REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

MARCO TEORICO
La reaccin en cadena de la polimerasa es una reaccin enzimtica in vitro que amplifica
millones de veces una secuencia especfica de ADN durante varios ciclos repetidos en los
que la secuencia blanco es copiada fielmente. Para ello, la reaccin aprovecha la
actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente
el ADN en las clulas. En la reaccin, si usamos como sustrato ADN genmico, entonces
tpicamente hablamos de una PCR, pero si usamos ADN complementario (ADNc)
proveniente del ARNm (cido ribonucleico mensajero) se le conoce como RT-PCR
(Reverse Transcription-PCR, por sus siglas en ingls). Esta conversin se logra mediante
una reaccin conocida como transcripcin reversa y controlada por la enzima
transcriptasa reversa, capaz de convertir el ARNm en una molcula de ADNc. Este
mtodo fue copiado de los retro virus que usan una transcriptasa reversa para convertir su
genoma de ARN en ADN duplicarse en millones de partculas virales.El ADNc se utiliza
cuando analizamos la expresin del ARNm de algn gen de inters. Los elementos
importantes en la reaccin son el templado o molde (ADN o ADNc), la enzima, los
oligonucletidos o primers, los desoxirribonucletidos trifosfatados (dNTPs: adenina,
timina, citosina y guanina), el in magnesio (Mg +), una solucin amortiguadora o buffer y
H2 O. Todos estos elementos interactan en tres etapas principales de las que se
compone la PCR: desnaturalizacin, hibridacin y extensin. Los equipos en donde se
realiza la reaccin son llamados termocicladores, los cuales estn diseados para
establecer un sistema homogneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo
necesarios no se modifiquen en cada uno de los ciclos. Al final de la reaccin, para
corroborar si se amplific la secuencia blanco de inters, los productos de la PCR o
tambin llamados amplicones son analizados en geles de agarosa para confirmar si la
reaccin fue exitosa.
COMPONENTES DE LA PCR
El elemento principal en la PCR es el ADN. En la PCR, el templado son las cadenas de
ADN que se separan y funcionan como molde para que la enzima sintetice las nuevas
cadenas que llevan la secuencia blanco de inters. Por su parte, la ADN polimerasa se
encarga de la catlisis de la reaccin, sintetizando las nuevas cadenas de ADN que llevan
la secuencia blanco. La enzima ms usada con frecuencia se llama Taq ADN polimerasa,
que proviene de una bacteria termfila llamada Thermus aquaticus, la cual vive en
condiciones de temperatura muy altas y por eso su ADN polimerasa es capaz de soportar
ese tipo de temperaturas. El rasgo que distingue a esta enzima bacteriana de otras ADN
polimerasas de otros organismos es su capacidad para mantener su funcionalidad a
temperaturas altas, por lo que se le considera una enzima termoestable. Tambin hay
otras enzimas que se utilizan como la Vent, obtenida de la bacteria Thermococcus
litoralis.Normalmente, casi todas las enzimas que se venden comercialmente son

eficientes y generalmente cuando fallan lo hacen por una manipulacin incorrecta del
usuario. Para que la enzima funcione con alta especificidad y la reaccin transcurra
exitosamente, tambin se necesita primers, dNTPs, Mg +, buffer y H2 O. Los primers son
secuencias de oligonucletidos que flanquean y delimitan la secuencia blanco que se
desea amplificar y son complementarios a sta. Generalmente su tamao oscila entre 1525 pares de bases y la cantidad de G-C no debe ser ms del 55% de la secuencia. Si no
se respetan estas reglas, existe la posibilidad de la formacin de dmeros de primers, es
decir, de productos inespecficos. Esto repercutira en el rendimiento de la reaccin, as
como en la especificidad del producto esperado. Son dos secuencias diferentes de
primers las que se utilizan en la PCR, una denominada forward o sentido y otra
reward o antisentido; ambas deben estar diseadas para que hibriden con el templado
y las cadenas de ADN puedan ser extendidas por la Taq polimerasa en direccin 5-3
(como sucede endgenamente). Con la finalidad de garantizar la formacin de un
complejo estable entre el templado y los primers, hoy en da existen programas
informticos para disear primers con alta especificidad, por lo que se evita la formacin
de productos inesperados. Incluso, hay laboratorios de biologa molecular que se dedican
a disearlos, sintetizarlos y validarlos para garantizar su especificidad, facilitndole el
trabajo al usuario que slo elige el de su inters y los manda a comprar. Por su parte, los
dNTPs son los ladrillos o bases nitrogenadas con los que la Taq polimerasa construye las
nuevas cadenas de ADN. Son factores importantes que contribuyen a la especificidad de
la reaccin, por ello es importante que su concentracin sea la adecuada ya que de lo
contrario pueden afectar la funcin de la Taq polimerasa. Normalmente, se utilizan a una
concentracin que oscila entre 0.2 a 1.0 mM. El buffer es la solucin amortiguadora que
se usa en la reaccin y generalmente est compuesta de Tris-HCL (pH = 8) cuya
concentracin final de trabajo debe ser 1X. Tambin se usan otros buffers de composicin
distinta que son fcilmente comprados en el mercado. El magnesio es un cofactor
enzimtico que influye en la especificidad de la reaccin, por eso se debe tener una
concentracin adecuada para que no afecte el rendimiento de la Taq polimerasa;
regularmente su concentracin oscila entre 0.5 y 2.5 mM. En ocasiones ya viene incluido
en el buffer, pero en otras se le tiene que agregar. El agua es el disolvente en la reaccin
y se usa en su forma destilada libre de nucleasas, enzimas que degradan a los cidos
nucleicos.

ETAPAS DE LA REACCION

Desnaturalizacin.
En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una temperatura de 95
C durante 20-30 segundos; el tiempo
depende de la secuencia del templado, es
decir, si la cantidad de G-C es alta, ser
necesario ms tiempo para romper sus
uniones debido a que el apareamiento de
estas bases est formado por tres enlaces,
uno ms que las bases de A-T. Adems,
depende de la velocidad en la que el
termociclador aumenta la temperatura, esto
vara de acuerdo al modelo del equipo. Al
final de esta etapa tendremos las cadenas
separadas que servirn como templado para el siguiente paso.
Hibridacin.
En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3 del templado previamente separado e
hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el complejo templadoprimers, es importante que la temperatura de hibridacin o temperatura melting (Tm) sea
la ptima; sta generalmente oscila entre 50-60 C. Si el diseo de los primers es el
correcto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo ser
eficiente.
Extensin.
En esta etapa, la Taq polimerasa acta sobre el complejo templado-primers y empieza su
funcin cataltica a una velocidad muy rpida; agrega dNTPs complementarios para crear
las cadenas completas de ADN. La extensin de las cadenas es en direccin de la
sntesis del ADN, es decir, de 5 a 3. La temperatura ptima para la reaccin es de 72 C,
ya que a esa temperatura la enzima es funcional.

ANALISIS DEL PRODUCTO

Al final de la PCR, para saber si la reaccin transcurri eficientemente, los amplicones son
visualizados a travs de una electroforesis en geles de agarosa.La electroforesis consiste
en la separacin de grandes molculas como los cidos nucleicos a travs de una matriz
slida que funciona como un filtro para separar las molculas en un campo elctrico de
acuerdo a su tamao y carga elctrica. Esta separacin se hace bajo un buffer o tampn
que puede ser TAE o TBE. En el caso de los cidos nucleicos, el grupo fosfato les
proporciona la carga negativa, por lo que
durante la electroforesis migran hacia el polo
positivo. Para ello, se prepara un gel diluyendo
una cantidad de agarosa en el buffer, se
calienta hasta que la agarosa hierva lo
suficiente y posteriormente se vaca a un
recipiente que sirve de base para que
solidifique. Generalmente el porcentaje al que
se prepara el gel es al 1.2% aunque,
dependiendo del tamao de las molculas,
puede ser de hasta el 2%. Otro ingrediente que
se agrega al gel es un compuesto conocido como bromuro de etidio, una molcula
intercalante capaz de unirse al ADN de doble cadena. Cuando es excitado con luz UV
emite una seal que permite la visualizacin de los amplicones en forma de bandas. Es
importante manipular con mucho cuidado este compuesto porque se sabe que es
mutagnico y teratgeno. Cuando los amplicones son corridos en el gel, stos deben ser
cargados junto con un marcador molecular que contenga un nmero determinado de
segmentos de ADN conocidos, lo que facilita la identificacin de los amplicones y si su
tamao corresponde con el esperado. El tamao est dado por el nmero de pares de
pases del amplicn. El marcador de peso molecular es fcilmente adquirido en el
mercado, ya que se ofrece una gama de
marcadores
con
distintos
pesos
moleculares para elegir el de nuestro
inters.
Finalmente, la visualizacin de los
amplicones se lleva a cabo tomando una
foto digital al gel de agarosa expuesto a
luz UV (Figura 3); adicionalmente un
procesador de imgenes se encarga de
analizar las bandas observadas. La
combinacin adecuada de todos los
elementos qumicos mencionados hacen
posible la sntesis in vitro del ADN utilizando la PCR. Los cambios que ha sufrido la PCR
como plataforma tecnolgica han sido muy notables; conforme los paradigmas de estudio
de los cidos nucleicos han ido cambiando, la necesidad de ir mejorando la tcnica se
convirti en una prioridad para los investigadores; es por ello que la PCR ha sufrido

modificaciones para ofrecer una tecnologa ms innovadora apegada a los retos

inherentes que implica el estudio del ADN.
MATERIALES:

dNTPs.
Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers).
Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), (Mn2+)
Iones monovalentes, como el potasio.
Una solucin tampn o buffer
ADN polimerasa (Taq).
ADN molde.
Termociclador.
Micropipetas
Tips o puntas plsticas.
Tubos

PROCEDIMIENTO:
El procedimiento que a continuacin se describe es utilizado para la deteccin del gen
de resistencia a amino glucsidos en cepas de M. tuberculosis

De acuerdo al protocolo.

Extraccin del ADN por el mtodo de Boiling, de acuerdo a protocolo del

laboratorio de Biotecnologa.
Realizar la mezcla maestra de PCR (master mix), como se describe a
continuacin, encontrar el volumen para que la concentracin final quede como se
indica, adicionando los Primers especficos y el ADN en estudio.

REACTANTES
Agua Destilada
5X buffer
25nM MgCl
2,5 uM dNTPs
25 uM cebador
Enzima
ADN

VOLUMEN (ul)
12.9
5,0
1,5
2,0
1,0
0,1
2,5
25 ul

{FINAL}
1X
1,5 mM
200 uM
1 uM
1U/tubo

MIX (ul)
64.5
25
7.5
10
5
0.5
112.5 ul

Preparamos el mix PCR manipulando las micropipetas ya calibradas con los

volmenes obtenidos en la tabla anterior de cada componente
respectivamente, procedemos a colocar con cuidado el mix en un tubo
empedeford con un volumen de 25 ul aprox, de todos los componentes del
PCR master mix menos el ADN ha amplificar.

 Homogenizamos el PCR master mix, y se vierte el contenido del mismo, en 5

tubos de PCR (volumen 22 ul por c/tubo)

Agregamos el ADN muestra

 Ya listos los 5 tubos con todos los componentes del PCR convencional,
procedemos a rotularlos y luego los ingresamos al termociclador en donde
estarn de 1-2 horas.

CUESTIONARIO:
1. FUNDAMENTO DE EL EFECTO PELTIER?
Un refrigerador Peltier es una bomba trmica activa que transfiere calor desde una parte
del dispositivo hacia la otra. Los sistemas de enfriamiento de las cmaras CCD funcionan
con base en el efecto Peltier. As como en el termociclador usado en Biologa
Molecular para realizar la PCR.
Desde hace algunos aos se ha implemetado un nuevo mtodo para cambiar la
resistencia de estos termocicladores, utilizando para ello la tecnologa o
efecto Peltier (Descubierto en 1834) aprovechando las propiedades de los
semiconductores. El efecto Peltier hace referencia a la creacin de una diferencia de
temperatura debido a un voltaje elctrico. Esto ocurre cuando una corriente se hace pasar
por dos metales o semiconductores conectados por dos junturas de Peltier. La corriente
propicia una transferencia de calor de una juntura a la otra: una se enfra, mientras que la
otra se calienta. Este material ofrece mejor uniformidad en la temperatura y rampas de
incremento y decremento de la temperatura mucho ms pronunciadas, obteniendo
mejores resultados en los procesos de la PCR.

Hoy da, se ha implementado en los laboratorios un Termociclador en Gradiente. La

PCR de gradiente es actualmente el mtodo que se utiliza para seleccionar las
condiciones trmicas ptimas de la reaccin. Un gradiente de temperaturas programado
libremente hasta 20C no slo permite optimizar la temperatura de renaturalizacin, sino
tambin todos los pasos de temperatura de un protocolo de la PCR en las aplicaciones
ms complejas.
Gracias a la tecnologa de pendiente constante, siempre se utilizan ndices de
calentamiento y refrigeracin constantes, de forma que los resultados del experimento
gradiente se pueden realizar con sencillez y precisin en aplicaciones rutinarias.
En la bsqueda de mejorar la precisin, exactitud y homogeneidad de la temperatura
tambin se han introducido metales como el oro, la plata y otras aleaciones en los bloques
de los pozos, logrando estabilidad y reproducibilidad en los ensayos.

2. Organismos extremfilos de los cuales se obtienen ADN polimerasa para PCR

Organismos extremfilos
Bacillus stearothermorphilus
Pyrococcus furiosus
Pyrococcus sp.
Pyrococcus woesei
Thermus aquaticus
Thermus brocianus
Thermus filiformis
Thermus flavus
Thermococcus litoralis
Thermotoga martima
Thermus thermophilus
Bibliografa

AND
polimerasa
Bstl
Pfu
Psp
Pwo
Taq
Tbr
Tfi
Tfl
Tli
Tma
Tth

CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY. Recuperado de:

http://geguchadze.com/PDF/protocols/CPonline/Doc/18208-18208.htm
Castillo, F. 2005. Biotecnologa ambiental. Editorial Tbar. Madrid, Espaa. p: 398