HPLC Prctico en la Industria

Farmaceutica

Requisitos a cumplir para mtodos

cromatogrficos: Test de Adecuacin
System Suitability (Test de adecuacin)
Son una parte vital de los mtodos cromatograficos por GC y
HPLC
Se utilizan para verificar que el sistema cromatografico es
adecuado para el uso pretendido
El Concepto: Equipmento, electronica, las operaciones
analiticas y las muestras constituyen un sistema que pueden
ser evaluado como un todo

Test
de adecuacion
:
Test de adecuacion Principios generales

Injecciones de preparaciones apropiadas son requeridas para

demostrar que el sistema es adecuado a lo largo de toda la corrida
Cuando haya un cambio sustancial en el equipamiento o en algun
reactivo critico se debe realizar el test de adecuacin antes de
inyectar las muestras
No se pueden analizar las muestras hasta alcanzar los
requerimientos del test de adecuacin.
La especificacion de parametros cromatogrficos en un mtodo no
limita el uso de otras condiciones cromatogrficas dentro de ciertas
restricciones para alcanzar las especificaciones del test de
adecuacin

Test de adecuacin como se evala?

Repetibilidad
k : Factor de Capacidad
R: Resolucin
Factor de Tailing
N: Numero de platos tericos

Repetibilidad
USP

Los datos de cinco replicados son utilizados para el

calculo de
La desviacin standard relativa, si el requerimiento es
menor al 2%
Si el requerimiento es mayor al 2% se calcula el RSD
de seis replicados.

Factor de capacidad

Resolucin

Factor de tailing

Tiempo de retencin relativo

Factores que indican la bondad

cromatogrfica
O como alcanzar los requerimientos del
test de adecuacin del sistema

Repetibilidad

Etapas de Anlisis

Procesamiento de Muestra
Diluciones
volumtricas imprecisas
Limpieza de Muestra

columna
Inyeccin de Muestra

muestreador automtico
Separacin por LC

Deteccin

flujo
Procesamiento de
Standard Datos y Calibracin
de calibracin

Imprecisin Usual
0.5 %

Comentarios
Depende del Operador;

3 5 % Depende del Operador; Mejora la

robtica o cambio de
<1%

Llena completamente el loop;

Chequea el

0 2 % Mejores reas de pico; Utilizar Rs

1.5
<1%
Buena seal al ruido (mejora);
Limpia la celda de
05%

Altura de pico vs. rea;

interno; Frecuencia

13

Precisin

Trmino
Media (o Promedio), C

Ecuacin correspondiente
C=

(suma de todos los valores de Ci )

n

Desviacin Standard, SD

(
suma de todos los valores [C - C] )
=
SD

2 1/ 2

Coeficiente de Vairacin, CV
Rango de Valores de Ci

(n - 1)

CV = 100 SD/C (%)

El mayor Ci menos el menor Ci

12

Forma de Picos

Picos divididos
Picos con tailing
Picos anchos
Eficiencia pobre

Muchas de las formas de los picos son combinaciones

Ej: Ancho y con tailing o con tailing y tiempo de retencin creciente

13

Picos Divididos

Pueden ser causados por:

Contaminacin de la columna
Frit parcialmente tapado
Columna con volumen vaco
Efectos de la inyeccin de solventes

14

Picos Divididos
Contaminacin de la Columna

15

Picos Divididos
Efectos de la Inyeccin de Solventes

16

Determinando la Causa de los Picos Divididos

1. Matriz de muestra compleja o muchas muestras analizadas

probablemente contaminacin de la columna o frit
parcialmente tapado
2. Fase mvil pH 7 probablemente el volumen vaco en la
columna se deba a disolucin de slica (utilizar columnas
especiales)
3. Solvente de inyeccin ms fuerte que la fase mvil
probablemente picos partidos y anchos, dependiendo del
volumen de la muestra

17

Picos con Tailing, Ensanchados o con Prdida

de Eficiencia
Pueden ser causados por:

Interacciones secundarias de la columna

Volumen vaco en la columna
Contaminacin de la columna
Envejecimiento de columna
Columna sobrecargada
Efectos extra-columnares

18

Picos con Tailing

Interacciones Secundarias de la Columna

Picos con tailing eliminados con fase mvil (TEA) modificada a pH 7

19

Picos con Tailing

Interacciones Secundarias de la Columna

La reduccin del pH de la fase mvil reduce las interacciones con los

silanoles que causan los picos con tailing

20

Picos con Tailing

Contaminacin de la Columna

21

Picos con Tailing / Ensanchamiento

Efectos de Carga de la Muestra

22

Picos Ensanchados, Divididos

Columna con Volumen Vaco

Los cambios mltiples en la forma de pico pueden ser causados por el mismo
problema de la columna. En este caso el volumen vaco en la columna resulta por la
disolucin de la slica en pH altos

23

Picos Anchos
Picos Fantasmas Desconocidos

Platos tericos extremadamente bajos son una indicacin de un pico eluyendo muy
tarde de la corrida precedente.

24

Picos con Tailing

Falla en el Sello del Inyector

El retraso en el mantenimiento del instrumento puede causar problemas en la forma

de los picos.

25

Picos con Tailing

Volumen Extra-Columnar

26

Determinando la Causa de los Picos con Tailing

Evaluar los efectos de la fase mvil Alterar el pH de la fase
mvil y aditivos para eliminar las interacciones secundarias
Evaluar la eleccin de la columna Utilizar las columnas con
slica de alta pureza o distinta tecnologa de unin
Reducir la carga de la muestra
Eliminar los efectos extra-columnares
Limpiar la columna y chequear su degradacin/envejecimiento

27

Retencin

Cambios en el tiempo de retencin (tr)

Cambios en el factor de capacidad (retencin)
(k)
Cambios en la selectividad ()

28

Cambios en la Retencin
Misma Columna, Ms Tiempo
Pueden ser causados por:

Columna degradada
Contaminacin de la columna
Equilibrio insuficiente
Inadecuada combinacin columna/fase mvil
Cambios en la fase mvil
Cambios en el flujo
Otras caractersticas del instrumento

29

Cambio de la Fase Mvil

Causas de los Cambios en la Retencin

Evaporacin/desgasificacin del TFA de la fase mvil

Reemplazndolo se resuelve el problema

30

Degradacin de la Columna/Causas de
Equilibrio
Retencin/Cambios de Selectividad

El analito (I) es sensible al envejecimiento de la fase mvil

La forma de los picos fue una caracterstica secundaria resuelta por la limpieza de la
columna
La retencin y forma de pico fueron como se esperaba, despus de la limpieza

31

Determinando la Causa de los Cambios de

Retencin en la misma Columna
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Determinar k, , y tr para picos sospechosos

Lavar la columna
Testear la nueva columna anotar el nmero de lote
Revisar los procedimientos de equilibrio de la columna
.Preparar fase mvil fresca y testear
Chequear el funcionamiento del instrumento

32

Cambios en la Retencin/Selectividad
Columna-a-Columna

Diferentes historias de columnas (envejecimiento)

Equilibrio insuficiente/inconsistente
Inadecuada combinacin columna/fase mvil
Cambio en la fase mvil
Cambio en la velocidad del flujo
Otras caractersticas del instrumento
Pequeos cambios en volumen muerto de la columna (tr
solamente)

33

Ejemplo de Cambio en la
Retencin/Selectividad
Columna-a-Columna
Variacin de la Fase Mvil

He experimentado con nuestra fase mvil, abriendo nuevas botellas de todos los componentes de
la fase. Cuando uso todos los ingredientes frescos, el problema deja de existir, y limito el
problema a una mala botella de TEA o de cido fosfrico. Nuestro problema ha sido
solucionado.

34

Minimizar los Cambios en la

Retencin/Selectividad Lote-a-lote
Evaluar:
Todas las causas del cambio columna-a-columna*
Robustez del mtodo (buffers/fuerza inica)
Sensibilidad al pH (muestra/interaccin de columnas)
* Todas las causas del cambio columna-a-columna deberan ser consideradas
primero, especialmente cuando ha sido testeada una sola columna de un lote.

35

Cambio en la Selectividad Lote-a-lote - pH

El pH 4.5 muestra un cambio en la selectividad lote-a-lote por componentes bsicos

El pH 3.0 no muestra cambios en la selectividad lote-a-lote, indicando sensitividad del
silanol a pH 4.5

36

Condiciones Experimentales para Clasificacin

Cambios en la Selectividad de la Columna

Cambios en > 10% sugieren cambios en la fase unida a la slica

37

Evaluar los Cambios de Retencin

Lote-a-lote
Eliminar las causas del cambio de la selectividad columna-acolumna
Re-evaluar la robustez del mtodo modificar mtodo
Determinar sensibilidad al pH modificar mtodo
Clasificar los cambios en la selectividad
Contactar al fabricante por asistencia

38

Conclusiones

Los problemas de columna en HPLC se muestran como:

Alta presin
Formas de picos indeseables
Cambios en la retencin/selectividad
Generalmente estos problemas no estn asociados con la
columna y pueden ser causados por instrumentos y
condiciones experimentales.

39

Mtodos de anlisis por HPLC de activos

farmacuticos

Qu tienen en comun????

40

Drogas Antianginales
Uso de dos Detectores

41

Antiarritmicos

42

Antibiticos Penicilnicos

43

Tetraciclinas

44

Antibacterianos: Deteccin a Longitudes de

Onda Mltiples

45

Antihipertensivos: Dependencia de la
Temperatura en la Forma del Pico

46

Sedantes

47

Sulfamidas: Dependencia de la Separacin con

la Temperatura

48

Vitaminas Liposolubles

49

Vitaminas Hidrosolubles

50

Desarrollo de Mtodos para

Molculas Pequeas Ionizables por
Fase Reversa

51

Estrategia de Desarrollo de Mtodos

para Compuestos Ionizables
Compuestos bsicos con poca sensibilidad al pH

Mezcla de Compuestos bsicos y cidos

Separacin Inicial

PEB:

[1]

a. Columna C18 o C8 (A)

Compuestos bsicos poco retenidos

b. Buffer fosfato 20-50mM ph 3
[1b]
c. Ajustar %ACN para k= 0.5-20 ; 1.0 mL/min
Compuestos Bsicos
a. Usar modificador orgnico
PEB
[2]
metanol, ph 3 buffer fosfato
Variar la temperatura de la columna
b. Agregrar 25-50 mM cido
PEB
hexanosulfnico
PEB
[3]
c. Ajustar hasta k = 0.5-20 con
PEB
%MeOH, 1.0 mL/min
Cambiar a MeOH o THF, k= 0.5-20
PEB

Problemas de espaciamiento
de bandas

Picos con
[1a]
tailing
Agregar 20 mM TEA o Acetato de TEA

[2a]
PEB

Modificar %ACN en 5% v/v

[3a]
Variar la temperatura de la columna

[4]
A.
B.
C.

Cambiar funcionalidad de la fase unida a CN o fenilo (B)

Repetir [1c], [2], [2a], [3], [3a]
PEB

PEB
a. Columnas C18 o C8 Slica SolGel endcapped (C)

[5b]
Compuestos cidos

a. Usar modificador orgnico metanol,

ph 3 buffer fosfato

b. Agregrar 25-50 mM fosfato

tetrabutilamonio
c. Ajustar hasta k = 0.5-20 con
%MeOH, 1.0 mL/min
PEB

[5]

b. Optimizar pH 4-8, buffer orgnico 20-50 mM + 20 mM TEA

c. Fijar a 40 C, constante
PEB

[6]
a. Columnas C18 o C8 Slica SolGel endcapped (D)
b. pH 9-10, 10-50 mM glicina o buffer borato
c. Fijar a 40 C, constante
d. Ajustar % ACN para k= 0.5-20

PEB

Zorbax SB-C18 o SB-C8

Zorbax SB-CN o SB-Fenil
Zorbax XDB-C18 o XDB-C8
D.
Zorbax XDB-C18
[5a]
Repetir [2], [2a], [3], [4]

PEB

PEB

Problemas de espaciamiento de bandas? Pruebe otro mtodo de HPLC

[6a]
Repetir [2], [3]

52

Comenzar el Desarrollo a Bajo pH

Tanto los grupos silanoles de la slica como los solutos (bsicos y cidos ) estn
protonados
Generalmente se producen bandas ms angostas, mejor forma de pico y
reproducibilidad en la separacin .Raramente se requieren modificadores (ej TEA)
para obtener buenas formas de pico
Las fases estacionarias convencionales de cadena corta son inestables

Slica Tipo A

Slica Tipo B (mas purificada)

Los compuestos bsicos pueden dar

tailing a causa de los silanoles residuales
cargados negativamente en la superficie
acdica (bajo pKa de los silanoles)

Los compuestos bsicos no dan tailing

debido a que el pKa de los silanoles es
ms alto

53

Condiciones Experimentales Iniciales

para la Separacin
Variable de Separacin
Columna
Dimensiones
Tamao de Partcula
Fase Unida
Fase Mvil
Solventes A y B
%B
Buffer
Aditivos

Eleccin Inicial
15 (o 25) x 0.46 cm
5 o 3.5 m
C18 o C8
Buffer Acuoso / CAN
Variable (k=0.5 20)
25 mM Fosfato de Potasio, ph 3
25 50 mM TEA o TEA / Acetato, si es necesario

Flujo
1-2 mL / min

Temperatura
40 C
Tamao de Muestra
Volumen
Masa

50 L
< 25 g

54

Cul es el Mejor Solvente Orgnico para

Fase Reversa?

Miscible con el agua

Baja viscosidad
Baja deteccin en UV
Buena solubilizacin
Qumicamente inerte

... acetonitrilo es la mejor eleccin

55

Efecto de la Fuerza del Solvente en el

Espaciamiento de Banda
1-5

100% Acetonitrilo

2-5

2 3

80% Acetonitrilo
4 5

60% Acetonitrilo

2 3

1
1
1

4
5

4
5

40% Acetonitrilo

50% Acetonitrilo

45% Acetonitrilo
7

10

11

12

56

Efecto de Fase Mvil en el

Espaciamiento de Banda Muestra de
7 componentes Zorbax XDB-C8
BP

u = uracilo
P = propranolol
BP = butilparabeno
DPP = dipropilftalato
N = naftaleno
Ac = acenafteno
A = amitriptilina

65% MeOH
7 mM Fosfato

N
P

DPP

Ac

50% ACN
7 mM Fosfato

BP

DPP

N
Ac

A DPP & N
BP
P
Ac

38% THF
7 mM Fosfato

57

Normograma de Fuerza del Solvente para

Fase Reversa

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Acetonitrilo-Agua

40

60

80

100

Metanol-Agua

0 10

20 30 40 50 60 70 80

90 100

TetrahidrofuranoAgua
* Referencia: Snyder, Glajch, Kirkland
"Practical HPLC Method Development," Wiley, NY

58

Efecto de la Temperatura en el Ancho de

Pico
Hidrolizado proteico
4.6 X150 mm Zorbax 80 SB-C18 (3.5 m); 0.75 mL/min; Iny: 45 L (75 g); 210 nm;
Gradiente: 5-60% B en 90 min; A - 0.1% TFA en agua, B - 0.095% TFA en 80% ACN/agua

3.5 m, 35C
P = 170 bar

RS = 1.3

Absorbancia (210 nm)

37

38

39

3.5 m, 85C
P = 88 bar

RS = 1.5
A

000138P1.CDR

34
0

10

15

20

25

30

35

40

35

59

36

Columnas Protegidas
Ej: ZORBAX RP-HPLC
Aumentar la estabilidad y disminuir el sangrado de columna
StableBond, pH 1-6

Eclipse XDB, pH 3-8

1. Usas silanos voluminosos

2. No-encapada

1) dimetilalquilsilanos
2) Doblemente encapadas
A bajos pH la unin siloxano se
hidroliza. Usando grupos
voluminosos, (isopropilos o
isobutilos) se protege la unin
de la hidrlisis
A pH intermedios, la slica
puede sufrir disolucin. Este
proceso se minimiza con el
encapado total de los silanoles
libres.

60

Separacin de Cefalosporinas en Fases

Bonus-RP y Alqulicas

Columna:
Fase Mvil:

4.6 x 150 mm
25 mM Na citrato, pH
DAD1 A, Sig=254,16 Ref=450,80
(F:\1\DATA\TRANQ\TRANQ063.D)
6/MeOH,
75/25
Flujo:
1 mL / min.
Deteccin:
254 nm
Iny.:
3 L
Muestra:
Cefalosporinas
1 cefalexina
3 cefuroxima
2 cefaclor
Silica-based Column Packing with Alkyl/amide Stationary Phase
4 cefoxitina

mAu
120

Bonus-RP

80

3
2

40

0
1

mAu
120

Alkyl C8

DAD1 A, Sig=254,16 Ref=450,80 (F:\1\DATA\TRANQ\TRANQ062.D)

80
40

0
0

min
Si
NH
O

Zorbax Rx-SIL Silica Support Surface

61

Condiciones sugeridas para Compuestos

Bsicos para Columnas con Base Slica

Usas soporte de slice menos cido

Fase mvil pH 3
Concentracin del buffer en fase mvil 10 mM
Modificador de fase mvil, 20 - 50 mM Trietilamina
para columnas de diseo ms antiguo.
Tamao de muestra 1 g/pico

62

Razones para realizar Separaciones a pH

Intermedio

Los Compuestos de inters son inestables a bajos pH

No se obtiene la selectividad deseada a bajo pH
Columnas de fase unida inestables a bajos pH
Compuestos bsicos protonados se retienen muy pobremente a
bajo pH.

63

Problemas Potenciales a pH Intermedio

Grupos Silanoles libres; solutos bsicos parcialmente ionizados

Dificultad para mantener buena forma de pico,y alta eficiencia
Mtodos poco robustos
Realizar un control ms preciso de temperatura y pH
0.1 pH, 1C pueden afectar la separacin
Degradacin de la columna por disolucin del soporte de slica depende
fuertemente de:
- pH
- Tipo y concentracin del buffer
- Temperatura
- Tipo de soporte de Slica

64

Comparacin de Slicas

Rx-SIL
(Tipo Sol )

ESTRUCTURA:

Xerogel
(Tipo sil)

SUB PARTICULAS UNIFORMES

ENTORNO POLIMERICOTIPO ESPONJA

POROSIDAD (%):

50

70

TAMAO DE PARTICULA/
AREA SUP(M2/G)

80A/180

100A/300

FUERZA:

ALTA

MODERADA

RESISTENCIA A ALTO pH:

BUENA

POBRE

PUREZA:

ALTA

BAJA- ALTA

DISTRIBUCION DE TAMAO
DE PORO Y PARTCULA

ANGOSTA

ANCHA

65

Retencin de un Compuesto Bsico en

Funcin de pH y pKa
C

Tiempo de retencin

B
pKa 1.5

A
Compuesto
bsico dbil

pKa
pH 2

Carga del analito:

Carga de la superficie
de slica:

4
+

neutral

7
+/neutral

-/neutral

neutral
-

66

Buffers

Buffer

Fosfato
pK1
pK3

Citrato
pk1

pKa

Rango Buffer

2.1
pK2
12.3

1.1 - 3.1
7.2
11.3 - 13.3

3.1

2.1 - 4.1
pK2
pK3

Buffer

pKa Rango Buffer

Formiato
3.8
Acetato
4.8
6.2 - 8.2
Tris(hidroximetil)
aminometano
8.3
Amonaco
9.2
Borato
9.2
Pirrolidina
10.5
4.7
3.7 - 5.7
5.4
4.4 - 6.4

Otros aditivos comunes de la fase mvil

cido Actico
cido Fosfrico
cido Sulfrico
cido Triflouroactico (TFA)

2.8 - 4.8
3.8 - 5.8
7.3 8.2 8.2 9.5 -

67

9.3
10.2
10.2
11.5

Las Fases Mviles son Importantes

para Controlar la Retencin de
Compuestos
Ionizables
Buffers
Son una forma efectiva de variar y controlar el pH
Mejoran la retencin, el ancho de pico y la simetra (especialmente a pH <3)
Minimiza las diferencias columna columna
Elimina las diferencias probables en el pH del agua
Permite un uso eficiente del pH como una variable de separacin durante el
desarrollo de mtodos

El pH debe ser preciso y reproducible

68

Consideraciones para la Seleccin del Buffer

Inorgnicos vs. Orgnicos- la eleccin puede afectar la resolucin y la vida de la

columna
pH del buffer
Seleccionar en base al pH deseado y la optima capacidad del buffer
Medir el pH del buffer antes de mezclarlo con el modificador orgnico
Comparar la resolucin al pH deseado y + 0.1- 0.2 unidades
Concentracin del buffer: Comenzar con 20-25 mM
Preparar el buffer con procedimientos adecuados evitar el reajuste
Comparar la resolucin del buffer a la concentracin deseada
+ 5-10 mM

69

Secuencia Aconsejada para Desarrollar un

Mtodo de Fase Reversa
Para un pH 4-8: Buffer de pH intermedio.
La Retencin no debera depender del pH
Elegir cuidadosamente el Buffer (dependiendo de la long de
onda, formacin de complejos, etc.)
Se puede usar un modificador bsico de la fase mvil
Convenientemente columnas encapadas
Siempre recuerde HACER UN CAMBIO POR VEZ!!!

70

El CATA, de Analytical Technologies, es un espacio dedicado a:

Consultora en el desarrollo de nuevas aplicaciones analticas y
entrenamiento operacional para asistir a los clientes en el campo de la
seguridad alimentaria y ambiental,
a la industria farmacutica , a la
industria petroqumica y a laboratorios terceristas.
Programas de capacitacin continua para empresas e instituciones
que emplean instrumental analtico
Cursos regulares de operacin de instrumentos , manejo de software y
mantenimiento de equipos.
Cursos y programas de capacitacin a medida para empresas e
instituciones
Seminarios de actualizacin tcnica
Si desea mayor informacin sobre los servicios o los programas de capacitacin :

www.analytical.com.ar/CATA
capacitacion@analytical.com
011-4509-9000

Alternativa: Desarrollar Mtodos a pH > 10

Las compuestos bsicos como sus bases libres

Grupos Silanol totalmente ionizados
Se eliminan las interacciones inicas con el soporte
Se pueden usar soportes de zirconio, almina, polmeros porosos de carbn
Limitaciones:
Eficiencia de columna
Reproducibilidad de la Separacin
Forma de pico
Restricciones de fase mvil

72