16/7/2012

Espectrometria de massa &

anlise de biomolculas
Curso de Inverno
16/07/2012
Sayuri Miyamoto

Tpicos
I.

Breve Introduo

II.

Espectrmetros de Massa

III. Aplicaes em Anlise de

Biomolculas

16/7/2012

Os primeiros espectrmetros de massa

1906

1922

1989

1930:Estabelecimento
da tcnica de
espectrometria de
massa.
1948-52: TOF
1955: Quadrupole
1983: Ion Trap
1968: MS/MS

Joseph John Thomson

Francis William Aston

Wolfgang Paul

United Kingdom

United Kingdom

Federal Republic of Germany

University of Cambridge

University of Cambridge

University of Bonn

1897 Descobre o eltron e

determina seu m/z
1912 Constroi o primeiro
espectrmetro de massa e obtem o
espectro de O2, N2, CO, CO2

1919 Espectro de Massa

de Istopos de Elementos

Nobel Prize in Chemistry

2002

John B. Fenn is the chemist who

invented the ELECTROSPRAY
method (1988). Professor of
Chemistry at Yale University, USA,
and at Virginia Commonwealth
University, USA

Koichi Tanaka research engineer who

developed the MALDI technique (1987).
Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan.

16/7/2012

John B. Fenn

NOBEL LECTURE

Electrospray Wings for

Molecular Elephants

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2002/fenn-lecture.html

Espectrometria de Massas
Espectrometria de massas uma tcnica que
permite a pesagem de molculas.

Obviamente a pesagem no feita atravs de uma

balana e sim atravs de um equipamento chamado
de espectrmetro de massa.

16/7/2012

Tabela Peridica
MASSA ATMICA: dado pelo nmero de prtons e neutrns de um tomo e a
sua unidade unidade de massa atmica ou simplesmente u (1u=1Da).
Importante: a massa atmica = massa mdia dos istopos

Massa: Conceitos Importantes

Massa nomimal: massa calculada a partir da massa do
istopo natural mais abundante de cada elemento,
arredondada para o valor inteiro
Massa mdia: massa calculada usando-se a massa atmica
mdia de cada elemento, a qual obtida ponderando-se a
massa dos istopos naturais
Massa exata (massa terica): massa calculada usando-se a
massa de um istopo especfico.
Isbaros: tomos ou molculas com a mesma massa nominal,
porm com massas exatas diferentes.

Vessecchi et al 2011 Nomenclaturas de espectrometria de massas em lngua portuguesa.

Qumica Nova vol. 34, pag 1875-.

16/7/2012

Istopos e suas Massas

Elemento

Massa
Nominal

Massa Exata Abundncia

Relativa

Massa
Mdia

1
2

1.0078225
2.0141000

99.985 %
0.015 %

1.00794

12
13

12.000000
13.003355

98.90%
1.10%

12.011

14
15

14.003074
15.000108

99.64%
0.36 %

14.007

16
17
18

15.994915
16.999133
17.999162

99.76%
0.04%
0.20%

15.999

31

30.973762

100%

30.973

32
33
34

31.972070
32.971456
33.967866

95.03%
0.75%
4.22%

32.066

Exemplo de Massas de Compostos Orgnicos

Ubiquitina

C18H32O2

C378H630N105O118S

Massa Nominal

280

8566

Massa Mdia:

280.438219

8565.764735

Monoisotopic mass:

280.2324052406

8560.6245369044

Abundncia Relativa (%)

cido Linoleico
Molecular formula:

Pesticide Mix
100

Pico monoisotpico

279.24

280.2397

Picos isotpicos
%

281.2431
280.24

281.24

282.2461

0
274

275

276

277

278

279

280

281

282

283

284

285

286

m/z
287

m/z

16/7/2012

Resoluo
Expressa o grau de separao entre dois picos
Determina a preciso da massa determinada

m=FWHM

R = m/m

FWHM = Full Width of the Peak at Half its Maximum

Largura Total do Pico na Metade de sua Altura

Maior ResoluoMaior Preciso

m/z 1060.5692 (monoisotopic mass of
the protonated bradykinin ion)

http://msr.dom.wustl.edu/Research/MALDI_TOF_Mass_Spec_and_Proteomics/

16/7/2012

Tpicos
I.

Breve Introduo

II.

Espectrmetros de Massa

III. Aplicaes em Anlise de

Biomolculas

Ion-Trap
Q-TOF (Micro-TOF)

Q-TOF de Alta Resoluo (Maxis)

MALDI-TOF
Equipamentos disponveis na Central Analtica (IQ-USP)

16/7/2012

Espectrmetro de massa
O que ele mede?

Espectrmetro de massa NO MEDE MASSA.

Espectrmetro mede a Relao MASSA/CARGA (m/z).
Como ele mede?

A medida baseada na movimentao de uma

partcula carregada, chamada ON, em um campo
eltrico ou magntico.
Essa movimentao ocorre em FASE GASOSA e no
VCUO e afetada pela razo massa/carga (m/z).

Espectrmetros de massa
Componentes bsicos:

1. Fonte de ons
2. Analisador de massas
3. Detector
Vcuo

1.Fonte de ons ons

Entrada
da
Amostra

2.Analisador de Massas

ons 3.Detector
de ons

Gas (GC-MS)
Lquido (LC-MS)
Slido (MALDI)
Espectro de massa

16/7/2012

Fonte de ons (Ion Source)

EI/CI
ESI
MALDI

Ionizao por Eltrons

Ionizao Qumica
Ionizao por Electrospray
Ionizao/Dessoro a Laser assistida por Matriz

Electrospray Ionization (ESI)

a

Dessolvatao

Formao de gotculas carregadas

Formao de ons com mltiplas cargas

www.csd.uwo.ca/~bma/CS661/ms-1.ppt

16/7/2012

Matrix-Assisted Laser Desorption

Ionization (MALDI)

(337 nm)

Amostra co-cristalizada
juntamente com uma MATRIZ.
Koichi Tanaka,
Nobel Prize 2002

A matriz absorve a energia, a qual

utilizada para a vaporizao e
transferncia da molcula para a
fase gasosa. Voet Biochemistry 3e
2004 John Wiley & Sons, Inc.

Voet Biochemistry 3e
2004 John Wiley & Sons, Inc.

10

16/7/2012

Anlise de Citocromo c

ESI

MALDI

+16

+18

+17

+15

ons com Cargas Mltiplas

+14
+19

+20

+13

+12
+11

Transformation
Maximum Entropy

11

16/7/2012

Fonte de ons (Ion Source)

EI/CI
ESI
MALDI

Tcnica de ionizao mais antiga ainda muito utilizada

em GC-MS. A amostra na fase gasosa bombardeada
com um feixe de eltrons (entre 10 -150 eV).
Muitos fragmentos!!
Tcnica bastante branda de ionizao.
Permite anlise de ampla gama de compostos.
Analitos com mltiplas cargas.
Acoplamento com LC (LC-MS), eletroforese capilar, etc.
Anlise direta de analitos em slidos.
Ionizao produz ons monocarregados.
Espectros de fcil interpretao.

Analisadores de Massa

Quadrupole
TOF
Ion Trap
Orbitrap
Mag. Sector
FTMS

12

16/7/2012

QUADRUPOLE

Amplamente utilizado.
ons so acelerados atravs da aplicao de uma diferena
de potencial.
A dinmica de movimentao do on atravs das barras depende
de uma radiofrequncia (RF).
O valor da massa resultado dos valores de radiofrequncia (RF)
e de correntes (DC) aplicados.

Ion-Trap: Aprisionamento de ons

Enquanto no Quadrupolo a campo aplicado bidimensional no

Ion-Trap o campo tridimensional. Aprisionamento de ions.
Permite acmulo de ons: Ganho de sensibilidade.
Vantagem: MSn !!

13

16/7/2012

TOF (Linear)

ons so acelerados atravs da aplicao de uma diferena

de potencial.
ons percorrem uma distncia fixa.
Separao das massas por Tempo de Vo.
Vantagem: Massas com alta resoluo.

TOF (Refletor)
ons so refletidos

No Refletor aps os ons percorrerem uma distncia eles entram em um

campo eletrosttico que funciona como um espelho.
Os ons so refletidos.
O Refletor corrige pequenas diferenas na migrao de massas com a
mesma massa e essa correo aumenta bastante a resoluo do sinal.

14

16/7/2012

Analisadores de Massa

Quadrupole
TOF
Ion Trap
Orbitrap
Mag. Sector
FTMS

Quantificao

Caracterizao/Identificao

Altssima Resoluo e
Preciso!!

Analisadores de Massa

Quadrupole
TOF
Ion Trap
Orbitrap
Mag. Sector
FTMS

15

16/7/2012

Espectrmetro de Massa em
Tandem

MS/MS

Tandem Mass Spectrometry

Diferentes configuraes de MS-MS:
Quadrupole-quadrupole: Triple-quadrupole
Quadrupole-time-of-flight: Q-TOF
Time-of-flight-time-of-flight: TOF-TOF

possvel realizar fragmentaes em equipamentos

com um nico analisador.
Ex: Ion trap e TOF com post-source decay

16

16/7/2012

Triplo-Quadrupolo

Q1

Q2

Q3

Voet Biochemistry 3e Page 174

2004 John Wiley & Sons, Inc.

Caracterizao/Identificao

Anlise de classes de compostos

Anlise de classes de compostos

Anlise de alta especificidade

Ganho de sensibilidade
Quantificao

17

16/7/2012

Tpicos
I.

Breve Introduo

II.

Espectrmetros de Massa

III. Aplicaes em Anlise de

Biomolculas

METABOLMICA
cidos Nucleicos

Espectrometria
de Massas
Protenas
Protemica

Lipdeos
Lipidmica

Carboidratos

18

16/7/2012

Aplicaes em Anlise de Protenas

Identificao e confirmao de protenas
Deteco de modificaes ps-traducionais.

Sequenciamento de novo de peptdeos

Monitoramento de complexos de Protenas-Ligantes.

Determinao da pureza de protenas/Confirmao da Identidade

A

SDS-PAGE (412% gradiente)

MALDI-TOF mass spectrometry

19198
600
kDa

550
500

150

Absolute Intensity

100
75
50
37

450
400
350
300
250
200

25

150
100
50

15

0
10000

Frao de Protenas Solveis

15000

20000

25000

30000

m/z

Extrato Bruto
Fracionamento
Salino

Cromatografia de
Afinidade

Cromatografia de
Filtrao em Gel

Armengaud et al. BMC Structural Biology 2005 5:3 doi:10.1186/1472-6807-5-3

19

16/7/2012

Identificao de Protenas

http://www.natureprotocols.com/2008/06/16/analysis_protein_complexes_by.php

Sequenciamento de Peptdeos

20

16/7/2012

Anlise de Modificaes em Protenas

Published in: Carlos A. O. Sigolo; Paolo Di Mascio; Marisa H. G. Medeiros; Chem. Res. Toxicol. 2007, 20, 1099-1110.
DOI: 10.1021/tx700111v
Copyright 2007 American Chemical Society

MALDI-TOF mass spectra showing protein modification of

270 M cytochrome c incubated for different time periods
with 18 mM DDE at 37 C and pH 7.4. (A) Cytochrome c
(control, without DDE) and cytochrome c incubated with
DDE for (B) initial time, (C) 1 h, (D) 2 h, and (E) 4 h.

21

16/7/2012

Aplicaes em Anlise de Lipdeos

Anlise Lipidmica
Anlise de Lipdeos modificados
Estudos mecansticos
Identificao/quantificao de marcadores de
peroxidao lipdica (Biomarcadores )

Anlise Lipidmica

LC-ESI-MS/MS
LC

MS1

CID

MS2

22

16/7/2012

Nature Reviews Molecular Cell Biology 11, 593-598 (August 2010)

Anlise do Perfil de Fosfolipdeos de crebro de

rato por ESI-MS no modo negativo
MS1- Scan

Fosfolipdeos

23

16/7/2012

Fragmentos de m/z 885

Fosfatidil-Inositol
18:0-20:4

Resumo
Espectrometria de massas uma tcnica
poderosa que permite:
Determinar a massa molecular
Caracterizar a estrutura de compostos
desconhecidos
Verificar a identidade e a pureza de substncias
Quantificar de forma especfica e sensvel
diversos compostos

24

16/7/2012

REFERENCES

Mass Spectrometry: Principles and Applications

3rd Edition (2007)
Edmond de Hoffmann, Vincent Stroobant

Introduction to Mass Spectrometry:

Instrumentation, Applications, and
Strategies for Data Interpretation.
4th Edition (2007)
J. Throck Watson, O. David Sparkman

Obrigada pela Ateno

Laboratrio de Pesquisa de Lipdeos Modificados

25