FUNDACIN UNIVERSIDAD DE AMRICA QUMICA INDUSTRIAL ORGNICA EXPERIMENTAL GRUPO 11

Prctica 1: Extraccin de Esencias y Separacin de Pigmentos Naturales

Velsquez Beltrn Eduardo1
Giraldo Collazos Oscar Santiago1
Murillo Marn Juliana 1
Qumica Industrial Orgnica Experimental Grupo 11
Fundacin Universidad de Amrica
Resumen
Introduccin. Es bastante catico y curioso el querer obtener el color de las plantas o hacer que su aroma perdure para un muy
largo tiempo. Las esencias y pigmentos son aquellos compuestos que generan tal ambicin.Una esencia es un conjunto de muchos
compuestos qumicos bastante complejos, aromtica y altamente voltil, biosintetizada por una planta y se le conoce como tal
porque su aroma al ser procedente de su flor le caracteriza en sa la flor. Un pigmento a cambio no slo es un conjunto de
muchos compuestos orgnicos bastante complejos sino que este presume de varias categoras de coloracin y se le reconoce es
por cambiar el color de la luz que refleja como resultado la la absorcin selectiva de ese color. Las esencias y pigmentos se han
desarrollado en la actualidad para innovar en las materias primas ya sean de consumo, material textil o toda la perfumera , una
aparente innovacin a la industria. Da a da se busca encontrar ms posibilidades para la obtencin de estos recurso s como as
lograr sintetizarlos.
Objetivo. Conseguir extraer esencias y pigmentos de cscaras de limn, ptalos de rosa y hojas de espinaca con el fin de adquirir
habilidades en el proceso de extraccin de esencias y separacin de pigmentos para aplicarlas en la industria.
Materiales y Mtodos. En la prctica se utiliz un montaje de destilacin con cscaras de limn y agua como gas que arrastra el
vapor de la esencia, un montaje de extraccin soxhlet (un condesador de reflujo de sifn con un sistema de refrigeracin y un a
cmara de extraccin junto a un baln de boca esmerilada que contena al solvente) para extraer la esencia de los ptalos de una
rosa, y un equipo de cromatografa para el anlisis de unos pigmentos a separar de las hierbas de espinaca.
Palabras clave: Cromatografa. Extraccin. Solubilidad. Esencias. Pigmentos. Separacin.

INTRODUCCIN
Durante el desarrollo de la industria se ha encontrado que
muchos elementos en la naturaleza con componentes orgnicos
se pueden utilizar como materias primas necesarias para los
procesos industriales. Los ms comunes son los pigmentos y las
esencias, y son comunes por la facilidad de separacin y
extraccin de estos. Empleados en la industria textil y en la
industria de los perfumes, entre otros.
A medida de que pasa el tiempo, se ha comprobado que
muchos componentes ya sean naturales o sintetizados
reaccionan con las ondas electromagnticas del espectro
visible.
Es entonces que se conocen a los pigmentos como elementos
(o compuestos que en su caso son orgnicos) que reaccionan
con las ondas electromagnticas del espectro visible. Es un
material que cambia el color de la luz que refleja como resultado
de la absorcin selectiva del color. Los pigmentos, presentan un
peso molecular alto, es decir, no son sustancias voltiles.
En la naturaleza los pigmentos ms abundantes se encuentran
en las hojas de muchas plantas y exactamente en los
cloroplastos
de
sus
clulas.
La clorofila es un pigmento de las plantas, encontrados en los
plastos de ella, que les proporciona su color verde y que
absorbe la luz necesaria para la fotosntesis. La clorofila refleja
luz verde y absorbe a la luz violeta, roja y azul. La abundancia
de clorofila en hojas y su ocasional presencia en otros tejidos
vegetales es la causa de que esas partes de las plantas
aparezcan verdes, pero en algunas hojas la clorofila es
enmascarada por otros pigmentos. La extraccin y
reconocimiento de estos pigmentos es interesante para
resultados ptimos en la prctica.
Los Pigmentos vegetales, que se encuentran en los
cloroplastos, son molculas qumicas que reflejan o transmiten
la luz visible, o hacen ambas cosas a la vez. El color de un
pigmento depende de la absorcin selectiva de ciertas
longitudes de onda de la luz y de la reflexin de otras.
Hay diversas clases de pigmentos: Principales:
Clorofilas (a, b, c, d y bacterioclorofilas) de coloracin verde.
(Que dentro de los procedimientos de extraccin slo la Clorofila
a y la Clorofila b se tomarn en cuenta para los resultados de la
prctica)

Carotenoides (carotenos y xantofilas) de coloracin amarilla y

roja.
La importancia de la clorofila en las plantas es que su
absorbancia de la luz es un factor fundamental para llevar a
cabo el proceso de la fotosntesis, proceso que posibilita la
sntesis de sustancias orgnicas a partir de las inorgnicas
(CO2, H2O y sales minerales), mediante la transformacin de la
energa luminosa en energa qumica.
En ocasiones, la presencia de clorofila no es tan patente al
descomponerse y ocupar su lugar otros pigmentos tambin
presentes en los plastos como son los carotenos y las
Xantofilas.
Cuando la molcula de clorofila absorbe un fotn, sus electrones
se excitan elevndose a un nivel de energa superior. Esto es el
punto de partida en el cloroplasto de una secuencia compleja de
reacciones qumicas que dan lugar al almacenamiento de
energa en forma de enlaces qumicos.
La clorofila y los carotenoides son compuestos apolares y en los
efectos de la extraccin, su solubilidad con solventes orgnicos
casi siempre hacen que la clorofila sea el compuesto ms
sencillo a separar.
Las esencias por otra parte ya no cumplen con un papel que
interacta con el espectro electromagntico visible porque lo
que lo que las hace llamativas es que describen el aroma
natural de sus plantas de origen, son importantes porque son
exquisitas y bastante llamativas. Son compuestos voltiles, es
decir, con un punto de ebullicin y un peso molecular bajo. As
mismo muchas de estas sustancias son oxigenadas y estn
compuestas por grupos carbonlicos como lo son los aldehdos,
cetonas, steres, entre otros, se oxidan por exposicin al aire y
se pueden extraer mayormente de las flores, frutos y hojas de
diferentes planta.
A diferencia de los pigmentos naturales, las esencias naturales
abundan en ms de 150 ejemplares y todas sometidas a
procesos de extraccin diferentes y dispendiosos.
Una vez entendiendo su naturaleza se entran a comprender y
efectuar procedimientos esenciales para la extraccin de
esencias y separacin de pigmentos naturales as como se
llevan a cabo los procesos qumicos macroscpicos de ellos.
Estos dentro de la cromatografa, la extraccin con arrastre de
vapor y la extraccin por medio de un montaje Soxhlet.

METODOLOGA
Extraccin con arrastre de vapor.
Se prepar un montaje de destilacin llenando
aproximadamente de uno de los balones del montaje
con agua destilada (balones de fondo plano con
desprendimiento) y colocando 60 perlas de ebullicin
para evitar complicaciones con algn residuo
microscpico altamente voltil. Mientras, ambos balones
se calentaron a fuego lento por conductividad trmica de
las placas protectoras sometidas a la llama del mechero.
En el segundo baln, de menor tamao, se coloc la
cscara, previamente picada, de un limn y medio.
Ambos balones se conectaron por tubos de seguridad y
conduccin de vapor a un condensador donde fluy
agua fra para efectuar el arrastre de vapor con el vapor
del agua del primer baln y de la esencia extrada del
limn en el segundo. Finalmente se utiliz un
Erlenmeyer donde se recolect la esencia extrada por
absorcin de agua.
Extraccin con soxhlet.
Se realiz el montaje de extraccin Soxhlet con un
condensador de reflujo de sifn, un sistema de
refrigeracin y una cmara de extraccin junto a un
baln de boca esmerilada que contuvo alcohol etlico al
96%p. Se arm un dedal-cartucho elaborado con papel
filtro y contena ptalos de rosas previamente picados en
pedazos pequeos. Se guard el dedal en la cmara de
extraccin y se calent el baln a llama baja porque el
solvente es altamente voltil y la falta de control podra
ocasionar accidentes. En este proceso el solvente se
evapor y su vapor subi por el sistema soxhlet de
reflujo hasta el condensador, absorbi el vapor del
extracto por medio del refrigerante, y se precipit hasta
haber ido aumentando su volumen por medio del tubo de
reflujo.
Separacin de pigmentos con solventes.
Se efectuaron dos procedimientos.

Para haber efectuado ambos procedimientos se

prepararon dos soluciones. Una solucin de acetona con
espinaca molida y otra de etanol con la misma.
Consisti en moler 2 gramos de espinaca en un mortero
junto con 10 mL de acetona y se tritur hasta que la
solucin tom una coloracin verde. Luego se llen un
tubo de vidrio para centrifugado del lquido (con la menor
cantidad de slido suspendido posible) y se centrifug
durante 10 minutos a una velocidad de 2000 rpm.
La segunda solucin se prepar con 2 gramos de
espinaca en un mortero junto a 12 mL de etanol y se
tritur de nuevo hasta que la solucin tom una
coloracin verde. Esta vez sin centrifugar.
Cromatografa
Se determin en dos fases la suspensin sobrenadante
de la solucin de acetona con espinaca molida y
centrifugada, y se coloc una gota de este en una lnea
previamente dibujada a un centmetro del borde de una
tira de papel wathman fundamental para la
cromatografa con la ayuda de un tubo capilar. Se dej
secar y se repiti el proceso diez veces. As mismo,
para comenzar con el procedimiento, se satur la
cmara cromatogrfica con 9 mL de ter de petrleo y 1
mL de acetona. Se dej reposar para que toda la cmara
se haya distribuido uniformemente con la solucin de
ter de petrleo y acetona en sus fases lquida y vapor.
Luego se ajust la tira de papel de tal modo que la gota
de pigmento haya quedado posicionada en la parte
inferior de la cmara cromatogrfica. Despus de
determinado tiempo se retir la tira de la cmara
cromatogrfica y se analizaron los resultados.
Espectrofotometra
En este proceso se pas el contenido de la segunda
solucin de etanol y espinaca molida a un tubo de
ensayo, se diluy con 5 mL ms del solvente, para as
disminuir la cantidad de slido presente. Se calent a
bao mara durante 5 minutos con llama de mechero. Se
llev la sustancia al espectrofotmetro y se tomaron los
datos.

RESULTADOS
Tabla 1. Datos Obtenidos
Materia prima

Componente qumico
que le da el aroma

Mtodo de extraccin

Ptalos de rosas

Alcohol etlico

Con Soxhlet

Cscara de limn

Agua destilada

Arrastre de vapor

------------------------Espinaca

Cromatografa

Comentarios
El reflujo de sifn no alcanz a evacuarse como
para determinar un resultado congruente, sin
embargo s se logr extraer una fragancia floral.
Se quem el limn y su aroma no estuvo de
estuvo cerca al esperado pero alcanz a
percibirse.
Despus de sacar el papel whatman de la
cmara cromatogrfica y dejar que se estabilizara
el papel con el aire, se percibi un color amarillo
claro desplazado por capilaridad en el papel junto
al verde

------------------------Espinaca

Extraccin

Con espectrofotometra:

Con solventes:

Tabla 2. Datos de extraccin con solventes.

Longitud de
Absorbancia
onda ()
Blanco(Etanol)
645 nm
0
Pigmento
645 nm
2.246
Blanco(Etanol)
660 nm
0
Pigmento
660 nm
2.286
ANLISIS DE RESULTADOS
Discusin de Resultados
El limn se quem (Arrastre de Vapor)
No se sigui el procedimiento de la gua por tener mayor
calidad de tiempo as que lo extrado en el Erlenmeyer
no se someti a un tubo de decantacin o a una bureta.
El segundo baln de fondo plano con desprendimiento
que tuvo el limn picado no fue calentado a bao mara
y tampoco fue adaptado para que el vapor de agua haya
producido una mayor remocin del contenido y arrastre
de la esencia. Se dej la llama de ambos balones con
una llama bastante alta y se quem el limn.
No se permiti que la extraccin se realizara
completamente (Soxhlet). No hubo modificacin alguna
al sistema salvo que no se adecu a un tiempo
necesario y por lo tanto no se permiti obtener un
resultado o sobre todo comparar con respecto al
esperado.
Sin embargo cabe mencionar que con lo poco que se
obtuvo s se logr percibir la fragancia floral.
La cmara cromatogrfica no se satur suficiente
(Cromatografa). No se dej en reposo la cmara de
extraccin por 30 minutos as como que esta tampoco
estuvo en la oscuridad.
Debido a la carencia de tiempo se decidi agregar 4.5
mL ms de ter y para cumplir con la proporcin, se le
agregaron 0.5 mL de acetona.
El procedimiento indicaba nueve gotas para someter a
capilaridad por cromatografa pero no se evidenci un
tono fuerte dentro del papel y la apreciacin
considerable de eluyente tuvo que variar (aument a
once gotas para la adsorcin de vapor).
No se separaron todos los pigmentos en el papel
whatman, se evidenci a nivel cualitativo la extraccin de
Xentofila y Clorofila en el papel.
A pesar de ser los resultados esperados, con
condiciones ptimas se esper extraer todos los
pigmentos pero no fue as (no se evidenci degradacin
de pigmentos en un contenido gris)
Falta de lquido sobrenadante (Espectrofotometra)
No se solubilizaron los lquidos sobrenadantes de ambas
soluciones preparadas previamente para la separacin
de pigmentos y tampoco se diluyeron por falta de
lquidos sobrenadantes. Se consider pertinente
preparar otra solucin alternativa con espinaca pero
tampoco haba materia prima. Se midi su absorbancia
con una celda de solucin de etanol y de pigmento de
espinaca tomando como longitud de onda 645 nm y 660
nm y al etanol como blanco analtico.
Errores
El limn se quem (Arrastre de Vapor)
A nivel cualitativo la fuente de error existe gracias a la
inexperiencia de los experimentadores (propiamente es
un error humano) porque se efectu el procedimiento
sugerido en sus mejores fortalezas pero el equipo en
disposicin no estuvo completamente adecuado para
realizar el montaje de destilacin y a su vez por falta de
conocimientos prcticos, se quem el contenido de
ambos balones tal que los resultados no fueron los
esperados (fragancia de limn).
A nivel cuantitativo no se recolectan datos y el anlisis
no toma este carcter pero de ser as, ya no existe una

fuente de error ya que la equivocacin experimental no

genera una incertidumbre de resultados y por lo tanto no
se puede comparar con los resultados esperados. Una
explicacin ms detallada de esto es que la
equivocacin en consecuencia podra cambiar hasta las
propiedades fsicas de la muestra y tcnicamente se
estara elaborando otro laboratorio (pasa igual con los
procedimientos siguientes como la extraccin de
esencias por equipo Soxhlet, cromatografa y el anlisis
de
pigmentos
separados
por
medio
de
espectrofotometra).
Por tiempo no se permiti que la extraccin se
realizara completamente (Soxhlet)
No complet siquiera un sifn evacuado en el tubo de
reflujo y no se pudo determinar nada, error crtico pero
no es una fuente de error experimental ni si quiera un
error externo, simplemente un mal procedimiento.
Si se tomaran datos a por propiedad fsico-qumica,
estos seran inconclusos pues el procedimiento no se
efectu completamente.
La cmara cromatogrfica no se satur suficiente
(Cromatografa)
Fuente de error humana y de prejuicio.
A lo largo de la prctica los experimentadores no fueron
ptimos en adaptar el papel whatman dentro de la
cmara de extraccin (ignorando de por s que como mal
procedimiento, la cmara de extraccin no se dej
saturar en su totalidad o que esto sera un error externo
si se determinara una evaluacin a nivel cuantitativa),
esto permiti que se desestabilizara el sistema y se
atribuy la influencia de esto a la obtencin de los
resultados, un error que no es crtico pero s puede
generar incertidumbre.
Una interpretacin de carcter cualitativo como lo es
definir por medio de la coloracin del papel el tipo de
pigmento
extrado,
obligatoriamente
obliga
al
experimentador a ser parte de una fuente de error.
Sencillamente no es lo mismo lo que perciben los
sentidos de un experimentador con respecto a otro.
Se estableci en conjunto que la coloracin amarilla es
el pigmento Xantofila y la verde es el pigmento Clorofila.
Falta de lquido sobrenadante (Espectrofotometra)
Es un error externo el que el espectrofotmetro se haya
descalibrado en una ocasin y dentro de ese tiempo los
resultados pudieron ser alterados, insignificante pero de
apreciar a comparacin de un mal procedimiento como
lo es la decisin de analizar por celdas una solucin
nica de espinaca molida y etanol.

Figura 1. Curva Espectral de la longitud de onda con

respecto a su absorcin de la Clorofila.

Figura 2. Curva Espectral de la longitud de onda con

respecto a su absorcin de Pigmentos Fotosintticos.
La Clorofila que se obtuvo est acorde a los valores
esperados en las grficas.
La interferencia de los diferentes pigmentos provoca la
degradacin de la clorofila ms fcil al momento de
identificarla; la clorofila a se encuentra en menor
cantidad con respecto a los dems pigmentos presentes
en la muestra.
Todos los pigmentos fotosintticos interfieren en la
determinacin de clorofila ya que son los que componen
a las plantas, se encuentran en los cloroplastos de la
clula vegetal y les dan color al reflejar o transmitir la luz
visible, adems de que son los que constituyen el
sustrato fisicoqumico de la fotosntesis.
CONCLUSIONES
Se identific que las esencias son compuestos
voltiles, es decir, con un punto de ebullicin y un peso
molecular bajo. As mismo muchas de estas sustancias
son oxigenadas y estn compuestas por grupos
carbonlicos como lo son los aldehdos, cetonas, steres,
entre otros. Se pueden extraer mayormente de las flores,
frutos y/u hojas de diferentes plantas. Su bajo peso
molecular es caracterstico de tener bajas cadenas
carbonatadas, conjugadas y apolares.
Se concluy que el mtodo de extraccin soxhlet es un
mtodo ineficiente para llevar a cabo la produccin de
esencias con respecto al mtodo de arrastre de vapor al
menos a nivel del laboratorio aun as es ms eficaz a un
nivel industrial; no slo por el tiempo requerido para
realizar ambos ya que el arrastre de vapor produce ms
en menos tiempo, sino porque a niveles industriales
podra ser cuestin de eficiencia, tambin de economa y
sobre todo de sostenibilidad.
Utilizar agua como materia prima necesaria para
extraer la esencia con respecto a etanol a niveles
industriales podra ser perjudicial por los problemas
ambientales al lado del etanol que podra considerarse
como un recurso renovable dentro del mecanismo que
ejerce el mtodo de extraccin Soxhlet.
CUESTIONARIO
1. Qu normatividad tiene el pas para las
esencias?
Segn la resolucin del 5 de Junio de 2012 se define el
reglamento sobre los requisitos que se deben en tener
en cuenta para los saborizantes/ aromticos, dentro de
los cuales dicha esencia debe ser realmente natural y
debe poseer ciertas caractersticas analticas, tambin la
explicacin de las materias primas y algunas

definiciones de algunos conceptos dentro de esta

resolucin. En esta resolucin se define que los
productos voltiles se pueden obtener por procesos
fsicos.
2. Componentes qumicos que proporcionan el olor
de la esencia, frmula estructural.
En nuestro alrededor, encontramos una diversa variedad
de plantas, donde algunas tienen un valor comercial
importante, ya que son materias primas tiles para la
obtencin de diferentes productos (Colorantes,
Saborizantes y Fragancias). Los compuestos aromticos
poseen una amplia aplicacin en la industria basada en
los alimentos y bebidas. En algunos casos se emplean
las races, en otros la corteza o la madera, las flores, los
frutos, las hojas e incluso las semillas. Las esencias
poseen tres grupos de compuestos aromticos, notas
superiores, siendo stas las ms voltiles y las notas
inferiores siendo las menos voltiles. Dentro de las notas
superiores encontramos a los ctricos, las notas
intermedias estn conformadas por aromas de semillas y
especias y finalmente las notas bajas que perduran todo
el da e incluyen el cedro y el vetiver. Una de las
materias primas usadas en el laboratorio fueron las
rosas, donde encontramos que los principales
componentes de su aroma son:
Citronelol:

Figura 4: Elemento qumico de

representado por la frmula C10H20O.
Geraniol:

origen

orgnico

Figura 5: Es un alcohol que est presente en las rosas.

C10H18O.
Alcohol Fenetlico:

Figura 6: Es un alcohol primario aromtico, su frmula es

C8H10O
3. Paralelo entre esencia sinttica y esencia natural.
Tabla 3. Esencia Sinttica y esencia Natural

ESENCIA NATURAL

ESENCIA SINTTICA

Provienen de un fruto, flor u hoja

del reino vegetal.
En la mayora de casos genera
ms costos la extraccin de una
esencia natural para su posterior
comercializacin, puesto que se
requiere demasiada materia prima
para lograr extraer poca cantidad
de esencia.
Tiene propiedades medicinales y
teraputicas.

No

provienen
vegetal.

del

reino

Son creadas a partir de

reacciones qumicas que
logran generar un olor similar a
la fragancia sobre la que se
quiere trabajar.
No tiene propiedades
medicinales ni teraputicas.

4. En qu consiste la extraccin de esencias por

disolucin de aceites fijos.
Por disolucin, los aceites fijos son solubles en grasas y
alcoholes de alto porcentaje. Sobre una capa de vidrio
se coloca una fina pelcula de grasa y sobre ella los
ptalos de flores extendidas. La esencia pasa a la grasa,
as hasta saturacin de la grasa. Posteriormente con
alcohol de 70, se extrae el aceite esencial.
5. Explique en qu consiste la extraccin por fluidos
Supercrticos y d ejemplos industriales de
compuestos que se puedan extraer por esta tcnica.
Esta tcnica consiste en empacar en una cmara de
acero inoxidable la materia prima a utilizar, previamente
cortada en trozos pequeos, la cual se hace circular a
travs de un fluido supercrtico, el ms comn es dixido
de carbono (CO2). Las esencias son as solubilizadas y
arrastradas, y el fluido supercrtico, que acta como
solvente extractor se elimina por descompresin
progresiva hasta alcanzar la presin y temperatura
ambiente, dando como resultado la esencia, cuyo grado
de pureza depende de las condiciones de extraccin.
A pesar de que es un proceso tcnicamente fcil, los
equipos a utilizar en un nivel, son de alto costo, es por
esto que dicha tcnica no es muy utilizada en Colombia.
Sin embargo, mediante este proceso de extraccin se
pueden obtener aceites esenciales puros.
6. Explique en qu consiste el proceso de enflorado
El proceso de enflorado consiste en colocar el material
vegetal con el que se desee trabajar, en contacto con
una grasa. La esencia se mezcla con dicha grasa que
funciona como agente extractor, la cual da como
resultado una mezcla entre aceite esencial y grasa la
cual se separa posteriormente por otros medios fsicoqumicos. Usualmente, este proceso se lleva a cabo
para la extraccin y obtencin de esencias florales.
7. Distinga en su muestra A qu pigmento
corresponde cada mancha?
En la muestra se pudo observar una mancha de color
verde y otra, ms pequea, ubicada en la mitad de la tira
whatman con la que se trabaj, de color amarillo claro.
La clorofila no absorbe el color verde, es decir, lo refleja
y nos permite identificar que dicha mancha, pertenece al
ya mencionado pigmento. Por el contrario, dentro del
grupo de los carotenoides, especficamente las
xantofilas tienen un color caracterstico amarillo. Lo que
quiere decir que estos pigmentos son los que se logran
identificar en la muestra analizada.
8. Calcular la movilidad relativa de los distintos
pigmentos Rf.

9. Qu factores pueden afectar el Rf?

Los factores que pueden afectar la reproducibilidad de
Rf son: la temperatura, puesto que un aumento de
temperatura, puede aumentar la volatilidad de los
solventes y por ende, el valor de Rf decrece ligeramente;
la fase mvil, ya que entre ms puros y de buena calidad
sean, mejores resultados se obtendrn; La saturacin de
la cmara cromatogrfica tambin puede afectar la
reproducibilidad de Rf, es por ello que se recomienda
realizar dicho proceso 30 minutos antes de utilizarla.
10. Haga los clculos correspondientes para la
extraccin de pigmentos.

BIBLIOGRAFA
VOLANT, Mara y QUIROGA, Pablo. (2013). Anlisis
farmacutico. Buenos Aires: 1 Ed.
ROTHSTEIN, Erika y Roldn, C, Julio. (2010).
Factibilidad del proyecto de extraccin de aceites
esenciales de naranja en Antioquia. Revista soluciones
de posgrado EIA, volumen (5), 4-5.
Philip S. Bailey, JR. Christina A. Bailey 'Alcoholes,
Fenoles y teres'; ' Aldehidos y Cetonas', Qumica
Orgnica, Conceptos y Palicaciones, Pearson Prentice
Hall 2013, 257, 296 - 336, 367.
MARKER, A.H. F., 1 972 . The use of acetone and
methanol in the estimation of chlorophyll in the presence
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