COLUMNA DE

WINOGRADSKY
La columna de Winogradsky es un mtodo de
fcil construccin y anlisis pero efectiva
manera de simular ambientes de ecosistemas,
especialmente las interacciones de
microorganismos en suelos. (Bautista Francisco,
2004, P. 195)

UNIVERSIDAD CENTRAL

Biogeoqumica

Sonia Lucia Gonzales

Cardona
Stephanie Toro Castaeda
Juan Camilo Contreras
Andrs David Ramrez
Vivas

Luis Guillermo Avendao 1

COLUMNA DE WINOGRADSKY
OBJETIVOS.
Generar un ecosistema en el laboratorio donde aparezcan distintos tipos de bacterias
interrelacionadas metablicamente.
Identificar las diferentes etapas que ocurren durante el ciclo del azufre
MATERIALES Y REACTIVOS

Esptula
Botella plstica de 500 mL
Papel peridico.
Lodo rico en materia orgnica.
Sulfato de Calcio.
Carbonato de Calcio
Huevo
Carbonato cido de sodio
Cloruro de amonio
Balanza.

PROCEDIMIENTO
1. Para realizar la columna se utiliza una probeta de 100 ml o una botella plstica de
agua o gaseosa.
2. Aadir una fuente de carbono y energa para la cadena trfica microbiana, en este
caso es celulosa, que puede administrarse en forma de tiras de papel peridico. Es
importante que la celulosa permanezca en el fondo o en la zona intermedia, pero no
en la zona superficial
3. Se llena la columna con lodo, (materia orgnica), hasta 1/3 de su volumen.
4. Se aade a la mezcla una fuente de sulfato (sulfato de calcio, CaSO 4 o yeso) y un
agente tempanador del pH (carbonato de calcio, CaCO3).
5. El lodo tambin puede mezclarse con el contenido de un huevo, como fuente de
azufre. Se aade tambin bicarbonato sdico (NaHCO3), cloruro de amonio (NH4Cl)
y tampn fosfato pH 7,3. La mezcla se compacta para forzar la salida de las
burbujas de aire, hasta obtener una capa de unos 10 cm.
6. Se aade agua, de charca, hasta rellenar casi completamente la columna (hay que
dejar con aire unos 5 cm de la misma). Si no se dispone de suficiente agua de ro, se
puede terminar de llenar la columna con agua corriente.

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7. Se tapa la columna, con parafina o con papel de aluminio con la tapa del envase,
para evitar la evaporacin. Se coloca cerca de una ventana donde reciba luz solar
atenuada, y se deja durante varias semanas.
8. Se examinar la columna peridicamente, anotando los cambios de color y grosor
de las diferentes capas. Se tomarn muestras de las capas para estudiar los diferentes
tipos de microorganismos.
MARCO TEORICO
Los ecosistemas tienen complicadas relaciones de metabolismos bacterianos donde los
ciclos biogeoqumicos tienen fundamental importancia. Esto hace del estudio de
microorganismos en ecosistemas naturales, una actividad difcil de hacer debido a la
complejidad de las relaciones entre organismos vivos y la magnitud del campo a estudiar
(Moreno, 2012).
Por lo anterior, se simplifica el campo de estudio por medio de la Columna de
Winogradsky, donde en una representacin de ecosistema anaerbico microbiano simple, se
pueden estudiar fcilmente los ciclos biogeoqumicos, las relaciones1 y diferencias entre
diferentes tipos de microorganismos de distintas comunidades y metabolismos energticos;
adems permite observar cmo los microorganismos altamente especficos ocupan
microespacios dependiendo de sus necesidades de supervivencia y reproduccin, como sus
requisitos de carbono, energa y oxgeno. Esta simulacin de ecosistema, slo requiere de
energa lumnica para su mantenimiento, es autnomo y completamente autoreciclable
(UNAM) (Moreno, 2012) (Santos, 2009).
La columna de Winogradsky se dise en 1880 con objeto de estudiar los microorganismos
del suelo, se ha usado de manera recurrente en el aislamiento de bacterias fototrficas rojas
y verdes, y de otros anaerobios (Santos, 2009); fue diseado por el ruso Sergei
Winogradsky quien con Martinus Willem Beijerinck fueron los primeros en estudiar las
relaciones entre variados microorganismos en un mismo hbitat. El ruso precursor de la
columna, fue uno de los fundadores de la ecologa microbiana y de los ciclos
biogeoqumicos a finales del siglo XIX y principios del XX (Moreno, 2012).
La construccin de la columna de Winogradsky se hace en un recipiente transparente donde
se adicionan muestras de suelo hmedos, que se enriquecen con materiales orgnicos e
inorgnicos, posteriormente el recipiente se expone a la luz natural y se observan y analizan
los cambios, en la que probablemente haya una sucesin (Santos, 2009) (Moreno, 2012);
donde despus de 3 4 semanas aumenta la poblacin de microorganismos, que se
1 La actividad metablica de un microorganismo puede inhibir o favorecer el
crecimiento de otros microorganismos.

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establecen en diferentes partes de la columna de acuerdo a sus caractersticas fisiolgicas
(UNAM).
Pueden construirse Columnas de Winogradsky para cada ciclo biogeoqumico, la Columna
ms usada para prcticas de laboratorio es en la que involucra el ciclo del azufre como
elemento principal.
Estratificacin
La asientacin de los microorganismos forma diferentes estratos en la columna. En la zona
inferior, en ausencia de oxgeno, se desarrollan microorganismos anaerbicos de
actividades fermentativas produciendo como subproductos de su metabolismo alcohol,
cidos orgnicos, cido sulfhdrico, metano, hidrgeno y cidos grasos que sirven como
sustrato para el desarrollo de bacterias reductoras de sulfato. Los subproductos liberan
productos sulfurados que se expanden a la capa superior creando intercambios de sulfuro de
hidrgeno en diferentes concentraciones en cada capa; luego las bacterias rojas (bacterias
rojas del azufre), prpuras y verdes (bacterias verdes del azufre), se estratifican de acuerdo
a su tolerancia al sulfuro de hidrgeno, en el medio de esta zona se ubican bacterias rojas y
verdes no del azufre. En la zona media, microaerfila, se hayan bacterias oxidadoreductoras aerobias y bacterias fotosintticas que usan los compuestos qumicos para su
metabolismo. Una capa superior, pueden hallarse organismos aerbicos como algas verdes
eucariotas y cianobacterias que liberan oxgeno y mantienen esta zona de la columna
aerbica, dichos organismos crecen rpidamente en esta capa de la columna (Moreno,
2012) (Santos, 2009).
Cuadro de identificacin de potenciales microorganismos en base a la coloracin de
estratos.
COLOR
Verde
Rojo/marrn
Rojo/prpura
Blanco
Rojo/prpura
Verde
Negro

MICROORGANISMOS
Algas y Cianobacterias
Cianobacterias o Tiobacilos
Bacterias prpuras no del azufre
Bacterias sulfo-oxidadoras
Bacterias prpuras del azufre
Bacterias verdes del azufre
Bacterias sulfo-reductoras o fermentadoras
(Moreno, 2012)

Las algas y cianobacterias forman una capa superficial de color verde brillante, y al
producir oxgeno ayudan a mantener la aerobiosis en la zona superior de la columna,
mientras que, en el fondo de la columna, las bacterias reductoras del sulfato (SO 4-2)
producen sulfuro, que provoca el crecimiento de bacterias rojas y verdes del azufre, de
modo que se establecen dos gradientes en la columna, uno deoxgeno y otro de sulfuro de
hidrgeno (H2S).

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Las bacterias quimiorganotrofas crecen a lo largo de toda la columna, los microorganismos
aerobios y microaerfilos en la parte superior, los anaerobios en las zonas donde hay
sulfuro de hidrgeno, al cabo de cuatro o seis semanas comenzarn a observarn una serie
de comunidades microbianas en la columna, que de arriba abajo son: (ver figura)

Principales reacciones (desde la parte superior a la inferior en la Columna de Winogradsky)

CO2 + 2 H2O (CH2O) + H2O + O2 Fotosntesis

SH2 + 2 O2 H2SO4 Organismos del S
2 SH2 + O2 2 S + 2 H2O Beggiatoa y Thiothrix
CO2 + 2 SH2 2 (CH2O) + 2 S + H2O Anoxigenica
(CH2O)2 + SO4-2 + 8 H+ 3(CH2O) + CO2 + S-2 + H2O Quimioorganotrofo y anaerbico

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En las dos ltimas capas de la columna, las Cianobacterias producen la fotosntesis usando
el agua como cedente de electrones con liberacin de oxgeno molecular, por ende se
produce una zona oxignica (Sagardoy, 2004).
Clasificacin de microorganismos
La identificacin de los microorganismos presentes en la Columna de Winogradsky
generalmente se hace de manera macro, observando la coloracin, las caractersticas y
comportamiento a travs del tiempo de los materiales que componen la Columna. Hacer un
anlisis ms profundo para determinar de manera exacta las concentraciones de la solucin
y los microorganismos presentes en ella requiere de procedimientos ms complejos, que
pueden involucrar algunas herramientas de difcil adquisicin (Santos, 2009).

Pigmentos microbianos:
Una forma de identificacin de microorganismos puede ser posible por sus
caractersticas de los pigmentos microbianos, los cuales suelen ser carotenoides y
clorofilas; especialmente los carotenoides se encuentran en todo el Reino Vegetal en
tejidos fotosintticos y no fotosintticos.
Cuando los pigmentos se extraen para su estudio, se debe hacer con especial
cuidado debido a su fragilidad con la temperatura, luz y aire; estos elementos
favorecen diferentes reacciones en los pigmentos que pueden provocar su
degradacin o descomposicin. Por tal motivo, se debe (preferiblemente) realizar la
prctica lo ms rpido posible, en ausencia de luz, oxgeno y a temperatura
ambiente o menor.
Despus de haber obtenido el extracto de carotenoides, se pueden separar por
liofilizacin, ste mtodo tiene mejores ventajas respecto a los dems porque se
realiza a baja temperatura y al vaco.

Cromatografa:
La determinacin de presencia y cantidad de microorganismos por cromatografa se
hace por medio de la separacin por competencia de dos fases, una fija y otra mvil.
La muestra que es aplicada a la fase fija es adsorbida por la actividad de fuerzas
electrostticas en la superficie del material, luego se liberan en dependencia a la
constante de afinidad de los componentes de la muestra de fase mvil.

Cromatografa en Capa Fina (CCF):

En esta tcnica de separacin, la fase fija est sobre un plano, haciendo una capa de
partculas slidas esparcida sobre una placa de vidrio o aluminio que sirve como
soporte. La muestra se aplica en puntos o en banda, para seguidamente, ser diluida
en un tanque cromatogrfico.

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Si los elementos de la muestra no pasan de incoloros a coloros, puede ser necesario
usar el revelado de la placa, mtodo que permite visualizar los elementos presentes
en la muestra.
El mtodo requiere contar con un patrn de referencia para comparar el valor de
efecto retardo (Rf) de la muestra a analizar y el color de la muestra estndar al ser
revelada con agentes qumicos

Mtodo de revelado de placa:

El mtodo de revelado de placa se puede hacer por mtodo qumico o mtodo fsico.
En el primero se obtienen derivados coloreados o fluorescentes de los componentes
de la muestra. En el segundo, con radiacin con luz UV a la placa cromatogrfica a
254nm-365nm.

Caracterizacin espectral:
Cuando hay carotenoides que no se pueden identificar por CCF, revelado de placa y
comparacin de muestras, se debe recurrir a identificacin por mtodos espectrales,
tales como UV-visible, iR, EM y RMN (Resonancia Magntica Nuclear). El
espectro visible de los carotenoides se encuentra alrededor de 400 a 500nm. El
espectro por iR es poco til y rara vez se usa, pero tiene utilidad en carotenoides de
poca aparicin en las muestras.

DATOS OBTENIDOS

15 DE FEBRERO: primera toma que se basa en la construccin de la columna de

winogradsky

3 DE MAYO: 2 toma que se basa en la observacin de la columna pasados 3 meses

aproximadamente

DIMENSIONES FINALES DE CADA UNA DE LAS CAPAS

PRIMERA CAPA (papel peridico)

6,8cm

SEGUNDA CAPA (tierra)

4,7 cm

TERCERA CAPA (parte liquida)

5 cm

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CUESTIONARIO

1. Realice los dibujos correspondientes a cada una de las observaciones realizadas

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2. Investigar las principales reacciones de oxidacin y reduccin que se presentan en

las zonas de la columna indicando la clase de microorganismos.
Zona aerbica:
Esta es la parte de la columna ms rica en oxgeno y ms pobre en azufre. El agua de la
parte superior de la columna contiene abundantes poblaciones de microorganismos
aerobios, que aparecen normalmente en hbitats acuticos ricos en materia orgnica
(estanques poco profundos, arroyos, etc.). Suelen ser microorganismos flagelados, lo que
les permite moverse y establecerse en nuevas reas, as como microorganismos
fotosintticos: algas (diatomeas) y cianobacterias filamentosas. El oxgeno que producen
estos productores primarios difunde desde la superficie, creando condiciones similares a las
que existen en un lago con sedimentos ricos en nutrientes.
Zona microaerfila:
Es la zona en la que solapan ambos gradientes, el de oxgeno y el de sulfuro de hidrgeno.
Aparecen bacterias oxidadoras del azufre como Beggiatoa Thiothrix o Thiobacillus, que
usan como fuente de carbono la materia orgnica, y oxidan el H2S que llega por difusin
desde las capas inferiores a azufre elemental. La reaccin qumica que se lleva a cabo es la
siguiente (reaccin de Bunsen): O 2+ H2S H20 + S. Son, por lo tanto,
microorganismos mixtrofos. Estos gneros acumulan grnulos de azufre en sus
citoplasmas por oxidacin del H2S. Si se deja evolucionar el sistema, cuando la
concentracin de H2S es muy baja, los grnulos de azufre elemental intra- citoplasmtico

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presentes en estas bacterias empiezan a desaparecer poroxidacin total a sulfato (H2S
S0SO4 (2 ))
Zona anaerbica:
Esta zona contiene H2S (procedente del fondo), en la zona anaerbica superior predominan
las bacterias fotosintticas anaerobias, y en la columna se observan bandas de colores rojo y
verde:

Bacterias
rojas
no
del
azufre:
Rhodospirillum,
Rhodomicrobium
Rhodopseudomona, son bacterias anaerobias fotoorgantrofas, que slo pueden
realizar la fotosntesis en presencia de una fuente de carbono orgnico. Forman una
capa de color rojo-anaranjado. Las bacterias verdes no del azufre son termfilas y,
por lo tanto, no crecen la columna a temperatura ambiente.

Bacterias rojas del azufre: (Chromatium, Thiospirillum, Thiocapsa, forman una capa
de color rojo-prpura) y bacterias verdes del azufre, (Chlorobium, Pelodyctium).
Estas bacterias son fotolittrofas y realizan una fotosntesis anoxignica, no
producen oxgeno ya que no utilizan H2O como elemento reductor sino H2S,
generando en este proceso sulfatos (SO 4-2). La reaccin que tiene lugar es la
siguiente: 2 H2S + CO2 (CH2O) + H2O + 2 S0 Estos microorganismos aparecen
como zonas decrecimiento en el lodo de la columna, pero tambin pueden
desarrollarse en el agua si los fottrofos oxignicos son escasos.

En la zona anaerobia ms profunda, de color negro intenso, aparecen microorganismos

capaces de realizar respiracin anaerbica y fermentacin.

Bacterias reductoras del sulfato (BRS): Desulfovibrio, Desulfobacter

Desulfotomaculum o Desulfomonas. Usan el sulfato, u otras formas parcialmente
oxidadas de azufre como el tiosulfato, y generan grandes cantidades de H 2S en el
proceso. La reaccin de reduccin bacteriana del sulfato es la siguiente:
SO4-2 + 8 H+ H2S + 2 H2O + 2 OH. Este H2S reaccionar con el hierro presente
en el sedimento, produciendo sulfuro de hierro (II), que precipita y da el color
negro. Es por esto que, en la naturaleza, los sedimentos acuticos son
frecuentemente negros. La reaccin sera la siguiente:

Sin embargo, no todo el H2S reacciona con el hierro (II), parte de ste difunde hacia arriba a
lo largo de la columna de sedimentos y es utilizado por las bacterias verdes y rojas del
azufre que crecen en las zonas superiores.

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Bacterias fermentadoras: utilizan la celulosa del papel aportado como fuente

primaria para su metabolismo, aparecen las bacterias del gnero Clostridium Son
anaerobias estrictas, y no empiezan a crecer hasta que el oxgeno desaparece del
sedimento. Estas bacterias degradan la celulosa hasta residuos de glucosa y, a
continuacin, fermentan la glucosa para obtener la energa que necesitan,
produciendo una serie de compuestos orgnicos simples (etanol, cido actico,
cido lctico, cido succnico, etc.) como productos finales de esa fermentacin.
Estos compuestos orgnicos sern, a su vez, respirados por las bacterias reductoras
del sulfato. Cuando la celulosa se agote, usarn la materia orgnica producida por el
resto de bacterias.

Tambin pueden aparecer bacterias metanognicas que generan CH4, que se observa como
burbujas de gas en el fondo de la columna

3. Investigar cmo se relaciona la practica con los ciclos biogeoqumicos.

La transformacin de los elementos claves para la supervivencia de los organismos

dentro de la columna tienen relacin con los ciclos biogeoqumicos, pues las
relaciones de transformacin y traslado de compuestos de una clase de organismos a
otro, se da por medio de los nombrados ciclos biogeoqumicos (UNAM).

La columna de la prctica se enfoca sobre todo al ciclo del azufre, pero se podra
desarrollar igualmente la reproduccin de otros ciclos biogeoqumicos equivalentes para
nitrgeno, carbono y otros elementos.

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Las bacterias y arqueas tienen gran cantidad de diferentes formas metablicas, que son
mantenidas por las relaciones y dependencias que hay entre microorganismos, unos
incentivan el crecimiento de otros y algunos inhiben el desarrollo de otros
microorganismos.
La mineralizacin2 o solubilizacin3 de un compuesto y la oxido-reduccin del
cometabolismo de los microorganismos con interacciones con los ciclos biogeoqumicos 4
dependen de las condiciones ambientales. Estos organismos incentivan el desarrollo de sus
pares.
En funcin de la actividad enzimtica de los microorganismos, pueden usar elementos o
compuestos orgnicos e inorgnicos de la naturaleza, tal como ocurre con el fsforo, dado
que la mayora del elemento en la naturaleza, est atrapado en las rocas y en el suelo y
algunos otros se encuentran en condiciones insolubles en agua; la disponibilidad del
elemento para los organismos vivos es limitada. En razn a lo anterior, puede radicar la
importancia del ciclo del fsforo, en la medida que se produce la mineralizacin y
solubilizacin de las formas insolubles y la asimilacin de los fosfatos inorgnicos.
El azufre abunda en la corteza terrestre, se encuentra disponible como sulfato soluble o en
compuestos orgnicos; el ciclo biogeoqumico del azufre se produce por la reduccin a H 2S
por cuenta de los microorganismos, posteriormente el sulfato reducido por la reaccin de
oxidacin es usada por bacterias anaerbicas para su metabolismo.
El azufre es uno de los numerosos compuestos orgnicos, algunos forman protenas, otros
llegan a plantas y productores primarios en forma de ion sulfato SO 4-2; los organismos lo
incorporan a las molculas en forma de protena y luego, por cadena trfica, llegan a
organismos superiores. Cuando estos mueren, el azufre de las protenas se descompone y
entra al ciclo del azufre en forma de ion sulfato en que las plantas pueden usarlo
nuevamente.
El antagonismo o antibiosis es el caso en el que los metabolitos inhiben el crecimiento de
otros organismos, por medio de la produccin de sustancias txicas (en concentraciones
menores a 10 ppm) para los otros microorganismos (UNAM)

2 Por mineralizacin se entiende por la transformacin de un compuesto orgnico, a uno inorgnico

3 Solubilizacin est definida como la transformacin de un compuesto de una forma insoluble,
normalmente inorgnica, a otra soluble en agua. Por lo cual los compuestos quedan disponibles para
los organismos.
4 Las transformaciones se realizan por medio de reacciones de xido-reduccin de elementos como
el Nitrgeno, Azufre, etc., por consiguiente algunas transformaciones ocurren en ambientes
aerobios o anaerbicos.

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Anlisis
En la prctica se busc identificar de manera general, las caractersticas de los compuestos
y la presencia de microorganismos en un micro-ecosistema construido con una muestra de
lodo, papel peridico y otros compuestos orgnicos e inorgnicos. En ella se puede
observar en la Columna de Winogradsky la an abundante presencia de celulosa
(representada en papel peridico), la cual tiene la capa de mayor tamao. La zona anaerobia
es la zona de menor tamao entre las tres capas identificadas, en ella hay menor cantidad de
bacterias. En la ltima capa, la zona aerobia y microaeroflica hay mayor presencia de
oxgeno y por ende, mayor presencia y actividad microbiana.
La coloracin de las capas, especialmente en la capa microaeroflica y anaerbica no es
clara, posiblemente debido a que durante la prctica se agit la Columna y la coloracin se
torn homognea.

Conclusiones
En la capa anaerobia hay presencia de bacterias reductoras que dan el aspecto negro
observado en la Columna analizada, stas componen la mayor parte de la poblacin de los
microorganismos en la capa, a juzgar por su coloracin. La ausencia de lodo, el ambiente
anaerobio observado y la descomposicin de parte de la celulosa, evidencian la presencia
de bacterias Clotridium.
En las capas microaeroflicas y aerobias se observan una mayor cantidad de actividad y
poblacin de bacterias; en ella no se visualizan bacterias prpura no del azufre, tampoco
bacterias prpuras del azufre. A pesar de que las coloraciones no son lo suficientemente
claros, se puede especular que hay presencia de algas, Cianobacterias, Tiobacilos, bacterias
sulfo-oxidadoras y bacterias sulfo-reductoras o fermentadoras

BIBLIOGRAFIA

Columna de winogradsky. Prcticas de ecologa microbiana. Alberto Fonte polo

http://es.scribd.com/doc/59281261/Columna-de-Winogradsky
Sagardoy marcelo.(2004) , Biologa de estudio , Baha Blanca Argentia
Universidad Nacional del Sur

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COLUMNA DE WINOGRADSKY

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Formadeprepararlacolumnayejemplosd
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Moreno, R. (15 de Julio de 2012). Revista Reduca. Recuperado el 12 de

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Sagardoy, M. (2004). Biologa del suelo. Baha Blanca, Argentina:

Editorial de la Universidad Nacional del Sur.

Santos, A. (13 de Julio de 2009). Revista Reduca. Recuperado el 12 de

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UNAM. (s.f.). UNAM. Recuperado el 12 de Mayo de 2013, de

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/DiversidadMicrobianaColum
naWinogradsky_21554.pdf