losa, respectivamente. Estas enzimas presentan un gran interés en la ind limentaria ya que se utilizan en la obtencidn de jarabes ricos en fructosa. El ca melilico de estas enzimas mejora el proceso. Enzimas como la alcohol deshidrogenasa, que cataliza la oxidacién de alco ‘cundarios, presentan gran interés en biotecnologia. Existen enzimas de mes 2¢ llevan a cabo este proceso pero las termoiilicas presentan muchas caractert > gran interés incustrial Otras extremoenzimas incluyen nitrilasas, racemasas tas enzimas se estén aislando de extremétilos y su aj by interesante, y glutamato deshidrogen icaci6n en biotecnolog bliografia ‘saan, D. C., Monis-Vatas, F, Cassipy, C. (2001): Opinion in Chemical Biology. 144-151, YZALEZ- Tor, E., LLOBEF-BROSSA,E., Casawuvor, E. 0., AMANN, R., Avis, R, (2003): “M bial ecology of an extreme acidic enviroment, the Tinto River”. Applied and Environ Microbiology. 4853-4865. ‘xo8K, K. 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Adem, el uso de la Tag incrementa la espedt de la reaccién ya que el DNA se copia a 72°C (no a 37°C como con Kenny ue se evita la hibridacién inespecitica de los iniciadores con el DNA La Taq polimerasa presenta el problema de no poseerfuncién correctora (act exonuclease ¥-5) y, como consecuencia, comete mis errores en la replicarion de Ecol, que si posee esta actividad. La DNA polimerasa de Pyrotocene ri clenominada Piu polimerasa, es mas termoestable que la Tay y presente cau set orrectora (DNA polimerasa de alta fidelidad). En [a tala 11.3 se muestran ditintas DNA polimerasas, su origen y su utilis en algunas ténicas como PCR, PCR de alt fielded, obtencion de DNA spor RINA mediante transcriptasa inversa (RT-PCR) y secuenciacion de DNA Tabla 11.3, Aplicaciones dels DNA termoestables, ND. no sa det Tl ree] Ownine __ [ren [ Renata hd | RC ome] DRA Paina cera Tay FON [Tremor aguas : 5 oc Th pol [Thoms emepinn ~~ + Ti pol — | Teas or rs) aa Tip | Ther tae No +s Tea pol [Ther alps GO] + 2 zal st pol [facts seaethemephir [+ pos Tina pot therogs martina] + a we DNA Pola de aueoba ir Top roca woes : : Ps pot —[iyoceur rior : Sa Vert pol Themococas feels] i Sefer ODI pal reoccur goo —[ + ; = a técnica de la PCR también se utiliza para cuantficar la expresion génica diante el uso de vanseriptasasinversas que utilizan el RNA como molde pare ven trlo en DNA complementario. AI inicio se utilizaban transcriptasas deades ae tus, pero presentaban el problema de que las teacciones se levaban a cabo s ens taturas bajas y se formaban esiructuras secundaias en el RNA. Fr los dimes anne aulizan DNA polimerasas termoesables que utilizan RNA como molde en presare de jones manganeso: es el caso de la de Thermus thermophilus. Estas polimerre ‘moestables se han utlizado en secuenciacién, y su utlizacién ha mejor near esta técnica. 11.4.5. Otras enzimas con interés biotecnolégico En este grupo destacan enzimas como las glucosas isomerasa, ya referidas ante Tiormente, que eataizan la isomerizacién de D-glucosa y D-ilosa en Dittonrilasas y pululanasas hipertermofilas o acidéfilas. fstas mejoran la bioconve | almidon y se evita la generacién de las grandes cantidades de sales. Recientemente se ha expresado en £. coli una e-amilasa proveniente de la art teria Thermococcus hydrotermalis, caracterizada por presenta gran estabilid. Iidiciones de desnaturalizacién quimica y térmica. Se han utilizado glicosh 1» actividad pululanasa procedentes de hipertermdilos que degradan almidn, ay amilopeptina formando maltotriosa y maltosa; la termoestabilidad de esta rnas puede usarse para mejorar el proceso de hidrdlisis del almidén. Se han identiticado glicosidasas halofilicas que presentan actividad frente a» 408 sustratos y que se caracterizan por permanecer activas en presencia de cor clones muy elevadas de sales, como por ejemplo, B-galactosidasa de Halofera tei 4.3. Proteasas y peptidasas Las proteasas estin implicadas en la conversién de proteinas en aminodcid otidos. Las enzimas microbianas producidas en mayores cantidades, desde el p vista industrial, son las proteasas que se utilizan como aditivos en los deterge a lavar la ropa. La mayoria de los detergentes actuales contienen enzimas, principalmente pre + pero también amilasas, lipasas, reductasas y otras. Muchas de estas enzime an de bacterias alcalofilas y se usan como aditivos en detergentes, ya que « teasas se caracterizan por ser resistentes a la desnaturalizacion por detergente \diciones alcalinas. En los dltimos anos se ha generado interés en el uso de pre ue provienen de psicrofilos para desarvollar detergentes que laven en frio. tras proteasas con actividad queratinolitica y elastolitica se utilizan en la in del cuero. La proteasa extracelular purificada dle Halobacterium halobium se « an la sintesis de polipéptidos que contienen glicina y presenta la ventaja de qu y estable incluso en presencia de disolventes orgini¢ox 4.4. DNA polimerasas, Las DNA polimerasas son enzimas clave en la replicacién del material celular | te en los seres vivos. Catalizan, en presencia de iones magnesio, a sintesis Aen la direccién 5'-¥. Uno de los avances mas importantes en los dltimos 15 afios ha sido el desarn 4 reaccién en cadena de la polimerasa (PCR). Esta técnica uilizaba originariary | ragmento Klenow de la DNA polimerasa puriticada de E. coli pero, debido a 5 temperaturas necesarias en el proceso para desnaturalizat el DNA, habia que erla en cada ciclo. F1 problema se ha resuelto utilizando una DNA polimerasa ada de un extremofilo hipertermotilo, Thermus aquaticus, conocida como Taq 2rasa. Esta enzima es estable a 95 °C y, por lo tanto, es efectiva incluso en la etTabla 11.2, xtremoenzimas rclevantes en isis, r a Orpen ‘Stable Ter hip Pyrococcus hres erpeaturs Gina 100°C sable 30 mina 126°C Taras tna cites inches Flemparatura opens 33°C sable Thea ote Taras toni Archon ls Activa 70°C pass temo Biche stearethemophios —PTemperats opin GC Estable 30 min 055°C Temata cil hermocatenutatis | Tenperanata Spins 0707 Pruluanasa hyperemia Teoeroccn pers ener gina 95°C stable 2.5 ha 100 559% activa desputs de 30 mh a 60 °Cpr 5.5 Paleanac trata Tacs cilia ‘ails acon y wero [ Aioycobacilin occas Actividad Spina 375°C pH egalocunidaes hala alot alicantt Activa solo 3 4 M NACL Fruco dois hall aksnculs valor Actividad Spina 3 25 MRT Frociosaklolass hipsters] Thema aquaices Activa y sable 390°C durant mis deh, Extable 3 97 derane 1 Terperstura pina 37°C Frost aloes Ripenemmbits | Sopylococcan aus rrease peia scion TARE [Spina a baja erpertora Prete la Hlabactevivm Falbiam Minima actividad 34 M NaCT aio amis Reataca emda [ Rac 9p Temperatura opm 3 65 °C iio ida temot cis pals Termoestabie hasta 55° Neobol deshidrogenasa Pyrococcus taro stable 160 8 3 FC ipeteri y7ha 95°C Stuamato desidrageross Pyrococcus aos 36 veces mis tables 57 >a Y 750 atta sta pao Shewanella we [Optima baja tempera Senna corose pret [Bates py cameras [Opis ls eee 4.2. Glicosidasas y enzimas implicadas en la quimica de azticares A partir del almidn, mediante la accin de amilasas, glucoamilasasy putilan, buele obtener glucoss, que puede converse enfructosa por accion de la gl mmerasa. La accidn de estas enzimas, desde el punto de Vista industrial, lees tencién de un edulcorante rico en fructosa a parr del maiz, trigo o almidon de 2. En la industria alimentaria este proceso es muy importante, sobre todo en la cci6n de bebidas no alcohdlicas, El proceso de hidrdisis de almidén para la obtencién de glucosa y fructosa se aque desarollar en varias etapas que implican la utlizacion de distines pls tceso, que varian de 4,5 a 8,5, y distintas temperaturas, que van desde 55° 3°C. Al final del proceso se generan concentraciones muy elevadas de sales ‘ que eliminar mediante intercambio i6nico que encarece el procedimiento. Fh mos afios se estén utilizando en este proceso enzimas extreméfilas tiles euLos dcidofilos presentan caracteristicas muy extremas que hacen que sus enzi- mas se puedan utilizar en diferentes procesos. Las aplicaciones de las enzimas ac do-tolerantes van desde su uso como biocatalizadores en sintesis de compuestos en disoluciones dcidas hasta el procesamiento de minerales. También se ha descrito su {uso como aditivos en piensos para animales (pueden funcionar muy bien en su cestomago). Los alcaléfilos, por su parte, han tenido un gran impacto en la aplicacién indus- trial ya que sus proteasas alcalinas y celulasas se estan utilizando en el desarrollo de detergentes biol6gicos. Para trabajar eficazmente, los detergentes deben actuar frente ‘a manchas de comida y otras fuentes de grasa. Los organismos pertenecientes al grupo de baréfilos también presentan muchos in- lexés y la investigacion se ha centrado en la identificacion de operones que estén re- 3ulados por presién, aunque en los dltimos afos se estan estuliando las posibilidades Je usar las enzimas de estos microorganisms en procesos concretos en los que haya Implicadas altas presiones En el campo del tratamiento biolbgico de la contaminacién presentan gran interés bs organismos capaces de adaptarse a concentraciones toxicas de disolventes, meta- #5 0 radiactividad en el medio. Como se ha reierido anteriormente, la bacteria Dei- tococcus radiodurans tolera altas dosis de radiacién. La potencialidad de esta bacte- ia para descontaminar desechos radiactivos, por ejemplo uranio, la convierten en na alternativa biotecnol6gica muy poderosa y eiectiva en el tratamiento biologico. Las enzimas pertenecientes a organismos termotilos, enzimas termofilicas, han do las mas estudiadas y utilizadas en la industria, Estas enzimas presentan pran in- ‘rés ya que son muy resistentes a proteasas, detergentes y agentes caotrépicos. La tabla 11.2 muestra las enzimas mas interesantes desde el punto de vista de su ilizacién en biotransiormaciones industriales que son activas 0 estables en condi- jones extremas. A pesar de la cantidad de enzimas caracterizadas, es muy pequefio indimero de extremoenzimas que tienen uso industrial. A continuacién se revisan las 4s utilizadas. 4.1, Esterasas y lipasas Estas enzimas se utilizan en la industria quimica debido a que se pueden usar en catalisis pata la produccién de compuestos puros. Se han aislado muchos tipos de serasas y lipasas termafilicas. Las enzimas termofilicas tienen un gran potencial en 'e tipo de aplicaciones especificas que tequieten temperaturas altas u otras condi- anes especiales. Se han descrito esterasas aisladas de Pyrococcus furiosus que presentan una activ 4 Optima a 100 °C. También existen estispes psicrofilas que presentan lipasas adap- las al frfo y que se utilizan en procesos biotecnolégicos Hevados a cabo a bajas aperaturas. Como ejemplo cabe destacar la lipasa de Pseudomonas sp. B11, que se liza para sintetizar potenciadotes del sabor como el butil-caprilato.Fn aigunas ocasiones, el uso de enzimas de organismos messfilos ha solucic el problema, pero en ottos casos esta limitado porque los procesos ve hero qw Yar 2 cabo en condiciones en las que estas enzimas no son activas. En ene cert, Use dle enzimas derivadas de extremoilos abre la posibilidad de su use er pro en los que no se pueden usar las tradicionales En Ia tima década se han aislado un gran nimero de microorganismos extn *. Los Procesos metabélicos y sus funciones biologicas espectficas se deben {ads Y broteinas que funcionan en condiciones extremas. Estas biomolecalae mice caracteristicas Unicas, como una termoestabilidad elevada 0 rosston paaializantes tales como detergentes, dsolventes orginicos y pH extreme, tes podria ser uilizadas como modelo para el diseho y consinceidn de protcineg nuevas propiedades que son de interés en aplicaciones industialec kn la tabla 1.1 se muestra una posible apicacién de las enzimas de extremét ta mayor parte del trabajo se ha llevado a cabo en terms e hipertermotion bla 11.1, Aplicaciones indusriafes de erzhnasastadas de extremétios ‘Organiane Preece ‘Aplicacin Aare Fructos y sacar pare advan ‘ona Blanqueanieno de papel Hipeneamétls > 80°C Traness eins para produccin de asa alimentos ydtergenes CC Protas newts Produccion de tetas Protesas Detergents Psicroitos 015°C [amttnne Lipase Fema Actos rao potinsatwados Aciiios O< p= 4 | Ovdaciin de ane [Desofeacn deca Protease Detergents Arnos Alaotios p> 9 [Tpasss tabaci de suanctas water icldetrinas [Caron [Coloranies para aera Aico Fiemacos Glicerot ee ior compels Fiomacox Feubiizadones de encima emia Surfactants para Famacca pacts = 500 ry | iroonanisme camp [romacion de gles y nln Se OS [exiolranes| Microogniome completo | Bionerediacion Producidas por microorganisms adaptados al fo, pre Pole aan eficiencia catalitica que ofrece un potencial en la industria Kioree rnologica, por ejemplo en alimentacién y fabricacion de detergentes También presentan gran interés las enzimas halofilicas ya que son estables en pre. Sencia de concertraciones muy elevadas de sales y sven como modelo en BioconSreacién del Instituto de Astrobiologia de la NASA (NAN), cuando se alcanzan les 2iveles exigibles de rigor que permiten a la Astrobiologia constiturse como dscipl 22 Gientifica con capacidad para desarrollar e impulsar proyectos y misiones de in. ‘estigacién Se conoce, através de estudio de los féxiles mas viejos de la tierra, que la apart 60 de la vida en nuestro planeta acontecié antes de lo previamente estimado. Se ha codido comprobar que la vida es un fendmeno muy resistente a situaciones catastroh. 8 y a condiciones medioambientales limite, como es el caso de los extremdilos. Es. 2s microorganismos, como hemos visto, viven y se desarrollan en ambientes consid. ‘dos, hasta hace poco, inviables para la vida, y el nimero de los descubicrtos au. conta a medida que se perfeccionan las técnicas para su deteccién, Referente a los estudios Hlevados a cabo para la bisqueda de vida en Mane cabe sstacar los que se han realizado en los manantiales de Yellowstone (USA). Parece te en Marte la actividad volcanica ha interactuado con el agua de la misma forma te ha sucedido en la Tierra. Los manantiales termales son oasis minerales para die {as formas de vida y los depositos preservan los fosiles que pudieran postbiltar el scubriminto de vida en otros planetas.Estudiando los cambios del registro TOs se €ede formar una imagen de la historia dela vida y del clima de la Tierra, Comparan. Estos registros fosiles con las racas encontradas en Marte se podiia hallar une teba definitiva de vida pasada en ese planeta. Las misiones de exploracion de Mar, edn poner de manifiesto la existencia de condiciones favorables para al existens de vida, Paralelamente, en Rio Tinto (Huelva, Espana) los astrobidlogos estin levando a 2 fstudios con objeto de desarrollar técnicas para perforar la superficie de Marte busqueda de signos de vida. Se reconace que el érea del Rio Tinto es un modelo ‘ortante de la basqueda de vida en agua liquida bajo la superficie de Marte. £1 Rio. © recibe su nombre por su color, debido al hierro y otros metales disueltos en sus as de marcado carécter acido. Es considerado un ecosistema extremadamente act. resenta un pH que va desde 1,5 a 3,1, y una elevada concentracién de metales ‘dos en disolucion (hierro, cobre y zinc). Las condiciones exttemas del rio se de. a Ia actividad metabslica de microorganismos quimioautotrofos que oxidan hie. ¥ azufte, Estas condiciones tan extremas son consideradas muy similares a las sites en Marte, por lo que el resultado de las perforaciones podra extrapolase a ‘Studios levados a cabo en el planeta rojo ya que se prevé la existencia de agua dda en el subsuelo marciano. + Biotecnologia de extremsfilos iste un enorme interés acerca de las proteinas estructurales y las enzimas me- icas que son responsables dle las propiedades inusuales de los mictoorganismos efilos. Pueden ser de mucha uiilidad en biocatalisis (sintesis de polimerow, pro. § farmacéuticos, agroquimicos, etc), ya que este tipo de procesos, en muchas 'slancias, son inespecilicos y generan productos sectindarios,Los organismos capaces de sobrevivir en condiciones de maxima sequeda desde colonias de bacterias (estas bacterias colorean las rocas de los desiertos, que también se conoce como bamiz del desierto) hasta colonias simbicticas de con hongos (liquenes). Estos liquenes pueden soportar condiciones de extrema s dad aunque no son tan resistentes como las bacterias. Tienen un papel muy impe te en la formacién de suelos ya que son los primeros en colonizar las rocas, alae la superficie de las misma. 11.2.6. Toxicidad Los organismos que toleran altas concentraciones de agentes txicos, se agnt bajo el término de toxitolerantes. La tolerancia a agentes tGxicos, como disolve ‘organicos 0 antibisticos, se ha descrito desde hace tiempo, considerindose las be Fias como las mas tolerantes. Pseudomonas putida DOT-T1 tolera concentraciones del 90% de tolueno & medio; ademis, utiliza este disolvente orgénico como fuente de carbono y ene para su crecimiento. Las adaptaciones de los microorganismos a estas condiciones aig de 20°C y una temperatura minima de crecimiento de OC o mis baja, tox anismos pertenecientes a este grupo crecen a temperaturas por debsjo de. los undue su rango de temperaturas. no mortales puede ir desde los 20°C haste nos de 0°, {os organismos que crecen a 0°C pero tienen temperaturas dptimas de 20-40 °C Jenominan psicrotolerantes. Bs Zonas microscopicas con agua liquida donde los microomanismos pueden abolizar y crecet. Aunque la congelacién evita el crecimiento’ mictobiane: no ia necesariamente la muerte celular 2% psicrflos ocupan ambientes fos que son, actualmente, mis comunes y exe 2m cus os calientes. Los océanos, que representan mis dela mitad de la supent emrestre, mantienen una temperatura media de 5 “C, mas baja en sus profundida- las grandes extensiones polares, Anico y Antic, permanecen congelados la spare del tiempo 0 se descongelan algunas semanos al alo. Estox cminanie no son estriles y se encuentran microorganismos vos creciendo a cualquierental legar a una temperatura minima. Entre ambos extremos, en los qu Ti cata de protones y el transporte de nutrients, se da una tempe Far roca oe Pata cada organismo, las reacciones enzimaticas tienen lea Yor velocidad posible y el crecimiento celular tiene lugar de la forma matt rte Punto, si el resto de las condiciones ambientales son las adlecusdae se ¢ ¢l punto ideal del desarrollo del microorganismo. Los valores de temperatura mixin, minima y dptima son especticos p Corganismo y pueden variarsegtin las circunstancias. Aestas temperaton el seams cerca de la mxima que de la minima. Se sabe, hasta ahora, que el de temperaturas en el que pueden vivir los organismos abarca deed un poce os organismos eucariotas no crecen normalmente por encima de los 60° ‘as plantas toleran 45-50 °C y las algas y hongos, 55-60°°C. Las eubacteria {erméjilas toleran 70-90 °C. Algunas cianobacterias y bacterias fotosintticns ¢ emparnen bien a 70-75°C. Solo algunas eubacterias como Thermotuge A empPeratura Optima 80 °C) Thermus tenmophylus y Aquitex pyrophilos ary Pre Urine on Capaces de crecer a temperatras caracteristcas de las arch Petterméfilas, Los organisms terméfilos e hipertermvsilos conocidos haeta ale todos procariotas pertenecientes a los dominios Archaea (arqueobactevian ye (eubacterias) fr tlacion con la temperatura dima podemos disinguircuato grupos d nisms tFig. 11.1. Veh Se eo Pc Mesos Teamétitos Mperernstits Temperatura °C Figura 11.1. Clasiticacion de organisms en fancion de la temperatura,1. Interés de los extreméfilos asta hace relativamente poco tiempo se creia que la vida, por definicién, + {@ exisir en un ndmero muy limitado de ambientes. Sin embargo, se han enc sucrBanismos en lugares considerados inhabitables por el hombre y en los Allos son perfectamente capaces de adaptarse. F! término extremttlo se att designar un organismo que crece de manera Optima bajo condiciones extrer emperatura, presiGn, salinidad y pH pero que no puede crecer en condicio nales, Este término también incluye al que puede tolerar altos niveles de. rat © compuestos téxicos § bastante frecuente que estos organismos vivan en biotopos que combinan do Factores extremos, por ejemplo, altas temperaturas y condiciones acidas, 0 te ura baja y alta presi. Bajo la denominacién de extremes se incluyen di § laxones de procariotas (Bacteria y Archaea) y eucatiolas. Entre los procario Can las arqueobacterias como los microorganismos mas abundantes eh setos 5 extremos, [nteres general de este “original” grupo de organismos ha aumentado desde laron los primeros en ambientes que anteriormente habian sido considerad ibles para la vida. Algunas de estas formas son conocidas desde: hace 25, pero su estudio se ha intensificado acimiento de que sus equipos biolbgic ante tiles para una variada serie mis ¢ 1 los ikimos tiempos impulsado por ‘0s de supervivencia pueden ser pote: de aplicaciones industriales 5 extreméfilos presentan un interés bioligico diver '8 RUevos que en el momento de descubrirse com, 0 de los seres vivos y también han enriquecido | rites de la vida. Ademds, sus biomolécul ‘as de su entorno, lo que ha conducido a intensos trabajos para intentar com * los mecanismos bisicos de resistencia, asi como para desatrollaraplicacione iales. De interés particular son las enzimas que ayudan a los extrematlos ar en las circunstancias extremas de su entorno. rsificado. En primer lugar, so ipletaron el conocimiento file los debates relativos al origen las son resistentes a las condicione Bases bioquimicas de las adaptaciones a los medios extremos ‘Temperatura edida que la temperatura ambiente aumenta, I teacciones enzimaticas crece de fo! la velocidad a la que se desarro- ma proporcional, lo que implica un desa pido del microorganismo., Esto sucede hasta llegar a una temperatura *r encima de la cual determinados componentes de la célula comienza a dh + de forma irreversible (desnaturalizacion de proteinas y acidos nucleicos, Crecimiento cesa y sobreviene la muerte celular, Por el Contratio, 2 medida jmPeratura baja, la velocidad de las reacciones enzimaticasdisminuye, y por \ crecimiento celular se hace cada vez mis lento hasta que cesa completa.Glosario ‘Acid6file: Oranisma que crece a pH bajo. Alcaldfila: Omanismo que cece a pH alt. Astobiologia: Ciencia que estudia el orgen, evolucién, distribuciin y destino de la vida en e ‘Barolo: Organismo que cece en coadicones de alta presi, Biocataisis: Uizacion de ransormacion quimica especitica, NA polimerasa: Enzima que sinteiza una nueva cadena ce DNA usando ota coms mold Extremoenzima: Fovima sislada de exremtils Extremsfilo: Organism que crece de manera optima en condiciones scasextremas, Halil: Omansmo que tequiere ala concentacion de sal para crecee, Hipertermofite: Organism cuya temperatura dptima de crecimiento es de 80°C 0 superior DHE: Logaimo cambiado de signo dela concenttacin de lores hidgeno en una chook, Porina: Protcina que formar canals en Ia membrana por los que diunden molecules onginicas. 2sicrfile: Onsanismo cuya temperatura dpa de crecimiento es de 13° 0 menor 2uimisorganotrfo: Microorganism que obtene ener pati de a oxida de compuesos 01 adil: Organise capa de toler alas dows de rodioet vida {erméfile: Onsanismo cuya temperatura egitim de crecimiento ex de 45-80 °C, ‘itolerante: Orgnismo que tolera concentaciones elevadas de sxtancastoxias. ‘aluto compatible: Solutio acumulado en el citoplasma «ue no ibe kn procesoe bioguimicos o {er6fle: Organino que puede sobrevivien condiciones de alta desecacion.PITULO 11 IQUIMICA Y BIOTECNOLOGIA MICROORGANISMOS EXTREMOFILOS Interés de los extreméfilos Bases bioquimicas de las adaptaciones a medios extremos 1.2.1. Temperatura Psicrfilos y psicrotoleramtes Meséiilos Termafilos e hipertermatilos 11.2.2. pH Acidofilos Alealétilos. 11.2.3, Salinidad 11.2.4, Presion 11.2.5. Humedad 11.2.6. Toxicidad 11.2.7. Radioactividad Astrobiologia Biotecnologia de extremdiilos T1ALI. Esterasasy lipasas| 11.4.2. Glicosidasas y enzimas implicadas en la quimica de azdcares 11.4.3. Proteasas y peptidasas 11.4.4. DNA polimerasas 11.4.5. Ottas enzimas con interés biotecnoligico urafiaregién promotora entre las distintas copias del transgén, mientras que transcripcional afecta tanto a transgenes como a genes endégenos qu homologia en la region codificante. En los Giltimos aftos se ha descubierto un sistema de silenciamiento génic de pequeas secuencias de RNA que o bien degradan el mRNA de forma es, © bloquean su transcripcién (RNA interferente). Este proceso se esta utilizanc biotecnologia animal para tratar enfermedades como la hepatitis. iografia ‘Auwsto, No, Questa, F. M., Khan, ©. ¥. 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Scorer eee eee Parisi Conteris 5 Teas Ta prec de un determina iin prowoca wh au {ia expeston dl ge 1.000 wees. ‘Hoes de Te wanscripcion [Stands en of exer adores Stands en eleven Fe polaeniocion pecs fay que eliminar alguns de ets safes ya que pueden ‘Rsor en un inadecua procesaminto det RNAM, ‘Ti Tiers 9 cocoon [Stunden of extern 5. codones Tccomendabie ste wansgin ro presenta ol mismo uso decom que scfm. Hay que cambiar uso de eadones sn aera a seven et aminoscides [etaminoscidos Tela wcwencla Spina | Convolar zona proumas 2 for ston de iio de a wanscpctn y rs de nicto de ts al esduccdn, manne sos TrapecTica: de giconlacin | Emir secuencas que determine sliconlaciones 0 ancoe de lipids no deseo. [lipids no desendon, RNA antisentido silenciamiento génico. [A veces interesa eliminar 0 disminuir la expresién de un determinado gen © tna planta transgénica, Para ello, conocida la secuencia del gen se puede it troducir su DNAC en direcciin reversa y bajo el control de un promotor fuer! de tal forma que la planta sintetiza un RNA complementario al de partid: Uniéndose las dos moléculas de RNA. Al RNA complementario se le denomin IA antisentido, El RNA bicatenario es inestable y es rapidamente degradad por las ibonucleasas, Sin embargo, estos RNA bicatenarios nunca han sido de tectados en tojidos vegetales, ni en muchos casos cantidades apreciables de le RNAs antisentido. Ademas, se han originado RNAS antisentido, expresados panir de promotores débiles y a veces estas construcciones han tenido inclus ‘mis 6xito. Por lo tanto, hay otros factores desconocidos que pueden estar intl ‘yendo en este proceso. Asi, hay que considerar la interaccion DNA-RNA qu riginaria metilaciones ¢ inhibicion de la transcripcion, o a la generacion « tuna seflal que se transmitiera amplificando la informacién de la presencia ¢ estructuras extrafas. EI silenciamiento génico se descubrié cuando se observ que algunos transfo mantes obtenidos con una determinada construccién no expresaban transgén, a pesar de comprobarse que una 0 varias copias se habian integrac fen el genoma, mientras que otros transformants silo expresaban. Asi, se pu den eliminar 6 disminuir determinados genes de funcién no deseada o gener plantas resistentes a patégenos. El silenciamiento génico puede ser de dos os, ranscripcional 0 postranscripcional. A veces puede ocurtir que se site fia tanto el transgén en cuestion como genes homologos de la planta; es fenémeno se conoce como supresion, aunque se puede utilizar como sinénin de silenciamiento postranscripcional. El silenciamiento transcripcional se c racteriza por la ausencia de RNAm del gen silenciado, mientras que en el po: transcripcional ocurre sintesis de RNA pero no se exporta al citoplasma. En neral el silenciamiento transcripcional esti relacionado con homologia entuna soiucion colorante Itluoresceina 0 rodamina) como marcad proceso. = Sonicacion. Se utiliza para transformar organismos que son resistentes a la trans Cin. Asi, la sonicacion provoca una Cavitacién, formacién de micro jas, que a su vez genera presiones elevadas que danan a las células Uiendo la entrada del DNA. = Contencién del DNA en liposomas. Son vesiculas que estén formadas por lipidos catiénicos y en cuyo i queda atrapado el material genético. Esta técnica no es muy frecuent transiormar células vegetales. ©) Método fisico (electroporac fs uno de los métodos mas usados pata la transformacién de protoplas plantas. Consiste en la generacién de poros microscépicos en la men mediante pulsos de un campo eléctrico. Para optimizar este proceso. hy {ener en cuenta unos parémettos del pulso (amplitud, numero, duracién, valos, etc) y el tamafo de la cubeta. d) Método biolégico. Consiste en la infeccién de la planta por Agrobacterium tumefaciens. Est método mas utilizado aunque esta restringido a plantas dicotiledéneas, as de la construccién de u 2 planta transgénica a) Elaboracién de la consiruccién del DNA utilizado en la transformacién, Para que un gen se exprese tiene que estar sometido al control de una 1 promotora. Este promotor determina dénde, cuando, cudnto y en qué con res este gen se va a expresar. Normalmente, para expresar un gen en plan Uitiizan promotores constitutivos, tales como, el 355 del virus del mosai la coliflor, que se usa para cualquier tipo de planta, 0 los de la ubiquitina tina para plantas monocotiledoneas. La fuerza del promotor se puede ‘mentar utilizando secuencias potenciadoras (enhancers) o bien alteran propia secuencia de la regin promotora. A veces interesa que un gen se € se en un solo tejido por fo que se pueden usar promotores de genes que expresados exclusivamente en dicho tejido. Por otro lado, a veces se ree {a expresion de un gen de forma temporal, para lo que se usan promoton ducibles en respuesta a senales externas, a las cuales normalmente la plat insensible como la mayoria de las proteinas de plantas se sintetizan en el sol, cuando se quiere expresar una proteina en un determinado organulo ‘quiere la expresién de una proteina de fusién que contenga la secuencia cespecifica de transporte para ese organulo. En general, para garantizar una ‘na expresién de un transgén hay que tener en cuenta una serie de caractt Cas importantes que se muestran en al tabla 10.3.© que son t6xicos tales como antibidticos, insecticidas, pesticidas, agentes etc. - Plantas transgénicas tecnologia de manipulacién genética existente hace posible introducir DN. po en el genoma de una planta, convirtiéndola en una planta transgénica 0 me {a genéticamente. El gen ex6geno que proviene de otro organismo se denomin 5n (véase Capitulo 18). as de transformacién de plantas aso crucial en la obtencién de una planta transgénica es la x6geno a la misma mediante diversas técnicas de transformacion, Método quimico (uso del cloruro calcico) ‘A veces es mis cémado realizar la clonaciOn de los genes que se van a intro ducir en la planta en vectores que tienen un origen de replicacién reconocide 20r E.coli, En estos casos es necesario inttoducir estas construcciones de DNA an E. coli mediante transformacién. Para ello, se utiliza una solucion fria de sloruro calcico que provoca que las células se vuelvan competentes, es decit 2reparadas para aceplar DNA de! medio extemo. Posteriormente, para que: au nente la eficiencia de transformacién se realiza un choque téemico a 37-42 °C Jurante 1-2 min. Los transformantes se seleccionan en placas de medio s6lido 'n presencia del marcador seleccionable que porta el plismido, normalmente ésistencia a un antibiotico. En algunos casos la eficiencia de la transformacion © aumenta mediante el uso de otros compuestos tales como rubidio, hexaami. tocobalto y DMSO. En la mayoria de los casos se usan los plismidos Ti bina. jos de Agrobacterium tumefaciens insferencia de ‘étodos mecéinices. Agitacion mecinica, Se incuban las células y el DNA a transformar en una disolucién contenien- do un agente fisico (perlas de vidrio, aciculas de cloruro de silicio, etc) Para alterar los protoplastos y que el DNA pueda entrar en st interior Método balistica Las particulas de oro o tungsteno de un tamafio muy pequefo (alrededor de | um) se impregnan con una disolucién conteniendo el DNA y se montan, fen unos cartuchos que posteriormente se disparan sobre las células veyeta, {es a transformar mediante un sistema de aceleracin impulsado por la de- ‘onaci6n de péivora o la apertura de una vilvula con helio a preston, Microinyeccicn. Se inyecta en una célula una solucién conteniendo el DNA mediante una Punta de un microcapilar de vidrio (0,2-1 yum), Normalmente, se utilizaTabla 10.2, Microonganismos resstentes a anttidticos icroorganie Resistencia Tafermedad Saphylecoccus aeus ancomicin efecciones de pep eva Enterococcus antigticoshisicor_[infeccones del taco urinario y alae del 6 ‘Srapococcus preumonine —[pencilinas eum, mening, nkccions de odo evseris gonorrhea anbdticor basicos | gonor Saimoneta y Escherichia col [antbicos isicos | neoxicaciones aliens le antibidticos producidos en los Estados Unidos se han empleado en tratami« lacientes y el resto en granjas y cultivos. En cuanto al uso de antibidticos en « 2, el 20% se usan para tratar animales enfermos y el resto para prevenir enter ‘es, promover el crecimiento y evitar enfermedades de las cosechas. Por lo ta’ an detectado bacterias pertenecientes a los géneros Salmonella, Enterococe: coli que se han transmitido de animales a humanos. Los mecanismos por los cuales una bacteria se hace resistente a un antibi esconocidos en detalle, aunque hay descritos varios procesos implicados. L ria de los microorganisms (Streptomyces) que son productores de antibistic cen genes de resistencia a éstos y dichos genes pueden ser transferidos de dlfe ormas: a) Tansformacién. En determinadas condiciones una célula se puede hacer competente, es receptiva para la adquisicién de DNA exdgeno del medio. La enfermec transmisién sexual llamada gonorrea se ha hecho resistente a la penicilin este mecanismo. ) Tansfeccion. Fs un caso particular de transferencia del DNA (procedente de virus Conjugacién, Para ello se requiere el contacto fisico entre dos microorganismos. Aderr necesitan en el organismo donador la presencia de genes tra, encargados formacién de los pelos sexuales (“pills”) por donde se transmite el DN/ producir cambios en la pared celular, etc., y genes mob, que suelen ence se en el DNA transfetr y son requeridos para la movilizacién del mistr este proceso se suele intercambiar DNA plasmidico. La enfermedad ca por Shigella diarrhea se transmite a través de la transferencia por conjug de un plasmido pequeto. Existen genes de resistencia a antibidticos que presentan en sus extremos scuencias que codifican integrasas, enzimas que tienen la capacidad de se sos genes de resistencia del resto del genoma y convertirlos en material ger incional y, por lo tanto, transferible y replicable en el nuevo microorganism« ito lado, hay que considerar la capacidad que presenta un microorganismo tutar de forma espontinea. Este fendmeno puede ocurrir cuando una bacteri ometida a una presién selectiva, es decir, hay presencia de agentes en el nicoonganime Resistencia Enfermedad Saphylecoceus aureus Fancomicina nfeciones de pe y herds Fntemcoceus antbioticos Bisicos [nfecciones del waco urinario y vaeaas dels ‘Sneplococcux posumonine | pritinas euonis, mening ecco de ofdo Nehers gonortea anitcon sion | gonores Salmaneta y Escherichia cot [ wabvaticorbasicos [intovcacines alimeicae € antibiéticos producidos en los Estados Unidos se han empleado en tratamic acientes y el resto en granjas y cultivos. En cuanto al uso de antibidticos en : ss, el 20% se usan para tratar animales entermos y el resto para prevenir enfer es, promover el crecimiento y evitar enfermedades de las cosechas, Por lo tai an detectado bacterias pertenecientes a los géneros Salmonella, Enterococct fl que se han transmitido de animales a humanos. Los mecanismos por los cuales una bacteria se hace resistente a un antibiétit esconocidos en detalle, aunque hay descritos varios procesos implicados. 1 ria de los microorganisms (Streptomyces) que son productores de antibiétic ln genes de resistencia a éstos y dichos genes pueden ser transferidos de dite a) Transformacién, En determinadas condiciones una célula se puede hacer competente, es receptiva para la adguisicion de DNA exogeno del medio. La enfermed transmisi6n sexual llamada gonorrea se ha hecho resistente a la penicilie este mecanismo. Transfeccién. sun caso part Conjugacion, Para ello se requiere el contacto fisico entre dos microorganismos, Adem necesitan en el organismo donador la presencia de genes tra, encargados formacién de los pelos sexuales (“pills”) por donde se transmite el DNA producir cambios en la pared celular, etc. y genes mob, que suelen enco se en el DNA a transerir y son requeridos para la movilizacion del mism ‘este proceso se suele intercambiar DNA plasmidico. La enfermedad cat por Shigella diarrhea se transmite a través de la transferencia por conjug, de un plismido pequeno. b) lar de transierencia del DNA (procedente de virus), ° Existen genes de resistencia a antibiéticos que presentan en sus extremos ‘cuencias que codifican integrasas, enzimas que tienen la capacidad de se (5 genes de resistencia del resto del genoma y convertirios en material gen nicional y, por lo tanto, transferible y replicable en el nuevo microorganismo r0 lado, hay que considerar la capacidad que presenta un microorganismo star de forma espontanea. Este fendmeno puede ocurrir cuando una bacteria ‘metida a una presiGn selectiva, es decir, hay presencia de agentes en el mes de inyeceién de agua, los tanques de almacenamiento, los sistemas de t 210 de aguas negras, los sistemas de filtacion, las tuberias de uso diverso ‘ tbranas de Osmosis reversa, el sistema de distribucion de agua potable, etc. f -yeia de los sistemas industrales los depésitos causantes det biodeterioro esta if¥nados con diversos tipos de ensuciamiento abistico. Para su prevencion y :e debe considerar no s6lo la actividad y el crecimiento microbianos, sino las condiciones fisicoquimicas de la interfase metal-disolucion y las relaci cas en el fluido citcundante. La eliminacién de microorganismos es diffe Ws o sistemas abiertos, mientras que en tanques o sistemas cerrados, la elit es mas sencilla. Asi, se pueden utilizar agentes bacteriostaticos y bacteric {estruyan 0 inhiban el crecimiento, © mexificar las propiedades biolgicas: a “= para inhibir las bacterias anaerdbicas, pH de crecimiento no adecuado, elir 1» de azuite para bacterias oxidadoras del mismo, cambios en la concentracis 210, uso de condiciones alcalinas en aleaciones de hierro y acero median EAacién de carbonato de calcio o cal y uso de protectores como las camisas de Jeno que impiden la humedad. Las cubiertas protectoras también pueden ser + 5_..como las detectadas en piezas arqueolégicas del tipo fino y compacta, lan 2 ata, 0 fosfato ferroso bisico que inhibe anddicamente el proceso de la biocs + ate += Contaminacién biolégica 71, Resistencia a antibisticos primera plaga (peste bubsnica) que hay registrada en la bibliografia ocurri (@& 1300 y afect6 a un tercio de la poblacién de Europa. Un gran avance se ¢ saando se descubrié la penicilina en os anos 50 del siglo pasado. Actualment Gtros antibidticos bisicos, como la estreptomicina, la gentamicina y el clora Sin embargo, cada vez se dan mas casos de eniermedades que son mas difi luss0 imposibles de tratar, y causan la muerte. Un estudio realizado en Est ts entre los anos 1980 y 1992 refleja que mas del 58% de las muertes caus int fermedades infeccioss se debe al problema de la resistencia a antibidticos acta ver que un paciente enfermo consume un antibiético, éste destruye a la dive las bacterias, pero algunas pueden sobrevivir adquiriendo genes de resi 2 otras bacterias. Estos gérmenes pueden multiplicarse muy ripiamente ct asi estirpes resistentes a la droga. Este proceso provoca que los tratamiento +4205 para eliminar ciertas enfermedades infecciosas sean cada vez mas lent 3005. En la tabla 10.2 se muestra algunos de los microorganismos resistentes eves. nmayoria de las eniermedades infecciosas estin causadas por agentes vir atiaibidticos solamente son ciectivos en los casos en que las infecciones « akas por bacterias. Sin embargo, el mayor problema de resistencia a antibi6 eaen el uso que se hace de los mismos para tratar animales y cultivos que p> inteate son de consumo humano. Mas del 40% de los 25 millones de kilogrs«La capacidad quelante de la biopelicula, para atrapar selectivamente ior influyen en la actividad biol6gica del consorcio, ©) Cambios en la conductividad eléctrica de la zona involucrada. Este fen reduce la efectividad de los biocidas, porque baja su concentracion crt! 10.5.2. Métodos de identificacién y control de la biocorrosién specciones microscépicas auestras. Asi, los cambios en la superficie del metal se atribuyen a la presen ricroorganismos (deptsitos blandos y/o mucilaginosos, tubérculos o excrecenc etal, pequerios ofiticios con cavidades formadas por debajo de la superficie. & specto de los depésitos puede indicar cuales son los microorganisms pat ‘abla 10.1). Tabla 1011, Aspecto de los depsisites sobre ta superficie del metal epee Micooaanine es Negro — [Races rectors de sla Narani_[Bocteris oxidantes de hiro Amarillo Wactetakoxiartes del azute Vsrono | Stora trmadovas de Tow > obstante, se requiere un andlsismicrobiolégico exhaustvo, ya que es fundarr intificar los microorganismos para confirmar que la Causa tiene origen bioldgico "realizar un tratamiento adecuado. EI ansliss microbioligico consa de des p 2) Determinacién de microorganismos mediante métodos épticos ¢ inmut gicos. b) Deteccién, enumeracién ¢ idenificacién de los microorganismos. Hay tres todos de deteccién de la biocorrosin ~ Conteo directo otal de celulas viables, activas y latent fincluyend la lulas muertas). ~ Células viables (que se reproducen. Se determina ol crecimiento de las lulas en medias de cultivos generates y/o selectivos. = La actividad celular (que no necesariamente es su cultivo antfcial, veneiéin y control “ay que mantener limpio el sistema. Los problemas mis frecuentes en una ple sstrial ocurrren en los sistemas de enrlamiento recirculacion abierta 0 cera},pbiana de una superticie metilica quedan atrapadas moléculas en la interfase m isolucién. Este proceso de adsorcién espontnea modifica la sensibilidad y dist fn de las cargas eléctricas en la superficie metalica, produciéndose un ambier tuado para la actividad microbiana. La adsorcion posterior de células tiene lug da interiase. Las células inician la colonizacién irregular de la superficie metalic ablecen zonas localizadas heterogéneas, donde existen dreas que actdan cor [os © citodos sobre la superficie de metal. Este fensémeno permite la solubiliz de minerales que atraen a otros tipos de microorganisms. Esta localizacién | me induce celdas de aireacién diferencial, mientras que debajo de esas zor nnicroorganismos se encuentran en anaerobiosis. Por lo tanto, se encuentra w |anddica que favorece la disolucién de la aleaci6n y, simultineamente, la may ‘entraciGn de oxigeno causa una zona de reacciGn catédica que acelera la inc ién de iones a la interfase. Como consecuencia de la biocorrosion se encuentt Juras que crecen en area y profundidad. La distribucién no homogénea de icula sobre superficies metalicas determina la resistencia a la corrosién. La c« incia de especies aerdbicas y anaerdbicas sobre la superficie permite que bacter ‘ces de reducir Los compuestos férricos (insolubles) a ferrasos (solubles) causen tuciOn de capas del hierro formados por Oxidos e hidroxidos férricos. De esta s¢ facilta el acceso a la superficie metalica de los sulfatos y otros productos os generados por las bacterias sulfatorreductoras anaerdbicas. in el pasado se usaron detergentes aniénicos y catiénicos, metales pesados, ar sy cromatos, como inhibidores de la corrosion, Actualmente no se san por n de proteccién ambiental y en el control del biodeterioro se utiliza cloro y/o pr srofenol y, sales cuaternarias de amonio. Ya que estos métodos no son tan ee ‘Como los anteriores, actualmente se estin desarrollando biocidas que sean tces. Generalmente los tratamientos quimicos no contemplan las interaccior * los depésitos biolégicos e inorgénicos, ni la compatibilidad entre un tratamie Sidor de corrosién y un biocida de aplicacién simulténea. El registro del siste 2 incluir métodos que permitan medir el proceso de la biocorrosiOn y el biode >. £l método més utilizado en el control del biodeterioro es por cloracion perié ‘continua del agua de alimentacién, para destruir los microorganismos de la t ula y solubilizar parcialmente los mucopolisacéridos. A veces estas técnicas in por problemas de incompatibilidad quimica y ambiental. Ademas, se probado que la cloracién solamente alcanza los estratos mas superficiales. Po + en los titimos afos se ha centrado la atencién en el uso de biocidas alten ‘de mejor compatibilidad con el ambiente (ozonc). La calidad de un biocida Je de su perduracién, actuacién rapida y su capacidad de proteger los metaler &s incluso se requiere que sean desincrustantes, para evitar la acumulacién de ates que atraigan a los causantes de la biocorrosi6n. _a elaci6n entre biocorrosién y biodeterioto depend de diversos factores: 4) El metabolismo microbiano de la biopelicula. 3) La concentracién de productos metabslices liberados. 5) El tipo de compuestos quimicos reducidos por los microorganismos adhe alos mucopolisacaridos.Puestos naturales, y a que hay compuestos naturales de igual natura !os compuestos xenobisticos pero que no han sido descubiertos come ii) Diferencias laboratorio-campo. Las condiciones del laboratorio son muy diferentes a las del ambiente ral (terrenos arcillosos que estan altamente empaquetados y el agua Y ‘geno penetran muy despacio). Ademas, las condiciones medigambie pueden ser fluctuantes. ) Interacciones. = Interaccién de exigencias, {Las bacterias que llevan a cabo la degradacién conjunta de un com {0 no tienen los mismos requisitos de crecimiento. Asi, en la dep i6n de policlorobifenilos éstos son desclorados por organismos an bios estricios y el esqueleto carbonado resultante es degradado por rnismos aerobicos. ~ Interaccién entre los productos de degradacién. Las bacterias que degradan un compuesto en una primera fase, pu Benerar un producto que es t6xico para otras, Asi, en la degradiaci¢ policlorobitenilos se forman clorocatecoles que pueden ser transfom 2 protoanemonina, un antibidtico que puede destruir a otras bactt -5. Biocorrosién y biodeterioro 5.1, Definicién y tratamientos Los microorganismos pueden modificar la estructura quimica de los materi bacterias que oxidan minerales, fijan CO, y son auttrofas (quimiolitetrofos). » de reacciones requieren, ademnis de oxigeno, un metal divalente y azuite Atal o en forma reducida. E| producto es un metal oxidado y cide sultirico. P< ©, estas bacterias tienen que ser acid6filas (pH 2), ademas de mostrar toleranc al, que se solubiliza a este valor de pH, ya que los iones metalicos son solu os para la vida microbiana. Los microrganismos en ausencia de onigeno. & 2o, nitrato o fosfato. En el caso del sulfato, el agente responsable del deteriort LS, y el anion suliato es el compuesto inorgénico usado como aceptor final trones. ‘os procesos de biocorrosion y biodeterioro dependen de la propiedad microb i intetizar mucopolisaciridos, compuestos orginicos necesarios para que los ti < nismos se adhieran a las superticies. Estos mucopolisacaridos facilitan las react 3e Gxido-reduccién entre el metal y los minerales del agua (fendmenos electroe '8), lo que implica que a mayor secrecién de aquéllos, los minerales en circ se retienen en ese lugar, y, a su vez, se atrapa un mayor numero y variedacd dorganismos (formacién de un biofilm o biopelicula). En esta biopelicula com? Uimiolitotrofos, heter6trofos aerobios y anaerobios. Previamente a la colonizate!= Desarrollo de una poblacién microbiana adecuada, Cada especie bacteriana tiene una capacidad limitada de degradacién, posible que una misma especie pueda oxidar el carbono de los compues contaminantes hasta CO, pero otras veces los compuestos organicas co plejos pueden volver a la fase Iiquida en el caso de que no pueda romper tun enlace concreto y otros organismos se encargan de asimilar estos me bolitos intermedios. Puede ocurtir que la fraccién no degradada por un p ‘mer cultivo sea t6xica para las bacterias iniciadoras de la degradacién, y, no hay un cultivo secundario que consuma estos restos, la toxicidad se | acumulando hasta que se pare el sistema. Las etapas para el desarrollo de un cultivo microbiano atilizado en biorrecup racién son: Seleccién de las fuentes de microorganismos. = Crecimiento de los cultivos bacterianos en laboratorio. — Determinacién de los pardmetros cinéticos y estequiométricos. = Determinacién de los limites de toxicidad, Crecimiento de cultivos a alta concentracién. Pardmetros de funcionamiento y control del proceso. i) Concentracién de sélides. En la mayoria de casos la concentracidn de sélidos ocupa de un 10% has! tun 40%. Lo que se pretende es que dichos sélidos no decanten para que + proceso sea mis corto, Ademés, cuanto mayor es la concentracién de sol dos, mayor es la concentracién de compuestos a degradar que pueden sc t6xicos para los microorganismos. Otro problema ocasionado por el auumer to de sdlidos es la reducida tasa de transferencia de oxigen, Aireacién y demanda de oxigeno. La mayoria de los procesos degradativos ocurten en condiciones aerobicas por este motivo, en los sistemas de biorrecuperacién se utilizan mezclado tes que ayudan a distribuir el oxigeno disuelto. i) Temperatura y pH. iv) Surfactantes y ottos acltivos. Los surfactantes se emplean a veces para ayudar a la desorcién y solubiliza in de los compuestos a degradar con el objetivo de mejorar su biodegra dacion. Los surfactantes actian como emulsionantes que hacen que com ppuestos mas hidréfobos pasen a la fase liquida. En algunos casos se afacler oxidantes que hacen que los compuestos sean mas facilmente degradables Inconvenientes de la biortemediacién ex situ i) Microorganismo adecuado. Resulta muy dificil encontrar bacterias que degraden todos y cada uno de los contaminantes. La capacidad que presentan los microorganismos para degradar los compuestos xenobidticos se debe a que son analogos a com.(8) ea ay i UL B) Proceso de mezclado. La funcion del mezclado es producir una buena homogenizacién de | fluido, Se pretende evitar gradientes de concentracién y temperatura det reactor y minimizar los procesos de toxicidad para los microorganismos ©) Necesidades de nutrientes, La degradacién de compuestos complejos, como los que normalmente ‘cuentran en suelos contaminados, da a menudo como resultado rendin celulares sorprendentemente bajos, y por lo tanto, hay pocas necesidar nutrientes, De todas formas es dificil predecir las cantidades de nitrogen foro y otros elementos necesarios y normalmente se suministran en exces forma de sales que suelen ser mas solubles. D) Pretratamiento. Es un proceso muy frecuente en los procesos de descontaminacién de s ya que los contaminantes son generalmente hidrotobicos y estin unido Capa mas fina del suelo que tiene una mayor relacion supericie/volumes Fo tanto, piedras, arenas y gravas estin por lo general limpias y deben ser radas del terreno a trata. Ademas, este tipo de material sucle ser el mis p {que se acumularia en el fondo del reactor, y entorpeceria mantener la te si6n. Adicionalmente, hay otros deshechos que no forman parte del suelo era, plasticos, etc.) que también son retirados. Hay dos tipos de técnicas ~ Separ El terreno es cribado y separado segin el tamano de las particulas. As ‘materiales ligeros (madera, plasticos, etc.) son separados de los mater pesados del suelo (grava y arena) y éstos, a su vez, son separados d partculas finas (limos, arcillas y humus). = Lavado del terreno, El objetivo es separa las particulas fnas akamente contarvinadas de as ulas gruesas menos contaminadas. Este método suele ser bastante caro y ¢st8 aconsejado en el tratamiento de suelos arenosos y de grano grueso, n por tamafios. ©) Inoculacién microbiana. Hay varios parémetros a considera, tales como el desarrollo de la poblax ‘microbiana adecuada, el suministro de una concentracién adecuada de mi organismos y el control de la toxicidad.Bioaumento 0 biomagnificacién. Adicién de microorganismos naturales ¢ manipulados genéticamente al medio. Bioestimulacion, Modificacién del medio para reforzar el crecimiento de los microorganismos, Normalmente se adicionan nutrientes, oxigeno, etc. tiortemediacién ex situ (biorreactores). | tratamiento de residuos t6xicos se realiza en biorreactores. Los biorreactores ja suspensién se utilizan para la biorrecuperacién de terrenos contaminados. I terreno a descontaminar se introduce en un recipiente de contencién con su- ciente agua para permitir una mezcla continua. Normalmente se optimiza la jorrecuperacién afiadiendo nutrientes (orgénicos o inorganicos), controlando | pH y la temperatura, 0 reactores utilizados en ef proceso via suspensién pueden ser construidos ependiiendo del tamario de los materiales seleccionados. Los tamaiios de los iomeactores comerciales oscilan desde 3 m de altura y 15 m de diimetro has- 14,4 mde altura y 7,6 m de didmetro. Los suelos o lodos contaminados se in- Coducen dentro del reactor, se afiaden los nutrientes, el agua y los cultivos ‘obianos. Se mezcla y se airea la suspensi6n hasta que las transiormaciones & los compuestos seleccionados alcanzan un estado satisfactorio. Posterior- rente, se para el mezclado y la aireacién y se deja a los s6lidos separase del -aido por sedimentacién (suelos) 0 por flotacion (langos). Los sélidos son ret dos y, si procede, devueltos a su lugar de origen y los liquidos, 0 bien se de- 1 evaporar o bien se reutilizan en un nuevo tratamiento. acién de los reactores | ministro de oxigeno, anque hay compuestos que pueden actuar como aceptores terminales de Ectrones altenativos al O, (NO,, NO;, SO} ,ete.), la mayoria de los procesos + gradativos se llevan a cabo en condiciones aerdbicas. 1 oxigeno se puede smninistrar mediante diversos sistemas como se muestra en la figura 10.3: ‘Aireacién difusa. El oxigeno se suministra haciendo pasar el aire a través de unos dispositivos porosos (dispositivos de ceramica) que suelen estar colo- cados en el fondo del tangue. ‘Turbina difusora. Son sistemas combinados de aireacién mecinica y difusa, cen los que el aire es introducido bajo una turbina de alambres planos situa da en la parte baja del reactor. En este caso, el aire se fracciona en pe- quefias burbujas lo que origina unas buenas Caracteristicas de mezclado y transferencia.. Aireacién superficial. Esta originado por una turbina situada en la parte su- perficial del reactor. Cuando dicha turbina gira, el agua es arastrada hacia arriba en pequetas gotas. Estas gotas proporcionan una buena superficie de transferencia del oxigeno y la turbulencia general resultante proporciona un buen mezclado.to efectos negativos sobre la coordinacién motora y disminucién en la ca dad de aprender, 14. Biodegradacién Los compuestos orgénicos son inestables y los microorganismos pueden ob ‘mo productos finales CO, y CH, en anaerobiosis y CO, en aerobiosis, ackems Oy NH,, La mineralizacion de un compuesto organico es la degradacién tot: smo, es decir cuando se generan los productos finales descritos anteriormente Contratio, un compuesto es recalcitrante cuando no se transforma en absolute @ lado, se da cometabolismo cuando e! microorganismo modifica la estructur Mmpuesto pero no obtiene energia del proceso ni incorpora ninguna parte « 2lécula original. Hay algunos microorganismos que pueden obtener energia a j | compuesto, aunque ninguno de ellos pueda degradarlo independientemente, ‘meno se denomina metabolizacién por un consorcio (sintrofia). A veces la ‘cia de un compuesto facilmente asimilable aumenta la degradacién del com xenobidtico. Otras veces, la presencia de un segundo sustrato impide la utiliza compuesto. Que ocurra una cosa u otra depende del microorganismo, del « 2sto a degradar y de las condiciones ambientales, este fendmeno se denomina +i6n de un segundo sustrato 0 cosustrato, aa iorremediacién Se refiere a cualquier métodlo que usa microorganismos para reciclar mater nicos y separar iones inorganicos. Los microorganismos deben estar presente Ciente cantidad y diversidad Para que ocurra este proceso en condiciones ptimas se requiere que la corm ion de oxigeno residual sea 1 ppm o superior (procesos aerobicos), que estén tes los nutrientes inorgénicos esenciales, y que los microorganismos y el sust :nen contacto. -2 biorremediacién presenta ventajas sobre otras técnicas alternativas para el compuestos contaminantes como son los tratamientos fisico-qulmicos, ya qu: 2roceso natural para destruir contaminantes organicos, los productos formados sralmente inocuos, la relacién coste/efectividad es menor comparada con © vologias y puede ser ejecutada in situ 1s de biorremediacién \) Biorremediacién in situ Se refiere al tratamiento de compuestos t6xicos en el lugar donde se ha pro ido la contaminacién. A su vez hay dos tipos de técnicas de biorremediac in sit:ietithexil italato (DEHP). Constituye el 90% de! total y se emplea como adi 2VC usado en objetos tan variados como prendas de lluvia, botas de agua, jug 4e nis, tapones de cerveza, guantes de goma, bolsas de sangre, etc. A butilbenzil ftalato (BBP). Se emplea como plastficante en productos como ¢ niético, baldosas, repelentes, etc. 1 dietlftalato (DEPI. Se utiliza como plastificante de las peliculas de acetato losa, cepillos de dientes y juguetes. 2. Actuaci6n y efectos de los interferidores hormonales ‘08 compuestos xenobidticos alteran el funcionamiento de los sistemas hormo rvioso de varias formas: ) Emulando la accién hormonal. Asi los compuestos xenoestrégenos (nonil fet les) emulan la accién del estradiol. ) Estimulando la sintesis de receptores hormonales y potenciando la accién las hormonas naturales y sintéticas ) Bloqueando la accién hormonal. En algunos casos, las dioxinas presentan efecto antiestrogénico, mientras que el DDE (producto de descomposician « DDT) y la vincocilina (un fungicida) son antiandrogénicos al competir con testosterona ) Favoreciendo la degradacion de hormonas. Las dioxinas y los policlorobife los provocan una disminucién de hormonas masculinas, y de la insulina, tro nna y progesterona, ' Favoreciendo la eliminacién de las enzimas que degradan las hormonas. Destruyendo las hormonas directamente. fectos que provocan jos interferidores hormonales pueden ser diversos: Reproduccion. Los embriones son especialmente sensibles a las hormonas. + jos € hijas de madres que tomaron DES (dietilesilbestrol) tienen problemas + fertilidad. Los policlorobifenilos disminuyen la concentracién de progesteror al favorecer su destruccién en el higado, ademas se han relacionado con la d minucién de movilidad y del nimero de espermatozoides en el hombre. Sistema inmune. Detfines muertos por infecciones tienen concentraciones « policlorobifenilos dos-tres veces superiores. Carcinogénesis. Algunos compuestos xenobidticos son cancerigenos, pe: ademis, los xeno-estrogenos (DDT, policlorobifenilos, dioxinas y atracina, e: tte otros) promueven la proliferacién de algunos tumores. En ratas se ha demo trado que los estrogenos inducen cancer de prostata. La incidencia de cnc de préstata ha aumentado un 126% entre 19733 y 1991 en los hombres de No twamérica. Comportamiento. Resultan especialmente sensibles los embriones. Experimet tos con embriones de monos expuestos a policlorobifenilos ponen de manitie‘mganoclorades recalcit Las dioxinas se producen principalmente en el blang acci6n incineracién de PVC y sintesis de al »xiacéticos clorados), iquco del papel con clora Igunos compuestos organocloradk Los policlorobifenilos se empezaron a comerciali rmadores eléctricos, cosméticos, barnices, Sn se prohibid en muchos paises pero el nsformadores, izar en 1929 y se usaron en lintas y retardantes del fuego. La pre problema persiste en lo acumulac iguicidas — Herbicidas. Entre ellos se encuentran los c ‘ompuestos fenoxiacéticos clorac fa atrazina, ~_Insecticidas. EI DDT se comenz6 a producir en 1938 y se us6 a gran escal todo ef mundo, Se dej6 de usar en los paises desarollados en 1972 per Continua produciendo en USA para su exportacién y en los pafses en via desarrollo. Fungicidas. E1 pentaclorofenol se usa para preservar fibras textiles y mad vilfenoles ie uiizan como detergents, surfactantes portadores de plaguicidas, ingredier ‘sméticos, ingredientesactivos de espermicidas(nonil-9), antioxidants y estat 2res de plasticos PVC y poliestreno), ingreientes de pinturas de latex y emul: 6s de grasas y lubricantes. nol A sel monémero para la sintesis de resinas epoxi o pi Smero puede estar presente por una polimerizacién i polimero al calentar. También se emplea en los emy listicos de policarhonato, incompleta 0 porque se ro: pastes dentales, emplean en la fabricacion de plisticos para aumentar su flexibilidad y en la ¢ i6n de pinturas,tintas y adhesivos. Su produccién actual es del orden de 4m de Tm/ano. Algunos de ellos acttian como interferidores hormonaless‘tin local 90% agus resales teas 30% resis ramparts o 0% resid in Figura 1022, Residues generados en Estas Unidos por aio 2.2. Clasificaciones 1) Clasificacion segtin fa EPA, 1) Residuos de procedencia especifica (*K"): generados en procesos conere de ciertas actividades industriales (industria de plaguicidas, industria hierro y acero, tratamiento de aguas residuales con pentaclorofenol, an nas, etc. 2) Residuos de procedencia inespecitica (*F"): generados en la fabricaci ‘compuestos de uso habitual que posteriormente suiren otras modificacior (disolventes halogenados en procesos de desengrasado y electroplastia; drocarburos alifticos clorados en limpieza de reactores). Residuos relacionados con productos quimicos concretos de indole « mercial (*P" y “U"). Estos residuos son considerados toxicos cuando $ descartados en su forma pura, 0 bien, son eliminados en contenedore: vertidos. 3) 1 Clasiicacion general. 1) Segtin su forma o fase de distribucién (sides, liquids, et.) 2) Residuos organicos o inorganicos.. 3) Segan su categoria quimica (disolventes, metales, etc) 4) Segtin los componentes peligrosos que afecten a su tratamiento. Compuestos xenobisticos ‘ompuestos organicos se pueden clasificar en dos grandes grupos: Compuestos biogénicos 0 naturales, que son sintetizados por los seres vives son biodegradables. Compuestos xenobisticos, que son sintetizados por el hombre, en su mayor proceden de actividades indusiriales, y tienen estructuras diferentes a los nat rales. Por lo tanto, la toxicidad de los compuestos xenobisticos radica en + igfan persistencia en el medio ambiente, la mayoria son compuestos cance: sgen0s y. ademés, pueden actuar como interferidores hormonales (véase Cay tulo 17),500% (esis slides 36% (calidad agus residuales ode Shuastecimiento) (calidad det ite 7% sido ido) Figura 10.1, Particiom del presupuesto destinado a temas ambientales en fos Estados Unic tnque esta definicion hace referencia s6lo a residuos sélidos, también se puedet !nrarresicuos iquiddos que son altamente t6xicos. Ademis, hay residuos liquids 7 almacenados y posteriormente exportados que se convierten en residuos soi (tra definicién mas completa realizada por el Programa Medioambiental ck 'ciones Unidas define los residuos toxicos como solidos, lodos, liquidos, 0 ¢ tasados que no son radiactivos 0 infecciosos y que debido a su actividad quin ica, explosiva 0 corrosiva son fuente de peligro pata la salud © para el medio. Ite, de modo individual o en contacto con otros residuos Por lo tanto, para que un residuo sea catalogado de peligroso téxico debe 4 tuna de las siguientes caracteristicas: a) Cotrosién. Residuos altamente acidos o alcalinos. }) Inflamabilidad. Residuos de facil combustién que ofrecen riesgo de incen ©) Reactividad. Residuos dafinos por reacciones sibitas (explosives). 9) Toxicidad. Residuos capaces de desprender concentraciones importantes sustancias especificas en el agua 2.1. Generacién de residuos toxicos 108 residuos t6xicos tienen su origen en una amplia gama de actividades indust agricolas, comerciales o domésticas Fig. 10.2) 1) Los residuos industriales. Son de origen muy diverso y comprenden: materias primas ya agotadas, ma fial procesado sin uso alguno, material proveniente de lodos procesados (ta Imientos de aguas residuales, recuperacion de otros residuos toxicos, ef. productos quimicos comerciales. ) Los generados en pequenas cantidades. En este grupo se encuentran los servicios de limpieza en seco, mantenimier de automéviles, laboratorios fotograficos y laboratorios de anslisis. ' Residuos t6xicos generados en el mbito doméstico. Este grupo comprende productos relacionados con pinturas, productos de lit Pieza, plaguicidas y compuestos quimicos utilizados para el automénil,+ Introduccién a la contaminacién quimica y biolégica a contaminacién se define como un desequilibrio entre la entrada (produccién Vida (descomposicion) de los ecosistemas como consecuencia de una pertyrt en el transporte (horizontal) de una materia que no ha sido asimilada por la x iv (ver Capitulo 1). 1 la €poca romana, muchas de las personas acaudaladas morian de satumisn stiGn de plomo) y, en parte, el declive del Imperio Romano pudo deberse » sis que originaba en los emperadores romanos estas mutes. Sin embargo, | cemas de la contaminacién surgen con la Revolucidn Industral. De modo gr se fueron generando residuos inorgénicos, tales como el plomo y el mercuric, siglo XX comenz6 a generarse gran cantidad de productos organics siméticg Acipio, las politicas gubernamentales no prestaban interés por estos residues 10 se tomaron medidas porque se confiaba en la capacidad del medio ambien 1similarlos, o, simplemente, se desconocian sus efectos devastadores. 1n el desarrollo de la Quimica, la Epidemiologia y la Toxicologia, se empez6 render los efectos, a corto y largo plazos y a escalas individual y ecosistemicg Compuestos t6xicos. Sirvan los ejemplos siguientes: DDT (iclorodifenilticloroetano). En 1962 se hizo publica la presencia de est plaguicida en calamares de! fondo marino, en pingvinos de la Antartda y ¢ {ejidos grasos del hombre. En aves acudticas, los efectos del DDT se asocisro, on ingerilidad y en el caso del hombre se asocié con el incremento de la apo Fici6n de canceres. ‘Mercurio. En estado liquido se utlizaba para curar restriados, ya que no se co ocfan sus efectos colaterales negativos, Las sales de mercurio se emplearon er {a industria textil de los Paises Bajos para hacer sombreros (locura del sombre £0). EI mercurio inorganico es metilado en los sedimentos y después es ingerice 90r crustaceos, pasando a la cadena alimenticia hasta llegar a los humanox. £ ‘netilmercurio produce paraliss y pérdidas scnsoriales. °CB (policlorobifenilos). Su uso como insecticidas fue extensive durante lox 40s 60 y 70. Ademés, se utilizaron en la industria de ls refrigerantes, de plas iicantes, yen la produccién de papel sin carbono, Los efectos sobre la pole in son un aumento en aborios y defectos de nacimiento, tt de los afios 60 se empez6 a tener conciencia colectiva del problema de taminantes. La mitad del presupuesto gastado por los Estados Unidos destina ntos medioambientales ha sido a partir de los afios 90 para la gesticin de resi- lidos (Fig. 10.1). Residuos A (Agencia de Proteccién Medioambiental de Estados Unidos) define “residuo” 11 objeto inmévil sin uso conocido y que esta permanentemente descartado.osario remediacin: Tatamiento de compuesos txicos para ws elminacién, reactor: Recipiente de contencin donee se realizan procesos de biowemediacién, pelicula (biol: Supericieinoginica ala cual se athiren microoxzaniamon lomando capas ‘puesto xenabidtco:Susancia que presenta estuctra dierente alos compension naturales yo ‘ada principalmente como consecuencia de actividades intial, = Agencia de Proteceién medioambiental de Estados Unidos. ‘ferdor hormonal: Compuesto xencbidtico que afeca fs sistemas hormonal y newvioxo, rerazaién: Degrdacion de un compuesto hasta CO, y CH, lnaerobiosn © CO, aero) pares por millon, Aleitranca: Resistencia a la degradocin, ‘duo: Objto inmeil sin uso conocido Y que ests pexmanentemente descartado, sgn: Gen exdigeno que provine de otto organism,CAPITULO 10 CONTAMINACION QUiMICA Y BIOLOGICA Glosario 10.1 10.2. 10.3, 1. 10.5. 10.6. Introduccién a la contarninacién quimica y biolbgica Residuos 10.2.1. Generacién de residuos toxicos 10.2.2. Clasificacion Compuestos xenobisticos 10.3.1. Clasificacién de los interieridores hormonales ‘Organoclorados recaleitrantes Plaguicidas Alguilfenoles Bisfenol A Ftalatos 10.3.2, Acuacion y efectos de ls interieridores hormonales, Biodegradacion 10.4.1. Bioremediacion Tipos de biorremediacion Modelizacion de los reactores Biocorrosion y biodeterioro 10.5.1. Definicidn y tratamientos 10.5.2. Metodos de identticacion y control de la biocorrsién Identticacion de la biocorrosion Prevencién y control Contaminacién biolégica 10.6.1. Resistencia a antibisticos 10.6.2. Plantas transgénicas Técnicas de transformacion de plantas Etapas de la construecion de una planta transgénica Bibliogratia