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RESUMEN
Problema
Identificacin de molculas de AANN de secuencia especfica
Material de partida
a.
b.
c.
d.
e.
f.
Electrotransferencia
2. Obtencin de la sonda
QU ES UNA SONDA
TIPOS MARCAJE
Caliente (nucletidos trofosfato con fsforo radiactivo generalmente en
posicin alfa o gamma). Detectable mediante autorradiografa.
Fro (anticuerpos conjugados a un nucletido trifosfato): Digoxigenina,
biotina o fluorescena. Detectables con anticuerpos especficos.
MTODOS DE MARCAJE
Traslado de la mella (Nick-traslation): DNasaI + ADN polimerasa I de E. coli
Primado al azar (Random-primer): Hexanucletidos + Fragmento Klenow
Adicin de colas marcadas en 3 (Oligonucleotide tailing): Transferasa
terminal
Marcaje en extremo 3 (3'-End-labeling): ADN polimerasa I fragmento Klenow
Marcaje en extremo 5 (5'-End-labeling): fosfatasa + polinucletido kinasa
Marcaje por PCR: Taq polimerasa (o cualquier polimerasa termoestable)
Marcaje por transcripcin in vitro: ARN-polimerasa, para sondas de ARN
3. Hibridacin
4. Revelado
- Sondas radiactivas: Deteccin mediante pelcula sensible a rayos X (autorradiografa)
- Sondas fras: Con anticuerpos especficos frente al anticuerpo empleado para marcar:
Deteccin:
Directa: anticuerpos especficos marcados con fluorocromo
Indirecta: anticuerpos especficos conjugados fluorocromos o con enzimas
(deteccin de la acctividad enzimtica de dicho enzima).
BIBLIOGRAFA RECOMENDADA
BIBLIOGRAFA ADICIONAL
Principles of gene manipulation and genomics. (2006, 7 ED.). S.B. Primrose and R.M.
Twyman.
Blackwell
Science.
ISBN:
1-4051-3544-1.
http://www.blackwellscience.com/primrose.
Recombinant DNA : Genes and genomes A short course. (2006, 3 Ed.) J.D. Watson,
A.A. Caudy, R.M. Myers, J.A. Witkowski. Cold Spring Harbour Press and Freeman.
ISBN: 0-7167-2866-4.
Gene cloning and dna analysis, an introduction (2006, 5 ED.) T.A Brown. Blackwell
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Analysis of genes and genomes (2004, 1 ED.) Richard J Reece. Wiley. ISBN: 0-47084380-2.
Understanding dna and gene cloning. A guide for the curious (2004). Karl Drlica. Wiley.
ISBN: 0471-43416-7.
From genes to genomes. Concepts and applications of DNA technology. J.W. Dale y M.
von Schantz. Wiley (2002). ISBN: 0-471-49783-5.