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DE BIOLOGA M0LECULAR
APLICADAS EN ANATOMA PATOLGICA
NDICE
UNIDAD DIDCTICA I
PRESENTACIN Y METODOLOGA DEL CURSO
10
12
UNIDAD DIDCTICA II
INTRODUCCIN A LAS TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR
APLICADA EN ANATOMA PATOLGICA
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2.1 Introduccin
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2.11 Conclusiones
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3.1 Introduccin
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29
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UNIDAD DIDCTICA IV
TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR
EN FASE LQUIDA Y CON MEMBRANA
4.1 Introduccin
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37
37
39
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39
39
40
40
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UNIDAD DIDCTICA V
TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR IN SITU
5.1 Hibridacin in situ
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5.7 Conclusin
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UNIDAD DIDCTICA VI
ANLISIS POR REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
6.1 Introduccin
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7.4 Citogentica
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UNIDAD DIDCTICA IX
SECUENCIACIN AUTOMTICA DEL ADN
9.1 Secuenciadores automticos en geles / equipamiento
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9.8 Equipamiento
101
9.9 Glosario:
104
UNIDAD DIDCTICA X
NIVELES DE SEGURIDAD Y PELIGROSIDAD EN EL LABORATORIO
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CUESTIONARIO
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Cuestionario
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UNIDAD DIDCTICA I
PRESENTACIN Y METODOLOGA DEL CURSO
Presentacin
1. Sistema de Cursos a Distancia
En este apartado aprender una serie de aspectos generales sobre las tcnicas de
formacin que se van a seguir para el estudio.
2. Orientaciones para el estudio.
Si usted no conoce la tcnica empleada en los Cursos a Distancia, le
recomendamos que lea atentamente los epgrafes siguientes, los cuales le ayudarn a
realizar el Curso en las mejores condiciones. En caso contrario, slo tiene que seguir los
pasos que se indican en el siguiente ndice:
Se dan una serie de recomendaciones generales para el estudio y las fases del
proceso de aprendizaje propuesto por el equipo docente.
3. Estructura del Curso
Mostramos cmo es el Curso, las Unidades Temticas de las que se compone, el
sistema de evaluacin y cmo enfrentarse al tipo test.
Acadmicos. Sern aquellos que resuelvan las dudas del contenido del Curso,
planteamientos sobre cuestiones test y casos clnicos. El tutor resuelve las
dudas que se plantean por correo electrnico.
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Elegir el horario ms favorable para cada alumno. Una sesin debe durar
mnimo una hora y mximo tres. Menos de una hora es poco, debido al tiempo
que se necesita de preparacin, mientras que ms de tres horas, incluidos los
descansos, puede resultar demasiado y descendera el rendimiento.
Marcar los conceptos sobre los que se tengan dudas tras leerlos
detenidamente. No insistir de momento ms sobre ellos.
b) Fase reflexiva.
c) Fase creativa.
En esta fase se aplican los conocimientos adquiridos a la resolucin de pruebas de
autoevaluacin y a los casos concretos de su vivencia profesional.
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Los temas comienzan con un ndice con las materias contenidas en ellos. Contina
con el texto propiamente dicho, donde se desarrollan las cuestiones del programa. En la
redaccin del mismo se evita todo aquello que no sea de utilidad prctica.
El apartado de preguntas test sern con los que se trabajen, y con los que
posteriormente se rellenar el FORMULARIO de respuestas a remitir. Los ejercicios de tipo
test se adjuntan al final del temario.
Cuando estn presentes los ejercicios de autoevaluacin, la realizacin de stos
resulta muy til para el alumno, ya que:
Dentro de las unidades hay distintos epgrafes, que son conjuntos homogneos de
conceptos que guardan relacin entre s. El tamao y nmero de epgrafes depender de
cada caso.
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1.3.5 Fechas
El plazo de entrega de las evaluaciones ser de un mes y medio a partir de la
recepcin del material del curso, una vez pasado este plazo conllevar una serie de
gestiones administrativas que el alumno tendr que abonar.
La entrega de los certificados del Curso estar en relacin con la fecha de entrega
de las evaluaciones y NUNCA antes de la fecha de finalizacin del Curso.
Ser capaces de aprender sobre la marcha nuevos conceptos que pueden ser
planteados en estas preguntas, conceptos que se retienen con facilidad.
1.3.7 Envo
Una vez estudiado el material docente, se contestar la encuesta de satisfaccin, la
cual nos ayudar para evaluar el Curso, corregir y mejorar posibles errores. Cuando haya
cumplimentado la evaluacin, enve las respuestas a la direccin indicada.
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UNIDAD DIDCTICA II
INTRODUCCIN A LAS TCNICAS DE BIOLOGA
MOLECULAR APLICADA EN ANATOMA PATOLGICA
2.1 Introduccin
El paradigma gentico del cncer que los tumores surgen como consecuencia
de la acumulacin de mutaciones genticas en una misma estirpe celular- est ya
ampliamente aceptado. El anlisis funcional de los productos de los diversos genes
tumorales indica que stos juegan papeles fundamentales en procesos de transduccin de
seales implicadas en control de la proliferacin, diferenciacin, o muerte celular. Estos
estudios han esclarecido tambin cmo la progresin normal del ciclo celular es el
resultado de una interaccin cuidadosamente balanceada entre mltiples reguladores
codificados por protooncogenes y genes supresores de diversos tipos. No es
sorprendente, por tanto, que cualquier alteracin funcional a nivel de uno de estos
mltiples reguladores produzca un ciclo celular alterado que eventualmente desemboca
en una progresin neoplsica. Esta simplificacin conceptual, derivada del anlisis de
tumores a nivel molecular, ha dado lugar a la definicin del cncer como una "enfermedad
gentica del ciclo celular".
Los espectaculares avances registrados durante los ltimos aos en el estudio de
los mecanismos moleculares del cncer han supuesto un gran impulso en la comprensin
de los procesos de proliferacin celular, tanto normal como tumoral, as como la
identificacin de los diferentes componentes que constituyen los eslabones de los mismos
y la interrelacin de sus respectivas actividades.
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2.1.2 Espacios
El laboratorio de biologa molecular requiere de tres espacios separados, una zona
de pretratamiento para realizar la manipulacin de las muestras y la extraccin de cidos
nucleicos, espacio que puede estar compartido en el laboratorio general. Una segunda
zona limpia y separada del resto del laboratorio en donde prepararemos y realizaremos la
amplificacin y las tcnicas de PCR. Y como tercera la zona oscura para realizar la
electroforesis y la lectura de geles.
2.1.3 Instrumentacin
La instrumentacin bsica puede ser compartida con otras tcnicas; como material
dispondremos al menos de:
Frigorfico y congelador
Bao termosttico
Centrifuga y Microcentrifuga
Termociclador
Aparato de electroforesis
2.1.4 Personal
Profesionales Tcnicos Superiores en Anatoma Patolgica y Citologa. En relacin
al personal adecuado y necesario para la realizacin, interpretacin y puesta al da de las
tcnicas de biologa molecular, debemos considerar una experiencia mnima en dichas
tcnicas. Se precisa capacidad de interpretacin de los resultados y amplia resolucin de
problemas.
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Tipodeprueba
Organismo
Bacterias
StreptococcigrupoA
Legionellapneumophila
Chlamydiatrachomatis
Deteccindirectadelamuestra
Neisseriagonorrheae
Tricomonasvaginalis
Virus
Papilomahumano
Bacteria
Enterococci
StreptococcigrupoB
Haemophilusinfluenzae
Listeriamonocytogenes
Neisseriagonorrhoeae
Mycobacteriumtuberculosis
Mycobacteriumavium
Confirmacindecultivo
Otrasespeciesdemycobacteria
Hongos
Cryptococcusneoformans
Histoplasmacapsulatum
Blastomycesdermatidis
Coccidioidesimmitis
Virus
Papilomahumano
Tabla 1 ejemplos de organismos que pueden ser detectados por medio de sondas de
cidos nucleicos disponibles comercialmente.
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2.9.1 Interpretacin
Debido a la alta sensibilidad de estos exmenes, la interpretacin es en algunos
casos difcil, ya que el organismo puede no estar viable pero su ADN puede todava ser
amplificado. Adems, la presencia de un organismo en una determinada muestra no
siempre significa infeccin.
Es por ello que para el caso de infecciones virales (VIH y CMV) se recomienda
realizar la determinacin de la carga viral, la cual determina la cantidad de secuencias
blanco presentes en el plasma de un individuo
Por estas razones, los laboratorios que usan tcnicas de amplificacin deben tener
normas estrictas de control de calidad. El Comit Nacional de Normas de Laboratorio
Clnico de USA tiene un documento de regulacin provisorio que es bastante especifico.
En nuestro pas no existen regulaciones formales, pero los laboratorios debieran
tratar de cumplir el mnimo de requerimientos, como es tener un espacio separado para el
procesamiento de la muestra y otro para la amplificacin y tener adems el personal
adecuado para realizar estas tcnicas.
2.11 Conclusiones
A pesar del innegable poder de las tcnicas de biologa molecular en el
diagnstico, es errneo pensar que van a reemplazar a los exmenes convencionales para
deteccin de agentes patgenos. Sin embargo, la capacidad de estas tcnicas para
proporcionar un diagnstico definitivo en corto tiempo tendr sin duda, un efecto en el
manejo del paciente y nos ayudarn a entender mejor la patognesis de la infeccin.
Aunque existe la posibilidad de usarlas en todos los microorganismos, las tcnicas
de diagnstico molecular tendrn un mayor impacto en algunos patgenos. Es as que
exmenes rpidos para la identificacin de Micobacterias y la deteccin de resistencia a
las drogas de primera lnea, dar la base para que se tomen ms oportunamente las
decisiones clnicas adecuadas. Tambin, la identificacin rpida de virus Herpes simplex en
el LCR de un paciente con encefalitis dar la oportunidad de comenzar oportunamente la
terapia adecuada, eliminando otros procedimientos ms invasivos.
A medida que se automaticen, con un costo menor y con regulaciones ms
precisas, los laboratorios podrn incorporar estos exmenes en el funcionamiento de
rutina y los facultativos podrn familiarizarse an ms con la interpretacin y con las
ventajas que proporcionan las tcnicas de biologa molecular en el diagnstico.
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3.1 Introduccin
Este conjunto de tcnicas, que han sido tomadas tanto de la gentica molecular
como de la bioqumica, nos permite analizar fenmenos biolgicos y patolgicos en el
nivel molecular. Al igual que la microscopa electrnica y la inmunohistoqumica, estas
tcnicas pueden aplicarse para refinar el diagnstico en Anatoma Patolgica.
Pueden enumerarse las siguientes tcnicas: hibridacin in situ, reaccin en cadena
de polimerasa (PCR), in situ-PCR, anlisis de polimorfismo de fragmentos de restriccin,
Southern blot, Western blot y Northern blot. Todas las tcnicas mencionadas pueden
aplicarse al material obtenido por biopsia, autopsia e incluso muestras citolgicas.
La tcnica de Southern blot permite el anlisis de ADN genmico o fragmentos
definidos de ADN despus de digestin con endonucleasas de restriccin. La tcnica de
Northern blot permite estudiar ARN en forma anloga. El Western blot es una tcnica
inmunolgica derivada , que se utiliza para analizar antgenos proteicos. Las protenas se
separan mediante electroforesis y se transfieren a una membrana slida o membrana o
filtro.
La membrana se incuba con anticuerpos, los que se detectan ulteriormente con
sondas marcadas radioactivamente o con enzimas
Por el contrario, en otros casos el valor diagnstico se alcanza una vez que el
fragmento amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes tcnicas:
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Secuenciacin.
Los fragmentos generados durante la reaccin de
secuenciacin se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (Ej.
Secuenciacin de genes mitocondriales mutados implicados en ciertas
enfermedades...).
Las mejoras tcnicas del cariotipo multicolor avanzan con gran rapidez y ya se est
optimizando el M-FISH con bandas multicolor.
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UNIDAD DIDCTICA IV
TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR
EN FASE LQUIDA Y CON MEMBRANA
4.1 Introduccin
Las tcnicas de biologa molecular que utilizan membranas o las que utilizan
sondas y ADN diana en medio lquido estn poco extendidas en los laboratorios de
Anatoma Patolgica. La razn fundamental es que, a pesar de sus muchas ventajas, no
permiten visualizar la morfologa del espcimen.
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Sondasunilocus
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RT-PCR
Nested PCR
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reapostPCR,amplificaciny
fotodocumentacin
Termociclador
Pipetasautomticas
Pipetasautomticas
Microcentrfuga
Hornodehibridacin
Bloquetrmico
Vortex
Equipodeelectroforesisen
agarosa/acrilamida/secuencia
Hielo
Sistemafotodocumentacinconsoftware
Materialdesechable:
Materialdesechable:
Puntasdepipetaconfiltro
Puntasdepipetaconfiltro
Tuboseppendorf
Tuboseppendorf
Guantes
Guantes
Contaminacinporproductoamplificado
SepararFSICAMENTElaszonasdeprey
postPCR
Utilizarmaterialdelaboratoriodiferenteen
ambaszonas.
Utilizarmtodosdedescontaminacin
Contaminacinporambiente
Notrabajarconplsmidos
recombinantes
LuzUV
HCl
Enzimas:UracilNGlycosylase(UNG)
UtilizarreactivosprePCRyapreparados,
analizadosyconservadosenalcuotas.
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UNIDAD DIDCTICA V
TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR IN SITU
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57
5.7 Conclusin
La especificidad de la unin de segmentos de ADN catalizada por la enzima ADN
ligasa puede ser explotada en sistemas diseados para identificar la presencia de una
secuencia diana de cidos nucleicos dentro de una muestra biolgica. Los mtodos de
amplificacin basados en la ligasa permiten incrementar la sensibilidad sin producir una
merma en la especificidad. Se han descrito modificaciones de estas tcnicas que permiten
reducir la ligacin inespecfica. La automatizacin de los ensayos permitir en el futuro el
uso rutinario de este tipo de tecnologa en el laboratorio clnico.
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UNIDAD DIDCTICA VI
ANLISIS POR REACCIN EN CADENA
DE LA POLIMERASA (PCR)
6.1 Introduccin
La reaccin en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en
ingls, Polymerase Chain Reaction) permite amplificar ms de un milln de veces un ADN
obtenido a partir de una regin seleccionada del genoma, siempre y cuando se conozca
una parte de su secuencia de nucletidos. Esta tcnica fue ideada en 1989 por Kary B.
Mullis que obtuvo el premio Nobel de Qumica en 1993 por dicho invento.
Para la PCR se utilizan dos oligonucletidos sintticos de unos 15-20 nucletidos
que son complementarios a las zonas flanqueantes de la regin que se quiere amplificar.
Estos oligonucletidos (habitualmente conocidos por su nombre en ingls, "primers")
actan como cebadores para la sntesis in vitro de ADN la cual est habitualmente
catalizada por una enzima llamada Taq polimerasa. Dicha enzima se asla de una bacteria
termfila, denominada Thermus Aquticus, que es capaz de crecer a temperaturas
elevadas (79 - 85 C). A esta temperatura dicha enzima es capaz de mantener una media
de extensin de ms de 60 nucletidos por segundo en regiones ricas en uniones G-C. La
temperatura optima a la que acta la Taq polimerasa permite el uso de elevadas
temperaturas para la unin de los primers y para la extensin, de esta manera se aumenta
el nivel de exigencia de la reaccin y se reduce la extensin de los primers unidos
inespecficamente al ADN.
La reaccin se lleva a cabo en una serie de ciclos cada uno de los cuales incluye
tres fases o pasos:
1. DESNATURALIZACIN: Para que comience la reaccin es necesario que el
ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue
aplicando temperaturas de 90 a 95C que producen la rotura de los
puentes de hidrgeno intercatenarios y por lo tanto la separacin de
ambas cadenas. Para conseguir la completa separacin de las hebras de
toda la muestra esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el
ADN solo se desnaturaliza parcialmente ste tender a renaturalizarse
rpidamente, evitando as una eficiente hibridacin de los primers y una
posterior extensin.
2. HIBRIDACIN: Esta fase se denomina tambin fase de annealing o de
emparejamiento. Una vez que el ADN est desnaturalizado se disminuye la
temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60C para que
se pueda producir la unin de los primers a las secuencias flanqueantes del
fragmento que se va a amplificar. La temperatura de fusin o annealing
(Tm, melting temperature) depende de varios factores y es
relativamente especfica para cada primer. La longitud de los primers y la
secuencia son crticas en la designacin de los parmetros de una
amplificacin, una frmula simple para calcular la Tm es la siguiente:
Tm = 4(G+C) + 2 (A+T).
No obstante, cada primer exige una serie de estudios
experimentales para determinar su temperatura de annealing especfica ya
que si la temperatura es muy baja la unin se har de forma inespecfica y si
es muy alta no se producir una unin completa.
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6.2.2 Primers
A la hora de elegir unos primers para amplificar un determinado fragmento de
ADN hay una serie de reglas a seguir:
La relacin bases pricas: bases pirimidnicas debe ser 1:1 (o como mucho
40-60%).
6.2.4 TaqPolimerasa
Las cantidades ptimas de Taq polimerasa necesarias para la sntesis de ADN estn
alrededor de 2 unidades en 25 l de volumen final de reaccin. La actividad de este
enzima se ve influenciada por la concentracin de dNTPs, de Mg2+ y de algunos iones
monovalentes de manera que concentraciones elevadas de los mismos inhiben dicha
actividad.
Por otro lado, pequeas concentraciones de KCl estimulan la actividad sinttica de
la Taq en un 50-60% con un mximo aparente cuando su concentracin es de 50 mM.
Existen algunos datos relacionados con la influencia de ciertos reactivos que se emplean
antes de la amplificacin y que alteran la actividad de la Taq. Por ejemplo concentraciones
1M de urea estimulan la actividad, el SDS a bajas concentraciones que la inhibe al igual
que concentraciones mayores del 10% de etanol.
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Electroforesis capilar
El nmero de muestras que podemos cargar en cada gel, viene determinado por el
nmero de pocillos que posee el peine (de dientes de tiburn) que utilicemos. Hay peines
de cuatro tamaos distintos: de 36, 48, 64 y 96 pocillos.
La electroforesis se desarrolla durante 7 horas, y se puede realizar una lectura de
unos 700pb aproximadamente, dependiendo siempre de la calidad del ADN, de la
correcta cuantificacin del mismo, de la utilizacin del primer adecuado, y de la
polimerizacin correcta del gel de acrilamida/bis principalmente.
Cuando las muestras a secuenciar tienen una longitud no superior a 400pb,
podemos disminuir el tiempo de la electroforesis a 3.5 horas, aumentando la velocidad de
barrido del laser, y el resultado es igualmente optimo.
La electroforesis capilar es una tcnica relativamente novedosa en el campo de la
Gentica Forense pero que est poco a poco sustituyendo a los sistemas de electroforesis
vertical. En este caso el proceso electrofortico es llevado a cabo en un capilar de silica de
unas 50 m de dimetro, lo cual hace que la cantidad de calor generado sea menor y que
puedan aplicarse voltajes mayores.
Para que puedan ser analizados por electroforesis capilar los primers o los
dideoxinucletidos (en el caso de la secuenciacin) deben ser marcados
fluorescentemente con unas molculas denominadas fluorocromos que emiten
fluorescencia a una determinada longitud de onda cuando son excitados por lser. El
equipo en el que se realiza el proceso lleva acoplado un ordenador encargado de traducir
los datos de emisiones fluorescentes en secuencias o fragmentos con sus
correspondientes alelos asignados.
La electroforesis capilar presenta una serie de ventajas frente a los sistemas de
electroforesis vertical como son:
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Casodeestudiobiolgicodelapaternidadrealizadoconelectroforesiscapilar.Cada
picocorrespondeaunalelo,elhijo(H)debeposeerunalelodelamadre(M)yotro
delpadre(P)paraquelapaternidadseacompatible
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UNIDAD DIDCTICA VII
FUTURAS TECNOLOGAS: BIOCHIPS
Cada casilla del chip posee una cadena de un oligonucletido de manera que
solamente aquel fragmento de ADN que hibride perfectamente con ella permanecer
unido tras los diversos lavados.
Previamente a la hibridacin, el ADN de la muestra a estudiar debe haber sido
amplificado y marcado fluorescentemente en uno de sus extremos. Una vez marcado se
incuba en el recipiente que contiene al chip tras lo cual se lava varias veces para eliminar
los fragmentos que no hayan hibridado y se introduce el chip en un escner en el que se
detectan los patrones de hibridacin.
Esta deteccin se realiza en base a la fluorescencia emitida por los fluorocromos de
la muestra cuando son excitados por luz y en aquellos pocillos en los que la unin haya
sido completa la fluorescencia ser mayor que los que contengan alguna base
desapareada.
Un ordenador conectado al escner es el que identifica las secuencias sonda por su
posicin el chip.
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7.3.1 Fabricacin
En la fabricacin de microarrays se emplean tcnicas fotolitogrficas anlogas a las
utilizadas en microelectrnica. Un sustrato de vidrio se trata qumicamente con
determinados grupos reactivos para permitir la implantacin de los oligonucletidos
sobre el mismo; a continuacin se deposita sobre el substrato una pelcula fotodegradable
y mediante la utilizacin de una plantilla y un haz luminoso, se crea la estructuura de
celdas del microarray.
Existen dos tcnicas para para acoplar los oligos a cada una de las celdas.
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7.4 Citogentica
Para facilitar la comprensin de la nomenclatura citogentica es necesario recordar
que la mayora de los cromosomas humanos tienen dos brazos, uno largo (q) y otro corto
(p).
XY: los cromosomas sexuales (para un varn). Una mujer tendra dos
cromosomas X.
numricas
estructurales
Tipode
alteracin
Nombre
Abreviatura
Descripcin
Trisoma
Gananciadeuncromosoma
Monosoma
Prdidadeuncromosoma
Numricas
Hiperdiploida
Nmerodecromosomas>46
Hipodiploida
Nmerodecromosomas<46
Delecin
del
Prdidadeunsegmento
cromosmico
Inversin
inv
Girode180Cdelmaterial
dentrodelmismocromosoma
Isocromosoma
Estructurales
Traslocacin
Derivativo
Duplicacindetodoelbrazode
uncromosomaconprdidadel
otrobrazo
Intercambiorecprocode
materialcromosmicoentre2o
mscromosomas
der
Intercambionorecprocoentre
doscromosomas
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Sondasunilocus
La cantidad de ADN que se necesita est entre 20 y 100 ng, cantidad difcil
de conseguir en casos de criminalstica en los que los indicios biolgicos
encontrados son mnimos.
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UNIDAD DIDCTICA IX
SECUENCIACIN AUTOMTICA DEL ADN
A:Casete.
B:Tapacubetasuperior
C:Barraprotectoradellaser
D:Cubetasuperior
E:Pinzas
FYG:Cubetainferior
H:Dispositivodecarga
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Gel de secuencia: cada uno de los carriles corresponde con una muestra, y cada
una de las bandas de colores con una de las bases del ADN. El ordenador
identifica color con base y dibuja un cromatograma con los picos de colores y su
correspondiente base
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Retiene dsADN de ms de 125 pb y ssADN de 300 nucletidos o ms. Ref: N 930- 2119 ( 24 unidades).
fluorescentemente
9.5.2 Mtodo enzimtico de Sanger
Este mtodo de secuenciacin de ADN fue diseado por Sanger, Nicklen y Coulson
tambin en 1977 y se conoce como mtodo de los terminadores de cadena o dideoxi.
Para este mtodo resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y
un iniciador, cebador o "primer" complementario de una regin del ADN molde anterior a
donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN
polimerasa I que va a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de
ADN.
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JOE
Emisin:
verde
Derivado de fluorescena
FAM
Emisin:
azul
Derivado de fluorescena
TAMRA
Emisin:
amarillo
Derivado de rodamina
ROX
Emisin:
rojo
Derivado de rodamina
Durante la electroforsis las bandas del ADN de cadena sencilla pasan a travs de
un lser de argn que excita las sondas fluorescentes, la seal de emisin de fluorescencia,
una vez amplificada, es detectada a travs de un filtro y asignada a la base
correspondiente
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Enfriar el tubo a 4C
98
El tiempo necesario del proceso es. para la polimerizacin del mismo, unas
dos horas y para la preelectroforesis, una hora aproximadamente.
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100
9.8 Equipamiento
Secuenciador en geles ABI 377
Modo operativo: Preparacin del ADN para secuenciacin automtica.
Una de las modificaciones de este mtodo con relacin a una lisis alcalina normal
consiste en crecer las bacterias en Terrific Broth en lugar de Luria Broth (LB), con lo cual se
aumenta de 4 a 8 veces el nmero de bacterias por ml de cultivo, consiguindose mayores
rendimientos en la obtencin de plsmido.
Otra de las modificaciones, consiste en introducir una precipitacin con PEG, con lo
cual se enriquece la preparacin en ADN sper enrollado, libre de contaminaciones de
ADN cromosmico y RNA. De hecho, ADN plasmdico aislado empleando otros protocolos
de purificacin no ha podido ser secuenciado empleando Taq polimerasa y dideoxiterminadores fluorescentes.
9.8.1.1 Protocolo:
1. Incubar los cultivos O/N a 37C en Terrific Broth con el antibitico
adecuado. El volumen de cultivo en los frascos no debe exceder 1/4 del
volumen total, con el fin de conseguir una buena aireacin.
2. Centrifugar alcuotas de 1.5 ml durante 1 minuto en una minifuga. El tubo
puede rellenarse hasta tres veces sin necesidad de modificar los volmenes
empleados en la lisis y extraccin del plsmido.
3. Quitar el sobrenadante lo ms posible, aspirando con una pasteur.
4. Resuspender el pellet en 200 l de GTE.
5. Aadir 300 l de una solucin 0.2 N NaOH/ 1% SDS recin preparada.
Mezclar el contenido por inversin e incubar en hielo durante 5 minutos.
6. Neutralizar la solucin aadiendo 300 l de AcK 3 M, pH 4.8. Mezclar
invirtiendo el tubo. Incubar en hielo 5 minutos.
7. Eliminar los restos celulares centrifugando 10 minutos a temperatura
ambiente. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.
8. Aadir RNasa (libre de DNasa) hasta una concentracin final de 20 g/ml e
incubar a 37C durante, al menos, 20 minutos.
9. Extraer el sobrenadante dos veces. Para ello aadir en la primera extraccin
400 l de fenol. Mezclar las fases con la mano durante 30 segundos.
Centrifugar 5 minutos para separar las fases. Recoger la fase superior.
Extraer nuevamente esta fase con 400 l de cloroformo: Alcohol isoamlico
(24: 1). Centrifugar y recoger la fase acuosa.
10. Precipitar e ADN aadiendo un volumen de isopropanol (100%) y
centrifugar inmediatamente de 10 a 15 minutos a temperatura ambiente.
11. Lavar el ADN con 500 l de Etanol 70%. Secar los pellets.
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SOLUCION A:
PO4H2K 0.17M-PO4HK2 0.72 M
SOLUCIN B:
12 gr de bacto triptona
24 gr de extracto de bacto-levadura (Bacto-yeast extract)
4 ml de glicerol (aproximadamente 5 gr)
H2O desionizada hasta 900 ml. AUTOCLAVAR
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9.9 Glosario:
ADN de cadena simple: Polmero no ramificado, compuesto por cuatro tipos de
subunidades: los desoxiribonucletidos que contienen las bases adenina(A),
citosina(C), guanina(G) y timina(T).
ADN Polimerasa: Enzima que cataliza la incorporacin de los nucletidos
complementarios a la cadena molde durante el proceso de replicacin del ADN.
Bacterifago (Fago): Cualquier virus que
ampliamente utilizada como vector de clonaje
infecte
bacterias.
Herramienta
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UNIDAD DIDCTICA X
NIVELES DE SEGURIDAD Y
PELIGROSIDAD EN EL LABORATORIO
todo el personal conozca las razones por las que debe proceder de la
manera indicada y se promueva el conocimiento y la utilizacin adecuados.
10.1.1.1 Vacunacin
El personal de un hospital est sometido a numerosos riesgos biolgicos,
producidos por bacterias, hongos, virus, etc., frente a los cuales se dispone de vacunas que
hacen posible su prevencin y, a veces, su tratamiento.
La inmunizacin activa frente a enfermedades infecciosas ha demostrado ser, junto
con las medidas generales de prevencin, una de las principales formas de proteger a los
trabajadores.
Deber vacunarse todo el personal que desarrolle su labor en ambientes que
tengan contacto, tanto directo como indirecto, con la sangre u otros fluidos biolgicos de
otras personas infectadas (por ejemplo, la vacuna contra la Hepatitis B para el personal
que desarrolle su labor en ambiente hospitalario y que tenga contacto directo o indirecto
con la sangre u otros fluidos de los pacientes).
107
108
Desinfeccin:
109
TIPO
ALCOHOLES
(etanol,
isopropanol)
COMPUESTOS
DEAMONIO
CUATERNARIO
COMPUESTOS
FENLICOS
IODFOROS
GLUTARAL
DEHIDO
CONC.
ACCIN
UTILIZADAS
6090%
0,41,6%
0,40,5%
75ppm
2,0%
B,F,V
B*,F,V*
MECANISMO
DESNATURALIZACIN NOMANCHA
PROTEINAS
NIIRRITA
INCREMENTOS
PERMEABILIDAD
CELULAR
DESNATURALIZACIN
B.F,V(T)
PROTEINAS
B,F,V,T
VENTAJAS
IODACINY
OXIDACINDE
PROTEINAS
INCONVENIENTES
INACTIVADOPOR
MATERIA
ORGNICA;
INFLAMABLE
BARATO
IRRITANTE;
TXICO
BARATO
TXICO;
CORROSIVO;
PERMISO
RESIDUOS
IRRITANTE
TXICO;
CORROSIVO
ESTABLE;
ACCIN
RESIDUAL
CARO;
INACTIVADOS
PORMATERIA
ORGNICA
IRRITANTE
DEPIELY
MUCOSAS
VAPORES
IRRITANTES;
TXICO
TXICO;
IRRITANTE
NO
CORROSIVO;
ENTRECRUZAMIENTO
B,F,V,T,E
INAFECTADO
DEPROTEINAS
POROTROS
COMPUESTOS
500ppm
(Clorolibre)
B,F,V,T
INACTIVACIN
ENZIMTICA
BARATO
PERXIDODE
HIDRGENO
3,0%
B,F,V,T,E
RADICALESLIBRES
ESTABLE
TXICO:
CORROSIVO;
TXICO;
INACTIVADOPOR
CORROSIVO
MATERIA
ORGNICA
CORROSIVO;
CARO
Esterilizacin:
NOBACTERIAS
GRAM();PUEDE
ACTUARCOMO
FUENTEDEN;
INACTIVACIN
MATERIA
ORGNICA
HIPOCLORITO
EFECTOS
SOBRE
HUMANOS
Debe mantenerse por dos horas a partir del momento en que el material ha
llegado a los 170C.
-
Radiaciones ionizantes
Los agentes gaseosos, tales como el formaldehdo o el xido de etileno, tienen una
actividad bactericida y esporicida en el intervalo de 30-80C.
La esterilizacin, en este caso, se lleva a cabo en esterilizadores diseados
especficamente, que tambin se llaman autoclaves, y que permiten obtener las
condiciones de presin, de temperatura y de humedad adecuadas. Funcionan de manera
automtica, por ciclos, e incluyen la evacuacin de los fluidos.
-
Este tipo de esterilizacin slo debe aplicarse a aquel material que no pueda ser
esterilizado al vapor y debe llevarse a cabo por personal cualificado, informado de los
riesgos que presenta su utilizacin, disponiendo de un protocolo de actuacin bien
establecido y, cuando el caso lo requiera, de los equipos de proteccin individual
adecuados.
Los autoclaves de xido de etileno deben ser de estanqueidad contrastada, a ser
posible de doble puerta con extraccin por encima de la de descarga y con aireacin
incorporada. Deben ubicarse en reas aisladas, bien ventiladas y mantenidas a depresin
con las adyacentes, procedindose a un control ambiental peridico de la presencia en
aire del compuesto.
111
112
En cada unidad del laboratorio debe haber lavabos de manos, a ser posible
con agua corriente, instalados preferentemente cerca de la salida.
113
Todos los desechos biolgicos, ya sean lquidos o slidos, tienen que ser
descontaminados antes de su eliminacin y se seguirn las normas
existentes sobre la gestin de residuos contenidos en las reglamentaciones
referentes a residuos sanitarios.
115
10.3.1 Clasificacin
En todo proceso de gestin de residuos es de capital importancia la clasificacin
que hagamos de los distintos grupos generados, porque de ella dependern las dems
etapas. Como hemos visto, no existe una norma reguladora de carcter especfico, por lo
tanto la clasificacin que se propone es orientativa, si bien est comnmente aceptada
por la comunidad cientfica.
Son Los producidos fuera de la actividad asistencial, por lo que no presentan una
contaminacin especfica.
Por tanto son residuos como restos de comidas, alimentos, embalajes, mobiliario
en desuso, jardinera, colchones, papelera generados en reas administrativas, de
mantenimiento, almacenes y muelles de carga y descarga...
de
las
no
de
10.3.2 Recogida
El primer paso a seguir en el tratamiento de los residuos sanitarios es su
clasificacin, por lo que no se depositarn en un mismo recipiente residuos sanitarios de
tipos diferentes, respetando la clasificacin establecida, consiguindose as minimizar la
cantidad de residuos.
Al mismo tiempo, la recogida de residuos sanitarios deber atender a los criterios
de asepsia, inocuidad y economa. Su recogida se realizar, segn los grupos:
Grupo I: Se recogen en bolsas de color negro que cumpla la norma UNE 53147-85, con galga mnima 200.
Grupo II: Se recogen en bolsas de color marrn que cumpla la norma UNE
53-147-85, con galga mnima 200.
Grupo III.a: Se recogen en bolsas de color rojo que cumpla la norma UNE
53-147-85, con galga mnima 400, y/o contenedores de un solo uso,
elaborados con material que garantice su total eliminacin, rgidos,
impermeables, resistentes a agentes qumicos y a materiales perforantes y
que dispongan de un cierre provisional que garantice su estanqueidad
hasta su llenado y de un cierre hermtico definitivo.
118
Contenedores de residuos del grupo III.a. Dentro del Grupo IIIa hemos
hecho referencia a punzantes y otros residuos infecciosos, las diferencias
que existen entre ellos tambin se pueden ver reflejadas en el tamao de
los contenedores, no as en lo relativo a sus caractersticas generales:
estanqueidad, opacidad, resistencia a golpes, desgarros, dotacin de doble
cierre y todas aquellas cuyo manejo no suponga riesgos para sus
manipuladores.
119
Una vez que los residuos han sido depositados en los contenedores respectivos se
inicia la siguiente fase, consistente en el itinerario por el Centro Sanitario desde el lugar de
generacin del residuo al de su almacenamiento previo o definitivo antes de entregarlo al
gestor externo autorizado: ser el servicio municipal de basuras para los grupos I y II o
empresa contratada para el resto de los grupos.
El circuito comenzar por el rea de produccin ms alejado del almacn de sucio
para los del Grupo III a o del lugar por el que sern depositados en los contenedores del
servicio municipal para los Grupos I y II, ambos recorridos no podrn ser simultneos. Se
comenzar por estos ltimos, sirviendo este primero por las reas de produccin, para
evaluar las necesidades de reposicin de contenedores del Grupo III a, que se retirarn en
el segundo recorrido. Los circuitos deben mantener las reas de limpio y sucio separadas.
Es necesario fijar un horario de recogida que al menos se realizar cada doce horas,
teniendo en cuenta los mximos de produccin y la menor afluencia de pblico.
Una vez practicada la retirada de los distintos residuos generados, se proceder a
la limpieza y desinfeccin exhaustiva de suelos y superficies.
120
CUESTIONARIO
Cuestionario
1. La molcula de ADN est constituida por?
a. Dos largas cadenas de nucletidos formando una hlice
b. Una cadena corta de nucletidos helicoidal
c. Dos cadenas cortas de nucletidos formando una hlice entre si
2. La secuencia del ADN est compuesta por:
a. Cuatro bases fosfatadas
b. Cuatro bases nitrogenadas
c. Infinitas bases nitrogenadas
3. Los errores genticos provocan enfermedades, cul de los siguientes patrones
afirma este postulado:
a. Disposicin exacta de las bases
b. Elaboracin exacta de protenas
c. Bases fuera de lugar
4. El nmero de cromosomas corresponde a:
a. 44
b. 45
c. 46
5. Que son las sondas?
a. Segmentos de ADN o ARN marcados
b. Segmentos reticulares
c. Secuencias plsticas polimrficas
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