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REDUCCIN DE

NITROBLUE
TETRAZOLIUM (NBT)

El rendimiento de un procedimiento estimulado puede resultar til para revelar la


presencia de un defecto neutroflico intrnseco4,6,7,11,18,42,49,50.

REACTIVOS

(Procedimiento nmero 840)

VIAL DE NBT, nmero de catlogo 840-10


Nitroblue tetrazolium, 1 mg, liofilizado, con tampn fosfato y cloruro sdico.

APLICACIN

HEPARINA(N), SAL SDICA, nmero de catlogo 840-20


Viales de vidrio siliconizado con heparina(N) (porcina), 20 unidades, para la recogida de 1
ml de sangre total.

Para la demostracin histoqumica de la reduccin del NBT intracitoplsmtico en


neutrfilos, para identificar disfunciones de los neutrfilos y/o distinguir infecciones
pirognicas2. Los reactivos de tincin de NBT son para uso diagnstico in vitro.
Se atribuye a Park y cols.1 la primicia en utilizar la prueba de reduccin de nitroblue
tetrazolium (NBT) en neutrfilos, como ayuda de diagnstico para diferenciar las
condiciones febriles inducidas por bacterias, de aqullas de origen no bacteriano. La
prueba consiste en la incubacin de sangre con una solucin tamponada de NBT. Las
extensiones se preparan, se tien y se examinan en el microscopio para determinar el
porcentaje de neutrfilos que presentan depsitos intracitoplsmticos de formazn. Este
porcentaje generalmente aumenta en infecciones bacterianas.
Algunos estados patolgicos, especialmente aqullos que implican defectos
metablicos de la funcin neutrfila, muestran valores de la prueba NBT bajos o normales,
incluso cuando existe infeccin bacteriana activa. Estas condiciones pueden ser
detectadas mediante la modificacin de la prueba NBT para que incluya la estimulacin
in vitro del sistema fagoctico. Esta estimulacin puede alcanzarse mediante la
incorporacin de filtrado de cultivo bacteriano2,3, partculas de ltex4,5, cimosn6,
endotoxina7-9, contacto con el vidrio6, o altas concentraciones de heparina9-12, en la mezcla
de incubacin de sangre-NBT. La estimulacin in vitro de la sangre de personas normales,
sin defectos celulares o humorales y sin deterioro en el metabolismo granuloctico,
mostrar un marcado aumento del porcentaje de formazn en los neutrfilos. Las clulas
de pacientes con tales defectos (p.ej., granulomatosis crnica [GC]) no muestran una
respuesta positiva, ni siquiera con estimulacin4,6,8,11.
Se han publicado muchos documentos2,4,7,13-27 confirmando o desmintiendo la
reivindicacin original1 referente a la utilidad de esta prueba para fines de diagnstico. En
una revisin del estado actual de la prueba NBT en el diagnstico clnico, Segal28 sugiere
que la misma es de poco valor en el diagnstico de la infeccin pirognica. Como
respuesta a esta crtica, Freeman y King29 puntualizan que pueden producirse resultados
contrapuestos procedentes de diferentes laboratorios a raz del uso de modificaciones
escasamente normalizadas del procedimiento de Park1.

VIALES DE VIDRIO CON TAPN, nmero de catlogo 840-50


Viales siliconizados para la incubacin de muestras.
TINCIN DE WRIGHT ACCUSTAIN, nmero de catlogo WS 10
Tincin de Wright, 0,3 %, tamponada a pH 6,8, en metanol.
ESTIMULANTE, nmero de catlogo 840-15
Extractos de bacterias (no viables), liofilizados.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:
Almacenar el vial de NBT en la oscuridad y refrigerado (28 C). Almacenar el
estimulante refrigerado (28 C). Almacenar la heparina y los viales a temperatura
ambiente (1826 C).
Almacenar la tincin de Wright ACCUSTAIN a temperatura ambiente (1826 C).
Estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
PREPARACIN:
La SOLUCIN DE NBT se prepara reconstituyendo un vial de NBT, nmero de
catlogo 840-10, con 1,0 ml de agua destilada. Dejar reposar durante unos minutos y
mezclar vigorosamente. El vial reconstituido es estable durante 1 da si se guarda en el
frigorfico (28 C).
LA SOLUCIN DE ESTIMULANTE se prepara reconstituyendo el estimulante, nmero
de catlogo 840-15, con 1,5 ml de agua destilada. Agitar hasta su disolucin. Almacenar por
debajo de 0 C. La solucin puede congelarse y descongelarse varias veces.
PRECAUCIONES:
Se deben seguir las precauciones normales ejercidas en el manejo de reactivos de
laboratorio. Deshacerse de los desechos observando todas las normativas locales,
regionales y nacionales. Consultar la Hoja de datos de seguridad del material para obtener
cualquier informacin actualizada sobre riesgos, peligros o seguridad.
Declaracin de riesgos y seguridad (EE.UU.)
Viales de NBT. Precaucin: Evitar el contacto y la inhalacin.
Viales de heparina. Precaucin: Evitar el contacto y la inhalacin. rgano al que
afecta: la sangre.
Estimulante. Precaucin: sustancia en proceso de prueba.
La solucin de tincin de Wright es INFLAMABLE y TXICA. Txica por inhalacin, en
contacto con la piel y en caso de ingestin. Irritante para los ojos y la piel. Mantener alejada
de las llamas no fumar. Mantener el envase bien cerrado. Usar ropa y guantes protectores
adecuados. En caso de accidente o de malestar, buscar atencin mdica inmediatamente
(mostrar la etiqueta si es posible).

Se ha informado de que los siguientes factores tcnicos afectan a los resultados de la


prueba NBT:
Duracin y temperatura del almacenamiento de la sangre antes del ensayo9,10.
Duracin y temperatura de la incubacin de la mezcla de sangre-NBT6,9-12,30-34.
Concentracin de la heparina o NBT6,9-12,31-34.
Sangre capilar frente a sangre venosa35.
Contacto con plstico frente al vidrio siliconizado durante la incubacin34.
Experiencia del observador15,29.
Contacto con vidrio siliconizado frente a no siliconizado durante el almacenamiento o
la incubacin6.
8. Recogida en tubos Vacutainer 24.
9. Criterios utilizados para identificar clulas como positivas o negativas2,11,26,33,35.
10. Uso de EDTA como anticoagulante, con resultado de inhibicin de la respuesta de
NBT3,12.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Declaracin de riesgos y seguridad (U.E.) (Precaucin: sustancias en proceso de prueba)


Viales de NBT. Evitar el contacto con la piel y los ojos. No inhalar el polvo.
Estimulante. Precaucin: sustancia en proceso de prueba.
La solucin de tincin de Wright es ALTAMENTE INFLAMABLE y TXICA. Altamente
inflamable. Txica: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalacin, por contacto
con la piel y en caso de ingestin. Txica por inhalacin, en contacto con la piel y en caso
de ingestin. Mantener alejada de las llamas no fumar. Mantener el envase bien cerrado.
En caso de accidente o de malestar, buscar atencin mdica inmediatamente (mostrar la
etiqueta si es posible). Usar ropa y guantes protectores adecuados.

Parece ser que el efecto inhibidor de EDTA queda anulado si la prueba se lleva a cabo
en capas leucocitarias preparadas con sangre total en presencia de Ficoll, un polmero de
sucrosa33. Se dice que el Ficoll ejerce un efecto protector sobre la membrana
citoplasmtica de los leucocitos durante la incubacin de stos con NBT36. El uso de capas
leucocitarias para concentrar los neutrfilos, y por consiguiente acortar el tiempo de
enumeracin, tambin ha sido sugerido por Patterson37 y otros20,38.
Como respuesta a la necesidad de normalizacin, Sigma-Aldrich ofrece un
procedimiento de NBT semicuantitativo, basado en una modificacin del mtodo de Feigin
y cols.17,34 que proviene, a su vez, del mtodo de referencia de Park y cols.1

PROCEDIMIENTO
RECOGIDA DE LAS MUESTRAS:
Se recomienda que la recogida de las muestras se lleve a cabo de acuerdo con las
directrices del documento M29-A2 de la NCCLS. Ningn mtodo de prueba puede
garantizar la completa seguridad de que las muestras de sangre o tejido no transmitan
infecciones. Por lo tanto, todos los derivados de la sangre o muestras de tejido deben
considerarse potencialmente infecciosos.
La sangre debe recogerse dentro de las 2 horas anteriores a la realizacin de la
prueba. Si la prueba no se va a llevar a cabo inmediatamente, la muestra debe
almacenarse en el frigorfico9,33. Debe utilizarse una jeringa de plstico para la venipuncin.
Debe evitarse la introduccin de fluidos histolgicos. La aguja se retirar de la jeringa antes
de expulsar con cuidado exactamente 1 ml de sangre en un vial de recogida siliconizado
que contenga 20 unidades de heparina, nmero de catlogo 840-20. Mezclar bien, pero
con cuidado, inclinando ligeramente el vial y hacindolo rodar entre las manos durante
aproximadamente 30 segundos. Evitar el contacto de la sangre con el tapn.

La prueba NBT ha sido propuesta como ayuda para:


1. Identificar pacientes con granulomatosis crnica o condiciones similares debidas a
defectos metablicos de la funcin neutrfila4-6,11,39.
2. Distinguir las condiciones febriles y/o las leucocitosis de infeccin bacteriana, de
aqullas de origen no bacteriano1,7,17,18.
3. Determinar la respuesta a la terapia antibitica1,2,7,17-19.
4. Monitorizar pacientes con alto grado de susceptibilidad a infecciones bacterianas7,20.
Para realizar la prueba, las muestras de sangre heparinizada se incuban con una solucin
tamponada de NBT en condiciones cuidadosamente controladas1,11,34. Las extensiones se
preparan, se tien y se examinan en el microscopio para determinar el porcentaje de neutrfilos
que presentan depsitos intracitoplasmticos de NBT reducido (formazn).
No estimulados
Neutrfilos normales
+ NBT

Neutrfilos con
Defecto metablico
(p.j., CG, etc.)
+ NBT

Pocos depsitos de formazn1,2,17-22,40-48


Estimulados
(in vivo o in vitro)

No estimulados
Estimulados
(in vivo o in vitro)

MATERIAL ESPECIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO:


Microscopio con objetivo de inmersin de aceite.
Pipeteadores para el suministro exacto de los volmenes requeridos para el ensayo
Bao de agua a 37 C
Portaobjetos de microscopio

Aumento del porcentaje de


depsitos de formazn1-3,7,17-20,40-43

NOTAS:
Cuando el procedimiento se realiza utilizando el reactivo con una muestra de sangre
normal, debera obtenerse un alto grado de respuesta. Si ste no es el caso, es posible que
el reactivo se haya deteriorado.

Pocos depsitos de formazn o ninguno

6,7,11,18

Pocos depsitos de formazn o ninguno6,7,11,18

1-ES

3. Para que pueda considerarse positivo, el neutrfilo debe contener depsitos de


formazn en forma de masas discretas, grandes y de forma irregular.
4. Seguidamente, se registra el porcentaje positivo de 100 o ms neutrfilos contados.
NOTA: Slo se cuentan los neutrfilos. Los depsitos de formazn tambin pueden
aparecer en monocitos o en acumulacin de plaquetas1-3,51,52. Para afinar an ms, la
determinacin del porcentaje de neutrfilos NBT-positivos puede hacerse
simultneamente con un recuento total de leucocitos y el diferencial para permitir el
clculo del nmero absoluto de clulas positivas. Feigin y cols.17 utilizaron el porcentaje
de NBT-positivo y el nmero absoluto de neutrfilos NBT-positivos, para desarrollar un
nomograma para una clasificacin provisional de los pacientes. Sin embargo, no puede
recomendarse el uso del nomograma que ellos publicaron, a menos que la precisin de
la aplicacin que ellos realizaron pueda demostrarse tambin en el laboratorio donde se
realiza la prueba.

Una extensin gruesa proporciona un mayor nmero de neutrfilos, especialmente


importante cuando los nmeros absoluto y relativo de neutrfilos son bajos, permitiendo
as una numeracin ms rpida.
Cada laboratorio debe establecer su propio tiempo de tincin ptimo.
Se recomienda que cada laboratorio establezca un margen normal. La sangre de
individuos normales debe someterse a ambos procedimientos descritos como controles
con cada serie de pruebas realizada. Si el sistema de reactivos funciona
satisfactoriamente, el nmero de clulas con contenido de formazn aumentar por encima
de lo normal tras la estimulacin de control con el extracto bacteriano.
La respuesta cuantitativa de personas clnicamente sanas, obtenida con la prueba
NBT estimulada, vara considerablemente2,3 lo que dificulta la interpretacin. Sin embargo,
los valores de la prueba de NBT generalmente aumentarn de un 10 a un 50 % de clulas
positivas debido a la presencia de varios estimulantes2,3,9,24. Por ejemplo, una muestra no
estimulada que haya producido un 10 % de clulas positivas, despus de la estimulacin
puede esperarse que produzca de un 20 a un 60 % de clulas positivas. El uso de
estimulante, nmero de catlogo 840-15, como se ha descrito, debera producir un alto
grado de respuesta en la sangre de individuos sanos.
Se han presentado informes de valores elevados cuando la sangre total es sustituida,
en la mezcla de reaccin, por lquido cefalorraqudeo procedente de casos con meningitis
bacteriana44, o por lquido sinovial procedente de casos con artritis pirognica53. El uso de
fluidos corporales que no sean la sangre total no ha sido completamente evaluado, por lo
que, de momento, no se pueden ofrecer juicios relativos a su uso con los reactivos
suministrados.
Los datos obtenidos mediante este procedimiento slo sirven como ayuda en el
diagnstico y deben ser revisados junto con otras pruebas clnicas o informacin de
diagnstico.

VALORES ESPERADOS
Rango especfico17
217 %
Clulas positivas
Media
9%
Clulas positivas
La mayora de investigadores1-3,14,18,20-22,40-48,53-55 informan que los valores medios de
neutrfilos (con contenido de formazn) para personas clnicamente sanas son del 10% o
menos positivos, aunque algunas muestras pueden producir valores hasta un 17 %17. La
mayora de observadores estn de acuerdo1,2,17-21,40-42 en que el porcentaje de neutrfilos
positivos generalmente aumenta en presencia de infeccin bacteriana, siempre que los
leucocitos sean metablicamente normales. Paterson y Matula2 hallaron que todos los
pacientes con bacteremia presentaban valores elevados en la prueba de NBT.
Los valores normales o bajos en ausencia de infeccin bacteriana se informan en:
Enfermedades vricas1,2,7,17
Artritis reumatoide1,5,53
Embolia pulmonar13
Pacientes con transplantes de tejido2,7
Cncer2,18
Mujeres en postparto7,47
Pacientes en postoperatorio7
Otras condiciones febriles (o que muestren leucocitosis) que no sean de origen
bacteriano1,2,7,15,18

PROCEDIMIENTO:
No estimulado:
Puede realizarse una prueba NBT estimulada (tratamiento de la sangre con extracto
bacteriano) como control positivo, al mismo tiempo que esta prueba de NBT no estimulada
(o bien despus de la misma), para detectar defectos metablicos de la funcin neutrfila.
Tambin se proporciona una descripcin de la prueba NBT estimulada.
Incubacin de la muestra y preparacin de extensiones:
1. Con una pipeta de plstico, transferir a un vial 0,12 ml de solucin de NBT, nmero de
catlogo 840-50.
2. Aadir 0,2 ml de sangre heparinizada bien mezclada. Mezclar bien, pero con cuidado,
inclinando ligeramente el vial y hacindolo rodar entra las dos manos. No invertir el vial.
Cerrar bien.
3. Incubar durante 10 minutos a 37 C. Extraer el vial y dejarlo estabilizar a temperatura
ambiente (1826 C) durante 10 minutos ms.
4. Mezclar de nuevo la mezcla sangre heparinizada-NBT haciendo rodar el vial despacio
entre las dos manos.
5. Con una pipeta de plstico, transferir 5075 l de mezcla a un portaobjetos de vidrio
limpio.
NOTA: Debe tenerse cuidado de minimizar el dao mecnico a los leucocitos durante
la preparacin de la extensin.
6. Preparar una extensin moderadamente gruesa para reducir el dao mecnico a las
clulas con contenido de formazn, que se vuelven ms frgiles6,34. Dejar secar la
extensin al aire.
7. Tratar la extensin con tincin de Wright ACCUSTAIN, nmero de catlogo WS 10, de
la siguiente manera:
a. Cubrir la extensin seca con 1 ml de tinte durante 15 segundos.
b. Aadir 1 ml de agua destilada a la extensin cubierta de tinte, y dejar reposar
durante 30 segundos (un tiempo ms prolongado aumentar la intensidad de la
tincin).
c. Aclarar la extensin con agua, dejarla escurrir y secarla con un secante o al aire.

Los valores normales o bajos en presencia de infeccin bacteriana se informan en:


Infecciones localizadas7,13,53,56 (los estudios in vitro indican que la respuesta a los
neutrfilos requiere que el estmulo sea de la fuerza adecuada2)
Administracin de corticosteroides, fenilbutazona y agentes inmunosupresivos43,47,49,54
Terapia antibitica, cuando la efectividad puede estar indicada mediante una
reduccin del porcentaje positivo, a veces en menos de 6 horas18
Tuberculosis primaria7,13
Defectos metablicos de la funcin neutrfila, tales como:
Granulopata crnica4,7,8,11,42,49
Deficiencias neutroflicas de la mieloperoxidasa57 o glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa50
Agammaglobulinemia congnita y adquirida7
Lupus eritematoso sistmico1,2,5,18
Estados de enfermedad caracterizados por complejos inmunes15
Histiocitosis lipocroma7
Leucemia mieloide crnica43,44
Kwashiorkor39
Diabetes58
Infecciones aplastantes22,27,54,57
Los valores elevados se informan en:
Infecciones bacterianas1-3,7,13,17-21,33,40-42,53,55,57,58
Infecciones por nocardia u otras enfermedades fngicas sistmicas1,2,57
Diversas infecciones parasitarias, incluida la malaria2,40,41,48
Tuberculosis miliar7,13
Meningitis tuberculosa7,13

Estimulado:
Este procedimiento puede realizarse simultneamente con la prueba de NBT no
estimulada (o bien despus de la misma), como una posible ayuda en la deteccin de
defectos metablicos de la funcin neutrfila (consultar la seccin Aplicacin).

Los valores elevados en ausencia de infeccin bacteriana se informan en:


Lactantes normales de menos de 2 meses (tambin recin nacidos y
prematuros)7,35,42,55,59
Embarazo46
Sndrome de Chekiak-Higashi60
Mielofibrosis idioptica15,43
Osteognesis imperfecta21
Hemofilia21
Enfermedad de Hodgkin u otros linfomas47,61
Sndrome de Behcet62
Enfermedades inflamatorias de los intestinos14
Inmunizacin tifoidea/paratifoidea (en unas horas)13,33,60
Terapia de estreptocinasa22
Meningitis vrica54
Hepatitis vrica63
Postdilisis20
Pacientes que toman contraceptivos orales64 (algunos informes indican que los
contraceptivos orales no causan ningn efecto)45,46
Infarto de miocardio65

Incubacin de la muestra y preparacin de extensiones:


1. Transferir a un vial 0,1 ml de solucin de NBT, nmero de catlogo 840-50.
2. Con una pipeta de plstico, aadir 0,05 ml de sangre heparinizada y 5 l de solucin de
estimulante. Mezclar bien, pero con cuidado, inclinando ligeramente el vial y hacindolo
rodar entre las dos manos. Cerrar bien.
3. Seguir con los pasos 3 a 7, como en Procedimiento (no estimulado) y continuar con la
seccin Examen con el microscopio y recuento.

CARACTERSTICAS DE FUNCIONAMIENTO
Los valores de la prueba se informan en trminos de neutrfilos positivos (con
formazn).
Examen con el microscopio y recuento:
Explorar la extensin teida utilizando un objetivo de inmersin de aceite y contar un
total de 100 neutrfilos o ms. Registrar como positivos estos neutrfilos que contienen
depsitos de formazn. Ocasionalmente, dichos neutrfilos pueden tener un aspecto
granular difuso, pero habitualmente aparecern como inclusiones intracitoplasmticas
grandes, de forma irregular y de un color prpura oscuro a negro. Al contar los neutrfilos
como positivos, se recomienda seguir las estipulaciones establecidas por Feign34, que son
las siguientes:
1. Los neutrfilos deben estar enteros y la membrana celular debe estar intacta.
2. El neutrfilo debe estar solo, sin que ninguna otra clula ni material celular (excepto los
hemates) est en contacto con l. Los neutrfilos que se encuentren en acumulaciones
de leucocitos o plaquetas no deben contarse.

El mismo tcnico realiz estudios de reproducibilidad con sangre de 25 pacientes,


empleando el mtodo descrito. Los resultados duplicados, expresados como porcentaje de
clulas NBT positivas, oscilaron entre el 2 y el 90 %. El uso del mtodo estadstico del
mnimo cuadrado produjo un coeficiente de correlacin de 0,9834 entre duplicados.
Si los resultados observados varan de los esperados, pngase en contacto con el
Servicio Tcnico de Sigma-Aldrich.

2-ES

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