rea Ciencias del Agro y Mar

Departamento de Sanidad Animal

Laboratorio de Microbiologa e Inmunologa Veterinaria

Actividad Prctica N 10
Estudio de los Hongos.
OBJETIVOS
1.
1.

Estudiar las caractersticas macroscpicas y microscpicas de los hongos.

Ejecutar las tcnicas de examen microscpico directo, macrocultivo y microcultivo.
GENERALIDADES

La micologa es el estudio de los hongos, la rama de la micologa clnica por su parte se

dedica exclusivamente a la investigacin de hongos y actinomicetos (bacterias) de comportamiento
parasitario en humanos y animales; estos especimenes pueden producir alteraciones en cualquier
parte del organismo, desde los tejidos superficiales como la piel y faneras, hasta los rganos ms
profundos como pulmn, mdula sea y sistema nervioso central. Si bien el nmero de especies en
la naturaleza es bastante amplio (150000), solo unas pocas especies son capaces de producir
patologas (200) en los animales.
MORFOLOGA
Bajo la acreditacin de hongo se agrupan organismos unicelulares y multicelulares
heterotrficos, saprofitos o parasticos; las primeras se conocen genricamente como levaduras, son
esfricas u ovales, mientras que las segundas estn constituidas por cuerpos cilndricos o
filamentosos llamadas hifas, la agrupacin de muchas de stas conforman estructuras denominadas
macroscpicamente como mohos. En ciertos ejemplares se presenta el fenmeno de dimorfismo:
bajo ciertas condiciones ambientales y de cultivo, una especie puede desarrollarse bajo la forma
levaduriforme, pero en presencia de variaciones externas, el microorganismo sufre modificaciones
estructurales, sobre todo en la pared, y fisiolgicas y empieza a desarrollarse como hifa o micelio; la
mayora de los hongos patgenos para animales experimentan estas variaciones, siendo la levadura
la forma parasitaria en tejidos y la micelial la fase saproftica de crecimiento en medios externos.
REPRODUCCIN
Los hongos poseen, desde el punto de vista del manejo de la informacin gentica, tres
mecanismos de reproduccin:

Asexual o Anamorfa: las clulas se reproducen por mitosis, de manera tal que el contenido
gentico se transfiere de las clulas madres a hijas de manera casi exacta e inalterada, por lo
cual, no se introducen variaciones en el genoma. Las clulas hijas se forman en organelos
especiales conocidos como conidiforos, y sufren modificaciones estructurales para hacerse
ms resistentes a las inclemencias ambientales, y de esta forma reciben la denominacin de
conidias. Esta va reproductiva no es la preferida por los hongos, pero la adoptan la mayora
de las veces en vista de que en su entorno ms inmediato no consiguen a otro ejemplar de la
misma especie con quien experimentar la reproduccin sexual o parasexual.

Actividad Prctica N 10
Estudio de los Hongos.

Pgina 2 de 7

Sexual o Teleomorfa: los hongos son capaces de liberar al medio ambiente ferhormonas a
fines de comunicarse con ejemplares de su misma especie, al no obtener respuesta deducen
que se encuentran solos y as adoptan la va de reproduccin asexual; en caso contrario y al
sentir la presencia de especimenes de su misma especie y de polaridad distinta, pasan a
experimentar la reproduccin perfecta o teleomorfa, en la cual hay intercambio del material
gentico y se forma un organelo especial entre ambas clulas (aparato gametangiforo), en
ste se reproducirn las clulas por meiosis (gametangios) y la progenie obtenida tendr un
genoma haploide, que ha resultado de la recombinacin del material gentico de ambos
progenitores. Desde el punto de vista evolutivo sta es la forma de reproduccin preferida por
los hongos, pero la menos frecuente en vista de las exigentes y exclusivas condiciones en las
cuales se lleva a cabo.
Parasexual: es una variante de la reproduccin teleomorfa, pero en este caso el apareamiento
se da entre clulas de polaridad o sexo semejante, obviamente la variacin generada en el
material gentico de las clulas hijas no es tan grande. Este fenmeno es solo visto en
algunos ejemplares de reino Fungi.
CLASIFICACIN DE LOS HONGOS

Existen diversos criterios para clasificar a los hongos, pero al final lo importante es aplicar
sistemas que permitan agruparlos para facilitar su identificacin y pronstico de la enfermedad.
Clasificacin taxonmica
Principalmente de acuerdo a la forma de reproduccin sexual, los especimenes del reino
Fungi se distribuyen en cuatro phyla, a saber:

Phylum Zygomycota: sus micelios estn escasamente septados (hifas cenocticas); las formas
de reproduccin asexual se conocen como conidias o esporas nacidas a partir de
esporangios, mientras que las sexuales se llaman zygosporas nacidas de zygosporangios.
Phylum Ascomycota: los micelios son septados y las esporas derivadas de la va sexual se
denominan ascosporas, derivadas de estructuras especializadas o ascas.
Phylum Basidiomycota: en este grupo se incluyen los tpicos hongos multicelulares en forma
de sombreritos u orejas de palo, sus hifas son septadas o tabicadas, las formas de
reproduccin sexual son las basidiosporas, derivadas de las basidias.
Phylum Chitridiomycota: estos ejemplares durante su ciclo de vida pueden experimentar una
etapa en medios acuosos, ocurriendo generalmente en ste la etapa reproductiva, cuyas
esporangiosporas o chitridiosporas son flageladas.
Phylum Deuteromycota: durante mucho tiempo la clasificacin taxonmica de los hongos
dependa de las caractersticas fenotpicas (morfolgicas, fisiolgicas y metablicas), pero
esta actitud llev a muchas confusiones, dado que haban ejemplares que siendo
verdaderamente de la misma especie reciban varias denominaciones, sobre todo porque eran
aislados en condiciones ambientales diferentes y as manifestaban caracteres fenotpicos
distintos; hoy en da estos errores de coincidencia se han descubierto por la implementacin
de tcnicas de anlisis y comparacin del material gentico, pero an no se ha descartado el
requisito de la visualizacin de la forma de reproduccin sexual para as definitivamente
clasificar taxonmicamente a las especies fngicas. El phylum Deuteromycota fue creado con
la intencin de agrupar transitoriamente a aquellos especimenes a los cuales no se les haba

Actividad Prctica N 10
Estudio de los Hongos.

Pgina 3 de 7

podido evidenciar la reproduccin teleomorfa, y aunque an se conserva, eventualmente

desaparecer al analizar el genoma de los ejemplares que agrupa y reubicarlos en los otros
phyla de acuerdo al grado de similitud del genoma, es un phylum artefacto.
Desde el punto de vista prctico y para el diagnstico de laboratorio, el sistema de
clasificacin taxonmica es poco aplicable y accesible, dado que es requisito indispensable
visualizar las formas de reproduccin sexual, y sta es bastante exquisita e infrecuente.
Clasificacin clnica
Este sistema resulta ms prctico y organiza a las especies de acuerdo al tipo de patologa y
rganos afectados:

Micosis superficiales: solo afectan las capas ms superficiales altamente queratinizadas como
uas, pelo, cabello, pezuas, cachos, etc. Los agentes causales son bastante queratinoflicos
y no invaden tejidos, degradan la queratina y liberan metabolitos que estimulan el sistema
inmunitario, induciendo reacciones alrgicas, para de esta forma inducir patologas. Ej.:
Piedraea hortae, gneros Microsporum y Trichophyton.
Micosis cutneas: al igual que en caso anterior, se afecta principalmente la epidermis,
generando cuadros de dermatitis que eventualmente puede sobreinfectarse con otros
microorganismos y complicar el cuadro; los agentes etiolgicos se conocen como hongos
dermatofitos e incluye los gneros Microsporum y Trichophyton.
Micosis subcutneas: en este grupo se describen patologas de afectacin de tejidos blandos
subcutneos, a raz de la invasin de los microorganismos por laceraciones y heridas
superficiales, clnicamente se conocen como micetomas y se subdividen en eumicetomas (el
agente causal corresponde a un hongo verdadero, Ej.: Lacazia loboi) y actinomicetomas (la
etiologa recae sobre bacterias, Ej.: Actinomyces spp., y Nocardia spp.).
Micosis profundas, generalizadas o sistmicas: los hongos penetran en la mayora de los
casos por va inhalatoria, llegan al tejido pulmonar y pueden quedarse all solo de paso (Ej.:
Criptococcus neoformas) e invadir a otros tejidos (Ej.: sistema nervioso central), o quedarse
all por largo tiempo y provocar o no patologa pulmonar, eventualmente podrn diseminarse e
invadir otros rganos profundos.
TOMA DE MUESTRAS

Dependiendo del tipo de micosis, se seleccionar el tipo de muestra biolgica ms

adecuado, en el cual exista la mayor probabilidad de visualizar y aislar el agente causal, dado que el
diagnstico de estas enfermedades se fundamenta bsicamente en la observacin del germen y la
caracterizacin microscpica de las lesiones en los tejidos. Por ejemplo, para las micosis
superficiales y cutneas se recomienda tomar raspados de piel, uas, pezuas, etc., que muestren
signos clnicos de infeccin, preferentemente en las zonas perifricas del crecimiento, dado que
estos microorganismos tienen la tendencia a desarrollarse de forma diseminativa en el plano
superficial; para los micetomas y micosis subcutneas se recomienda tomar material de las lesiones
recientemente drenado o tomado, bien sea para cultivos y para anlisis anatomopatolgicos; para
las profundas lo ideal es tomar muestras y biopsias de rganos profundos afectados, como
secreciones pulmonares, lquido cefalorraqudeo, etc.

Actividad Prctica N 10
Estudio de los Hongos.

Pgina 4 de 7
PROCESAMIENTO EN EL LABORATORIO

Una vez recibido el material biolgico a investigar, se debe separar en dos porciones y
decidir con cul procedimiento se debe tratar la muestra, en funcin de sus caractersticas:
1.

2.

3.

4.

Estudio microscpico directo: se hacen

Cuadro N 1: Medios de cultivo y lquidos de
extendidos (de lquido cefalorraqudeo,
montaje.
esputo, secreciones pulmonares,

Lactofenol: 20 g. de cido lctico, 20 g. de

sangre) y cortes histolgicos de los
cristales de fenol, 40 g. de glicerina y 20 mL
rganos afectados, para los estudios
de agua destilada.
anatomopatolgicos, pero en el caso de
Azul de lactofenol: se obtiene aadiendo a la
estructuras queratinizadas como
frmula anterior 0,05% del colorante azul de
raspados epidrmicos, uas, pelos, etc.,
algodn.
Fijador FAEX: alcohol, ter de petrleo, xilol.
se remueve el exceso de queratina
Agar Saboraud: 20 g. de glucosa, 10 g. de
(aclaramiento) al someter el material a
peptona, 20 g. de agar y 1000 mL de agua
la accin del NaOH y el KOH al 10-20%,
corriente.
y luego es dispuesto en lminas

Agar Lactrimel: 30 g. de harina de trigo, 10 g.

portaobjeto limpias y estriles para el
de miel de abejas, 15 g. de agar, 20 mL de
examen al microscopio ptico, utilizando
leche pasteurizada y 1200 mL de agua
como lquidos de montaje soluciones de
corriente.
lactofenol, azul de lactofenol, NaOH y
agua glicerinada (Cuadro N 1), en
estos ensayos se buscar visualizar estructuras fngicas vegetativas (levaduras, hifas) y
reproductivas (sean sexuales o asexuales).
Cultivo micolgico: muy pocas veces es posible visualizar en el estudio microscpico directo
las estructuras de reproduccin de los hongos, las cuales son las que verdaderamente
aportan informacin para la identificacin de la especie, por lo cual, es necesario mejorar las
condiciones ambientales para que ellos entren en etapa reproductiva, esto se logra
llevndolos a incubar en medios axnicos de enriquecimiento como el agar Saboraud, agar
harina de maz, agar papa dextrosa y agar Lactrimel (medio casero de Borelli) (Cuadro N 1),
considerando que los hongos son de lento crecimiento, es conveniente adicionarles
antibiticos para as hacerlos selectivos para los grmenes de inters; es importante destacar
que cada especie fngica tiene requerimientos nutricionales caractersticos, por lo cual, no
existe un medio de cultivo universal en donde TODOS los hongos de inters mdico vayan a
desarrollarse, esta premisa debe considerarse al momento de elegir el medio de cultivo en
funcin del agente etiolgico del cual se sospecha.
Caracterizacin macroscpica de la colonia: una vez crecido el microorganismo, es
conveniente evaluar caractersticas como el color (amarillento, blanquecino, oscuro, hialino),
textura (algodonoso, aterciopelado, aterronado, cerebriforme), topografa (irregular, planas,
elevadas, radiadas, concntricas), bordes (regulares, redondeadas, irregulares) y la velocidad
del crecimiento, tanto en la superficie como en el reverso de la colonia, esta informacin,
aunada a la historia clnica y los datos obtenidos de los estudios microscpicos, permitirn
finalmente llegar a la identificacin del microorganismo.
Estudio microscpico: nuevamente se realiza este tipo de ensayo pero en esta oportunidad se
evalan las estructuras desarrolladas en el cultivo. Para facilitar la toma del material, muchas
veces se utiliza una cinta plstica adhesiva transparente para tomar cuidadosamente material
de las colonias del hongo en estudio, y luego es superpuesta en una lmina portaobjeto a la

Actividad Prctica N 10
Estudio de los Hongos.

5.

Pgina 5 de 7

cual previamente se le haba colocado una gota del lquido de montaje seleccionado. Se
buscarn formas vegetativas y reproductivas que permitan identificar al agente.
Microcultivo: fisiolgicamente los hongos estn adaptados a desarrollarse, multiplicarse y
expandirse usando las formas celulares vegetativas cuando hay abundantes nutrientes en su
entorno, y lamentablemente stas no pasan de ser simples hifas o levaduras que no brindan
mayores luces sobre la taxonoma del agente en cuestin, se hace entonces necesario
presionar al organismo para que desarrolle estructuras de reproduccin sexuales o asexuales,
siendo stas de gran aporte, estas formas celulares son manifiestas cuando el hongo detecta
que las condiciones nutricionales son escasas y de ac el fundamento de la tcnica de
microcultivo de Ridell: en una placa de Petri hay abundantes nutrientes, pero en una gotita de
agar de una superficie de 1 cm2 las fuentes alimenticias son bastante escasas como para una
semana de incubacin, por lo cual, en ese lapso ya es posible examinar al microscopio el
montaje y observar estructuras reproductivas.
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

Los hongos patgenos deben ser manipulados con sumo cuidado, dada la natural capacidad
de las esporas para propagarse en el aire. Es recomendable abrir los tubos y placas de Petri con
cultivos cerca de los mecheros y estrictamente cuando sea necesario, evitando siempre movimientos
bruscos para prevenir la dispersin de las esporas. Si ya no se requiere que el microorganismo
permanezca viable, se le puede inactivar introduciendo una torunda de algodn impregnada con
formol, o bien inundar el cultivo con este solvente, unos minutos antes de su manipulacin.
ACTIVIDADES
ACTIVIDAD N 1: CARACTERIZACIN MACROSCPICA DE LAS COLONIAS.
Materiales: cultivo de un hongo en agar Saboraud al cual se le ha adicionado antibiticos de una
semana de incubacin, cuenta colonias.
Procedimiento: proceder a la caracterizacin macroscpica de la colonia seleccionada, evaluando
los parmetros indicados en la seccin de generalidades, tanto en la superficie como en el reverso
de la placa.
ACTIVIDAD N 2: CARACTERIZACIN MICROSCPICA DE LA COLONIA.
Materiales: cultivo de un hongo en agar Saboraud al cual se le ha adicionado antibiticos de una
semana de incubacin, asa y aguja de inoculacin, cinta adhesiva transparente, lminas portaobjeto,
lminas cubreobjeto, lquidos de montaje (agua glicerinada, lactofenol, azul de lactofenol),
microscopio ptico.
Procedimiento: tomar material de la colonia seleccionada con ayuda de los instrumentos de
inoculacin o con un trozo de cinta adhesiva transparente, colocar el material sobre una gota del
lquido de montaje dispuesto previamente en una lmina portaobjeto, de ser necesario, cubra la
preparacin con una laminilla cubreobjeto. Observe al microscopio en bsqueda de estructuras
reproductivas y vegetativas.
ACTIVIDAD N 3: MONTAJE DEL MICROCULTIVO.

Actividad Prctica N 10
Estudio de los Hongos.

Pgina 6 de 7

Materiales: cultivo de un hongo en agar Saboraud al cual se le ha adicionado antibiticos de una

semana de incubacin, asa y aguja de inoculacin, hisopos estriles, agar Saboraud suplementado
con antibitico fundido (en una fiola en bao de Maria), equipo para microcultivo (consiste de una
placa de Petri que contiene un fondo de papel absorbente, un soporte de vidrio en forma de U y dos
lminas portaobjeto, todo el material esta estril), piceta con agua destilada estril.
Procedimiento:
1.
Destapar el equipo de microcultivo cerca del mechero y tomar una lmina portaobjeto.
2.
Simultneamente se debe introducir el hisopo estril en el envase con el agar Saboraud
fundido
3.
Agregar una gota del medio de cultivo en la lmina portaobjeto, esparcindola
cuidadosamente hasta formar un valo de aproximadamente 1 cm2 de superficie, una vez
ligeramente solidificada la primera gota, se agrega una segunda siguiendo el mismo protocolo.
4.
Cuando ya se ha solidificado el valo de agar, se inocula en ambos extremos con una
pequea porcin de la colonia fngica en investigacin, tomada con ayuda del asa o aguja de
inoculacin.
5.
Repetir el mismo procedimiento para la segunda lmina portaobjeto suministrada, y una vez
inoculadas, se colocan sobre el soporte de vidrio, el cual debe reposar en la placa de Petri y
sobre el trozo de papel absorbente.
6.
Impregnar cuidadosamente con el agua destilada estril con ayuda de una piceta.
7.
El conjunto se somete a incubacin durante una semana a temperatura ambiente, cuidando
de no invertir la placa de microcultivo.
ACTIVIDAD N 4: LEVANTAMIENTO DEL MICROCULTIVO.
Materiales: microcultivo con siete das de incubacin a temperatura ambiente, formol, fijador FAEX,
lquidos de montaje (agua glicerinada, azul de lactofenol, lactofenol), lminas cubreobjeto,
microscopio.
Procedimiento:
1.
Destapar cuidadosamente la placa de microcultivo y colocarle una torunda de algodn
impregnada con formol, como mnimo 30 minutos antes de iniciar los trabajos prcticos.
2.
Agregar una gota del fijador FAEX sobre las zonas de crecimiento en las lminas cubreobjeto
del microcultivo; dejar actuar por cinco minutos a temperatura ambiente.
3.
A continuacin, remover el exceso de agar y material de cultivo con un bistur o el canto de
una laminilla cubreobjeto, agregar lquido de montaje a los cultivos y cubrir con una lmina
cubreobjeto de forma cuidadosa, tratando de no presionar ni alterar el material, de lo contrario,
podran deteriorarse las estructuras reproductivas de los hongos, lo cual dificultara la
identificacin del mismo.
4.
Observar al microscopio en bsqueda de estructuras vegetativas y de reproduccin.
Bibliografa recomendada

Koneman, E.W. Diagnstico Microbiolgico. Editorial Mdica Panamericana. 1992.

Carter, S., Chengappa, M. Bacteriologa y Micologa Veterinaria. Editorial El Manual Moderno. 1994.
Koneman, E., Robert, G. Micologa, prctica de laboratorio. Editorial Mdica Panamericana. 1987.
Casas Rincn, G. Micologa General, 2da. Edicin. Ediciones UCV. 1989.
Ruz de M., G., Zabala de R., D. Hongos mucosos, hongos inferiores y hongos imperfectos. S.E., 1993.
Rippon, J. Micologa Mdica: hongos y actinomicetales patgenos. Nueva Editorial Interamericana. 1990.
Bastardo de A., M.C., Delgado A., M.V. Temas de Micologa Mdica. 1996.

Actividad Prctica N 10
Estudio de los Hongos.
Prof. Merln Colmenares de Pulgar, Prof. Lilia Carrero.
Octubre de 2007.

Pgina 7 de 7