/100 mL
Acetona50.0
Alcohol etlico100.0
Preparacin:
Adicionar lentamente el alcohol etlico a la acetona y mezclar con cuidado.
Guardar en frasco hermticamente cerrado, hasta su uso.

SAFRANINA
Formulacin en g/100mL.
Agua destilada100.0
Safranina0.5
Preparacin:
Disolver los 0.5 g de safranina en 20 mL de agua destilada.
Despus aforar a 100 mL con agua destilada

FUCSINA FENICADA
Formulacin:
72
SOLUCIN A
Fucsina bsica0.3
Alcohol etlico al 95%10.0
Mezclar hasta disolucin completa
SOLUCIN B
Cristales de fenol5.0
Agua destilada95.0
Preparacin:
Combinar las dos soluciones A y B
Filtrar a travs de un papel filtro Whatman No 2.
Mantener la solucin en un frasco mbar, protegida de la luz y filtrar nuevamente si es necesario.
AZUL DE METILENO.
Formulacin g/mL:
Azul de Metileno1 g
Agua destilada100
Preparacin:
Disolver el gramo de azul de metileno en los 100 mL. de agua destilada.

VERDE DE MALAQUITA
Formulacin g/mL.
Verde de malaquita10.0
Agua destilada100
Preparacin:
Disolver el colorante en el agua.
Filtrar a travs de papel filtro Whatman No. 2.
Guardar el colorante en frasco mbar.

PRCTICA No. 4
Ciclos Biogeoqumicos
(Ciclo del Nitrgeno)
Agar Leche
Peptona de carne5 g
Extracto de levadura3 g
Agar bacteriolgico15 g
Agua destilada1000 mL
pH7.2 + 0.2
Suspender los ingredientes en el agua destilada. Dejar remojar durante 15 minutos y hervir hasta completa
disolucin. Esterilizar en autoclave a 121 C, 15 minutos. Enfriar hasta aproximadamente 50 C.
Leche en polvo10 g
Disolver perfectamente la leche en el agua destilada. Si es necesario calentar ligeramente. Esterilizar en autoclave a
112 C (7 libras de presin) durante 15 minutos. Enfriar hasta cerca de 50 C. Ambas soluciones se mezclan antes
de vaciar a los recipientes.
Medio para Amonificadores de Stuart
KH2PO41 g
73
Na2HPO41 g
Urea20 g
Extracto de levadura0.1 g
Rojo de fenol0.01 g
Medio para Desnitrificadores
Solucin A
KNO31 g
Asparagina1 g
Azul de bromotimol al 1% (solucin alcohlica)5 mL
Solucin B
Citrato de sodio8.5 g
KH2PO41 g
MgSO4 .7H2O1 g
CaCl2 .6H2O0.2 g
FeCl3 .6H2O0.05 g
Las soluciones A y B se preparan y esterilizan por separado. Suspender y disolver todos los ingredientes en el agua
destilada. Esterilizar a 121 C, 15 minutos. Antes del vaciado se hace una mezcla de las soluciones A y B en una
relacin 1:1.
Medio para Nitrificadores (Fase I)
(NH4)2SO40.5 g
KH2PO41 g
FeSO4 .7H2O0.03 g
NaCl0.3 g
MgSO4 .7H2O0.3 g
CaCO3 7.5 g
Disolver y repartir en tubo. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Medio para Nitrificadores (Fase II)
KNO20.2 g
KH2PO41 g
NaCl0.3 g
MgSO4 .7H2O0.1 g
FeSO4 .7H2O0.03 g
CaCO3 1 g
CaCl2 0.3 g
Disolver y repartir en tubos. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Reactivo de Griess I
cido sulfanlico0.6 g
cido actico al 30%100 mL
74
Reactivo de Griess II
Alfa-naftilamina0.6 g
cido actico al 30%100 mL
75

Manual Micamb

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Manual Micamb

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

OBSERVACIN DE ORGANISMOS PROCARIOTES

TCNICAS MICROBIOLGICAS: TINCINES

TECNICAS MICROBIOLGICAS: ESTERILIZACIN

TECNICAS MICROBIOLGICAS: CULTIVO

TCNICAS MICROBIOLGICAS: AISLAMIENTO

RUTAS METABLICAS: RESPIRACIN Y FERMENTACIN

CICLOS BIOGEOQUMICOS: CICLO DEL NITRGENO

FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

MUESTREO, RECUENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DEL AGUA:

MUESTREO, RECUENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DEL SUELO: 63

MUESTREO, RECUENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DEL AIRE : 65

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

INSTRUCCIONES GENERALES DEL LABORATORIO

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

2. ORGANIZACIN CON LOS ALUMNOS

2.2 Por equipo debern traer:

Jabn para manos liquido

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

PRACTICA 1: OBSERVACIN DE ORGANISMOS PROCARIOTES

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Enfocar la preparacin con el objetivo 4X 10X, ajustar la imagen

Observar y cerrar el diafragma dispuesto en el pie del microscopio

Bajar el condensador, hasta obtener la mxima nitidez de la imagen del

Centrar el diafragma de campo luminoso en el campo visual con los tornillos

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Regular el contraste de la imagen con ayuda del diafragma del condensador.

4.3 OBSERVACIN DE PREPARACIONES FIJAS

Tabla 1 preparaciones fijas.

Tabla 2 preparaciones en fresco.

6. ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

c) Observacin de la movilidad de los microorganismos

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Figura 1 Formas y agrupaciones de procariotes

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

intensa, el resultado es una cadena de clulas, estreptococos consistentes en 4 a 10 o con ms de 20 clulas

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

8. Lavar con agua corriente.

Figura 2 Tincin de Gram

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Fig. 1 a) Porta membrana y b) membrana para microfiltracin

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Tabla 2. Gelosa sangre

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Caldo de cultivo y rojo de fenol

Rojo fenol rojo a amarillo

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Tapar el matraz con tapn de algodn y papel Kraft

Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental

Figura 1. Aislamiento por estra cruzada

Fig. 2 Diluciones decimales

Fig. 3 Aislamiento por vaciado en placa