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A1.1 HEMATIMETRA
Importancia del hemograma en el diagnstico hematolgico.
Interpretacin. Utilidad del frotis sanguneo.
Generalidades
El hemograma efectuado por mtodos manuales automticos, que
incluye el recuento de reticulocitos y plaquetas, constituye uno de los
anlisis bsicos para el diagnstico clnico y hematolgico. Su
validacin requiere el conocimiento de todos las fases del proceso
analtico (pre analtico, analtico y post analtico).
Este conocimiento se extiende desde la extraccin de sangre hasta
la entrega del resultado, requiere, no slo que el paciente se
encuentre en condiciones basales, sino tambin, previo a la
extraccin, realizar una pequea anamnesis en la que conste: edad,
sexo, embarazo concomitante (indicar edad gestacional), patologas
de base existentes, ingesta de medicamentos, tipo de alimentacin,
contacto con txicos, quimioterapia, radioterapia o transfusiones
previas, peso al nacer (en caso de tratarse de un neonato) etc. Tiene
importancia tambin si el paciente es ambulatorio o internado y, en
este ltimo caso, si slo recibe alimentacin parenteral. Adems, es
necesario conocer los valores de referencia de la poblacin a la que
pertenece el paciente.
Deben respetarse condiciones estndares en la forma de extraccin
de la muestra: venosa, arterial capilar; el tipo de anticoagulante, la
relacin anticoagulante / sangre, si la muestra ha sido extrada en el
propio laboratorio derivada.
Debe remarcarse que los frotis deben ser realizados con sangre
sin anticoagulante y secados inmediatamente con aire seco a
temperatura no mayor de 40C. En todos los casos debe rotularse
correctamente a los fines de identificar fehacientemente al paciente.

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El procesamiento de la muestra, si se conserva a temperatura
ambiente, debe ser realizado antes de las seis (6) horas; si es
conservada a 4C, este tiempo puede extenderse hasta veinticuatro
(24) horas (ver manual de Tcnicas).
Previa constatacin del volumen adecuado de muestra y de la
ausencia de microcogulos, contaminacin crioaglutinacin (en
este ltimo caso se aconseja calentar la muestra a 37C y diluir para
el recuento, con solucin fisiolgica,

en iguales condiciones) se

realizar el hemograma, que requerir de la validacin de los

mtodos analticos, de la calibracin de analizadores y/ control de
calidad interno y externo. El proceso post analtico consiste en los
registros e informes, que requerirn de control de resultados y/o de
validacin informtica.
Si bien el hemograma por mtodos manuales adolece de un margen
de error superior al de los mtodos automticos, a los fines clnicos,
los resultados obtenidos son suficientes para efectuar una correcta
interpretacin y permiten realizar tambin el clculo de los ndices
hematimtricos.
Segn el Comit de Standardizacin en Hematologa (ICSH), se
deber informar: los GR, los GB y las Pq por litro (por ejemplo:
GR: 4.5 x 1012 / l; GB: 5 x 109 / l, Pq: 250 x 109 / l), Hb: en g/dl, Ret:
en % en valor absoluto, VCM en fl, HCM en pg, CHCM en g/dl.
Examen del frotis e informe
Una vez efectuado el recuento de eritrocitos, leucocitos, plaquetas y
reticulocitos, determinada la concentracin de Hb y el hematocrito,
puede procederse al clculo de los ndices hematimtricos. Los
mismos difieren algo de los obtenidos por los mtodos automticos,
pero siguen siendo de utilidad, sobre todo si la poblacin de
eritrocitos es homognea. Como los mtodos manuales no permiten

3
saber la variabilidad de dichos ndices, es imprescindible efectuar en
todos los casos la observacin de la morfologa de los eritrocitos en
el frotis sanguneo.
En el caso de que el recuento de leucocitos sea muy bajo
(<1.000/mm3) se aconseja efectuar una dilucin menor: ejemplo 1/10
1/5). Si el recuento de GB es >30.000 se aconseja efectuar el
recuento en el Retculo de Thoma, como si fueran GR y multiplicar
por 1.000 para obtener el resultado en GB/mm3.
Si al contar plaquetas se observaran microagregados no se podr
efectuar el recuento manual y podr inferirse un valor al observar el
frotis bien extraer sangre con otro anticoagulante (por ej., citrato)
ya que esta aglutinacin puede deberse a la pseudoaglutinacin
producida por el EDTA. Estos microagregados pueden encontrarse
en sangre de algunos pacientes y pueden ser cuantificados.
El frotis sanguneo permite una integracin global de los datos del
hemograma: en primer lugar controlar si el recuento de GB est
correctamente realizado por cuanto se podr observar si existe
leucopenia o leucocitosis. Algo similar ocurre con las plaquetas. Esto
es cierto siempre y cuando no se observen microcogulos en el
extendido.
La frmula leucocitaria relativa (FLR) se efecta segn el esquema,
de modo de clasificar tanto clulas pequeas (linfocitos y basfilos)
como clulas grandes (granulocitos, monocitos, blastos, etc.)

Esto permite una gran reproducibilidad en las frmulas cuando son

realizadas por distintos operadores. Al efectuar la FLR deben

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incluirse en la misma tanto los leucocitos normales como las
clulas

juveniles

(metamielocitos,

mielocitos

maduros),

las

inmaduras (blastos, promielocitos, etc.) y los linfocitos atpicos

clulas irritativas. En el caso de que pudieran detectarse
eritroblastos o normoblastos, estos deben informarse como N de
normoblastos por cada 100 leucocitos. En caso de que el nmero
fuese mayor a cinco (5) es necesario efectuar una correccin en el
recuento de leucocitos, calculndose la cifra de GB de la siguiente
manera. Ej.: en caso de clasificar cien leucocitos y veinte
eritroblastos
120 clulas clasificadas

100 leucocitos

N de leucocitos contados

X = N de leucocitos contados x 100 leucocitos = GB/mm3

120 clulas clasificadas
Es muy importante identificar correctamente todas las clulas que
aparecen, incluso formas de lisis de serie linfocitaria denominadas
Placas de Gumprecht. Estas se informan pero no se cuantifican.
Pueden tambin encontrarse clulas epiteliales que no es necesario
informar.
Se deben informar tambin las granulaciones txicas que pueden
aparecer en los neutrfilos, la presencia de neutrfilos sin lbulos
(aparecen como mielocitos con ncleo compacto) que corresponden
al fenmeno de Pelger Huet (puede ser congnito adquirido).
Deben observarse los linfocitos a los fines de determinar si
presentan proyecciones finas como cabellos, que se clasifican como
tricoleucocitos y observar si los monocitos se encuentran
fagocitando algn GR.
Pueden tambin aparecer parsitos.

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En cuanto a las plaquetas debe observarse la cantidad, el tamao
(2 a 5 m), la presencia de crommero y deben hallarse
normalmente agregadas. Si el nmero fuese normal, pero se
encontraran dispersas, esto deber informarse. Si existe ausencia
de crommero tambin debe informarse.
En cuanto a los hemates se observarn en la zona indicada como
H en el esquema bien dnde se encuentren los hemates
separados y con la zona central clara. Si los hemates estuviesen
totalmente teidos, se deber buscar otra zona de observacin en el
frotis. Si se observa Rouleaux (formacin de pilas de monedas)
aglutinacin deber informarse. Si no existiera esto se informar, si
existe: anisocitosis (diferencia de tamao de los GR), considerar
normocitos (GR de 7.2 m de dimetro), microcitos (GR de
dimetro < a 6 m), macrocitos (GR > de 9 m), megalocitos (GR
de dimetro > a 10 m que al tener mayor espesor se observan sin
la zona central clara, a veces pueden tener forma oval por lo que se
los llama macroovalocitos), poiquilocitosis (diferencia de forma),
anisocroma (diferencia de color rosado entre los hemates),
hipocroma (hemates con la zona central clara muy grande),
policromasia (diferencia de color: hemates rosados, grises, gris
azulados, etc.). Este ltimo tem se correlaciona con el porcentaje de
reticulocitos. En todos los casos se informar mediante el
Sistema de cruces: + (aislados), ++ (escasos), +++ (regular
cantidad) y ++++ (abundantes).
Del mismo modo deber informarse la presencia de esquistocitos
formas hemolticas que, en caso de adoptar formas caractersticas,
se informarn como tales: en cscara de huevo, pince de nez,
dacriocitos, formas triangulares, etc.
La presencia de ciertos hemates, por ejemplo, drepanocitos,
acantocitos, equinocitos, esferocitos, ovalocitos de eritrocitos

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con parsitos intracelulares inclusiones (cuerpos de Howell
Jolly, anillos de Cabot, punteado basfilo, punteado azurfilo)
tambin debern ser informados.
Las alteraciones mencionadas Ud. puede verlas en el Atlas.
Interpretacin
La interpretacin correcta del hemograma necesita del conocimiento
de los valores de referencia para la poblacin en estudio. Dichos
valores, para la zona de Rosario (ciudad a nivel del mar) se
encuentran en las tablas de referencia N 1 y 2 (ver pg 8 y 9).
Los valores de referencia de plaquetas son 150-350 x 109/l, para
ambos sexos, cualquier edad, inclusive, embarazo.
Las cifras de reticulocitos en adultos y nios oscilan entre 0.5-2.0 %,
encontrndose valores de hasta 5.2 1.9 % en recin nacidos. Este
valor disminuye gradualmente hasta alcanzar un valor de 1.1 1.0
entre los 6 y 12 meses de edad. En recin nacidos a trmino puede
aparece hasta un 2% de eritroblastos ortocromticos.
Con respecto a la morfologa de serie roja lo normal es observar
franca macrocitosis y policromatofilia en recin nacidos. Esta es
mayor si se trata de nios prematuros. Aproximadamente, al 3 mes
de vida, existe una poblacin de macrocitos, microcitos y aislados
esquistocitos. Entre los 6 y 12 meses es caracterstica la
microcitosis, que va disminuyendo con la edad hasta los 4 aos de
vida, cuando comienzan a observarse normocitos. En el adulto y la
embarazada normales la morfologa es de normocitos. En todos los
casos los eritrocitos son normocrmicos no existiendo poiquilocitosis
apreciable. Cuando la poblacin de eritrocitos es uniforme, como
ocurre en el recin nacido, lactante adulto, existe una buena
correlacin con los ndices hematimtricos.

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La comparacin de los datos obtenidos con los valores de referencia
nos permitir inferir si se trata de un hemograma normal para la
edad y sexo del paciente bien si nos encontramos frente a una
patologa.
Ms adelante, al efectuar la evaluacin de anemias y de alteraciones
de los leucocitos, veremos la metodologa a seguir para arribar al
diagnstico presuntivo ms probable.

TABLA N 1 - VALORES DE REFERENCIA ROSARIO. Provincia de SANTA FE

Hombres y
mujeres post
menopusicas
Mujeres en
edad
gestacional
Recin nacidos
(sangre de
cordn)
Neonatos (en el
3 mes de vida)
Lactantes (6
meses a 1 ao)
Nios
(1 a 2 aos)
Nios
(2 a 12 aos)
Embarazadas
(1 trimestre)
Embarazadas
(2 trimestre)
Embarazadas
(3 trimestre)

Hb g/dl

GR 1012/l

Hto %

VCM fl

HCM pg

CHCM g/dl

14.4 1.0

4.93 0.33

44.0 1.8

89.2 3.2

29.3 2.0

32.7 1.3

12.9 1.0

4.43 0.27

40.0 2.1

90.0 3.6

28.9 1.4

32.2 1.5

15.5 1.1

4.66 0.33

49.0 4.3

105.1 5.3

33.3 1.2

32.5 1.3

9.7 0.9

3.63 0.62

31.0 3.2

85.0 8.1

26.7 1.8

31.2 1.8

11.7 0.7

4.50 0.61

36.0 2.0

80.1 7.0

26.0 1.3

32.5 1.3

12.0 0.7

4.61 0.62

37.0 2.0

80.2 5.0

26.0 1.2

32.4 1.1

12.4 1.1

4.60 0.8

37.0 2.0

80.4 4.0

27.4 2.7

33.5 1.0

11.8 1.2

Sin datos

Sin datos

Sin datos

Sin datos

Sin datos

10.5 1.3

Sin datos

Sin datos

Sin datos

Sin datos

Sin datos

11.6 1.2

Sin datos

Sin datos

Sin datos

Sin datos

Sin datos

TABLA N 2 - LEUCOCITOS - FLR

CORDN

EN
TOTALES
NEUTRFILOS EOSINFILOS BASFILOS LINFOCITOS MONOCITOS
CAYADO
. 109/l
%
%
%
%
%
%
9
52
2.2
0.6
31
6
16 8

1 SEMANA

12 6

39

4.1

0.4

41

2 SEMANA

11 5

5.5

34

0.5

48

2 MES

11 5

35

14

01

60

4 6 AOS

8.5 3.0

45

14

01

45

6 13 AOS

7 3

56

14

01

34

02

55 65

14

01

25 35

48

13

65 80

14

01

15 25

4-8

ADULTOS
72
AMBOS SEXOS
EMBARAZADAS 7.5 2.0

NOTA: En recin nacidos y en embarazadas puede observarse desviacin a la izquierda, con aparicin de metamielocitos,
mielocitos maduros y an algn inmaduro.

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Consideraciones tcnicas
El hemograma consta de:
 Recuento de GB
 Recuento de GR
 Dosaje de hemoglobina (Hb)
 Hematocrito (Hto)
 Frmula leucocitaria relativa (FLR)
 Morfologa de serie roja y plaquetaria
Un hemograma especializado, incluye adems:
 Recuento de plaquetas (Pq)
 Recuento de reticulocitos (Ret)
Toma de muestra
Puede utilizarse sangre venosa o sangre capilar.
 Hemograma capilar: preferiblemente dactilar, pero puede
tomarse tambin del taln, lbulo de la oreja dedo gordo del pie
(especialmente en nios).

Debe punzarse con precisin y

alcanzar una profundidad de 3 mm. Se utiliza una lanceta

descartable. Nunca debe hacerse la puncin en zonas cianticas,
edematosas, congestionadas, etc., dado que introduce error en
los resultados. La sangre debe fluir libremente, sin presionar
mucho la zona, caso contrario pasara mucho lquido tisular lo
que provocara hemodilucin.
Tcnica de puncin: se utilizan lancetas descartables, algodn
y alcohol de 96. Se limpia la zona elegida, se seca y se punza.
La 1 gota se desecha porque contiene lquidos hsticos y se
ejerce una leve presin para que fluya la sangre. Si se saca del
taln conviene calentar previamente la zona, caso contrario

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suelen obtenerse valores ms altos que el venoso. Se cargar en
un micro contenedor con anticoagulante.
 Hemograma venoso: generalmente se extrae de la vena del
pliegue del codo, en la zona anticubital de las venas de la cara
dorsal de la mano pie. Se utiliza un equipo de jeringa y aguja:

Adultos: 25 x 8 mm

Nios: 15 x 0.7 mm

Ventajas y desventajas de la sangre capilar y venosa.

VENTAJAS

SANGRE
CAPILAR

SANGRE
VENOSA

DESVENTAJAS

Al cargar el material,
los elementos salen
distribuidos tal y como
se distribuyen en el
organismo.

No se pueden repetir las

determinaciones, deben
cargarse tubos y material
delante del paciente.

Pueden repetirse las

determinaciones y
permite controlar la
precisin y exactitud de
los mtodos usados.

Requiere el uso de
anticoagulantes en
concentraciones
adecuadas y debe
agitarse muy bien antes
de cargar el material.

Diferencias halladas entre sangre capilar y venosa

En un hemograma capilar puede estar algo aumentado el recuento
de GB debido a la marginacin perifrica de los mismos. Las Pq
pueden estar ligeramente disminuidas debido a la adhesin y
agregacin de las mismas con la zona lesionada. Para GR, Hb y Hto
no existen diferencias. A los fines clnicos no existen diferencias
significativas entre uno y otro.

12
Determinacin que debe hacerse sin anticoagulante: extendido
de sangre para FLR.
Anticoagulantes
 EDTA:

Las

sales

de

sodio

potasio

del

cido

etilendiaminotetractico (EDTA) son poderosos anticoagulantes y

suelen elegirse para el trabajo hematolgico normal. La
concentracin recomendada para la sal dipotsica es de
1.5- 2.0mg/ ml de sangre. El exceso de EDTA afecta a los GR,
GB y produce encogimientos y cambios degenerativos. Si se
emplean ms de 2 mg/ ml de EDTA, puede producirse una
disminucin importante en el Hto y un incremento en la CHCM.
En consecuencia, hay que agregar la cantidad correcta de sangre
al anticoagulante. Estos dos deben mezclarse bien, invirtiendo el
recipiente varias veces.
 Heparina: no afecta el tamao de los eritrocitos y, en
comparacin con el EDTA, es menos probable que cause
hemlisis. Puede usarse a una concentracin de 15 a 20 UI/ ml
de sangre, sin embargo, la sangre heparinizada no debe usarse
para preparar extendidos de sangre porque colorea el fondo de
azul claro, ni para recuentos de leucocitos porque tiende a
hacer que stos se aglutinen.

Almacenamiento y transporte de muestras de sangre

Los extendidos preparados con sangre anticoagulada (EDTA), que
han permanecido no ms de 1 hora a temperatura ambiente,
presentan pocos cambios en comparacin con los extendidos
preparados inmediatamente despus de extraer la muestra. A las
3 hs los cambios son discernibles y a las 6 u 8 sorprendentes. Los
GB presentan vacuolas y cambios nucleares degenerativos. La

13
morfologa de los GR no se ve muy afectada si la sangre permanece
hasta 6 hs a temperatura ambiente, pero luego de este lapso
comienza la crenacin. Todos estos cambios se producen con mayor
rapidez si la temperatura ambiente es ms alta y se retrasan si la
sangre se conserva a 4C. Tambin en otras pruebas se encuentran
alteraciones, por lo que aumenta el Hto, disminuye la velocidad de
sedimentacin y se reducen los recuentos de GB y Pq. El recuento
de Ret comienza a disminuir a partir de las 6 hs y los GR nucleados
desaparecen de la muestra de sangre en 24 a 48 hs. Como estos
cambios se producen con mayor lentitud a temperaturas ms bajas,
en la mayor parte de las pruebas es posible dejar la sangre a 4C
durante la noche, aunque es mejor realizar el recuento de leucocitos
y Pq en las 2 hs siguientes a la extraccin de sangre, la Hb
permanece inalterada durante varios das, si la muestra no est
contaminada. Si se almacena la sangre a 4C, es necesario dejar
que tome temperatura ambiente y mezclarla bien antes de efectuar
las pruebas.
Recuento globular visual
Se realiza utilizando cmaras cuentaglbulos y una dilucin
adecuada de la muestra. Estas se realizan con lquidos diluyentes.
Diluyente para recuento de GR
 Diluyente de Gowers: tiene la ventaja de que mantiene la forma
y el tamao de los GR. La concentracin de cido actico no es
lo suficientemente alta como para producir hemlisis.
Lquido de Gowers:
Sulfato de sodio anhidro

12.5 g

cido actico

33.3 g

Agua destilada csp

200 ml

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 Solucin fisiolgica: Su ventaja es que impide la formacin de
rouleaux, por lo que se utiliza en los casos en que se produce
aglutinacin pseudoaglutinacin. La desventaja es que se debe
realizar el recuento inmediatamente y slo sirve para los GR.
Diluyentes para el recuento de GB
Para el recuento de GB tambin pueden utilizarse los diluyentes
recomendados para el recuento de Pq.
 Solucin de Trk: tiene la ventaja de hemolizar bien los GR y el
colorante

agregado

permite

visualizar

perfectamente

los

leucocitos.
Lquido de Trk
cido actico glacial

3 ml

Agua destilada csp

100 ml

Solucin azul brillante de cresil

1 gota

Diluyente para el recuento de Pq

 Solucin de Milani: debe prepararse en el momento de usarse y
se puede conservar estril

en la heladera, caso contrario se

volver inestable y servir slo para un da de trabajo. La

novocana impide la agregabilidad y libera la Hb de los GR.
 Solucin de Oxalato de amonio al 1% (Mtodo de Bretcher):
su ventaja es que permite visualizar perfectamente las Pq y es
una solucin econmica y fcil de preparar. El inconveniente es
que debe conservarse a 4C y controlarse meticulosamente la
contaminacin con grmenes ya que stos producen una
refringencia similar a los trombocitos.
Material utilizado para los recuentos visuales
 Cmaras cuentaglbulos

15
 Cubrecmaras
 Micropipetas de recuento globular micropipetas de 20l con
capilar de vidrio para dilucin en tubo.
 Diluyentes
Por razones de bioseguridad es conveniente efectuar la dilucin en
tubos y no en micropipetas de recuento globular.
Dilucin para GR
Colocar en un tubo de hemlisis 4 ml de diluyente. Agregar 20 l de
sangre. Mezclar. (dilucin 1/200)
Dilucin de GB y Pq
Colocar 0.38 ml de diluyente. Agregar 20 l de sangre. Mezclar.
(dilucin 1/20)
Recuento de GB
Se realiza en la cmara cuentaglbulos, que deber tener certificado
de exactitud, a la que se le habr colocado el cubrecmaras
correcto. Los GB se cuentan en los 4 cuadrados primarios de los
extremos que, a su vez, estn divididos en 16 cuadrados
secundarios. Se cuentan los GR que tocan la lnea media superior y
la izquierda y todos los que estn en el cuadrado primario sin
considerar los que tocan la lnea derecha y la inferior.
Clculo: cada cuadrado primario tiene una superficie de 1 mm2 y un
volumen de 0.1 mm3.
Elementos contados (N)

4 mm2

1mm2

N/4

16
Dado que el espesor de la cmara es 0.1 mm, para expresar el
nmero de elementos por mm3 deberemos multiplicar el valor X por
10.
X= N/4 x 10
Como se ha efectuado una dilucin de 1/20, debemos multiplicar por
la dilucin, es decir:
X= N/4 x 10 x 20= N x 50= N de GB/mm3 l
Segn el ICSH, debe expresarse este resultado en N de GB 109/l
Recuento de GR
Se cuentan en el retculo de Thoma, en el cuadrado primario central,
que est dividido en 25 cuadrados secundarios de 16 cuadraditos
terciarios, en total: 400 cuadrados terciarios. Se cuentan todos los
GR que tocan 2 de las triples lneas internas (ejemplo, las de la
izquierda y arriba) y se desechan las otras 2 lneas (ej: derecha y
abajo) de 5 cuadrados secundarios. Generalmente se eligen los 4
cuadrados de los extremos y 1 cualquiera de los del centro.
Clculo: si contamos 5 cuadrados secundarios, hemos contado 80
cuadrados terciarios. Como el retculo de Thoma tiene 400
cuadrados terciarios, que ocupan una superficie de 1 mm2, el clculo
a efectuar es el siguiente:
GR contados (N)

80 cuadrados

400 cuadrados

X= N x 400 / 80

17
Este es el N de GR contados en un volumen de 0.1 mm3. Debemos
multiplicarlo por 10 para expresarlo en mm3. Al efectuar una dilucin
1/200 debemos multiplicarlo tambin por 200, es decir:
X= N x 400 / 80 x 10 x 200
X= N x 10000= N de GR/mm3 l
Segn el ICSH, debe expresarse este resultado en N de GR 1012/l

Recuento de Pq
Se carga la cmara cuentaglbulos y se deja 20 min en cmara
hmeda, para permitir la sedimentacin de las Pq. Se cuentan en el
retculo de Thoma como si fueran GR
Clculo:
Pq contadas (N)

80 cuadrados

400 cuadrados

X= N x 400 / 80
Este es el N de Pq contenido en un volumen de 0.1 mm3. Debemos
multiplicarlo por 10 para expresarlo en mm3. Al efectuar una dilucin
1/20 debemos multiplicarlo tambin por 20, es decir:
X= N x 400 / 80 x 10 x 20
X= N x 1000= N de Pq /mm3 o l
Segn el ICSH, debe expresarse este resultado en N de Pq 109/l

18
Errores propios del recuento globular
Estos dependen de:
a) Errores en la dilucin: estos se pueden disminuir a un mnimo
usando pipetas de recuento con certificado de calibracin
usando una micropipeta automtica calibrada en el mtodo
de las diluciones. Antes de efectuar la dilucin es necesaria
una correcta homogeneizacin de la muestra de sangre y,
una vez efectuada la dilucin, volver a mezclar al menos 2
min antes de cargar la cmara.
b) Errores en el recuento en cmara: deben usarse cmaras con
certificado de calibracin (en las fabricadas actualmente el
margen de exactitud y confiabilidad es del 0.5%). Si no
estuviesen calibradas, deber controlarse la superficie del
retculo con un ocular micromtrico. Es importante controlar la
altura de la cmara, se acepta como tolerancia de fabricacin
0.5m (5%). Este error puede aumentarse si no se usa el
cubrecmaras adecuado y si el mismo no se utiliza en la
posicin correcta. Se debe colocar, con leve presin y deben
observarse en los pilares de la cmara los anillos de
difraccin de Newton. La cmara debe llenarse de una sola
vez, sin exceso de lquido en el campo y sin formacin de
burbujas, lo que indicara que el material est engrasado y
debe procederse entonces a lavar con abundante agua y
limpiar con alcohol. Antes de efectuar el recuento debe
dejarse reposar, al menos, 2 min. No deben confundirse los
elementos con cristales o levaduras. Los eritroblastos se van
a contar como leucocitos, pero luego deben descontarse en el
recuento de GB totales.
c) Errores de prejuicio: para evitar esto debe contarse siempre
en las mismas zonas, en reas equidistantes.

19
d) Errores de distribucin celular: si observa que la distribucin
celular es heterognea, debe volver a cargarse la cmara.
e) Error por fatiga del operador: esto se minimiza teniendo un
cuidadoso entrenamiento. Teniendo precauciones pueden
reducirse hasta hacerlos insignificantes.
Errores del recuento globular visual
Pueden ser:
a) Errores asignables: son evitables ya que podemos asignarles
una causa y no dependen del azar. Pueden ser:
 Toma

de

muestra:

uso

de

anticoagulante

en

condiciones no ptimas, puncin realizada en zonas

cianticas, hemodilucin por salida abundante de lquido
tisular
 Hemlisis: uso de material hmedo, uso de agujas muy
finas formacin de espuma al extraer la sangre. Se debe
tratar de que la sangre fluya libremente.
 Dilucin de la muestra: homogeneizacin insuficiente,
material sucio y hmedo, uso de pipetas mal calibradas,
uso de reactivos vencidos contaminados.
b) Errores aleatorios: son aquellos que dependen del azar y son
inevitables. Pueden ser:
 Del azar.
 Distribucin de los elementos en la cmara de
recuento. El error, por ej. en los GR, sigue una distribucin
de Poisson. El desvo standard error de distribucin al
azar: = N, donde N es el nmero de clulas contadas.
El coeficiente de variacin CV = / N x 100, expresa el
error inherente al contaje globular. Para disminuir este tipo
de error se debe contar el mayor N de clulas posibles,

20
haciendo una dilucin menor bien contar dos veces la
misma muestra. Ej.si contamos 500 GR, = 22 y CV= 4.4.
Por lo tanto, si contamos un N adecuado de hemates, el
error no superar el 3%. Si contamos, por ej., 100 GB,
= 10 y CV = 10, lo que arroja un error del 10%. Este
porcentaje es muy alto, si bien para pacientes normales
este margen no tendra significacin clnica, en los
pacientes leucopnicos o con leucocitosis, tendran
graves modificaciones en sus recuentos, por lo que
deberemos aumentar el N de clulas contadas en casos
de leucopenias contar como Pq en las leucocitosis.
Recuento de reticulocitos
Los Ret, que se tien como hemates policromatfilos con la
coloracin de May Grundwald Giemsa son eritrocitos jvenes que
contienen todava ARN ribosomal que puede colorearse con un
colorante supravital como es el azul brillante de cresil.
Solucin de azul brillante de cresil (ABC):
ABC

1 gr

Solucin fisiolgica fresca csp

100 ml

Tcnica: colocar 2 gotas de sangre homogeneizada en un tubo de

Khan y 2 gotas de solucin de ABC, mezclar. Dejar reposar 10 a
15min. Realizar extendidos, secar, observar por inmersin. Contar
1.000 hemates, discriminando cuntos de ellos son Ret. Informar el
resultado /100 hemates. Si se quisiera informar en valor absoluto se
necesitar el recuento de hemates para poder hacerlo /mm3 l l.
.

21
Microhematocrito
Se usa sangre venosa con EDTA en la proporcin ya mencionada, o
bien, sangre capilar pero en este caso deben utilizarse los
microhematocritos heparinizados. Se cargan por capilaridad y se
tapan en un extremo con plastilina, en forma cuidadosa. Se
centrifuga en una microcentrfuga a 12.000g, durante al menos 5
min. Se puede leer en un baco se puede calcular de la siguiente
manera: leer con una regla milimetrada la columna de GR y la
columna total GR + GB + plasma. Luego se dividir la lectura de
GR / lectura total y se multiplicar por 100.
Coloracin del frotis sanguneo
Tcnica de May Grndwald Giemsa.
Reactivos: estos deben ser de excelente calidad analtica.
a) colorante May Grndwald (eosinato de azul de metileno en
alcohol metlico)
b) colorante Giemsa (azur II eosina azur II en alcohol metlico y
glicerina)
c) solucin estabilizadora de pH (tampn fosfato de Sorensen)
diluir segn indicaciones (1 / 50).
Una vez realizado el frotis, sobre un porta limpio y desengrasado,
secarlo rpidamente con aire seco a no ms de 37C.
a) cubrir el porta con 20 gotas de solucin de May Grundwald
durante 3 min
b) colocar 20 gotas de la solucin diluida de agua estabilizada,
mezclando suavemente, soplando con una pipeta. Dejar 1min.
c) volcar y cubrir con solucin de Giemsa diluida (1 gota de
colorante por ml de agua estabilizada). Se necesitan 2 ml por
porta. Dejar 15 min

22
d) lavar con agua corriente y secar al aire. Observar con objetivo
de inmersin
Los 3 min iniciales de la tcnica sirven para fijar el preparado. En el
paso b), el agua estabilizada permite actuar al eosinato de azul de
metileno del reactivo de May Grundwald. El eosinato colorea las
partes bsicas de los citoplasmas de un color rosado (Ej: citoplasma
de los granulocitos), tambin tie los hemates y las granulaciones
especficas de los eosinfilos. Las granulaciones especficas de los
neutrfilos y basfilos se colorean en forma metacromtica con el
azul de metileno. Este colorante tie tambin los nucleolos, los
citoplasmas basfilos, los hemates policromatfilos y colorea
levemente el ncleo, sin diferenciar la cromatina. El colorante
Giemsa colorea las granulaciones azurfilas (inespecficas) y
fuertemente los ncleos, diferenciando correctamente la cromatina.
Tie tambin los cuerpos de Howell Jolly, los anillos de Cabot y
Bastones de Auer.
Dosaje de Hb
Para el dosaje de Hb existen distintos mtodos: los de referencia y
los de rutina. Dentro de estos ltimos, los ms empleados son: el de
oxiHb y el de cianmetaHb. El de oxiHb, si bien es simple, tiene el
inconveniente de que no se puede procesar todos los das un
testigo. Es por ello que se utiliza el mtodo de cianuro de
hemoglobina. En esta tcnica la Hb se oxida por accin del
ferricianuro a metaHb, que se combina para dar cianmetaHb. Esta
es un pigmento estable que presenta dos mximos de absorcin a
421 y 540nm. El 1 es ms sensible pero se utiliza el 2 porque el
pico es lo suficientemente ancho como para permitir la lectura en
espectrofotmetros en fotocolormetros con un ancho de banda

23
amplio. Este mtodo dosa oxiHb, Hb no oxigenada, metaHb y
carboxiHb que pudiesen existir en la sangre a estudiar. No dosa
sulfoHb ni Hb desnaturalizada. La reaccin sigue la Ley de Beer.
Mtodo de CianmetaHb Mtodo de Van Kampen Ziljstra (es el
recomendado por el ICSH).
Reactivo:
Ferricianuro de potasio

200 mg

Cianuro de potasio

50 mg

Fosfato monobsico de potasio

140 mg

Sterox SE, TritonX 100 Nonidet/40 (hemolizante)

1 ml

Agua destilada csp

1000 ml

Ajustar el pH a 7.2 0.1 con cido fosfrico 0.1 N con hidrxido de

potasio 0.1 N. El reactivo debe guardarse en frasco oscuro, a
temperatura ambiente, estable 6 meses. No congelar.
Control de reactivo: colocar 5 ml de reactivo y 20 l de sangre.
Leer a 540, 504 y 700 nm.
Calcular el ndice Q. Densidad ptica a 540 / densidad ptica a 504.
Puede variar entre 1.59 a 1.63. Leer en un espectrofotmetro de
2 nm de ancho de banda.
Control de turbiedad: la lectura a 700nm debe ser inferior o igual a
0.002
Control de pH: si el pH es inadecuado puede haber turbiedad.

24
Barrido del espectro

Se efecta un barrido del espectro y la cianmetaHb tiene un pico de

absorbancia a 540nm. En caso de existir oxiHb no transformada,
habr otro pico a 576nm. Si hubiese metaHb sin transformar en
cianmetaHb, habra un pico ms bajo a 630nm, que es donde
absorbe la metaHb.

Testigo: existen testigos comerciales o se puede preparar un testigo

propio.
Clculo de la concentracin del testigo: deben usarse pipetas y
micropipetas calibradas. A 5 ml de reactivo, agregar 20l de lisado.
Enjuagar 3 veces con el diluyente. Mezclar por inversin sin agitar.
Luego de 5 min, leer en espectrofotmetro de 2nm de ancho de
banda, a 540nm, usando cubetas de caras paralelas de 1 cm de
paso ptico, contra blanco de reactivos y a 25C. En estas
condiciones
Hb g/dl = DO 540 x 36.77

25
Este factor 36.77 se obtiene de considerar el coeficiente de extincin
milimolar de la Hb, la dilucin efectuada y los clculos para llevarlo a
g/dl.
Actualmente los valores de Hb deben expresarse en g/l, sin
embargo

los

fines

del

curso

seguiremos

empleando

la

denominacin anterior.

Curva de calibracin: conocida la concentracin del testigo del

lisado globular, realizar en el fotocolormetro de rutina una curva de
calibracin empleando 4ml 5ml 7.5ml 10ml de reactivo.
Adicionar a cada tubo 20 l del testigo. Leer con filtro verde (entre
520 560 a 540 nm) contra blanco de reactivo. La concentracin
del tubo N 2 corresponder a la concentracin hallada en el
espectrofotmetro. La del tubo N 4 corresponder a la mitad, la del
tubo N 3 a la mitad ms la mitad de la ltima cifra y la del tubo N 1
a la del tubo N 2 por 1.25. Esta curva o su factor ser utilizada para
calcular la concentracin de Hb diariamente, procesando todas las
muestras y el testigo.
Causas de error en la determinacin de Hb (por el mtodo de
cianmetaHb).
a) Errores en la muestra: puncin capilar defectuosa, sangre
venosa mal homogeneizada o presencia de microcogulos.
Las hiperlipemias pueden producir resultados errneos.
b) Errores en la dilucin: micropipetas, pipetas o dilutores mal
calibrados, sucios o rotos.
c) Errores

en

la

conversin

de

cianmetaHb:

reactivos

deteriorados o mal preparados: la evaporacin del cianuro

es una de las causas ms comunes del deterioro, en estos

26
casos no se transforma toda la metaHb en cianmetaHb y la
densidad ptica leda ser menor que la real y tendremos un
resultado errneo. Por otra parte, el ferricianuro se
transforma paulatinamente en ferrocianuro (proceso que
se acelera por congelamiento) quedando oxiHb sin pasar a
cianmetaHb, obtenindose resultados mayores que los
reales, ya que la OxHb a 540 nm tiene un coficiente de
absortividad mayor que la cianmetaHb.
d) Errores en la lectura: aparatos no calibrados, testigos no
estables. La turbiedad en la reaccin final puede significar un
pH

menor

al

requerido,

un

aumento

importante

de

inmunoglobulinas o la presencia de lpidos. En el 1 caso, la

turbiedad se elimina llevando al pH ptimo. En el 2 es
necesario alcalinizar ms el medio. La hiperlipemia grosera
puede ocasionar errores tan importantes como hasta 3g/dl.

Indices hematimtricos
Son el VCM, la HCM y la CHCM.
Frmula prctica:
VCM = Hto x 10 / GR 1012 / l

VN: 80 95 fl

HCM= Hb g/dl x 10 / GR 1012 / l

VN: 27 33 pg

CHCM = Hb g/dl / Hto

VN: 31 35 g/dl